ES2689353T3

ES2689353T3 - Método para construir una biblioteca de ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla y reactivos de los mismos

Info

Publication number: ES2689353T3
Application number: ES14901597.6T
Authority: ES
Inventors: Chunyu Geng; Rongrong GUO; Ruoying Chen; Lingyu HE; Wenwei Zhang; Hui Jiang
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2034-10-14
Also published as: US20170275609A1; CN106795514A; JP6679576B2; EP3192877B1; EP3192900B1; WO2016037416A1; AU2014405969B2; ES2726149T3; EP3191630A1; WO2016037394A1; EP3191630B1; EP3192869A1; EP3192869B1; AU2014405991B2; JP2017528138A; DK3192900T3; DK3192877T3; EP3192877A4; CN107075731A; EP3192900A1

Abstract

Un método para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla, que comprende: fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble con un complejo incorporado de transposasa, que comprende transposasas y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador; ligar con ligasa un segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado en el espacio después de retirar la transposasa desde el sistema de reacción, el segundo adaptador tiene una secuencia diferente de aquella del cebador adaptador; realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un cebador producto de PCR ligado con una primera secuencia de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo; poner en contacto el cebador producto de PCR con un vehículo sólido que tiene un segundo marcador de afinidad, de tal manera que el cebador marcador de afinidad se combina con el segundo marcador de afinidad; aislar los ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el cebador marcador de afinidad a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado con el vehículo sólido; y ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla con una secuencia "puente" de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla.

Description

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DESCRIPCION

Método para construir una biblioteca de ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla y reactivos de los mismos Campo

La presente divulgación se refiere al campo de la biología molecular, en particular a un método y un reactivo para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla.

Antecedentes

La secuenciación de exones, también conocida como captura de exorna blanco, se refiere a un método de análisis de genoma mediante el cual los ADN que contienen regiones de exón de un genoma completo se capturan mediante tecnología de captura de región de secuencia y se someten a secuenciación de alto rendimiento después del enriquecimiento. La secuenciación de exones es una estrategia eficiente para seleccionar secuencias de codificación del genoma, que es menos costosa que la resecuenciación del genoma, y tiene grandes ventajas en el estudio del polimorfismo mononucleotídico, la inserción y la eliminación de genes conocidos. Una biblioteca de exones comúnmente utilizada es una biblioteca que contiene ADN de doble cadena para la plataforma Illumina o plataforma Proton que se construye aproximadamente de acuerdo con los siguientes protocolos: fragmentar de forma aleatoria el ADN genómico en fragmentos de longitudes que varían desde 180 hasta 280 pb, ligar un adaptador a cada terminal del fragmento subsiguiente a la reparación del extremo y agregar una cola de adenina (A), con el fin de construir una biblioteca. La biblioteca se somete a cebador enriquecimiento mediante primera hibridación líquida con sondas marcadas con biotina, luego los exones obtenidos después del cebador enriquecimiento se capturan mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptomicina y luego se eluyen de las perlas magnéticas para realizar un segundo enriquecimiento mediante segunda hibridación líquida. La biblioteca obtenida después de dos enriquecimientos se amplifica linealmente mediante reacción de PCR y se puede secuenciar después de que se ha probado que está calificada.

El documento WO2011/112718 divulga un método para generar ácido nucleico circular de cadena sencilla, que emplea polinucleótidos horquilla y una transposasa para fragmentar segmentos de ácido nucleico y ligar polinucleótidos horquilla a los fragmentos.

El documento WO2010/048605 divulga métodos, composiciones y kits para utilizar una transposasa y composiciones de extremos de transposones para generar una biblioteca de fragmentos de ADN etiquetados a partir del AdN objetivo.

El documento EP2712931A divulga composiciones que tienen una transposasa complejada con un adaptador de oligonucleótido en lisados de células crudas o unidas a un soporte sólido por medio de un enlace de un par de unión específico.

Sin embargo, no existe un proceso confiable para construir la biblioteca de exones utilizada en la secuenciación de plataformas de Complete Genomics (CG). Un método de construcción de la biblioteca en la técnica relacionada es un método que se basa en CG y mediante el cual se construye una biblioteca con un único adaptador de acuerdo con el protocolo básicamente mostrado en la Figura 1: fragmentar aleatoriamente el ADN genómico en fragmentos de longitudes dentro de un cierto rango de forma física, reparar el extremo y ligar direccionalmente un adaptador A, hibridar en forma líquida con sondas recubiertas con biotina, capturar exones con perlas magnéticas recubiertas con estreptomicina, realizar amplificación por PCR y aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla; y finalmente ciclar el ácido nucleico de cadena sencilla para obtener una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla. Dicho método es complejo y lleva mucho tiempo, por lo que aún hay mucho margen de mejora.

Un kit de fragmentación transposasa, liderado por el kit Nextera de la compañía Epicentra (adquirido por Illumina), puede completar la fragmentación del ADN y el ligamiento del adaptador al mismo tiempo mediante la transposasa, reduciendo de esta manera el tiempo de preparación de la muestra. Dicho método de fragmentación y ligamiento de adaptador se puede utilizar en la construcción de la biblioteca.

En vista de la simplicidad de las diversas operaciones, la fragmentación de transposasa es indudablemente muy superior a otros métodos en términos de rendimiento y simplicidad de operación. Sin embargo, dicha fragmentación también tiene deficiencias. Por ejemplo, la transposición realizada por la transposasa depende de una secuencia Me específica de 19 pb. Por lo tanto, aunque la transposasa puede ligar diferentes secuencias adaptadoras a una secuencia objetivo respectivamente en el extremo 5' y el extremo 3' al incorporar dos secuencias adaptadoras completamente diferentes, la secuencia objetivo después de la fragmentación contendrá simétricamente una secuencia Me en cada terminal de la misma con un espacio de 9 nt formado entre la secuencia objetivo (fragmentos fragmentados) y la secuencia Me debido a la función especial de la transposasa. Sin embargo, las secuencias Me idénticas en dos terminales de la secuencia objetivo tendrán una influencia adversa en las aplicaciones de tecnología corriente abajo. Por ejemplo, cuando se combina este ligamiento de adaptador con la tecnología de secuenciación de próxima generación, el hecho de que las secuencias Me ubicadas en dos extremos de la misma cadena de la secuencia objetivo sean complementarias entre sí, resultará fácilmente en una hibridación interna

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dentro de una molécula de cadena sencilla, lo que contribuye negativamente a la combinación con un cebador de anclaje.

En la actualidad, subsiste la necesidad urgente de un método simple para construir una biblioteca que contenga ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla, especialmente adecuados para la secuenciación de exones.

Resumen

Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan un método y un reactivo para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla. Adicionalmente, dicho método es simple y ahorra tiempo, sin influenciar adversamente por las secuencias de reconocimiento de transposasa idénticas en dos extremos de los ácidos nucleicos de cadena sencilla.

De acuerdo con las realizaciones de un cebador aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla, el método incluye:

fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble con un complejo incorporado de transposasa, que incluye transposasa y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador;

ligar con ligasa un segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado en el espacio después de retirar la transposasa desde el sistema de reacción, el segundo adaptador tiene una secuencia diferente de aquella del cebador adaptador;

realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un cebador producto de PCR ligado con una primera secuencia de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo;

poner en contacto el cebador producto de PCR con un vehículo sólido que tiene un segundo marcador de afinidad, de tal manera que el cebador marcador de afinidad se combina con el segundo marcador de afinidad;

aislar ácidos de cadena sencilla sin el cebador marcador de afinidad a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado nucleico con el vehículo sólido; y

ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla con una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla.

En las realizaciones de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente: realizar, antes de la primera reacción de PCR, una segunda reacción de PCR con un segundo par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un segundo producto de PCR ligado con la primera secuencia de adaptadores y la segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo.

En las realizaciones de la presente divulgación, uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo.

En las realizaciones de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente una etapa posterior a la segunda reacción de PCR y antes de la primera reacción de PCR: capturar un ácido nucleico de cadena sencilla que contiene una secuencia de exones, utilizada para la primera reacción de PCR, desde el segundo producto de PCR con una sonda para la secuencia de exones, en la que la sonda para la secuencia de exones contiene el cebador marcador de afinidad y es capaz de combinarse con el segundo marcador de afinidad del vehículo sólido.

En las realizaciones de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente: bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR con una secuencia de bloqueo de cebador, antes de capturar el ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones del segundo producto de PCR con la sonda para la secuencia de exones.

En las realizaciones de la presente divulgación, el cebador marcador de afinidad es un marcador de biotina, y el segundo marcador de afinidad es un marcador de estreptavidina.

En las realizaciones de la presente divulgación, la transposasa se retira del sistema de reacción mediante purificación de perlas magnéticas, purificación de columna o tratamiento de reactivo químico.

En las realizaciones de la presente divulgación, el vehículo sólido es de perlas magnéticas.

En las realizaciones de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente:

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realizar una segunda reacción de PCR con un segundo par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un segundo producto de PCR ligado con una primera secuencia de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo;

bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR con una secuencia de bloqueo de cebador;

capturar un ácido nucleico de cadena sencilla que contiene una secuencia de exones desde el segundo producto de PCR con una sonda para la secuencia de exones que contiene un marcador de biotina y capaz de combinarse con un marcador de estreptavidina del vehículo sólido;

realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones respectivamente, para obtener un cebador producto de PCR ligado con diferentes secuencias de adaptadores respectivamente en dos extremos de las mismas, en las que uno del cebador par de cebadores contiene el marcador de biotina en el extremo 5' del mismo;

poner en contacto el cebador producto de PCR con el vehículo sólido que tiene el marcador de estreptavidina, de tal manera que el marcador de biotina se combina con el marcador de estreptavidina;

aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el marcador de biotina a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado con el vehículo sólido; y

ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina con la secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina.

De acuerdo con las realizaciones de un segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona una combinación de reactivo para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla. La combinación de reactivo incluye:

un complejo incorporado de transposasa, formado con transposasa y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, y adecuada para fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador;

un componente, que comprende un segundo adaptador y ligasa, y adecuado para ligar el segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado con ligasas en el espacio;

un cebador par de cebadores, utilizados en una primera reacción de PCR, y dirigir el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, en el que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo;

un vehículo sólido, que tiene un segundo marcador de afinidad, adecuado para combinarse con el cebador marcador de afinidad;

una solución de desnaturalización, adecuada para desnaturalizar un producto de PCR combinado con el vehículo sólido con el fin de aislar ácido nucleico de cadena sencillas sin el cebador marcador de afinidad;

una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla, capaz de combinarse con dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla, y adecuada para ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla.

En las realizaciones de la presente divulgación, el kit de reactivos incluye adicionalmente: un segundo par de cebadores, utilizados en una segunda reacción de PCR, y dirigir el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente,

preferiblemente uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo.

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En las realizaciones de la presente divulgación, la combinación de reactivo incluye adicionalmente: una sonda para una secuencia de exones, que tiene el cebador marcador de afinidad y capaz de combinarse con el segundo marcador de afinidad del vehículo sólido, adecuada para capturar ácidos nucleicos de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones de un segundo producto de PCR; y

preferiblemente, la combinación de reactivo incluye adicionalmente una secuencia de bloqueo de cebador, para bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo del segundo producto de PCR.

De acuerdo con la solución técnica proporcionada en las realizaciones de la presente divulgación, el método actual incluye fragmentar una muestra de ácido nucleico de cadena doble con una transposasa y adicionalmente ligar un segundo adaptador a los ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados, obteniendo de esta manera ácidos nucleicos de cadena doble ligados con dos diferentes secuencias de adaptadores respectivamente en los dos extremos. Sobre esta base, el método incluye adicionalmente aislar y luego ciclizar ácidos nucleicos de cadena sencilla, obteniendo de esta manera la biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla. En comparación con el método existente, el método de acuerdo con la presente divulgación es simple y ahorra tiempo, sin influencia adversa por las secuencias de reconocimiento de transposasa idénticas en dos extremos de los ácidos nucleicos de cadena sencilla.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un método a base de CG para construir una biblioteca con un adaptador sencillo en la técnica relacionada.

La Figura 2 es un diagrama de flujo simplificado que muestra un método para construir una biblioteca de exones con transposasa y un adaptador sencillo, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 3 es un diagrama de flujo detallado que muestra un método para construir una biblioteca de exones con una transposasa y un adaptador sencillo, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 4 es un diagrama que muestra detección de electroforesis para una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla de acuerdo con una realización de la presente divulgación, en el que el carril 1 representa un producto de cadena sencilla cíclico obtenido en esta realización; y M1 y M2 representan dos marcadores de los ADN de cadena sencilla cíclico.

La Figura 5 es un diagrama que muestra la distribución de profundidad de cobertura acumulada de una única base obtenida por secuenciación de una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

Descripción detallada

La presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a realizaciones específicas. Las técnicas utilizadas en las realizaciones a continuación son técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica, a menos que se especifique lo contrario. Los instrumentos, equipos y reactivos utilizados en este documento están disponibles para aquellos expertos en la técnica a través de formas comunes, tales como la compra comercial, etc.

Los términos utilizados en este documento se explican de la siguiente manera: en las realizaciones específicas, el cebador adaptador se denomina adaptador No.1, el segundo adaptador se denomina adaptador No.2.

En la presente divulgación, los conceptos tales como "primero" y "segundo" se utilizan en cualquier caso solo para distinguir uno de otros sujetos, y no están destinados a indicar o implicar una secuencia o técnica relativa.

El método para construir la biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla de acuerdo con una realización de la presente divulgación incluye: fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble con un complejo incorporado de transposasa, que comprende transposasa y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador; ligar con ligasa un segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado en el espacio después de retirar la transposasa desde el sistema de reacción, el segundo adaptador tiene una secuencia diferente de aquella del cebador adaptador; realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un cebador producto de pCr ligado con una primera secuencia de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo; poner en contacto el cebador producto de PCR con un

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vehículo sólido que tiene un segundo marcador de afinidad, de tal manera que el cebador marcador de afinidad se combina con el segundo marcador de afinidad; aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el cebador marcador de afinidad a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado con el vehículo sólido; y ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla con una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla.

La biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla se puede lograr independientemente de los exones o intrones mediante el método descrito anteriormente. Es bien sabido que una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla para un genoma bacteriano que excluye intrones se puede construir por el método descrito anteriormente, que se puede utilizar adicionalmente en operaciones corriente abajo, tales como la secuenciación.

El método proporcionado en las realizaciones de la presente divulgación puede fragmentar los ácidos nucleicos y ligar el adaptador al mismo tiempo con el complejo incorporado de transposasa, que omite la reparación final, el ligamiento del adaptador y la etapa de purificación intermedia en un proceso tradicional, simplificando de esta manera el proceso y ahorrando tiempo.

En la presente divulgación, el cebador adaptador contiene la secuencia de reconocimiento de transposasa, normalmente la secuencia Me de 19 pb bien conocida, y está presente en forma de doble cadena, una cadena de la cual puede incluir una modificación didesoxi (es decir, didesoxinucleótido) en el extremo 3' de la misma para evitar el autoligamiento o interligamiento. "Autoligamiento" se refiere a dicho ligamiento que se produce entre dos adaptadores del mismo tipo, tal como un ligamiento entre dos primeros adaptadores o ligamiento entre dos segundos adaptadores. "Interligamiento" se refiere a dicho ligamiento que ocurre entre dos adaptadores de diferentes tipos, tales como un ligamiento entre el cebador y el segundo adaptador. La muestra de ácido nucleico de doble cadena está fragmentada por el complejo incorporado por transposasa, después de lo cual se liga una primera cadena del cebador adaptador a una cadena del ácido nucleico de doble cadena fragmentado, mientras que entre la otra cadena del cebador adaptador y la otra cadena del ácido nucleico de doble cadena fragmentado, se forma un espacio de 9 nt, que se debe rellenar mediante traslación de muesca de una manera convencional, mientras que simplemente proporciona un sitio de ligamiento para el segundo adaptador en el método de la presente divulgación.

En la presente divulgación, la secuencia del segundo adaptador puede ser una cualquiera diferente de aquella del cebador adaptador, ya que el segundo adaptador utilizado en la presente divulgación es principalmente para evitar la secuencia de reconocimiento de transposasa idéntica ubicada en dos extremos del ácido nucleico de doble cadena. Después que se liga el segundo adaptador en el espacio, el cebador producto de PCR, ligado con la primera secuencia de adaptadores y la segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, se puede obtener al realizar la primera reacción de PCR con cebadores que respectivamente dirigen el cebador y segundo adaptadores.

En la presente divulgación, uno de un cebador par de cebadores utilizado en la primera PCR contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo, y el cebador marcador de afinidad puede ser un componente comúnmente utilizado en reacciones de unión biológicas, tal como un antígeno o anticuerpo, una cadena de fragmento de ADN de doble cadena corto, biotina o estreptavidina, y así sucesivamente. En el caso en que se seleccione un antígeno como cebador marcador de afinidad, se selecciona un anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno como el segundo marcador de afinidad, y viceversa. En el caso en que se seleccione una cadena de fragmento de ADN de doble cadena corto como cebador marcador de afinidad, la otra cadena complementaria del mismo fragmento de ADN de doble cadena corto se selecciona como el segundo marcador de afinidad, y viceversa. En el caso en que se seleccione biotina como el cebador marcador de afinidad, la estreptavidina que es capaz de unirse a la biotina se selecciona como el segundo marcador de afinidad, y viceversa. En una realización de la presente divulgación, el cebador marcador de afinidad es biotina, y el segundo marcador de afinidad es estreptavidina, que tienen una fuerte capacidad de unión.

En la presente divulgación, la secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla es dicha secuencia que es complementaria con dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla y por lo tanto puentea los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla, con el fin de lograr la ciclización del ácido nucleico de cadena sencilla.

En una realización adicional de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente: realizar, antes de la primera reacción de PCR, una segunda reacción de PCR con un segundo par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente. Un propósito de la segunda reacción de PCR es amplificar masivamente los ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con la primera secuencia de adaptadores y la segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo. El segundo par de cebadores puede ser idéntico en secuencia al cebador par de cebadores excepto que no existe cebador marcador de afinidad en el segundo par de cebadores; el segundo par de cebadores puede no ser idéntico al cebador par de cebadores, por ejemplo, el segundo par de cebadores puede tener bases extra en el extremo 5' del mismo cuando se compara con el cebador par de cebadores. Un ejemplo típico pero ilimitado es que uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo. La secuencia de etiqueta de muestra puede ser una secuencia aleatoria para marcar diferentes muestras, de tal manera que las secuencias de diferentes muestras se pueden distinguir después de fragmentar, la construcción de la biblioteca y mezclar posteriormente para

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las etapas de secuenciación realizadas con diversas muestras al mismo tiempo. Esto se debe a que los ácidos nucleicos fragmentados para cada muestra contienen una secuencia de etiqueta de muestra específica.

De acuerdo con lo anterior, la eficiencia de secuenciación se mejora en gran manera en la secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, en el caso en el que uno del segundo par de cebadores contiene la secuencia de etiqueta de muestra, otro propósito de la segunda reacción de PCR es ligar la secuencia de etiqueta de muestra al fragmento de ácido nucleico de doble cadena fragmentado.

En una realización adicional de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente: una etapa posterior a la segunda reacción de PCR y antes de la primera reacción de PCR: capturar un ácido nucleico de cadena sencilla que contiene una secuencia de exones desde el segundo producto de PCR con una sonda para la secuencia de exones. La tecnología de captura de exón introducida en esta realización es una tecnología bien conocida para obtener la secuencia de exones. Como algunas secuencias de consenso existentes en el exón y/o entre exón e intrón son secuencias conservadoras, es posible diseñar una sonda para la secuencia de exones capaz de unirse con esta secuencia consenso, con el fin de aislar el ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones de diversos ácidos nucleicos fragmentados obtenidos después de fragmentar numerosas muestras de ADN genómico, para uso en secuenciación de exón. En una realización específica de la presente divulgación, la sonda para la secuencia de exones necesita contener un marcador de afinidad, por ejemplo, biotina, de tal manera que el fragmento que contiene la secuencia de exones se puede aislar por la sonda a través de la combinación del marcador de afinidad y un vehículo sólido que tiene el marcador de estreptavidina.

En una realización adicional de la presente divulgación, el método incluye adicionalmente: bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR con una secuencia de bloqueo de cebador, antes de capturar el ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones del segundo producto de PCR con la sonda para la secuencia de exones. La secuencia de bloqueo de cebador es capaz de unir específicamente la secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR, de tal manera que la sonda para la secuencia de exones no se puede unir con dicha secuencia de cebadores, evitando de esta manera un resultado falso positivo.

En la presente divulgación, el vehículo sólido para capturar el fragmento que contiene las secuencias de exones desde el segundo producto de PCR y el vehículo sólido para combinar el cebador producto de PCR puede ser un chip o perlas magnéticas. Específicamente, el chip o vehículo de perlas magnéticas se cubre con el segundo marcador de afinidad que es capaz de combinarse con el cebador marcador de afinidad. En una realización de la presente divulgación, se utilizan las perlas magnéticas recubiertas con el marcador de estreptavidina.

En la presente divulgación, después de que se fragmenta la muestra de ácido nucleico de cadena doble, la transposasa necesita ser retirada del sistema de reacción de manera general mediante purificación de perlas magnéticas, purificación de columna o tratamiento de reactivo químico para eliminar el efecto sobre las reacciones enzimáticas posteriores. La purificación de perlas magnéticas tal como perlas Ampure XP y la purificación de columna tal como columnas de purificación de QIAGEN PCR son métodos de purificación tradicionales, que son bien conocidos en la técnica relacionada. Sin lugar a dudas, cualquier producto similar para purificación de perlas magnéticas y purificación de columna se puede utilizar en la presente divulgación. La purificación puede eliminar completamente la transposasa del sistema de reacción, pero aumentará las operaciones y el coste correspondientes. La transposasa se puede disociar de las secuencias objetivo mediante desnaturalización o digestión mediante tratamiento con reactivos químicos debido a su naturaleza proteínica, y habrá perdido su actividad biológica después de este tratamiento, por lo que no tendrá un impacto negativo sobre la reacción posterior, incluso si todavía permanece en el sistema

En la presente divulgación, durante el tratamiento con reactivo químico, la solución de proteasa, la solución de dodecilsulfato de sodio (SDS), el tampón NT (tampón NT incluido en un kit Truprep en la serie S5) y similares se pueden elegir en cebador lugar para romper la adsorción entre la transposasa y la secuencia de ácido nucleico objetivo, luego se utiliza una solución que contiene Triton-X100 para disminuir una influencia adversa del reactivo anterior sobre la siguiente reacción enzimática. Con este método, se reemplazará la purificación de las perlas magnéticas tradicionales y la purificación de la columna con procesos complejos y de alto coste, y la amplificación por PCR corriente abajo se llevará a cabo sin problemas.

En la presente divulgación, el producto de PCR capturado por el vehículo sólido puede desnaturalizarse por calor o álcali, preferiblemente álcali, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio. En una realización de la presente divulgación, se utiliza hidróxido de sodio.

Con referencia a la Figura 2, un diagrama de flujo simplificado que muestra el método para construir una biblioteca de exones con transposasa y un adaptador sencillo de acuerdo con una realización de la presente divulgación incluye: fragmentar una muestra de ADN genómico con transposasa para obtener fragmentos fragmentados; amplificar los fragmentos fragmentados por una segunda reacción de PCR y capturar los fragmentos que contienen secuencias de exones a través de la tecnología de captura de exón; realizar una primera reacción de PCR y aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla; y ciclizar los ácidos nucleicos de cadena sencilla para obtener la biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla.

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Con referencia a la Figura 3, un diagrama de flujo detallado que muestra un método para construir una biblioteca de exones con transposasa y un adaptador sencillo de acuerdo con una realización de la presente divulgación incluye: fragmentar una muestra de ADN genómico con un complejo incorporado de transposasa para obtener ADN de doble cadena fragmentados ligados con un cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio de 9nt entre cada extremo 3' y el cebador adaptador; retirar la transposasa; ligar un segundo adaptador; realizar una segunda amplificación de pCr con un segundo par de cebadores, una que contiene una secuencia tag, para obtener un segundo producto de amplificación que contiene la secuencia tag; capturar un fragmento que contiene una secuencia de exones con una sonda para la secuencia de exones (que contiene un marcador de biotina); realizar una primera amplificación de PCR con un cebador par de cebadores, uno del cual contiene un marcador de biotina, para obtener un cebador producto de amplificación que contiene el marcador de biotina en una cadena del mismo; aislar el producto que contiene el marcador de biotina con perlas magnéticas recubiertas con estreptomicina; obtener un ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina a través de la desnaturalización; ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina con una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla para obtener la biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla.

En lo siguiente, la presente divulgación se describirá en detalle con referencia a las realizaciones.

Los reactivos utilizados en las realizaciones de la presente divulgación se explican como sigue: se adquieren ligasas de INVITROGEN; las transposasas (que incluyen enzima PCR) estaban contenidas en el Kit Prep de Muestra de ADN Avanzada TruePrep adquiridas de Vazyme Biotech; la Exonucleasa I y Exonucleasa III se adquirieron de NEB.

En la presente realización, un kit de transposasa se utilizó para el desarrollo de la tecnología, que incluyó ADN genómico en dos cantidades, 5 ng y 50 ng. El último se escogió en la presente realización.

1. Un par de secuencias de cebadores (secuencia A y secuencia B del Adaptador No.1) que contiene la secuencia Me de 19 bp se diseñó y adquirió para la preparación del Adaptador No.1 para incorporación, en el que la base de didesoxi timina (T) contenida en la secuencia B puede evitar eficientemente el autoligamiento de adaptadores:

Secuencia A del Adaptador No.1: GCTTCGACTGGAGACAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 1);

Secuencia B del Adaptador No.1: CTGTCTCTTATACACATC ddT (SEQ ID NO: 2).

2. La secuencia A y secuencia B del adaptador No.1 se diluyeron a 100 mM, se centrifugaron después de mezclar lo suficiente, y luego se hibridaron en el aparato de PCR de acuerdo con los siguientes procedimientos (Tabla 1) para obtener el adaptador No.1, que se almacenó a -20°C para la preparación del complejo incorporado de transposasa.

Tabla 1

Temperatura: Tiempo

75°C: 15 min

60°C: 10 min

50°C: 10 min

40°C: 10 min

25°C: 30 min

Tapa caliente 105°C

Después de la reacción, dos grupos de adaptadores hibridados se mezclaron a una relación de volumen de 1:1, para la preparación del complejo incorporado de transposasa.

3. Los componentes mostrados en el siguiente sistema (Tabla 2) se mezcló al soplar suavemente hacia arriba y hacia abajo durante 20 veces y luego se incubaron a 30°C durante 1 hora para incorporar el adaptador No.1 en la transposasa, obteniendo de esa manera el complejo incorporado de transposasa, que se almacenó a -20°C.

Tabla 2

Componente: Cantidad

Transposasa: 85 |jL

Adaptador No.1: 30 jL

5

10

15

Componente: Cantidad

Tampón de acoplamiento: 85 |jL

Total: 200 jL

4. 50 ng de ADN genómico con alta calidad se mezcló con el complejo incorporado de transposasa junto con otros componentes mostrados en la Tabla 3 al soplar gentilmente hacia arriba y hacia abajo durante 20 veces, seguido por incubación a 55°C durante 10 min y posteriormente enfriar a 4°C, de tal manera que se fragmentó el ADN genómico.

Tabla 3

Componente: Cantidad

Agua: 5 jL

5 x Tampón de fragmentación: 2 jL

ADNg (50 ng/jL): 1 jL

complejo incorporado de transposasa: 2 jL

Total: 10 jL

5. La purificación se realizó de acuerdo con los siguientes dos métodos:

Método 1: Los genomas fragmentados obtenidos anteriores primero se mezclaron con SDS en una concentración final de 0.04% a 0.1% para ser uniforme, luego se purificó con perlas Ampure XP en 1.3 pliegues;

Método 2: Los genomas fragmentados obtenidos anteriores primero se mezclaron con PBI (Kit de purificación de PCR Qiagen) en un pliegue en volumen para ser uniforme, luego se purificó con perlas Ampure XP en 1.3 pliegues;

Método 3 (sin purificación): Los genomas fragmentados obtenidos anteriores se agregaron con SDS en una concentración final de 0.04% a 0.1%, y se agregaron con 0.1% de Triton-X100 en la siguiente reacción enzimática.

6. El producto purificado obtenido en la etapa previa se incubó con los componentes mostrados en la Tabla 4 a 25°C durante 60 min para ligar el adaptador No.2.

Tabla 6

Componente: Cantidad

Agua: 8 jL

3 x Tampón de ligamiento: 20 jL

Adaptador No.2 (5 jM): 10 jL

Ligasa: 2 jL

ADN: 20 jL

Total: 30 jL

Nota: se muestran las secuencias del Adaptador No.2 como sigue:

Secuencia A del Adaptador No.2: AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGTC (SEQ ID NO: 3);

Secuencia B del Adaptador No.2: TTGGCCTCCGAC ddT (SEQ ID NO: 4, dd representa modificación didesoxi en el extremo 3').

7. El siguiente proceso se realizó:

Método 1 (purificación): la purificación se realizó con perlas Ampure XP en 1.3 pliegues;

Método 2 (sin purificación): 1% de Triton-X100 se complementó para la siguiente reacción de PCR.

8. 0.1%-2% de Triton-X100, preferiblemente 0.1% de Triton-X100 en esta realización, se mezcló con los siguientes componentes (Tabla 5), la mezcla obtenida se sometió a una primera amplificación de PCR bajo las condiciones mostradas en la Tabla 6. Los cebadores que contienen diferentes etiquetas se diseñaron para la captura de la región 5 (tag) directamente posterior a la purificación para mezclar los productos de PCR.

Tabla 5

Componente: Cantidad

ADN: 30 |jL

5 x tampón de PCR: 10 jL

dNTPs 10 mM: 1 jL

Cebadores etiquetados 18: 2 jL

Cebador 2: 2 jL

Enzima PCR: 1 jL

Agua pura: 4 jL

Total: 50 jL

Nota: Los cebadores etiquetados 1-8 se muestran como sigue, en los que las secuencias subrayadas representan secuencias tag (secuencias aleatorias):

10 Cebador etiquetado 1 (SEQ ID NO: 5): AGACAAGCTCGAGCTCACTGGTAAGAGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 2 (SEQ ID NO: 6): AGACAAGCTCGAGCTCAAGCTCCTGAGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 3 (SEQ ID NO: 7): AGACAAGCTCGAGCTCCTGGGGCTATGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 4 (SEQ ID NO: 8): AGACAAGCTCGAGCTCCCCAGTCAGGGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 5 (SEQ ID NO: 9): AGACAAGCTCGAGCTCGGATTTGGTTGCTTCGACTGGAGAC

15 Cebador etiquetado 6 (SEQ ID NO: 10): AGACAAGCTCGAGCTCTACTAATGGCGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 7 (SEQ ID NO: 11): AGACAAGCTCGAGCTCTTTTCATTTTGCTTCGACTGGAGAC Cebador etiquetado 8 (SEQ ID NO: 12): AGACAAGCTCGAGCTCCTGAGCTCCTGCTTCGACTGGAGAC Cebador 2 (SEQ ID NO: 13): TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT

Tabla 6

Temperatura: Tiempo ciclo

95°C: 30 min 1 ciclo

95°C: 10 sec 12 ciclos

56°C: 30 sec

72°C: 3 min

68°C: 10 min 1 ciclo

4°C: -

Después de la segunda PCR, 8 muestras que contienen diferentes etiquetas se mezclaron y luego se purificaron con perlas Ampure XP en 1.3 pliegues.

9. La muestra de 750 ng obtenida en la etapa previa se concentró en polvo seco. La mezcla de reacción 1 se preparó de acuerdo con las siguientes etapas:

(1) Formular la siguiente solución de reacción (Tabla 7):

Tabla 7

Componente: Cantidad

Secuencia de bloqueo #1 (Bloqueo SureSelect #1, Agilent Company): 2.5 |jL

Secuencia de bloqueo #2 (Bloqueo SureSelect #2, Agilent Company): 2.5 jL

Secuencia de bloqueo de cebador #1: 0.3 jL

Secuencia de bloqueo de cebador #2: 0.3 jL

Agua pura: 3.4 jL

Total: 9 jL

5

Nota:

Secuencia de bloqueo de cebador #1 (SEQ ID NO: 14):

5'-CTGTCTCTTATACACATCTGTC'TCCAGTCGAAGCCCGATCTTACCAGTTCGAGCT

TGTCT-.V;

Secuencia de bloqueo de cebador #2(SEQ ID NO: 15):

10 5'-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGA-3'.

La secuencia de bloqueo #1 y secuencia de bloqueo #2 eran secuencias de oligonucleótidos (Oligo) contenidas en un kit adquirido de Agilent Company, que se utilizó para bloquear algunas repeticiones en tándem en el genoma humano.

(2) La solución de reacción obtenida en (1) se mezcló con la muestra en polvo seco para obtener una mezcla de 15 reacción uniforme 1, que se incubó en el instrumento PCR a 95°C durante 5 min, y luego se mantuvo a 65°C.

(3) La mezcla de reacción 2 se formuló de acuerdo con la Tabla 8, luego se incubó en el instrumento PCR a 65°C durante por lo menos 5 min.

Tabla 8

Componente: Cantidad

Solución de hibridación #1 (SureSelect Hyb # 1, Agilent Company): 25 jL

Solución de hibridación #2 (SureSelect Hyb # 2, Agilent Company): 1 jL

Solución de hibridación #3 (SureSelect Hyb # 3, Agilent Company): 10 jL

Solución de hibridación #4 (SureSelect Hyb # 4, Agilent Company): 13 jL

Total: 49 jL

(4) La mezcla de reacción 3 se formuló de acuerdo con la Tabla 9, luego se incubó en el instrumento PCR a 65°C durante por lo menos 2 min.

Tabla 9

Componente: Cantidad

Solución de bloqueo de Rnasa (Bloqueo de Rnasa SureSelect, Agilent Company): 1 pL

Sonda de hibridación de biotina (Biblioteca de Captura Oligo SureSelect, Agilent Company): 5 pL

Agua pura: 1 pL

Total: 7 pL

Nota: La sonda de hibridación de biotina, también mencionada como la sonda para la secuencia de exones en otros lugares de la presente divulgación, se utilizó para capturar el fragmento de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones.

5 (5) Las mezclas de reacción 1-3 todas se mantuvieron a 65°C. Se agregó 13 pL de la mezcla de reacción 2 en la

mezcla de reacción 1 para obtener una mezcla uniforme, que luego se transfirió en la mezcla de reacción 3 para hibridación durante 24 horas después de sellado por película.

10. La muestra obtenida después de hibridación durante 24 horas se eluyó con perlas magnéticas M280 (es decir perlas magnéticas recubiertas con estreptomicina), luego se sometió a primera PCR sin aislar perlas magnéticas 10 M280 al utilizar los siguientes componentes (Tabla 10) y de acuerdo con las condiciones de reacción mostradas en

la Tabla 11, para amplificar el producto hasta una cantidad de 600 ng e introducir la biotina en el extremo cuando el adaptador No.2 se ubicó para la siguiente etapa de aislamiento de cadena sencilla.

Tabla 10

Componente: Cantidad

ADN: 120 pL

5 x Tampón de PCR: 40 pL

dNTPs 10 mM: 4 pL

cebador universal 1: 8 pL

Cebador 2 que contiene biotina: 8 pL

Enzima PCR: 4 pL

Agua pura: 16 pL

Total: 200 pL

15 Nota:

cebador universal 1: 5'-AGACAAGCTCGAGCTC-3' (SEQ ID NO:16);

Cebador 2 que contiene biotina: 5'-bio-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT-3' (SEQ ID NO:17).

Tabla 11

Temperatura: Tiempo ciclo

95°C: 30 min 1 ciclo

95°C: 10 sec 12 ciclos

56°C: 30 sec

72°C: 3 min

5

10

15

20

Temperatura: Tiempo ciclo

68°C: 10 min 1 ciclo

4°C: -

Después del PCR, el producto amplificado se purificó con perlas Ampure XP en 1.3 pliegues.

11. 600 ng de producto purificado se incubó con perlas magnéticas M280 recubiertas con estreptomicina durante 15 min, luego se lavaron dos veces sobre un separador magnético, finalmente se desnaturalizaron con 78 pL de solución de NaOH 0.1 M, después de lo cual la solución de NaOH se recicló y la solución de NaOH residual se neutralizó con 37.5 pL de tampón MOPS 0.3 M (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico, SIGMA).

12. Ciclización del ácido nucleico de cadena sencilla

Un sistema de reacción se formuló de acuerdo con la Tabla 12, y se incubó a 37°C durante 1.5 h.

Tabla 12

Componente: Cantidad

Secuencia “puente”: 20 pL

Agua pura: 178.3 pL

10 x tampón de ligamiento: 35 pL

ATP 100 mM: 3.5 pL

Ligasa: 1.2 pL

ADN de cadena sencilla reciclado en etapa previa: 112 pL

Total: 350 pL

Nota: Secuencia “puente”: 5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3' (SEQ ID NO: 18).

13. Digestión de ácidos nucleicos de cadena sencilla no ciclizados

Una mezcla se formuló de acuerdo con la Tabla 13, y luego se agregó en el sistema de reacción obtenido en la etapa previa después de centrifugación transitoria, seguido por incubación a 37°C durante 30 min.

Tabla 13

Componente: Cantidad

10 x tampón de ligamiento: 3.7 pL

20 U/pL de Exonucleasa I: 11.1 pL

100 U/pL de Exonucleasa III: 5.2 pL

Total: 20 pL

14. El producto (es decir ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla) obtenido después de digestión de los ácidos nucleicos de cadena sencilla no ciclizados se purificó con perlas Ampure XP en 1.8 pliegues. El producto purificado se secuenció cuando la solubilidad de los mismos se detectó para ser calificada. Se obtuvo 0.65 pmol de producto en esta realización, que es suficiente para hacer en nanoesferas de ADN la secuenciación del genoma completo. Una pequeña cantidad de producto purificado se tomó para detección electroforética. El resultado se muestra en la Figura 4, en la que el carril 1 indica que los ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla obtenidos en esta realización se muestran como una banda dispersa con un tamaño entre 600 y 800 nt como se esperaba, cumpliendo de esta manera el requisito para una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla.

5

10

15

20

25

30

Parámetro: Valor

Concentración: 1.62 ng/pL

Volumen: 40 pL

Cantidad total: 64.8 ng

Número de moles: 0.65 pmol

15. La anterior biblioteca se secuenció sobre el secuenciador CG, y los resultados de secuenciación se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15

Parámetro: Valor

Grado de cubierta: 98.6%

Número de SNP: 42000

Consistencia de datos dbSNP: 98.65%

Consistencia de genotipado: 99.97%

El diagrama que muestra la distribución de profundidad acumulativa de la cubierta de una sola base se muestra en la Figura 5. Los resultados anteriores indican que la biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla construida realización anterior de la presente divulgación se puede utilizar con éxito para la secuenciación y lograr resultados deseables.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BGI SHENZHEN CO., LIMITED

<120> MÉTODO PARA CONSTRUIR UNA BIBLIOTECA DE ÁCIDOS NUCLEICOS CÍCLICOS DE CADENA SENCILLA Y REACTIVOS DE LOS MISMOS

<130> P241699EP/CI

<140> EP14901597.6 con base en PCT/CN2014/088543

<141> 2014-10-14

<150> PCT/CN2014/086418

<151> 2014-09-12

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 34 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 1

gcttcgactg gagacagatg tgtataagag acag 34 <210> 2 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

<221> Modificación didesoxi en el extremo 3' <222> (19)..(19)

<400> 2

ctgtctctta tacacatct 19 <210> 3 <211> 22 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 3

agtcggaggc caagcggtcg tc 22 <210> 4 <211> 13 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<221> Modificación didesoxi en el extremo 3' <222> (13)..(13)

<400> 4

ttggcctccg act 13 <210> 5 <211> 41 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 5

agacaagctc gagctcactg gtaagagctt cgactggaga c 41 <210>6 <211> 41 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 6

agacaagctc gagctcaagc tcctgagctt cgactggaga c 41 <210>7 <211> 41 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 7

5

10

15

20

25

30

35

agacaagctc gagctcctgg ggctatgctt cgactggaga c 41 <210>8 <211> 41 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 8

agacaagctc gagctcccca gtcagggctt cgactggaga c 41 <210>9 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 9

agacaagctc gagctcggat ttggttgctt cgactggaga c 41 <210> 10 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 10

agacaagctc gagctctact aatggcgctt cgactggaga c 41 <210> 11 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 11

agacaagctc gagctctttt cattttgctt cgactggaga c 41 <210> 12 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 12

agacaagctc gagctcctga gctcctgctt cgactggaga c 41 <210> 13 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 13

tcctaagacc gcttggcctc cgact 25

5

10

15

20

25

30

<210> 14 <211> 60 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <400> 14

ctgtctctta tacacatctg tctccagtcg aagcccgatc ttaccagttc gagcttgtct 60 <210> 15 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 15

aagtcggagg ccaagcggtc ttagga 26 <210> 16 <211> 16 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 16

agacaagctc gagctc 16 <210> 17 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<221> marcador de biotina en el extremo 5'

<222> (1)..(1)

<400> 17

tcctaagacc gcttggcctc cgact 25 <210> 18 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <400> 18

tcgagcttgt cttcctaaga ccgc 24

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un método para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla, que comprende:

fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble con un complejo incorporado de transposasa, que comprende transposasas y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador;

ligar con ligasa un segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado en el espacio después de retirar la transposasa desde el sistema de reacción, el segundo adaptador tiene una secuencia diferente de aquella del cebador adaptador;

realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un cebador producto de PCR ligado con una primera secuencia de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo;

poner en contacto el cebador producto de PCR con un vehículo sólido que tiene un segundo marcador de afinidad, de tal manera que el cebador marcador de afinidad se combina con el segundo marcador de afinidad;

aislar los ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el cebador marcador de afinidad a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado con el vehículo sólido; y

ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla con una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente, realizar, antes de la primera reacción de PCR, una segunda reacción de PCR con un segundo par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un segundo producto de PCR ligado con la primera secuencia de adaptadores y la segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, que comprende adicionalmente una etapa posterior a la segunda reacción de PCR y antes de la primera reacción de PCR: capturar un ácido nucleico de cadena sencilla que contiene una secuencia de exones, utilizada para la primera reacción de PCR, desde el segundo producto de PCR con una sonda para la secuencia de exones, en la que la sonda para la secuencia de exones contiene el cebador marcador de afinidad y es capaz de combinarse con el segundo marcador de afinidad del vehículo sólido.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente, bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR con una secuencia de bloqueo de cebador, antes de capturar el ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones del segundo producto de PCR con la sonda para la secuencia de exones.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cebador marcador de afinidad es un marcador de biotina, y el segundo marcador de afinidad es un marcador de estreptavidina.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la transposasa se retira del sistema de reacción mediante purificación de perlas magnéticas, purificación de columna o tratamiento de reactivo químico.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vehículo sólido es de perlas magnéticas.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble con un complejo incorporado de transposasa, que comprende transposasa y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador;

ligar con ligasa un segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado en el espacio después de

retirar la transposasa desde el sistema de reacción, el segundo adaptador tiene una secuencia diferente de aquella

del cebador adaptador;

realizar una segunda reacción de PCR con un segundo par de cebadores que dirigen el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, para obtener un segundo producto de PCR ligado con una primera secuencia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

de adaptadores y una segunda secuencia de adaptadores respectivamente en dos extremos del mismo, en los que uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo;

bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo de la cadena sencilla del segundo producto de PCR con una secuencia de bloqueo de cebador;

capturar un ácido nucleico de cadena sencilla que contiene una secuencia de exones desde el segundo producto de PCR con una sonda para la secuencia de exones que contiene un marcador de biotina y capaz de combinarse con un marcador de estreptavidina del vehículo sólido;

realizar una primera reacción de PCR con un cebador par de cebadores que dirigen dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones respectivamente, para obtener un cebador producto de PCR ligado con diferentes secuencias de adaptadores respectivamente en dos extremos de las mismas, en las que uno del cebador par de cebadores contiene el marcador de biotina en el extremo 5' del mismo;

poner en contacto el cebador producto de PCR con el vehículo sólido que tiene un marcador de estreptavidina, de tal manera que el marcador de biotina se combina con el marcador de estreptavidina;

aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el marcador de biotina a través de la desnaturalización del cebador producto de PCR combinado con el vehículo sólido; y

ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina con una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla que es capaz de combinarse con los dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla sin el marcador de biotina.
10. Una combinación de reactivo para construir una biblioteca que contiene ácidos nucleicos cíclicos de cadena sencilla, que comprende:

un complejo incorporado de transposasa, formado con transposasa y un cebador adaptador que contiene una secuencia de reconocimiento de transposasa, y adecuada para fragmentar de forma aleatoria una muestra de ácido nucleico de cadena doble, para obtener ácidos nucleicos de cadena doble fragmentados unidos con el cebador adaptador en cada terminal del mismo, lo que resulta en un espacio entre cada extremo 3' y el cebador adaptador;

un componente, que comprende un segundo adaptador y ligasa, y adecuado para ligar el segundo adaptador al ácido nucleico de doble cadena fragmentado con ligasas en el espacio;

un cebador par de cebadores, utilizados en una primera reacción de PCR, y dirigir el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente, en el que uno del cebador par de cebadores contiene un cebador marcador de afinidad en el extremo 5' del mismo;

un vehículo sólido, que tiene un segundo marcador de afinidad, adecuado para combinarse con el cebador marcador de afinidad;

una solución de desnaturalización, adecuada para desnaturalizar un producto de PCR combinado con el vehículo sólido con el fin de aislar ácidos nucleicos de cadena sencilla sin el cebador marcador de afinidad;

una secuencia “puente” de ciclización de cadena sencilla, capaz de combinarse con dos extremos del ácido nucleico de cadena sencilla, y adecuada para ciclizar el ácido nucleico de cadena sencilla.
11. La combinación de reactivo de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende adicionalmente, un segundo par de cebadores, utilizados en una segunda reacción de PCR, y dirigir el cebador adaptador y el segundo adaptador respectivamente,

preferiblemente en el que uno del segundo par de cebadores contiene una secuencia de etiqueta de muestra en el extremo 5' del mismo.
12. La combinación de reactivo de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, que comprende adicionalmente, una sonda para una secuencia de exones, que tiene el cebador marcador de afinidad y capaz de combinarse con el segundo marcador de afinidad del vehículo sólido, adecuada para capturar ácidos nucleicos de cadena sencilla que contiene la secuencia de exones de un segundo producto de PCR; y

preferiblemente, en el que la combinación de reactivo comprende adicionalmente una secuencia de bloqueo de cebador, para bloquear una secuencia de cebadores ubicada en cada extremo del segundo producto de PCR.
13. La combinación de reactivo de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el cebador marcador de afinidad es un marcador de biotina, y el segundo marcador de afinidad es un marcador de estreptavidina.
14. La combinación de reactivo de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el vehículo sólido es de perlas magnéticas.