ES2933806T3

ES2933806T3 - Tagmentación que usa transposomas inmovilizados con enlazadores

Info

Publication number: ES2933806T3
Application number: ES18708547T
Authority: ES
Inventors: Grace Desantis; Stephen M Gross; jian-sen Li; Natalie Morrell; Andrew Slatter; Kevin Shen; Samantha Snow
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2023-02-14
Anticipated expiration: 2038-02-20
Also published as: WO2018156519A1; CN109415758A; DK3452621T3; KR102607830B1; SG11201810639RA; US10920219B2; US11708573B2; CN115927538A; US20210139887A1; BR112018076259A2; JP2020510401A; EP3783112A1; CA3026206A1; RU2018140894A3; MX2022005777A; EP3452621A1; JP7164276B2; IL263118B2; IL303805B1; IL263118B1

Abstract

La presente descripción se refiere a métodos, composiciones y kits para tratar ácidos nucleicos diana, incluidos métodos y composiciones para fragmentar y marcar ácidos nucleicos (p. ej., ADN) utilizando complejos de transposomas unidos a un soporte sólido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tagmentación que usa transposomas inmovilizados con enlazadores

Referencia a cualquier solicitud prioritaria

La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud provisional de patente de EE.UU. N.° 62/461.620, presentada el 21 de febrero de 2017.

Referencia al listado de secuencias

La presente descripción incluye un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado ILLINC-398WO_Sequence_Listing.txt, creado el 20 de febrero de 2017, que tiene un tamaño aproximado de 7 KB.

Antecedentes

Campo

La presente descripción se refiere a métodos, composiciones y kits para tratar ácidos nucleicos, que incluyen métodos y composiciones para fragmentar y marcar ácidos nucleicos (p. ej., ADN) usando complejos de transposomas inmovilizados en un soporte sólido.

Los protocolos actuales para la secuenciación de nueva generación (NGS, next generation sequencing) de muestras de ácido nucleico emplean de forma rutinaria un proceso de preparación de muestras que convierte el ADN o el ARN en una biblioteca de moldes fragmentados y secuenciables. Los métodos de preparación de muestras a menudo requieren múltiples etapas y transferencias de material, e instrumentos costosos para efectuar la fragmentación y, por lo tanto, a menudo son difíciles, tediosos, costosos e ineficaces.

En un enfoque, las bibliotecas de fragmentos de ácido nucleico se pueden preparar usando un método basado en transposomas donde dos secuencias finales de transposones, una unida a una secuencia marcadora y una transposasa forman un complejo de transposoma. Los complejos de transposoma se usan para fragmentar y marcar ácidos nucleicos diana en solución para generar una biblioteca tagmentada lista para secuenciar. Los complejos de transposoma se pueden inmovilizar sobre una superficie sólida, como a través de una biotina unida al extremo 5' de una de las dos secuencias finales. El uso de transposomas inmovilizados proporciona ventajas significativas sobre los enfoques de fase de solución reduciendo el tiempo práctico y global de preparación de la biblioteca, el costo y los requisitos de reactivos, disminuyendo los requisitos de entrada de muestras y permitiendo el uso de muestras sin purificar o degradadas como punto de partida para la preparación de la biblioteca. Los procedimientos y sistemas de transposición ejemplares para la inmovilización de transposomas sobre una superficie sólida para dar como resultado un tamaño de fragmento uniforme y un rendimiento de la biblioteca se describen en detalle en WO2014/108810, WO2016/189331, WO2016/061517A2, EP2712931A1, EP2527438A1 y WO2016/003814A1.

En ciertos métodos de tagmentación (marcaje y fragmentación) basados en perlas descritos en la Publ. PCT N.° WO2016/189331 y US 2014/093916A1, los transposomas se unen a perlas magnéticas mediante interacciones biotina-estreptavidina. Durante la etapa posterior de amplificación por PCR del protocolo, los enlaces biotinaestreptavidina se rompen por desnaturalización térmica, liberando así el producto de tagmentación biotinilado en la solución. Los amplicones con secuencias de interés, o amplicones diana, se pueden enriquecer, si se desea, por ejemplo, mediante captura por hibridación y secuenciarse.

Sin embargo, cuando las bibliotecas preparadas por tagmentación que usan transposomas inmovilizados se enriquecen para ciertas regiones del genoma usando métodos comunes de captura de hibridación, se puede lograr un enriquecimiento de lectura más bajo para ciertas regiones del genoma, en comparación con, por ejemplo, el enriquecimiento de bibliotecas generadas usando soluciones basadas en enfoques de transposomas.

Además, la estabilidad de los complejos de transposoma unidos al soporte varía dependiendo del constructo enlazador usado para conectar el complejo de transposoma al soporte. Si se eliminan complejos del soporte durante el almacenamiento o durante la preparación de la biblioteca, se ven afectadas la calidad y la eficacia de la biblioteca resultante. Por lo tanto, existe la necesidad de complejos de transposoma inmovilizados con estabilidad mejorada y métodos asociados que demuestren una eficacia mejorada de la producción de bibliotecas tagmentadas y, posteriormente, un mayor enriquecimiento de lectura para las bibliotecas resultantes. También existe la necesidad de composiciones y métodos que mejoren el enriquecimiento de lectura para las bibliotecas resultantes.

La presente descripción se refiere a complejos de transposoma unidos a un soporte con enlazadores modificados y disposiciones de componentes. La presente descripción proporciona métodos y composiciones para producir bibliotecas de ácidos nucleicos listas para la secuenciación usando dichos complejos modificados.

Compendio

La presente descripción se refiere a métodos, composiciones y kits para tratar ácidos nucleicos, que incluyen métodos y composiciones para fragmentar y marcar ADN usando complejos de transposoma en un soporte sólido.

La presente invención se refiere a un complejo de transposoma que comprende una transposasa, un primer transposón y un segundo transposón, en donde el primer transposón comprende (a) una porción 3' que comprende una secuencia final del primer transposón y (b) una primera secuencia adaptadora en el extremo 5’ de la secuencia final del primer transposón, y el segundo transposón comprende una secuencia final del segundo transposón complementaria a al menos una porción de la secuencia final del primer transposón; dicho complejo de transposoma comprende además un enlazador unido al segundo transposón y comprende un elemento de afinidad, en donde el enlazador está unido al segundo transposón en el extremo 3' del segundo transposón. Normalmente, la secuencia final del primer transposón y la secuencia final del segundo transposón se hibridan juntas, formando una secuencia final del transposón de doble cadena que es reconocida por una transposasa, cuya combinación forma un complejo de transposoma funcional.

En algunos aspectos, el complejo de transposoma comprende un enlazador escindible que es capaz de conectar el primer transposón (y por tanto el complejo) al soporte sólido. En tales aspectos, un primer extremo de un enlazador escindible se une al extremo 5' de la primera secuencia adaptadora. Opcionalmente, un segundo extremo del enlazador escindible se une a un elemento de afinidad. El elemento de afinidad es capaz de unirse (de forma covalente o no covalente) a una pareja de unión por afinidad en un soporte sólido. En algunos aspectos, el elemento de afinidad se une (covalente o no covalentemente) a una pareja de unión por afinidad en el soporte sólido, lo que proporciona un complejo de transposoma unido al soporte sólido. Estos complejos son complejos de transposoma con enlazador 5' y complejos con transposoma de enlazador 5' unidos a un soporte sólido.

En otros aspectos, el complejo de transposoma comprende un enlazador 3' que es capaz de conectar el segundo transposón (y por tanto el complejo) al soporte sólido. En tales aspectos, un primer extremo del enlazador se une al extremo 3' del segundo transposón y un segundo extremo del enlazador se une a un elemento de afinidad. El elemento de afinidad es capaz de unirse (de forma covalente o no covalente) a una pareja de unión por afinidad en un soporte sólido. En algunos aspectos, el elemento de afinidad se une (covalente o no covalentemente) a una pareja de unión por afinidad en el soporte sólido, lo que proporciona un complejo de transposoma unido al soporte sólido. En algunos aspectos, el enlazador es un enlazador escindible. Estos complejos son complejos de transposoma con enlazador 3' y complejos de transposoma con enlazador 3' unidos a un soporte sólido.

En algunos aspectos, la presente descripción se refiere a oligonucleótidos modificados. En algunos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende un primer transposón y un segundo transposón, en donde el primer transposón comprende (a) una porción 3' que comprende una secuencia final del primer transposón y (b) una primera secuencia adaptadora en el extremo 5' de la secuencia final del primer transposón, y el segundo transposón comprende una secuencia final del segundo transposón complementaria a al menos una porción de la secuencia final del primer transposón, e hibridada con esta, y en donde un primer extremo de un enlazador escindible está unido al extremo 5' de la secuencia del primer adaptador y, en algunos aspectos, un segundo extremo del enlazador escindible se une a un elemento de afinidad.

La presente invención también se refiere a un oligonucleótido modificado que comprende un primer transposón y un segundo transposón, en donde el primer transposón comprende (a) una porción 3' que comprende una secuencia final del primer transposón y (b) una primera secuencia adaptadora en el extremo 5' de la secuencia final del primer transposón, y el segundo transposón comprende una secuencia final del segundo transposón complementaria a al menos una porción de la secuencia final del primer transposón, e hibridada con esta, y en donde un primer extremo de un enlazador está unido al extremo 3' del segundo transposón y un segundo extremo del enlazador está unido a un elemento de afinidad. En algunos aspectos, el enlazador es un enlazador escindible.

En algunas realizaciones del complejo de transposoma con enlazador 3', el elemento de afinidad y el enlazador tienen una estructura de Fórmula (I), (I'), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b)), o (I(c)) como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, el elemento de afinidad está unido covalentemente al extremo 3' del segundo transposón, en donde el elemento de afinidad y el enlazador tienen una estructura de Fórmula (I):

en donde:

AE es un elemento de afinidad;

Y es alquileno C2-6;

X1 es O, NR1, o S;

en donde R1 es H o alquilo C1-10;

n es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5 y 6;

X2 es O, CH2, o S;

Ra es H u -OH; y

Z está ausente cuando Ra es H, o es CH2 cuando Ra es H u OH;

en donde •««« marca el punto de conexión con el segundo transposón.

En algunos aspectos, el enlazador descrito en la presente memoria es un enlazador 5', donde el grupo fosfato en la Fórmula (I) es un grupo fosfato terminal en la posición 5' del nucleótido terminal del primer transposón. En algunos aspectos, el enlazador descrito en la presente memoria es un enlazador 3'. Opcionalmente, el grupo fosfato en la Fórmula (I) está conectado a un hidroxilo 3' del nucleótido terminal del segundo oligonucleótido transposón.

La invención también se refiere a un método para generar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico marcados a partir de un ácido nucleico diana bicatenario, que comprende incubar el ácido nucleico diana con un complejo de transposoma unido a un soporte sólido como se describe en la presente memoria. Los métodos comprenden el tratamiento de la diana con el complejo de transposoma inmovilizado en condiciones en donde la diana se fragmenta en una pluralidad de fragmentos diana y el extremo 3' del primer transposón se une a los extremos 5' de los fragmentos diana para producir una pluralidad de fragmentos diana marcados en 5'.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la amplificación de uno o más de los fragmentos diana marcados en 5'. En algunos aspectos, los métodos comprenden además la secuenciación de uno o más de los fragmentos diana marcados en 5' o productos de amplificación de estos.

Por lo tanto, algunos aspectos adicionales de la presente descripción se refieren a un método para generar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico marcados, que comprende:

proporcionar un soporte sólido que comprende un complejo de transposoma descrito en la presente memoria inmovilizado sobre el mismo; y

poner en contacto el soporte sólido con un ácido nucleico diana bicatenario en condiciones suficientes para fragmentar el ácido nucleico diana en una pluralidad de fragmentos diana, y para unir el extremo 3' del primer transposón a los extremos 5' de los fragmentos diana para proporcionar una pluralidad de fragmentos diana marcados en 5'.

En algunos aspectos, el método comprende además amplificar los fragmentos diana marcados en 5'.

En algunos aspectos, la descripción proporciona una biblioteca de fragmentos diana marcados en 5' producidos por los métodos descritos en la presente memoria.

La presente invención también se refiere a un método para preparar un complejo de transposoma unido a un soporte sólido que comprende tratar una transposasa con el oligonucleótido modificado como se describe en la presente memoria en condiciones suficientes para unir la transposasa y el oligonucleótido modificado en un complejo de transposoma.

En algunas realizaciones de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, los complejos de transposoma comprenden dos poblaciones, en donde las primeras secuencias adaptadoras de cada población son diferentes.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra etapas ejemplares de un método para fijar un aspecto de un complejo de transposoma a la superficie de una perla.

La FIG. 2 ilustra un diagrama esquemático de un proceso de tagmentación ejemplar en una superficie de perla a través de la formación de grupos en una célula de flujo.

La FIG. 3 muestra etapas ejemplares del método de fragmentación y marcaje de ADN usando complejos de transposoma inmovilizados en una superficie de perla seguido de enriquecimiento de la diana que da lugar a contaminación de las lecturas fuera de la diana.

La FIG. 4 muestra etapas ejemplares del método de fragmentación y marcaje de ADN usando complejos de transposoma inmovilizados en una superficie de perla que usa un enlazador escindible enzimáticamente seguido de enriquecimiento de la diana.

La FIG. 5A muestra un ejemplo de un extremo 5' biotinilado de una secuencia de transposón unido a una superficie sólida para la tagmentación y posterior amplificación.

La FIG. 5B muestra un ejemplo de un extremo 3' biotinilado de una secuencia de transposón unido a una superficie sólida para la tagmentación y posterior amplificación.

La FIG. 6A compara el rendimiento de la biblioteca a partir de la tagmentación en fase sólida basada en perlas de estreptavidina usando complejos de transposoma que tienen dos enlazadores biotinilados en 3' diferentes.

La FIG. 6B demuestra los datos de estabilidad acelerada de la biblioteca de muestras preparada a partir de la tagmentación en fase sólida basada en perlas de estreptavidina que usa un complejo de transposoma que tiene un enlazador biotinilado en 3' de Fórmula (I(a)) después de un envejecimiento de 4 meses, en comparación con una biblioteca de muestras preparada a partir de un lote no envejecido del mismo complejo (control).

La FIG. 6C demuestra los datos de estabilidad acelerada de la biblioteca de muestras preparada a partir de un complejo de transposoma que tiene un enlazador biotinilado en 3' de Fórmula (I(c)) después de un envejecimiento de 4 meses y 8 meses, en comparación con bibliotecas de muestras preparadas a partir de complejos no envejecidas (controles ).

La FIG. 7A demuestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de ADN en función de la densidad del complejo que usa la preparación de la biblioteca en fase sólida basada en perlas de estreptavidina donde las perlas comprenden un complejo de transposoma inmovilizado unido a estas a través de un enlazador biotinilado en 3'.

La FIG. 7B es un gráfico de líneas que muestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de ADN en función de la condición SPRI que usa perlas de estreptavidina con un complejo de transposoma inmovilizado que comprende una transposasa Tn5 hiperactiva y un enlazador biotinilado en 3', y una densidad de complejo de 100 nM.

La FIG. 7C es un gráfico de líneas que muestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de ADN en función de la condición SPRI que usa perlas de estreptavidina con un complejo de transposoma inmovilizado que comprende una transposasa Tn5 hiperactiva y un enlazador biotinilado en 3', y una densidad de complejo de 600 nM.

Descripción detallada

Las bibliotecas de ácidos nucleicos fragmentados se crean a menudo a partir de ácidos nucleicos genómicos para su uso en aplicaciones de secuenciación de nueva generación (NGS). La presente descripción proporciona métodos, composiciones y kits para un método de preparación de bibliotecas transposicionales inmovilizadas. El método de preparación de bibliotecas transposicionales inmovilizadas es rápido en comparación con otros métodos de preparación de bibliotecas y es eficaz para preparar bibliotecas a partir de muestras crudas o no purificadas (como sangre, esputo, extractos celulares y similares) y muestras purificadas (como ácidos nucleicos genómicos purificados). Generalmente, un transposoma se inmoviliza sobre un sustrato, como un portaobjetos o una perla, usando parejas de unión covalentes o no covalentes, p. ej., un elemento de afinidad y una pareja de unión de afinidad (FIG. 1). Por ejemplo, un complejo de transposoma se inmoviliza en una perla recubierta de estreptavidina a través de un enlazador biotinilado unido al complejo de transposoma. Los ácidos nucleicos diana son capturados por el complejo de transposoma inmovilizado y los ácidos nucleicos se fragmentan y marcan ("tagmentación"). Se amplifican los fragmentos marcados, se capturan opcionalmente los amplicones de interés (p. ej., a través de sondas de hibridación) y se secuencian los fragmentos marcados.

El uso de complejos de transposoma unidos a un soporte sólido para la preparación de bibliotecas reduce la necesidad de normalizar la entrada de la muestra en el proceso de preparación de la biblioteca y de normalizar la salida de la biblioteca antes de las etapas de enriquecimiento o secuenciación. El uso de estos complejos también produce bibliotecas con tamaños de insertos más uniformes en relación con los métodos en fase de solución, incluso cuando se usan concentraciones de entrada de muestras variables. Sin embargo, se observó que ciertos complejos de transposoma con enlazadores biotinilados tenían una estabilidad reducida. Además, ciertas configuraciones de complejos unidos al soporte producen productos fuera del objetivo; en particular, la hibridación y la captura de amplicones de fragmentos diana marcados en 5' pueden estar contaminadas por fragmentos de ácidos nucleicos que todavía están hibridados con ácidos nucleicos inmovilizados (FIG. 3). Esta ineficacia puede dar como resultado el desperdicio de reactivos e instrumentos de secuenciación o espacio de célula de flujo con fragmentos y datos de secuenciación fuera del objetivo. La presente solicitud describe varios diseños de complejos de transposoma para abordar los problemas de calidad de la biblioteca y reducir la captura fuera del objetivo, y complejos con enlazadores modificados que demuestran una estabilidad química mejorada.

En algunos aspectos, las bibliotecas de ácidos nucleicos obtenidas mediante los métodos descritos en la presente memoria se pueden secuenciar usando cualquier plataforma de secuenciación de ácidos nucleicos adecuada para determinar la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia diana. En algunos aspectos, las secuencias de interés se correlacionan o asocian con uno o más trastornos congénitos o hereditarios, patogenicidad, resistencia a antibióticos o modificaciones genéticas. La secuenciación se puede usar para determinar la secuencia de ácido nucleico de una repetición corta en tándem, un polimorfismo de un solo nucleótido, un gen, un exón, una región codificadora, un exoma o una porción de este. Como tales, los métodos y composiciones descritos en la presente memoria se relacionan con la creación de bibliotecas secuenciables útiles en, pero no se limitan a, diagnóstico, pronóstico y terapia de cáncer y enfermedades, aplicaciones de huellas de ADN (p. ej., banco de datos de ADN, trabajo de casos penales), investigación y descubrimiento metagenómico, aplicaciones agrogenómicas e identificación y monitorización de patógenos.

Se puede minimizar el número de etapas necesarias para transformar un ácido nucleico diana, como el ADN, en moldes modificados con adaptador listos para la secuenciación de nueva generación mediante el uso de fragmentación y marcaje mediado por transposasa. Este proceso, denominado en la presente memoria "tagmentación", a menudo implica la modificación de un ácido nucleico diana por un complejo de transposoma que comprende una enzima transposasa acomplejada con un par de transposones que comprende una secuencia adaptadora monocatenaria y una región de secuencia final del transposón bicatenario, junto con secuencias adicionales opcionales diseñadas para un propósito particular. La tagmentación da como resultado la fragmentación simultánea del ácido nucleico diana y la ligación de los adaptadores a los extremos 5' de ambas cadenas de fragmentos de ácido nucleico dúplex. Los fragmentos resultantes se unen al soporte sólido donde están unidos los complejos de transposoma al soporte después de la reacción de tagmentación (ya sea directamente en el caso de los complejos de transposoma unidos en 5', o mediante hibridación en el caso de los complejos de transposoma unidos en 3').

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica. En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para un término en la presente memoria, prevalecerán las de esta sección a menos que se indique lo contrario. Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique lo contrario, se emplean métodos convencionales de espectroscopia de masas, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología. El uso de "o" o "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas, tales como "incluir", "incluye" e "incluido" no son limitativas. Como se usa en esta memoria descriptiva, ya sea en una frase de transición o en el cuerpo de la reivindicación, los términos "comprende(n)" y "que comprende(n)" se deben interpretar con un significado abierto. Es decir, los términos se deben interpretar como sinónimos de las frases "que tiene al menos" o "que incluye al menos". Cuando se usa en el contexto de un proceso, el término "que comprende" significa que el proceso incluye al menos las etapas enumeradas, pero puede incluir etapas adicionales. Cuando se usa en el contexto de un compuesto, composición 0 dispositivo, el término "que comprende" significa que el compuesto, composición o dispositivo incluye al menos las características o componentes enumerados, pero también puede incluir características o componentes adicionales.

Los encabezados de las secciones que se usan en la presente memoria tienen únicamente fines organizativos y no se deben interpretar como una limitación del tema descrito.

Terminología Química

Como se usa en la presente memoria, "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que está completamente saturada (es decir, no contiene enlaces dobles o triples). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que aparezca en la presente memoria, un intervalo numérico como "1 a 20" se refiere a cada número entero en el intervalo dado; p. ej., "1 a 20 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta 20 átomos de carbono inclusive, aunque la presente definición también abarca la aparición del término "alquilo" donde no se designa un intervalo numérico). El grupo alquilo también puede ser un alquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo alquilo también podría ser un alquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo se puede designar como "alquilo C1-4" o denominaciones similares. Sólo a modo de ejemplo, "alquilo C1-6" indica que hay de uno a seis átomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, y t-butilo. Los grupos alquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.

Como se usa en la presente memoria, "alcoxi" se refiere a la fórmula -OR en donde R es un alquilo como se definió anteriormente, como "alcoxi C1-9", que incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metiletoxi (isopropoxi), n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi y terc-butoxi, y similares.

Como se usa en la presente memoria, "arilo" se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos de carbono adyacentes) que contienen solo carbono en el esqueleto del anillo. Cuando el arilo es un sistema de anillos, todos los anillos del sistema son aromáticos. El grupo arilo puede tener de 6 a 18 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término "arilo" donde no se designa intervalo numérico. En algunos aspectos, el grupo arilo tiene de 6 a 10 átomos de carbono. El grupo arilo se puede designar como "arilo C6-10", "arilo C6 o C10", o designaciones similares. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, azulenilo y antracenilo.

Un "aralquilo" o "arilalquilo" es un grupo arilo conectado, como un sustituyente, a través de un grupo alquileno, como "aralquilo C7-14" y similares, que incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletilo, 3-fenilpropilo y naftilalquilo. En algunos casos, el grupo alquileno es un grupo alquileno inferior (es decir, un grupo alquileno C1-6).

Como se usa en la presente memoria, "carbociclilo" significa un anillo o sistema de anillos cíclicos no aromáticos que contiene solo átomos de carbono en el esqueleto del sistema de anillos. Cuando el carbociclilo es un sistema de anillos, se pueden unir dos o más anillos de forma fusionada, puenteada o espiroconectada. Los carbociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en un sistema de anillos no sea aromático. Por lo tanto, los carbociclilos incluyen cicloalquilos, cicloalquenilos y cicloalquinilos. El grupo carbociclilo puede tener de 3 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término "carbociclilo" donde no se designa intervalo numérico. El grupo carbociclilo también puede ser un carbociclilo de tamaño mediano que tiene de 3 a 10 átomos de carbono. El grupo carbociclilo también podría ser un carbociclilo que tenga de 3 a 6 átomos de carbono. El grupo carbociclilo se puede designar como "carbociclilo C3-6" o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de carbociclilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 2,3-dihidro-indeno, biciclo[2.2.2]octanilo, adamantilo y espiro[4.4]nonanilo.

Como se usa en la presente memoria, "Ca a Cb" o "Ca-b", en los que "a" y "b" son números enteros, se refieren al número de átomos de carbono en el grupo especificado. Es decir, el grupo puede contener desde "a" hasta "b", inclusive, átomos de carbono. Así, por ejemplo, un grupo "alquilo C1 a C4" o "alquilo C1-4" se refiere a todos los grupos alquilo que tienen de 1 a 4 carbonos, es decir, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- y (CH3)3C-.

Como se usa en la presente memoria, el término "anclado covalentemente" o "unido covalentemente" se refiere a la formación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, un recubrimiento de polímero anclado covalentemente se refiere a un recubrimiento de polímero que forma enlaces químicos con una superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con el anclaje a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, adhesión o interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que se anclen covalentemente a una superficie también se puedan unir por medio, además de la unión covalente, por ejemplo, de adsorción física.

El término "halógeno" o "halo", como se usa en la presente memoria, significa cualquiera de los átomos radioestables de la columna 7 de la Tabla Periódica de los Elementos, p. ej., flúor, cloro, bromo o yodo, siendo preferidos flúor y cloro.

Como se usa en la presente memoria, "heteroarilo" se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos adyacentes) que contienen uno o más heteroátomos, es decir, un elemento distinto del carbono, que incluye pero no se limitan a, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el esqueleto del anillo. Cuando el heteroarilo es un sistema de anillos, todos los anillos del sistema son aromáticos. El grupo heteroarilo puede tener de 5 a 18 miembros en el anillo (es decir, el número de átomos que forman el esqueleto del anillo, que incluye los átomos de carbono y los heteroátomos), aunque la presente definición también abarca la aparición del término "heteroarilo" donde no se designa un intervalo numérico. En algunos aspectos, el grupo heteroarilo tiene de 5 a 10 miembros en el anillo o de 5 a 7 miembros en el anillo. El grupo heteroarilo se puede designar como "heteroarilo de 5 a 7 miembros", "heteroarilo de 5 a 10 miembros" o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, furilo, tienilo, ftalazinilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, indolilo, isoindolilo y benzotienilo.

Como se usa en la presente memoria, "heterociclilo" significa un anillo o sistema de anillos cíclico no aromáticos que contiene al menos un heteroátomo en el esqueleto del anillo. Los heterociclilos se pueden unir entre sí de forma fusionada, puenteada o espiroconectada. Los heterociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en el sistema de anillos no sea aromático. El o los heteroátomos pueden estar presentes en un anillo aromático o no aromático en el sistema de anillos. El grupo heterociclilo puede tener de 3 a 20 miembros en el anillo (es decir, el número de átomos que forman el esqueleto del anillo, incluidos los átomos de carbono y los heteroátomos), aunque la presente definición también abarca la aparición del término "heterociclilo" donde no se designa un intervalo numérico. El grupo heterociclilo también puede ser un heterociclilo de tamaño mediano que tenga de 3 a 10 miembros en el anillo. El grupo heterociclilo también podría ser un heterociclilo que tenga de 3 a 6 miembros en el anillo. El grupo heterociclilo se puede designar como "heterociclilo de 3-6 miembros" o designaciones similares. En los heterociclilos monocíclicos de seis miembros preferidos, el(los) heteroátomo(s) se selecciona(n) de uno a tres de O, N o S, y en los heterociclilos monocíclicos de cinco miembros preferidos, el(los) heteroátomo(s) se selecciona(n) de uno o dos heteroátomos seleccionados de O, N o S. Los ejemplos de anillos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, azepinilo, acridinilo, carbazolilo, cinolinilo, dioxolanilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, morfolinilo, oxiranilo, oxepanilo, tiepanilo, piperidinilo, piperazinilo, dioxopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolidonilo, pirrolidionilo , 4-piperidonilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, 1,3-dioxinilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxinilo, 1,4-dioxanilo, 1,3-oxatianilo, 1,4-oxatiinilo, 1,4-oxatianilo, 2H-1,2-oxazinilo, trioxanilo, hexahidro-1,3,5-triazinilo, 1,3-dioxolilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-ditiolilo, 1,3-ditiolanilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, oxazolidinonilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, 1,3-oxatiolanilo, indolinilo, isoindolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidro-1,4-tiazinilo, tiamorfolinilo, dihidro-benzofuranilo, bencimidazolidinilo y tetrahidroquinolina.

Como se usa en la presente memoria, un grupo sustituido se deriva del grupo original no sustituido en el que ha habido un intercambio de uno o más átomos de hidrógeno por otro átomo o grupo. A menos que se indique lo contrario, cuando se considera que un grupo está "sustituido", se entiende que el grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), C3-C7-carbociclilo-C1-C6-alquilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclil-C1-C6-alquilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), aril(Ci-C6)alquilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo Ci-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroaril(C1-C6)alquilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6, C1-C6 alcoxi(C1-C6)alquilo (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), halo(C1-C6)alquilo (p. ej., -CF3), halo(C1-C6)alcoxi (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6, ariltio, amino, amino(C1-C6)alquilo, nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O). Siempre que un grupo se describa como "opcionalmente sustituido", ese grupo puede estar sustituido con los sustituyentes anteriores.

En algunos aspectos, los complejos de transposoma se inmovilizan en un soporte a través de uno o más polinucleótidos (p. ej., oligonucleótidos), como un polinucleótido (oligonucleótido) que comprende una secuencia final de transposón. En algunos aspectos, el complejo de transposoma se puede inmovilizar a través de un enlazador adjunto al final de una secuencia de transposón, por ejemplo, acoplando la enzima transposasa al soporte sólido. En algunos aspectos, tanto la enzima transposasa como el polinucleótido transposón (p. ej., el oligonucleótido) se inmovilizan en el soporte sólido. Cuando se hace referencia a la inmovilización de moléculas (p. ej., ácidos nucleicos, enzimas) en un soporte sólido, los términos "inmovilizado", "fijado" y "unido" se usan indistintamente en la presente memoria y se pretende que ambos términos abarquen unión directa o indirecta, covalente o no-covalente, a menos que se indique lo contrario, ya sea explícitamente o por contexto. En ciertos aspectos de la presente descripción, se puede preferir la unión covalente, pero generalmente todo lo que se requiere es que las moléculas (p. ej., ácidos nucleicos, enzimas) permanezcan inmovilizadas o unidas al soporte en las condiciones en las que se pretende usar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieren amplificación y/o secuenciación de ácidos nucleicos. En algunos casos, en la tagmentación basada en perlas, los transposomas se pueden unir a la superficie de una perla a través de un par de ligandos, p. ej., un elemento de afinidad y una pareja de unión por afinidad.

Transposomas y Transposasas

La tecnología basada en transposones se puede utilizar para fragmentar el ADN, por ejemplo, como se ejemplifica en el flujo de trabajo de los kits de preparación de muestras de ADN NEXTERA™ XT y FLEX (Illumina, Inc.), en donde los ácidos nucleicos diana, como el ADN genómico, se tratan con complejos de transposoma que fragmentan y marcan simultáneamente ("tagmentación") la diana, creando así una población de moléculas de ácido nucleico fragmentado marcadas con secuencias adaptadoras únicas en los extremos de los fragmentos.

Una reacción de transposición es una reacción en donde se insertan uno o más transposones en los ácidos nucleicos diana en sitios aleatorios o casi aleatorios. Los componentes en una reacción de transposición incluyen una transposasa (u otra enzima capaz de fragmentar y marcar un ácido nucleico como se describe en la presente memoria, como una integrasa) y un elemento de transposón que incluye una secuencia final de transposón de doble cadena que se une a la enzima, y un secuencia adaptadora unida a una de las dos secuencias finales del transposón. Una cadena de la secuencia final del transposón de doble cadena se transfiere a una cadena del ácido nucleico diana y no lo es la cadena de la secuencia final del transposón complementaria (es decir, una secuencia de transposón no transferida). La secuencia adaptadora puede comprender una o más secuencias funcionales (p. ej., secuencias de cebadores) según sea necesario o deseado.

Un "complejo de transposoma" está compuesto por al menos una enzima transposasa y una secuencia de reconocimiento del transposón. En algunos de estos sistemas, la transposasa se une a una secuencia de reconocimiento del transposón para formar un complejo funcional que es capaz de catalizar una reacción de transposición. En algunos aspectos, la secuencia de reconocimiento del transposón es una secuencia final de transposón de doble cadena. La transposasa, o integrasa, se une a un sitio de reconocimiento de transposasa en un ácido nucleico diana e inserta la secuencia de reconocimiento del transposón en un ácido nucleico diana. En algunos de estos eventos de inserción, una cadena de la secuencia de reconocimiento del transposón (o secuencia final) se transfiere al ácido nucleico diana, lo que también da como resultado un evento de escisión. Los procedimientos y sistemas de transposición ejemplares que se pueden adaptar fácilmente para su uso con las transposasas de la presente descripción se describen, por ejemplo, en la Publ. PCT N.° WO10/048605, la Publ. de Pat. de EE.UU. N.° 2012/0301925, la Publ. de Pat. de EE.UU. N.° 2012/13470087, o la Publ. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0143774.

Las transposasas ejemplares que se pueden usar con ciertos aspectos proporcionados en la presente memoria incluyen (o están codificadas por): transposasa Tn5 (véase Reznikoff y cols., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 266, 729-734), Vibrio harveyi (transposasa caracterizada por Agilent y usada en el producto SureSelect QXT), transposasa MuA y un sitio de reconocimiento de transposasa Mu que comprende secuencias finales R1 y R2 (Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, y cols., EMBO J., 14: 4893 , 1995), Tn552 de Staphylococcus aureus (Colegio, O. y cols., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001; Kirby, C. y cols ., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002), Ty1 (Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994 y la Publ. de PCT N.° WO95/23875), Tn7 transposón (Craig, N.L., Science, 271: 1512, 1996; Craig, NL, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204: 27-48, 1996), Tn/O e IS10 (Kleckner N. y cols., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204: 49-82, 1996), transposasa Mariner (Lampe, D. J. y cols., EM^bO J., 15: 5470 9, 1996), Tc1 (Plasterk, R.H., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996), Elemento P (Gloor, G.B., Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa & Ohtsubo, J. Biol. Chem., 265: 18829-32, 1990), secuencias de inserción bacterianas (Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Inmunol. 204: 1-26, 1996), retrovirus (Brown y cols., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 86: 2525-9, 1989), y retrotransposón de levadura (Boeke & Corees, Ann. Rev. Microbio!. 43: 403-34, 1989). Más ejemplos incluyen IS5, Tn10, Tn903, IS911 y versiones diseñadas de enzimas de la familia transposasa (Zhang y cols., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub Oct. 16; Wilson C. y cols. (2007) J. Microbiol. Methods 71: 332 5). Los métodos descritos en la presente memoria también podrían incluir combinaciones de transposasas, y no solo una única transposasa.

En algunos aspectos, la transposasa es una transposasa Tn5, MuA o Vibrio harveyi, o un mutante activo de estas. En otros aspectos, la transposasa es una transposasa Tn5 o un mutante activo de esta. En algunos aspectos, la transposasa Tn5 es una transposasa Tn5 hiperactiva (véase, p. ej., Reznikoff y cols., Publ. PCT N.° WO2001/009363, Patente de EE.UU. N.° 5.925.545, 5.965.443, 7.083.980, y 7.608.434, y Goryshin y Reznikoff, J. Biol. Chem. 273: 7367, 1998), o un mutante activo de esta. En algunos aspectos, la transposasa Tn5 es una transposasa Tn5 como se describe en PCT Publ. N.° WO2015/160895. En algunos aspectos, la transposasa Tn5 es una proteína de fusión. En algunos aspectos, la proteína de fusión de la transposasa Tn5 comprende un factor de elongación Ts marcado (Tsf) fusionado. En algunos aspectos, la transposasa Tn5 es una transposasa Tn5 hiperactiva que comprende mutaciones en los aminoácidos 54, 56 y 372 en relación con la secuencia de tipo salvaje. En algunos aspectos, la transposasa Tn5 hiperactiva es una proteína de fusión, en donde opcionalmente la proteína fusionada es el factor de elongación Ts (Tsf). En algunos aspectos, el sitio de reconocimiento es un sitio de reconocimiento de la transposasa de tipo Tn5 (Goryshin y Reznikoff, J. Biol. Chem., 273: 7367, 1998). En un aspecto, se usa un sitio de reconocimiento de transposasa que forma un complejo con una transposasa Tn5 hiperactiva (p. ej., Transposasa EZ-Tn5™, Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis.).

En algunos aspectos, el complejo de transposoma es un dímero de dos moléculas de una transposasa. En algunos aspectos, el complejo de transposoma es un homodímero, en donde dos moléculas de una transposasa están unidas cada una al primer y segundo transposones del mismo tipo (p. ej., las secuencias de los dos transposones unidos a cada monómero son las mismas, formando un "homodímero"). En algunos aspectos, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria emplean dos poblaciones de complejos de transposomas. En algunos aspectos, las transposasas en cada población son las mismas. En algunos aspectos, los complejos de transposoma en cada población son homodímeros, en donde la primera población tiene una primera secuencia adaptadora en cada monómero y la segunda población tiene una secuencia adaptadora diferente en cada monómero.

En algunos aspectos, la transposasa es una transposasa Tn5. En algunos aspectos, el complejo de transposasa comprende un dímero de transposasa (p. ej., una transposasa Tn5) que comprende un primer y un segundo monómero. Cada monómero comprende un primer transposón y un segundo transposón, donde el primer transposón comprende una secuencia final del primer transposón en su extremo 3' y una primera secuencia adaptadora (donde las secuencias adaptadoras en cada monómero de un dímero son iguales o diferentes), y el segundo transposón comprende una secuencia final del segundo transposón al menos parcialmente complementaria a la secuencia final del primer transposón. En algunos aspectos del enlazador escindible en 5', el primer transposón comprende en su extremo 5' un enlazador escindible conectado a un elemento de afinidad. En algunos aspectos del enlazador 3', el segundo transposón comprende en su extremo 3' un enlazador (opcionalmente escindible) conectado a un elemento de afinidad. Así, en aspectos preferidos, un transposón de cada monómero comprende un elemento de afinidad. En algunos aspectos, sin embargo, solo uno de los dos monómeros incluye un elemento de afinidad.

Secuencias adaptadoras

En cualquiera de los aspectos del método descrito en la presente memoria, el primer transposón comprende una primera secuencia adaptadora. En algunos aspectos, se añade un adaptador secundario a un fragmento marcado como se describe en la presente memoria que usa un transportador de adaptador secundario, que comprende una secuencia de cebador y una secuencia de adaptador secundario. Las secuencias adaptadoras pueden comprender una o más secuencias funcionales seleccionadas del grupo que consiste en secuencias universales, secuencias de cebadores, secuencias índice, secuencias de captura, secuencias de código de barras (usadas, p. ej., para contar o corregir errores), secuencias de escisión, secuencias relacionadas con la secuenciación y combinaciones de estas. En algunos aspectos, una secuencia adaptadora comprende una secuencia de cebador. En otros aspectos, una secuencia adaptadora comprende una secuencia de cebador y una secuencia índice o de código de barras. Una secuencia de cebador también puede ser una secuencia universal. Esta descripción no se limita al tipo de secuencias adaptadoras que se podrían usar y un experto en la materia reconocerá secuencias adicionales que pueden ser útiles para la preparación de bibliotecas y la secuenciación de nueva generación.

Las secuencias adaptadoras que se transfieren a los extremos 5' de un fragmento de ácido nucleico mediante la reacción de tagmentación (p. ej., la(s) primera(s) secuencia(s) adaptadora(s)) pueden comprender, por ejemplo, una secuencia universal. Una secuencia universal es una región de secuencia de nucleótidos que es común a dos o más fragmentos de ácido nucleico. Opcionalmente, los dos o más fragmentos de ácido nucleico también tienen regiones de diferencias de secuencia. Una secuencia universal que puede estar presente en diferentes miembros de una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes usando un solo cebador universal que es complementario a la secuencia universal.

En algunos aspectos, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria emplean dos poblaciones de complejos de transposoma. En algunos aspectos, cada población comprende una secuencia adaptadora con una secuencia de cebador diferente. En algunos aspectos, una primera población comprende una secuencia de cebador A14 y una segunda población comprende una secuencia de cebador B15.

Elemento de Afinidad y Pareja de Unión por Afinidad

Un elemento de afinidad, como se usa en la presente memoria, es un resto que se puede usar para unirse, de forma covalente o no covalente, a una pareja de unión por afinidad. En algunos aspectos, el elemento de afinidad está en el complejo de transposoma y la pareja de unión por afinidad está en el soporte sólido.

En algunos aspectos, el elemento de afinidad se puede unir o se une de forma no covalente a la pareja de unión por afinidad en el soporte sólido, uniendo así de forma no covalente el complejo de transposoma al soporte sólido. En tales aspectos, el elemento de afinidad comprende o es, por ejemplo, biotina, y la pareja de unión por afinidad comprende o es avidina o estreptavidina. En otros aspectos, la combinación elemento de afinidad/pareja de unión comprende o es FITC/anti-FITC, digoxigenina/anticuerpo de digoxigenina o hapteno/anticuerpo. Otros pares de afinidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiobiotina-avidina, iminobiotina-avidina, biotina-avidina, ditiobiotina-avidina succinilada, iminobiotina-avidina succinilada, biotina-estreptavidina y biotina-avidina succinilada.

En algunos aspectos, el elemento de afinidad se puede unir a la pareja de unión por afinidad a través de una reacción química, o se une covalentemente mediante reacción con la pareja de unión por afinidad en el soporte sólido, uniendo así covalentemente el complejo de transposoma al soporte sólido. En algunos aspectos, la combinación de elemento de afinidad/pareja de unión comprende o es amina/ácido carboxílico (p. ej., unión a través de una reacción de acoplamiento peptídico estándar en condiciones conocidas por los expertos en la técnica, como acoplamiento mediado por EDC o NHS). La reacción de los dos componentes une el elemento de afinidad y la pareja de unión a través de un enlace amida. Alternativamente, el elemento de afinidad y la pareja de unión pueden ser parejas químicas de dos clics (p. ej., azida/alquino, que reaccionan para formar un enlace triazol).

Enlazadores escindibles

La capacidad de romper enlaces que unen dos entidades moleculares puede ser una herramienta eficaz para reducir la captura de productos de hibridación fuera del objetivo, interrumpiendo la posibilidad de generar capturas fuera del objetivo en todo el genoma durante la primera hibridación. Tal como se define en la presente memoria, un enlazador escindible es una molécula con dos cabezas funcionales unidas mediante un enlace escindible. Las dos cabezas funcionales sirven para unir el enlazador a otros restos; en este caso, el enlazador escindible conecta el extremo 5' de la primera secuencia del transposón con un elemento de afinidad. Wagner y cols., Bioorg. Med. Chem. 20, 571-582 (2012) enumera una descripción general de los enlazadores escindibles clasificados de acuerdo con sus condiciones de escisión y aplicaciones biológicas.

Un enlazador escindible como se usa en la presente memoria es un enlazador que se puede escindir por medios químicos o físicos, como, por ejemplo, fotólisis, escisión química, escisión térmica o escisión enzimática. En algunos aspectos, la escisión puede ser por un agente bioquímico, químico, enzimático, nucleófilo, sensible a la reducción u otros medios.

En algunos aspectos, un enlazador escindible puede incluir un nucleótido o una secuencia de nucleótidos que se puede fragmentar por varios medios. Por ejemplo, un enlazador escindible puede comprender un sitio de restricción de endonucleasa; al menos un ribonucleótido escindible con una ARNasa; análogos de nucleótidos escindibles en presencia de determinado(s) agente(s) químico(s); un enlace diol escindible por tratamiento con peryodato (por ejemplo); un grupo disulfuro escindible con un agente químico reductor; un resto escindible que puede estar sujeto a escisión fotoquímica; y un péptido escindible por una enzima peptidasa u otros medios adecuados. Véase, p. ej., las Pat. de Publ. de EE.UU. N.° 2012/0208705 y 2012/0208724, y la Publ. de PCT N.° WO 2012/061832.

Los enlazadores fotoescindibles (PC) se han usado en una variedad de aplicaciones, como la purificación inducida por fotoescisión, la ingeniería de proteínas, la fotoactivación de compuestos y biomoléculas, así como el marcaje de masas fotoescindibles para ensayos multiplex. Los enlazadores PC pueden contener un grupo funcional fotolábil que se puede escindir con luz ultravioleta de longitud de onda específica (300-350 nm). El enlazador PC puede incluir, por ejemplo, una unidad de 10 átomos que se puede escindir cuando se expone a la luz ultravioleta dentro del intervalo espectral apropiado. Dichos enlazadores fotoescindibles y reactivos de fosforamidita están comercialmente disponibles en Integrated DNA technologies (IDT), Ambergen y Glen Research. El uso de composiciones de nucleótidos fotoescindibles se describe en detalle en las Pat. de EE.UU. N.° 7.057.031, 7.547.530, 7.897.737, 7.964.352 y 8.361.727.

En algunos aspectos, la escisión está mediada enzimáticamente por la incorporación de un nucleótido o nucleobase escindible en el enlazador escindible. Los ejemplos de dichos restos de nucleobase o nucleótido incluyen, pero no se limitan a, uracilo, uridina, 8-oxo-guanina, xantina, hipoxantina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metilcitosina, dímero de timina, 7-metilguanosina, 8-oxo-desoxiguanosina, xantosina, inosina, desoxiinosina, dihidrouridina, bromodesoxiuridina, uridina, 5-metilcitidina, desoxiuridina, 5,6-dihidroxitimina, timina glicol, 5-hidroxi-5-metilhidantona, uracilo glicol, 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina , metil tartronil urea (1,2), o un sitio abásico.

En algunos aspectos, el enlazador escindible incluye un número suficiente de nucleótidos escindibles para permitir la escisión completa. En algunos aspectos, el enlazador incluye de 1 a 10 nucleótidos escindióles. En algunos aspectos, el enlazador escindióle incluye al menos un nucleótido escindióle. En algunos aspectos, el enlazador incluye al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos escindióles. En un aspecto preferido, el enlazador escindióle comprende uno o más nucleótidos de uracilo y, opcionalmente, otras óases de ADN estándar. En algunos aspectos, un etapa enzimática adicional después de la PCR escinde el enlazador escindióle en la posición de nucleótido o nucleósido escindióle. Ejemplos de dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, uracilo ADN glicosilasa (UDG, tamóién conocida como uracil-N-glicosilasa o UNG), formamidopirimidina ADN glicosilasa (Fpg), RNasaH, Endo III, Endo IV, Endo V, Endo VIII, Klenow o apirasa. En algunos aspectos, se usa una mezcla de enzimas que comprende una enzima que escinde las óases de uracilo en ácidos nucleicos y una nucleasa AP. La concentración efectiva de las enzimas puede oscilar entre 0,025 U/pl y 10 U/pl. En un aspecto preferido, la mezcla de enzimas es uracilo ADN glicosilasa y Endo IV. Las mezclas de enzimas comerciales para usar en los métodos descritos en la presente memoria incluyen UDEM (Epicentre Biotechnologies). En otro aspecto más, la mezcla de enzimas es uracilo ADN glicosilasa y Endo VIII, comercialmente disponióle como USER (New England Biolaós) o Uracil Cleavage System (Sigma Aldrich). La escisión deja el elemento de afinidad 5' (p. ej., un resto de óiotina) en un oligonucleótido corto que se podría eliminar a través de muchos métodos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, durante la purificación de ácidos nucleicos, como la eliminación de ácidos nucleicos diana que usa una metodología óasada en microesferas que dejaría pequeños oligonucleótidos sin capturar. La escisión rompe la unión entre el elemento de afinidad (p. ej., óiotina) y el fragmento diana marcado en 5'. En aspectos preferidos, los enlazadores escindióles son adyacentes y están unidos al extremo 5' de la secuencia final del transposón del dúplex de transposón. En algunos aspectos, el enlazador escindióle está unido a una óiotina. En otras realizaciones, la óiotina se fija a una perla recuóierta de estreptavidina.

Complejos de Transposoma y Transposones con enlazadores en 3'

En otros aspectos, un enlazador está conectado al extremo 3' de un segundo transposón, en donde el enlazador es capaz de conectar el segundo transposón a un soporte sólido. El enlazador sirve para conectar el complejo al soporte sólido donde los transposones primero y segundo forman parte de un complejo de transposoma. En tales aspectos, un primer extremo del enlazador se une al extremo 3' del segundo transposón y un segundo extremo del enlazador se une a un elemento de afinidad. El elemento de afinidad es capaz de unirse (de forma covalente o no covalente) a una pareja de unión por afinidad en un soporte sólido. En algunos aspectos, el elemento de afinidad se une (covalente o no covalentemente) a una pareja de unión por afinidad en el soporte sólido, lo que proporciona un complejo de transposoma unido al soporte sólido. En algunos aspectos, el enlazador es un enlazador escindióle. Estos complejos son complejos de transposoma con enlazadores en 3' y complejos de transposoma con enlazadores en 3' unidos a soporte. En algunos aspectos, el elemento de afinidad es una óiotina y la pareja de unión por afinidad es estreptavidina.

En un aspecto, el enlazador está unido covalentemente al extremo 3' del segundo transposón. En algunos aspectos, el enlazador se une covalentemente al extremo 3' de la segunda secuencia final del segundo transposón. Por ejemplo, el enlazador descrito en la presente memoria puede estar unido covalente y directamente al grupo hidroxi del extremo 3' del segundo transposón, formando así un enlace -O-, o puede estar unido covalentemente a través de otro grupo, como un fosfato o un éster. Alternativamente, el enlazador descrito en la presente memoria puede estar unido covalentemente a un grupo fosfato del segundo transposón o a la secuencia final del segundo transposón, por ejemplo, unido covalentemente al 3' hidroxilo a través de un grupo fosfato, formando así un enlace -O-P(O)3-.

En algunos aspectos, el complejo de transposoma descrito en la presente memoria se inmoviliza en un soporte sólido a través del enlazador. En algunas de tales realizaciones, el elemento de afinidad es óiotina y el soporte sólido comprende estreptavidina. En alguna realización adicional, el soporte sólido comprende o es una perla. En una realización, la perla es una perla paramagnética.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen una estructura de Fórmula (I):

en donde:

AE es el elemento de afinidad;

Y es alquileno C2-6;

X1 es O, NR1, o S;

en donde R1 es H o alquilo C1-10;

n es un número entero del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5 y 6;

X2 es O, CH2, o S;

Ra es H u -OH; y

Z está ausente cuando Ra es H, o es CH2 cuando Ra es H u OH;

en donde marca el punto de conexión con el segundo transposón.

En algunas realizaciones de fórmula (I), AE es una biotina opcionalmente sustituida o un grupo amino. En otras realizaciones, AE es una biotina opcionalmente sustituida. En tales realizaciones, la biotina está opcionalmente sustituida con alquilo C1-4 En otras realizaciones, AE es biotina.

En algunas realizaciones de Fórmula (I), Y es alquileno C2-6. En otras realizaciones, Y es alquileno C2-5. En otras realizaciones, Y es alquileno C2-4. En otras realizaciones, Y es alquileno C2-3. En otras variantes, Y es un alquileno no ramificado. En otras realizaciones, Y es alquileno C2. En otras realizaciones, Y es alquileno C3. En otras variantes, Y es alquileno C4. En otras realizaciones, Y es etileno. En otras realizaciones, Y es propileno. En otras realizaciones, Y es butileno.

En algunas realizaciones de Fórmula (I), X1 es NR1, en donde R1 es H o alquilo C1-10. En algunas de tales realizaciones, R1 es H. En algunos aspectos, R1 es alquilo C1-3. En otros aspectos, X1 es O. En otros aspectos, X1 es S.

En algunas realizaciones de Fórmula (I), n es 1. En otras realizaciones, n es 2. En otros aspectos, n es 3. En otros aspectos, n es 4.

En algunas realizaciones de Fórmula (I), X2 es CH2. En algunas otras realizaciones, X2 es O. En otros aspectos, X2 es S. En algunas realizaciones de Fórmula (I), Ra es H. En otras realizaciones, Ra es-OH.

En algunas realizaciones de Fórmula (I), Z está ausente y Ra es H. En algunas realizaciones, Z es CH2 y Ra es H. En algunas realizaciones, Z es CH2 y Ra es OH.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (I'):

en donde AE, Y, X1, n, X2, se definen como se describe en la presente memoria para la Fórmula (I), y Z está ausente o es CH2.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (Ia):

en donde X1, n, X2, Ra, y Z se definen como se describe en la presente memoria para la Fórmula (I). En algunos aspectos, Ra es H.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (Ib):

en donde AE es como se define para la Fórmula (I) en la presente memoria; y n es 1 o 2.

En algunos aspectos de la Fórmula (Ib), AE es biotina opcionalmente sustituida o un grupo amino. En algunos aspectos, AE es biotina.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (Ic):

donde AE es como se define para la Fórmula (I) en la presente memoria; X2 es O o CH2; n es 1 o 2; y Z está ausente o es CH2.

En algunos aspectos de la Fórmula (Ic), AE es biotina opcionalmente sustituida o un grupo amino. En algunos aspectos, AE es biotina. En algunos aspectos, X2 es O. En algunos aspectos, X2 es CH2. En algunos aspectos, n es 1. En algunos aspectos, n es 2. En algunos aspectos, Z está ausente. En algunas realizaciones, Z es CH2. En algunos aspectos, n es 1, X2 es O, y Z está ausente. En algunos aspectos, n es 1, X2 es CH2, y Z es CH2.

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen una estructura seleccionada del grupo que consiste en:

En algunas realizaciones, el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura (I(c)).

En algunas realizaciones, la secuencia adaptadora comprende una secuencia de cebador. En algunas realizaciones, la secuencia de cebador es una secuencia de cebador A 14 o B15. En algunos aspectos, la secuencia de cebador es una secuencia de cebador P5 o una secuencia de cebador P7. En algunos aspectos, la transposasa es un dímero, cada monómero está unido a un transposón dúplex con una secuencia adaptadora como se describe en la presente memoria, donde la secuencia adaptadora en cada monómero es la misma. En aspectos en los que la transposasa es un dímero, uno o ambos monómeros incluyen el enlazador que conecta el complejo de transposoma con el soporte sólido. Cada monómero incluye un primer transposón con una secuencia adaptadora.

Soporte Sólido

Los términos "superficie sólida", "soporte sólido" y otros equivalentes gramaticales se refieren a cualquier material que sea apropiado o que se pueda modificar para que sea apropiado para la unión de los complejos de transposoma. Como apreciarán los expertos en la técnica, el número de sustratos posibles es una multitud. Los posibles sustratos incluyen, pero no se limitan a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (que incluyen acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TEFLON, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice o materiales a base de sílice, que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibras ópticas, perlas, perlas paramagnéticas y una variedad de otros polímeros.

En algunos de estos aspectos, el complejo de transposoma se inmoviliza sobre el soporte sólido a través del enlazador como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos adicionales, el soporte sólido comprende o es un tubo, un pocillo de una placa, un portaobjetos, una perla o una célula de flujo, o una combinación de estos. En algún aspecto adicional, el soporte sólido comprende o es una perla. En un aspecto, la perla es una perla paramagnética.

En los métodos y composiciones presentados en la presente memoria, los complejos de transposoma se inmovilizan en un soporte sólido. En un aspecto, el soporte sólido es una perla. Las composiciones de perlas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de torianita, carbón-grafito, dióxido de titanio, látex o dextranos entrecruzados como Sefarosa, celulosa, nailon, micelas entrecruzadas y TEFLON, así como cualquier otro material descrito en esta memoria para soportes sólidos. En cierto aspecto, las microesferas son microesferas o perlas magnéticas, por ejemplo partículas, esferas o perlas paramagnéticas. No es necesario que las perlas sean esféricas; se pueden usar partículas irregulares. Como alternativa o adicionalmente, las perlas pueden ser porosas. Los tamaños de las perlas varían desde nanómetros, p. ej., 100 nm, hasta milímetros, p. ej., 1 mm, prefiriéndose perlas de aproximadamente 0,2 micras a aproximadamente 200 micras, y siendo particularmente preferidas de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micras, aunque en algunos aspectos se pueden usar perlas más pequeñas o más grandes. La perla se puede recubrir con una pareja de unión por afinidad, por ejemplo, la perla puede estar recubierta con estreptavidina. En algunos aspectos, las perlas son perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina, por ejemplo, perlas Dynabeads MyOne estreptavidina C1 (catálogo Thermo Scientific # 65601), partículas paramagnéticas Streptavidin MagneSphere (catálogo Promega # Z5481), perlas magnéticas Streptavidin (catálogo NEB # S1420S) y MaxBead Streptavidin (Catálogo Abnova # U0087). El soporte sólido también podría ser un portaobjetos, por ejemplo, una célula de flujo u otro portaobjetos que haya sido modificado de modo que se pueda inmovilizar en él el complejo de transposoma.

En algunos aspectos, la pareja de unión por afinidad está presente en el soporte sólido o perla a una densidad de 1.000 a aproximadamente 6.000 pmol/mg, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 pmol/mg, o de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 5.000 pmol/mg, o de aproximadamente 3.500 a aproximadamente 4.500 pmol/mg.

En un aspecto, la superficie sólida es la superficie interior de un tubo de muestra. En un ejemplo, el tubo de muestra es un tubo PCR. En otro aspecto, la superficie sólida es una membrana de captura. En un ejemplo, la membrana de captura es una membrana de captura de biotina (por ejemplo, disponible en Promega Corporation). En otro ejemplo, la membrana de captura es papel de filtro. En algunos aspectos de la presente descripción, los soportes sólidos están compuestos por una sustrato o matriz inerte (p. ej., portaobjetos de vidrio, perlas de polímero, etc.) que se ha funcionalizado, por ejemplo mediante la aplicación de una capa o recubrimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten la unión covalente a moléculas, como los polinucleótidos. Los ejemplos de tales soportes incluyen, pero no se limitan a, hidrogeles de poliacrilamida sostenidos sobre un sustrato inerte como vidrio, particularmente hidrogeles de poliacrilamida como se describe en los documentos WO2005/065814 y US2008/0280773. Los métodos de tagmentación (fragmentación y marcaje) de ADN sobre una superficie sólida para la construcción de una biblioteca de ADN tagmentada se describen en los documentos WO2016/189331 y US2014/0093916A1.

Algunos aspectos adicionales de la presente descripción se relacionan con un soporte sólido que comprende un complejo de transposoma inmovilizado sobre él como se describe en la presente memoria, donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen una estructura de Fórmula (I), (I'), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b)), o (I(c)) como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, el complejo de transposoma descrito en la presente memoria se inmoviliza en un soporte sólido a través del elemento de afinidad. En algunos de tales aspectos, el soporte sólido comprende estreptavidina como pareja de unión por afinidad y el elemento de afinidad es biotina. En algún aspecto adicional, el soporte sólido comprende o es una perla. En un aspecto, la perla es una perla paramagnética.

En algunos aspectos, los complejos de transposoma se inmovilizan sobre un soporte sólido, como una perla, a una densidad o intervalo de densidad particular. La densidad de complejos en perlas, tal como se usa este término en la presente memoria, se refiere a la concentración de complejos de transposoma en solución durante la reacción de inmovilización. La densidad de complejo supone que la reacción de inmovilización es cuantitativa. Una vez que se forman los complejos a una densidad particular, esa densidad permanece constante para el lote de complejos de transposoma unidos a la superficie. Las perlas resultantes se pueden diluir y la concentración resultante de complejo en la solución diluida es la densidad preparada para las perlas dividida por el factor de dilución. Las diluciones madre de perlas retienen la densidad de complejo a partir de su preparación, aunque los complejos están presentes en una concentración más baja en la solución diluida. El etapa de dilución no cambia la densidad de los complejos en las perlas y, por lo tanto, afecta al rendimiento de la biblioteca, pero no al tamaño del inserto (fragmento). En algunos aspectos, la densidad está entre aproximadamente 5 nM y aproximadamente 1.000 nM, o entre aproximadamente 5 y 150 nM, o entre aproximadamente 10 nM y 800 nM. En otros aspectos, la densidad es de aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 25 nM, o de aproximadamente 50 nM, o de aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 200 nM, o de aproximadamente 300 nM, o de aproximadamente 400 nM, o de aproximadamente 500 nM, o de aproximadamente 600 nM , o de aproximadamente 700 nM, o de aproximadamente 800 nM, o de aproximadamente 900 nM, o de aproximadamente 1.000 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 100 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 300 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 600 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 800 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 100 nM. En algunos aspectos, la densidad es de aproximadamente 1.000 nM.

En algunos aspectos, el soporte sólido es una perla o una perla paramagnética, y hay más de 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000 o 60.000 complejos de transposoma unidos a cada perla.

Diferentes densidades de complejos de transposoma unidos a un soporte sólido producen fragmentos de diferentes longitudes (p. ej., diferentes tamaños de inserto). Por ejemplo, como se muestra en las FIGs. 7A, 7B, y 7C, la variación de la densidad de complejo da lugar a diferentes tamaños de inserto. Los tamaños de inserto pueden ser de aproximadamente 50 pb a aproximadamente 1.000 pb, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 pb, o de aproximadamente 175 a aproximadamente 200 pb, o de aproximadamente 500 pb.

Métodos de Preparación de Oligonucleótidos Modificados y Complejos de Transposoma Inmovilizados

La descripción proporciona además métodos para preparar oligonucleótidos modificados, complejos de transposoma y complejos de transposoma unidos a un soporte sólido como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, dichos métodos comprenden el tratamiento de una transposasa con el primer y segundo transposones como se describe en la presente memoria en condiciones adecuadas para formar el complejo. Los métodos para preparar un complejo de transposoma unido a un soporte sólido comprenden incubar un complejo de transposoma como se describe en la presente memoria con un soporte sólido que comprende una pareja de unión por afinidad en condiciones suficientes para que el elemento de afinidad se una (covalente o no covalentemente) con la pareja de unión por afinidad.

En algunos aspectos son métodos para preparar oligonucleótidos modificados. En algunos aspectos, se conocen en la técnica métodos para preparar oligonucleótidos modificados con un enlazador conectado a un elemento de afinidad. Ciertos métodos contemplados en la presente memoria comprenden hacer reaccionar un reactivo enlazador (o enlazador escindible) que comprende un primer grupo funcional reactivo (L-FG1) con un nucleótido que comprende un segundo grupo funcional reactivo (N-FG2), donde reaccionan el primer y el segundo grupo funcional reactivo para formar un producto Enlazador-Nucleótido con un enlace covalente (CB) entre el enlazador y el nucleótido (L-(CB)-N). En algunos aspectos, el reactivo enlazador incluye el resto AE (AE-Enlazador-FG1). En otro aspecto, el reactivo enlazador comprende una porción de la estructura del enlazador, y el AE se instala a través de una segunda reacción de acoplamiento para generar la estructura AE-Enlazador completa.

El primer grupo funcional reactivo puede ser, por ejemplo, carboxilo, carboxilo activado (como un éster, éster NHS, haluro de acilo, anhídrido o similar), azido, alquino, formilo o amino. En algunos aspectos, el primer grupo funcional reactivo es un carboxilo activado, preferiblemente un éster NHS.

El segundo grupo funcional reactivo puede estar en cualquier posición adecuada del nucleótido. En algunos aspectos, el segundo grupo funcional reactivo está en la posición hidroxilo 3' o en la posición fosfato 5' del nucleótido, ya sea en lugar del sustituyente natural o añadido a él a través de un enlace, como un grupo alquileno o heteroalquileno, o un grupo fosfato en el caso de un hidroxilo de nucleótido. En algunos aspectos, el segundo grupo funcional reactivo comprende un grupo alquilamino C2-10. En algunos aspectos, el segundo grupo funcional reactivo comprende un grupo hexilamino. En algunos aspectos, el segundo grupo funcional reactivo es -O^p(O)3-(CH2)6-NH2. En algunos aspectos, el segundo grupo funcional reactivo está conectado al nucleótido a través del hidroxilo 3' del nucleótido a través de un enlace de fosfato.

El nucleótido modificado puede ser parte de un oligonucleótido antes de unir el enlazador, en cuyo caso el nucleótido puede estar, por ejemplo, en el extremo 3' o en el extremo 5' del oligonucleótido. Alternativamente, el enlazador se une primero al nucleótido y el nucleótido modificado se usa como material de partida para sintetizar un oligonucleótido por medios estándar.

En algunos aspectos, el enlazador de Fórmula (I) está conectado a la posición 3' de un nucleótido, como una citidina. En algunos aspectos, el método para producir el nucleótido modificado comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (II) con un compuesto de fórmula (III):

-Nucleótido

( III)

en donde AE, Y, n, X2, Ra, y Z son como se definen en la presente memoria;

-C(O)X3 es un éster activado, como un éster, haluro de acilo, anhídrido de éster o éster de NHS; y X4 es un grupo -OH o -NH2;

para formar un compuesto de [Fórmula (I)]-Nucleótido.

En algunos aspectos, el compuesto de Fórmula (II) es AE-(CH2)4C(O)-O-NHS y el compuesto de Fórmula (III) es H2N-(CH2)6-OP(O)(O-)O-Nucleótido, y el producto es AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-Nucleótido. En algunos aspectos, el fosfato está conectado al grupo hidroxilo 3’ de un nucleótido, como una citidina. En algunos aspectos, el compuesto de [Fórmula (I)]-Nucleótido (o AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-Nucleótido) se hace reaccionar con nucleótidos adicionales para formar [Fórmula (I)]-Oligonucleótido (o AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O')O-oligonucleótido). En algunos aspectos, el segundo transposón es [Fórmula (I)]-Oligonucleótido (o AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-Oligonucleótido).

La presente descripción también se refiere a métodos para preparar complejos de transposoma usando los oligonucleótidos modificados descritos en la presente memoria. Dichos métodos comprenden mezclar una transposasa, un primer transposón y un segundo transposón, como se define en la presente memoria, donde las secuencias finales del primer y segundo transposón se hibridan entre sí para formar el complejo de transposoma. Como se describe en la presente memoria, uno de los transposones primero y segundo comprende un elemento de afinidad (en el extremo 5' en el caso del primer transposón; en el extremo 3' en el caso del segundo transposón). En algunos aspectos, el método comprende además la unión del elemento de afinidad a un soporte sólido que comprende una pareja de unión por afinidad. La unión se puede realizar antes o después de la formación del complejo de transposoma.

Preparación de Fragmentos de Secuenciación: Amplificación de Fragmentos Marcados

En algunos aspectos, se proporcionan métodos para preparar fragmentos de secuenciación a partir de un ácido nucleico diana, método que comprende proporcionar un soporte sólido que comprende un complejo de transposoma descrito en la presente memoria inmovilizado sobre este como se describe en la presente memoria; poner en contacto el soporte sólido con un ácido nucleico diana en condiciones para fragmentar el ácido nucleico diana y ligar un primer transposón al extremo 5' de los fragmentos, por lo que el fragmento queda inmovilizado sobre el soporte sólido. En algunos aspectos, el método comprende además amplificar los ácidos nucleicos fragmentados. En algún aspecto, la condición de fragmento es una condición adecuada para el marcaje mediante el uso del complejo de transposoma para fragmentar y marcar el ácido nucleico diana.

En algunos aspectos de los métodos descritos en la presente memoria, después de la fragmentación y el marcaje, los métodos comprenden además la eliminación de la transposasa de los fragmentos diana marcados en 5' para proporcionar fragmentos diana marcados en 5' no acomplejados. La eliminación de la transposasa se puede lograr en condiciones químicas, como tratamiento con un agente desnaturalizante como dodecilsulfato de sodio (SDS). Dichos métodos pueden comprender además la generación de versiones completamente en dúplex de los fragmentos diana marcados en 5'. Generar el dúplex completo puede comprender eliminar el segundo transposón hibridado (pero no ligado) (AE-enlazador-segundo transposón) a partir de los fragmentos diana marcados en 5' y extender los fragmentos diana marcados en 5' para generar fragmentos diana marcados en 5' completamente en dúplex. La generación se puede lograr, por ejemplo, calentando los fragmentos diana marcados en 5' no acomplejados a una temperatura suficiente para desnaturalizar selectivamente el segundo transposón, dejando intacta la región dúplex restante del fragmento. La extensión se puede lograr en presencia de dNTPs y una polimerasa adecuada. Alternativamente, la generación se puede lograr en una reacción, incubando los fragmentos diana marcados en 5' no acomplejados en presencia de nucleótidos individuales (dNTPs) y una polimerasa. En algunos aspectos, la incubación incluye calentar a una o más temperaturas suficientes para desnaturalizar el segundo transposón hibridado y extender los dúplex restantes. En otros aspectos, la polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de cadena, que sirve para eliminar el segundo transposón y extender el dúplex restante para generar fragmentos diana marcados en 5' totalmente dúplex. Las polimerasas adecuadas incluyen KAPA HiFi, Pfu y enzimas similares. Las polimerasas adecuadas incluyen polimerasas de desplazamiento de cadena como Bst, Bsu Vent, Klenow y enzimas similares.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la amplificación de los fragmentos diana marcados en 5' totalmente dúplex. La amplificación se puede realizar mediante cualquier método de amplificación adecuado, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación en círculo rodante (RCA) o la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). En algunos aspectos, la amplificación se realiza mediante PCR. En algunos aspectos, la amplificación y la extensión se realizan en una sola etapa de reacción, al reaccionar con los dNTPs en presencia de una polimerasa.

En algunos aspectos, la amplificación sirve para añadir una o más secuencias adaptadoras secundarias a los fragmentos diana marcados en 5' totalmente dúplex para formar fragmentos de secuenciación. La amplificación se logra mediante la incubación de un fragmento diana marcado en 5' completamente dúplex que comprende una secuencia de cebador en cada extremo con un transportador de adaptador secundario, nucleótidos individuales y una polimerasa en condiciones suficientes para amplificar los fragmentos diana e incorporar el transportador de adaptador secundario (o complemento de este), en donde el transportador del adaptador secundario comprende la complementaria de la secuencia de cebador y una secuencia adaptadora secundaria.

En algunos aspectos, el transportador del adaptador secundario comprende una secuencia de cebador, una secuencia índice, una secuencia de código de barras, una marcaje de purificación o una combinación de estos. En algunos aspectos, el transportador del adaptador secundario comprende una secuencia de cebador. En algunos aspectos, el transportador del adaptador secundario comprende una secuencia índice. En algunos aspectos, el transportador del adaptador secundario comprende una secuencia índice y una secuencia de cebador.

En algunos aspectos, los fragmentos diana marcados en 5' totalmente dúplex comprenden una secuencia de cebador diferente en cada extremo. En tales aspectos, cada transportador de adaptador secundario comprende la complementaria de una de las dos secuencias de cebador. En algunos aspectos, dos secuencias de cebador son una secuencia de cebador A14 y una secuencia de cebador B15.

En algunos aspectos, se añaden mediante amplificación una pluralidad de adaptadores secundarios. En algunos aspectos, cada uno de los transportadores del adaptador secundario comprende una de dos secuencias de cebador. En algunos aspectos, cada uno de los transportadores de adaptadores secundarios comprende una de una pluralidad de secuencias índice. En algunos aspectos, los transportadores de adaptadores secundarios comprenden adaptadores secundarios con una secuencia de cebador P5 y adaptadores secundarios con una secuencia de cebador P7.

En algunos aspectos, los fragmentos de secuenciación se depositan en una célula de flujo. En algunos aspectos, los fragmentos de secuenciación se hibridan con cebadores complementarios injertados en la célula de flujo o la superficie. En algunos aspectos, las secuencias de los fragmentos de secuenciación se detectan mediante métodos de secuenciación en matriz o de secuenciación de nueva generación, como la secuenciación por síntesis.

Los cebadores P5 y P7 se usan en la superficie de células de flujo comerciales vendidas por Illumina, Inc., para la secuenciación en varias plataformas de Illumina. Las secuencias de cebador se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2011/0059865 A1. Los ejemplos de cebadores P5 y P7, que pueden terminar en alquino en el extremo 5', incluyen los siguientes:

P5: AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEC ID N.° 1)

P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID N.° 2)

y derivados de estos. En algunos ejemplos, la secuencia P7 incluye una guanina modificada en la posición G*, p. ej., una 8-oxo-guanina. En otros ejemplos, el * indica que el enlace entre la G* y la A 3' adyacente es un enlace fosforotioato. En algunos ejemplos, los cebadores P5 y/o P7 incluyen enlazadores no naturales. Opcionalmente, uno o ambos cebadores P5 y P7 pueden incluir una cola de poli T. La cola de poli T generalmente se ubica en el extremo 5' de la secuencia que se muestra arriba, p. ej., entre la base 5' y una unidad de alquino terminal, aunque en algunos casos se puede ubicar en el extremo 3'. La secuencia de poli T puede incluir cualquier número de nucleótidos T, por ejemplo, de 2 a 20. Aunque los cebadores P5 y P7 se dan como ejemplos, se debe entender que se puede usar cualquier cebador de amplificación adecuado en los ejemplos presentados en la presente memoria.

En algunos aspectos, la etapa de amplificación del método comprende PCR o amplificación isotérmica. En algunos aspectos, la etapa de amplificación del método comprende PCR.

Descripción de las Figuras

La FIG. 1 ilustra las etapas ejemplares de un método para preparar complejos de transposoma y fijarlos a una superficie sólida (como una perla) a través de un elemento de afinidad unido al extremo 5' del primer transposón. En este ejemplo, dos poblaciones (130a y 130b) del primer y segundo transposones hibridados (oligonucleótidos que comprenden una región bicatenaria hibridada que comprende la secuencia final del transposón y una región monocatenaria), donde en cada población el primer transposón incluye una de las dos secuencias adaptadoras y un elemento de afinidad (110, dónde * indica elemento de afinidad), como biotina, en el extremo 5'. Por ejemplo, se genera una pluralidad de transposones primero y segundo biotinilados que comprenden las dos secuencias adaptadoras (p. ej., secuencias de cebador como A14 y B15). Como se representa, la cadena de la secuencia del transposón dúplex que se transferirá a los ácidos nucleicos molde es el primer transposón, que tiene el elemento de afinidad (p. ej., biotina). En la etapa 115, cada población de oligonucleótidos (130a y 130b) se acompleja con monómeros de transposasa como Tn5 (135), normalmente en reacciones separadas, para crear dos poblaciones discretas de complejos de transposoma (140), cada una con una secuencia adaptadora diferente (p. ej., secuencias de cebador como A14 y B15). Después de que se forman las dos poblaciones de complejos, se inmovilizan sobre un sustrato, perlas en este ejemplo (120). En algunos aspectos, las dos poblaciones se combinan antes de la inmovilización, lo que produce una superficie sólida o perla que comprende complejos de cada población. En otros aspectos, las dos poblaciones se inmovilizan por separado, lo que produce dos superficies sólidas o perlas, cada una de las cuales comprende uno de los dos tipos complejos. Después de la formación del complejo de transposoma, los transposomas 140 están unidos a la superficie 145 recubierta con una pareja de unión por afinidad, como estreptavidina.

La FIG. 2 ejemplifica un proceso de tagmentación y preparación de bibliotecas 200 sobre la superficie de una perla después de la inmovilización del transposoma usando una estrategia de enlazador en 5' descrita en la presente memoria. En el proceso 200 se muestra una perla 205 con transposomas 140 unidos a ella. El ADN 210 se añade a una muestra de perlas. Como el ADN 210 contacta con los transposomas 140, el ADN se tagmenta (fragmenta y marca) y se une a las perlas 205 a través de los transposomas 140. El ADN unido y tagmentado se puede amplificar mediante PCR para generar un grupo de amplicones libres de perlas 215. La etapa de PCR se puede usar para incorporar secuencias adaptadoras secundarias, como secuencias de cebador (p. ej., P5 y P7). Los amplicones 215 se pueden transferir a la superficie de una célula de flujo 220, por ejemplo, mediante injerto o hibridación con cebadores complementarios en la superficie de la célula de flujo. Se puede usar un protocolo de generación de grupos (p. ej., un protocolo de amplificación puente o cualquier otro protocolo de amplificación que se pueda usar para la generación de grupos) para generar una pluralidad de grupos 225 en la superficie de una célula de flujo. Los grupos son productos de amplificación clonal de ADN tagmentado. Los grupos ahora están listos para la siguiente etapa en un protocolo de secuenciación. Un ejemplo de proceso de tagmentación sobre la superficie de una perla se describe en detalle en la Publ. PCT N.° WO2016/189331.

La FIG. 3 ilustra los problemas que pueden surgir cuando se usan complejos de transposoma unidos en 5'. La etapa 300 ilustra gráficamente el proceso de tagmentación de los complejos de transposoma 140 inmovilizados sobre la perla 305 con ADN genómico 315, seguido de la posterior amplificación y enriquecimiento de la diana, incluida la captura de ácidos nucleicos no diana. Se representa en 310 una biblioteca inmovilizada de ADN genómico tagmentado. Las perlas de captura recubiertas de estreptavidina que tienen ADN tagmentado en ellas se pueden lavar (320), usando un tampón de lavado que comprende, por ejemplo, SDS al 5%, Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y Tween 20 al 0,1%, que desnaturaliza así la transposasa del complejo transposoma. El sobrenadante se puede eliminar después de la etapa de lavado, a través de la captura magnética de las partículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina (p. ej., perlas) y las perlas de captura que comprenden las bibliotecas tagmentadas inmovilizadas se pueden retener y lavar aún más usando Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,1 %. Los oligonucleótidos unidos se extienden a 330 para formar dúplex unidos con complementariedad completa.

En 340, la amplificación de la diana procede a través de ciclos térmicos para amplificar el ADN tagmentado mediante los métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede añadir una solución de reactivos de PCR (p. ej., una mezcla que comprende como mínimo un tampón de PCR, desoxinucleótidos, un catión divalente y una ADN polimerasa) y los aditivos necesarios para una amplificación eficaz a la solución que contiene perlas y el ADN tagmentado unido a la perla de captura se puede amplificar mediante ciclos térmicos (p. ej., 10 ciclos térmicos), una metodología conocida por los expertos en la técnica. En 350, el ADN tagmentado amplificado se puede purificar opcionalmente usando, por ejemplo, una columna de purificación (p. ej., una columna giratoria Zymo) y eluirse. El ADN tagmentado amplificado también se puede purificar opcionalmente usando perlas SPRI o Ampure XP (Beckman Coulter), el método de purificación no limita la presente descripción.

En la etapa 360, las bibliotecas tagmentadas se pueden enriquecer mediante un protocolo como se describe en el protocolo de enriquecimiento de Captura Rápida NEXTERA (Illumina) o cualquier otro método de captura de diana. Los fragmentos genómicos biotinilados están presentes desde el comienzo de la preparación de la biblioteca en la mezcla posterior a la amplificación (370) y podrían competir con las sondas diana biotiniladas (380), que sirven como sondas de hibridación del genoma completo durante el enriquecimiento de la diana. La presencia de estos fragmentos genómicos biotinilados en esta etapa podría comprometer la eficacia del enriquecimiento. Además, se podrían generar fragmentos genómicos biotinilados durante la amplificación por PCR a través del cebado y la extensión con polimerasa de adaptadores biotinilados libres que no se consumieron en la reacción de tagmentación, lo que añade así sondas de captura fuera del objetivo adicionales a la etapa de enriquecimiento de la diana.

La presente descripción proporciona varias soluciones a este problema. En un enfoque descrito en la presente memoria, se incluyen uno o más enlazadores escindibles entre el elemento de afinidad y la secuencia adaptadora del primer transposón. Una vez que se completa la tagmentación y se amplifica el ácido nucleico tagmentado, se podría escindir el enlazador escindible, liberando la porción biotinilada y minimizando o eliminando la captura fuera del objetivo. Esta modificación reduce drástica y sorprendentemente la captura fuera del objetivo y mejora el enriquecimiento en relación con otras metodologías de tagmentación basadas en perlas. En segundo lugar, el elemento de afinidad se mueve hacia el extremo 3' del segundo transposón y se une opcionalmente a través de un enlazador escindible.

La FIG. 4 ilustra gráficamente las etapas de un método 400 de fragmentación y marcaje de ADN que usa complejos de transposoma inmovilizados sobre una superficie sólida usando un enlazador escindible. En referencia a la FIG. 4, las etapas 410, 420, 430, 440, y 450 son las descritas para la FIG. 3 (310, 320, 330, 340 y 350, respectivamente) con la excepción de que los fragmentos genómicos biotinilados presentes en la mezcla posterior a la amplificación (470) contienen un enlazador escindible (p. ej., un enlazador que comprende uno o más uracilos). En la etapa 460, la biotina se escinde de los fragmentos genómicos a través de la escisión del enlazador usando el agente de escisión apropiado. Para el ejemplo de uracilo, la escisión se lograría con una enzima de escisión de uracilo (p. ej., Uracil DNA Excision Mix de Epicentre, por ejemplo). Durante el etapa de enriquecimiento 480, los fragmentos genómicos fuera del objetivo ya no están biotinilados y, por lo tanto, no se capturan como sondas diana biotiniladas (490). De esta forma, el método reduce la captura fuera del objetivo y aumenta la eficacia del enriquecimiento de la diana en comparación con el enfoque del enlazador en 5' sin un enlazador escindible.

En la FIG.5A se muestra un enfoque de tagmentación basado en perlas que usa secuencias adaptadoras que incluyen un elemento de afinidad como la biotina en el extremo 5'. Brevemente, se usa el elemento de afinidad en el extremo 5' de los dos tipos de oligonucleótidos adaptadores 501 y 502 para unir las dos poblaciones de transposomas a una superficie (p. ej., una con una secuencia adaptadora A14 y otra con una secuencia adaptadora B15). ME y ME' son las secuencias finales del transposón. El evento de tagmentación crea fragmentos marcados en 5' a partir de un ácido nucleico diana, como ADN genómico. Algunos de los fragmentos incluyen un A14 en el extremo 5' de una cadena y un B15 en el extremo 5' de la otra cadena del fragmento, como se muestra. Los fragmentos se extienden y/o reaccionan mediante amplificación, como PCR, opcionalmente en presencia de transportadores adaptadores secundarios, para preparar dúplex completos o amplicones, que comprenden opcionalmente adaptadores secundarios (p. ej., secuencias de cebador como P5 y P7 y/o secuencias índice como se muestra en la imagen inferior). Cuando se usan biotina/estreptavidina, los enlaces de afinidad se rompen durante la PCR, lo que deja los amplicones de fragmentos biotinilados en solución, lo que puede complicar los esfuerzos de enriquecimiento posteriores. Alternativamente, en la FIG. 5B, la unión del elemento de afinidad y el enlazador se cambia a una posición 3' en el segundo transposón. En este caso, el elemento de afinidad y el enlazador se unen al extremo 3' de la secuencia final del transposón complementario 503 (secuencia ME'). En esta configuración, los primeros transposones 501 y 502 no incluyen un elemento de afinidad. Con este proceso, el evento de tagmentación crea ADN genómico fragmentado no marcado, ya que el primer transposón (que carece de un elemento de afinidad) se transfiere al fragmento, y el elemento de afinidad se conecta simplemente debido a la hibridación del segundo transposón con el primer transposón. Las secuencias adaptadoras A14-ME, ME, B15-ME, ME', A14, B15 y ME se proporcionan a continuación:

A14-ME: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID N.°: 3)

B15-ME: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID N.°: 4)

ME': 5'-fos-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (SEQ ID N.°: 5)

A14: 5'-TCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID N.°: 6)

B15: 5'-GTCTCGTGGGCTCGG-3' (SEQ ID N.°: 7)

ME: AGAGGT GT ATAAGAGACAG (SEQ ID N.°: 8)

Ácido Nucleico Diana

El ácido nucleico diana puede ser de cualquier tipo que comprenda ADN, ARN, ADNc o similares. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede estar en una variedad de estados de purificación, incluido el ácido nucleico purificado. Sin embargo, el ácido nucleico no necesita estar completamente purificado o purificado en absoluto y puede ser parte de una muestra biológica, por ejemplo, un lisado de muestra crudo, un fluido corporal, sangre, plasma o suero, o puede estar mezclado con proteína, otras especies de ácidos nucleicos, otros componentes celulares y/o cualquier otro contaminante. En algunos aspectos, la muestra biológica comprende una mezcla de ácidos nucleicos (como ADN), proteínas, otras especies de ácidos nucleicos, otros componentes celulares y/o cualquier otro contaminante, presente aproximadamente en la misma proporción que se encuentra en vivo. Por ejemplo, en algunos aspectos, los componentes se encuentran en la misma proporción que se encuentran en una célula intacta. Debido a que los métodos proporcionados en la presente memoria permiten que el ácido nucleico o el ADN se una a un soporte sólido a través del proceso de tagmentación, se pueden eliminar otros contaminantes lavando el soporte sólido después de que ocurra la tagmentación. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, un lisado celular crudo o células completas. Por ejemplo, un lisado celular crudo que se aplica a un soporte sólido en un método establecido en la presente memoria no necesita haber sido sometido a una o más de las etapas de separación que se usan tradicionalmente para aislar ácidos nucleicos de otros componentes celulares.

Así, en algunos aspectos, la muestra biológica puede comprender no solo ácidos nucleicos purificados de cualquier fuente sino también, por ejemplo, ácidos nucleicos no purificados que se encuentran en sangre, plasma, suero, linfa, moco, esputo, orina, semen, líquido cefalorraquídeo, aspirado bronquial, heces y tejido macerado, o un lisado de este, o cualquier otra muestra biológica que contenga material de ácido nucleico o de ADN. El ácido nucleico diana puede ser de una muestra de tejido, una muestra de tumor, células cancerosas o una muestra de biopsia.

El ácido nucleico diana puede proceder de cualquier especie, o de una mezcla de especies. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser de un mamífero (como un ser humano, perro, gato, vaca, cerdo, oveja u otro animal doméstico) u otra especie como pez, bacteria, virus, hongo o arquea. El ácido nucleico puede provenir de muestras ambientales, como suelo o agua.

En algunos aspectos, el ácido nucleico diana es ADN. En uno de tales aspectos, el ADN es de doble cadena. En algunos aspectos adicionales, el ADN de doble cadena comprende ADN genómico. En algunos otros aspectos, el ácido nucleico diana es ARN o un derivado de este, o ADNc.

En algunos aspectos, una muestra biológica (muestra cruda o extracto) se procesa para purificar el ácido nucleico diana antes de los métodos de tagmentación descritos en la presente memoria. En algunos aspectos, la muestra biológica es una muestra cruda o un lisado de muestra crudo (p. ej., sangre o saliva). En algunos aspectos, el método de tratamiento comprende proporcionar una muestra cruda, un lisado de muestra cruda o una muestra previamente procesada (p. ej., una muestra de sangre o saliva), mezclar la muestra con un tampón de lisis y proteinasa K, incubar la mezcla para lisar las células en la muestra y liberar el ADN de las células, proporcionando así ácido(s) nucleico(s) diana para los métodos de tagmentación descritos en la presente memoria.

Los componentes de las muestras crudas o los lisados de muestras crudas, como la sangre, o los aditivos de las muestras previamente procesadas, como la saliva que se ha recogido en un tubo de recogida de Oragene (agentes de estabilización en los tubos de recogida), pueden inhibir las reacciones de tagmentación. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar una muestra cruda, un lisado de muestra crudo o una muestra previamente procesada para superar este problema. En algunos aspectos, el método comprende proporcionar una muestra cruda, un lisado de muestra crudo o una muestra previamente procesada (p. ej., una muestra de sangre o saliva), mezclar la muestra con un tampón de lisis, proteinasa K y perlas de purificación de ADN (p. ej., perlas SPRI, perlas que comprenden grupos carboxilo, donde las perlas son opcionalmente perlas magnéticas), incubar la mezcla para lisar las células de la muestra y liberar el ADN de las células, capturando así el ADN sobre las perlas de purificación de ADN o SPRI, y separar las perlas que comprenden el ADN capturado de la mezcla. La separación sirve para eliminar posibles inhibidores de la tagmentación presentes en el sobrenadante. El método comprende además, opcionalmente, lavar las perlas que comprenden el ADN capturado y eluir el ADN de las perlas para proporcionar ácido(s) nucleico(s) diana.

Métodos de Secuenciación

Algunos de los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen métodos de análisis de ácidos nucleicos. Dichos métodos incluyen preparar una biblioteca de ácidos nucleicos molde de un ácido nucleico diana, obtener datos de secuencia de la biblioteca de ácidos nucleicos molde y montar una representación de secuencia del ácido nucleico diana. En algunos aspectos, los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar en flujos de trabajo de secuenciación de nueva generación que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por síntesis (SBS). Los procedimientos SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección ejemplares que se pueden adaptar fácilmente para su uso con bibliotecas de ácidos nucleicos producidos por los métodos de la presente descripción se describen, por ejemplo, en Bentley y cols., Nature 456: 53-59 (2008), documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.

Algunos aspectos de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están comercialmente disponibles en Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1.

Otra técnica de secuenciación útil es la secuenciación de nanoporos (véase, por ejemplo, Deamer y cols. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer y cols. Acc. Chem. Res. 35: 817-825 (2002); Li y cols. Nat. Mater. 2: 611-615 (2003). Los métodos descritos en la presente memoria no se limitan a ningún tipo particular de instrumentación de secuenciación usada.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para describir, pero no limitar, la descripción proporcionada en la presente memoria.

Ejemplo 1: Tagmentación sobre una superficie sólida usando un enlazador con nucleótidos escindibles enzimáticamente

Los transposones se formaron hibridando dos conjuntos de oligonucleótidos (representados como cualquiera de las SEQ ID N.°: 9-11 (A14-ME modificado) y cualquiera de las SEQ ID N.°: 12-14 (^b15-ME modificado)), ambas de pares de bases que se hibridan a lo largo de una secuencia final de mosaico (ME) de 19 bases (SEQ ID N.°: 8, mostrada en letras minúsculas) con una secuencia final de mosaico complementaria (ME'; SEQ ID N.°: 5). Los oligonucleótidos representados por la SEQ ID N.°: 9 a la SEQ ID N.°: 14 se biotinilado en 5' para permitir la posterior unión de superficie a perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Los transposones hibridados se prepararon combinando 50 pM de cada oligonucleótido biotinilado con 50 pM de ME' (SEQ ID N.°: 5) en presencia de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y NaCl 25 mM y se calentaron a 95 °C durante 10 min y se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, los transposones hibridados se mezclaron con una enzima transposasa a una concentración final de 2 pM y se incubaron a 37 °C durante toda la noche.

En las SEQ ID N.°: 9-14 se proporcionan ejemplos de secuencias enlazadoras escindibles con restos de nucleótidos escindibles. Las secuencias etiquetadas como SEQ ID N.°: 9-14 comprenden la secuencia final de mosaico de 19 bases (ME) (mostrada en minúsculas) y las secuencias de lectura 1 y lectura 2 A14 y B15 (mostradas en cursiva). Las secuencias marcadas como SEQ ID N.°: 9 y SEQ ID N.°: 12 comprenden tres nucleótidos de uracilo (subrayados) después de una serie de residuos de timina (en negrita). De manera similar, las secuencias marcadas como SEQ ID N.°: 10 y SEQ ID N.°: 13 comprenden tres nucleótidos de uracilo en 3' de una serie de residuos de timina. La SEQ ID N.°: 11 y la SEQ ID N.°: 14 contienen un nucleótido de uracilo después de una serie de residuos de timina. Como se menciona en la presente memoria, los residuos de timina son parte del enlazador escindible y sirven para conectar la biotina a los restos escindibles que son secuencias en 5' de transposón y/o adaptadoras. En algunos aspectos, el enlazador escindible incluye de 1 a 10 nucleótidos de uracilo escindibles. En algunos aspectos, el enlazador escindible incluye al menos un nucleótido de uracilo escindible. En algunos aspectos, el enlazador escindible incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de uracilo escindibles. La SEQ ID N.°: 8 es la secuencia final de mosaico de 19 bases (ME) y la SEQ ID N.°: 5 es su complementaria.

SEQ ID N.°: 9 (A14-ME #1 modificada)

5'Biotina-TTTTTTTTTTUyyacacTCGTCGGCAGCGTCagatgtgtataagagacag

SEQ ID N.°: 10 (A14-ME #2 modificada)

5'Biotina-TTyyUTCGTCGGC^GCGTCagatgtgtataagagacag

SEQ ID N.°: 11 (A14-ME #3 modificada)

5'Biotina-TTTTU7CG7CGGCAGCG7Cagatgtgtataagagacag

SEQ ID N.°: 12 (B15-ME #1 modificada)

5'Biotina-TTTTTTTTTTyyyGTCTCGTGGGCTCGGagatgtgtataagagacag

SEQ ID N.°: 13 (B15-ME #2 modificada)

5'Biotina-TTyyyGTCTCGTGGGCTCGGagatgtgtataagagacag

SEQ ID N.°: 14 (B15-ME #3 modificada)

5'Biotina-TTTTyGTCTCGTGGGCTCGGagatgtgtataagagacag

Una vez formados los transposomas, se fijaron los transposomas a perlas recubiertas con estreptavidina. A continuación, las perlas se lavaron con una solución diluida de transposomas en tampón HT1 (Illumina). HT1 contiene un alto contenido de sal necesario para que la biotina-estreptavidina se una a las perlas. Las perlas y los transposomas se incubaron mientras se mezclaban en un mezclador durante 1 hora. Después de mezclar, las perlas se volvieron a suspender en un tampón de almacenamiento que contenía glicerol al 15 % y otros agentes tamponantes (p. ej., Tris).

A continuación, se realizó la tagmentación. Por ejemplo, se añadió una solución de tagmentación a la muestra que contenía los transposomas inmovilizados y se incubó a 55 °C durante aproximadamente 15 minutos. La reacción de tagmentación comprendía ADN (p. ej., aproximadamente de 50 pg a 5 pg de ADN) y un tampón de tagmentación. En un ejemplo, el tampón de tagmentación comprende los componentes necesarios para que se produzca una reacción de tagmentación, por ejemplo, un tampón que comprende Tris acetato 10 mM (pH 7,6), acetato de magnesio 5 mM y dimetilformamida al 10 %, como se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 9.080.211, 9.085.801 y 9.115.396. Se generó una biblioteca inmovilizada de fragmentos de ADN marcados.

Ejemplo 2: Amplificación por PCR de ADN tagmentado y escisión enzimática

Las perlas de captura recubiertas de estreptavidina que tienen ADN tagmentado sobre ellas, como se describe en el Ejemplo 1, se lavaron (p. ej., tres veces) usando un tampón de lavado que comprendía SDS al 5 %, Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM y Tween 20 al 0,1%, desnaturalizando así la enzima transposasa del complejo de transposoma. El sobrenadante se eliminó después del etapa de lavado a través de la captura magnética de las partículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (p. ej., perlas) y se conservaron las perlas que comprendían las bibliotecas tagmentadas inmovilizadas y se lavaron adicionalmente usando Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM y Tween 20 al 0,1 %.

El relleno de huecos de fragmentos de ADN (para rellenar los huecos entre los extremos 5' de las secuencias ME' y los extremos 3' de los fragmentos (véase, por ejemplo, la FIG. 5B) se realizó añadiendo, por ejemplo, mezcla NEM (Kit de Enriquecimiento de Captura Rápida NEXTERA, Illumina) e incubando a 72 °C durante 3 min.

Se realizó la amplificación de la diana por termociclado para amplificar el ADN tagmentado mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. En algunos ejemplos, se añadió a las perlas una solución de reactivos de PCR (p. ej., una mezcla maestra (por ejemplo, mezcla NEM (Kit de Enriquecimiento de Captura Rápida NEXTERA, Illumina) que comprende como mínimo un tampón de PCR, desoxinucleótidos, catión divalente, ADN polimerasa) y aditivos necesarios para una amplificación eficaz) y se amplificó el ADN tagmentado unido a las perlas mediante ciclos térmicos (p. ej., 10 ciclos térmicos).

El sobrenadante que contenía el ADN tagmentado amplificado se retiró de la cámara de reacción y se transfirió a una nueva cámara de reacción (p. ej., tubo, pocillo, etc.). La mezcla de fragmentos amplificados se trató con una o más enzimas que escinden las bases en el enlazador escindible. Se puede usar cualquiera de las varias enzimas conocidas que rompen el esqueleto de nucleótidos para digerir los productos fuera del objetivo para evitar la hibridación fuera del objetivo con el genoma. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, uracil ADN glicosilasa (UDG, también denominada UNG), formamido-pirimidina ADN glicosilasa (Fpg), RNAseH, Endo IV, Endo VIII, Klenow o apirasa.

El ADN tagmentado amplificado se purificó usando perlas SPRI o Ampure XP (Beckman Coulter), el método de purificación no limita la presente descripción. Las bibliotecas tagmentadas se pueden enriquecer usando un protocolo como se describe en el protocolo de enriquecimiento de captura rápida NEXTERA (Illumina) o cualquier otro método de captura de diana. La biblioteca de ADN enriquecida ya está lista para la secuenciación.

Ejemplo 3: Enriquecimiento de lectura usando escisión enzimática de un enlazador escindible que contiene uracilo

Brevemente, se usaron 50 ng de ADN genómico NA12878 (Coriell Institute) para cada condición probada. Como reacción de control, el ADN se tagmentó y las bibliotecas se prepararon y enriquecieron siguiendo el protocolo de enriquecimiento de captura rápida NEXTERA (Illumina), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se usaron los enlazadores escindibles que contenían uracilo SEQ ID N.°: 9 y SEQ ID N.°: 13.

Brevemente, cada reacción de 50 pl contenía tampón de tagmentación 5X, 50 ng de ADN, 5 pl de perlas paramagnéticas Dynal conjugadas con transposoma 250 nM (Life Technologies) con enlazadores de uracilo escindibles descritos en la SEQ ID N.°: 9 y la SEQ ID N.°: 13. La reacción se incubó a 55 °C durante 15 min seguido de la adición de 15 pl de tampón Stop Tagment (ST) y luego se incubó a temperatura ambiente durante 5 min adicionales. Las muestras se colocaron en un imán y se eliminó el sobrenadante. Las perlas se volvieron a suspender en 50 pl de NEM (Illumina) y se incubaron a 72 °C durante 5 min, seguido de enfriamiento hasta 10 °C. Las muestras se colocaron en un imán y el sobrenadante se retiró y se lavó en tampón de lavado HT2 (Illumina).

Las reacciones de PCR se prepararon añadiendo 40 pl de EPM, 10 pl de cada cebador índice (p. ej., P5'-índice-A14' y P7'-índice-B15') y agua. La amplificación por PCR se realizó de la siguiente manera: 72 °C durante 3 min; 98 °C durante 30 s seguido de 10 ciclos de 98 °C durante 10 s; 65 °C durante 30 s; 72 °C durante 60 s. Los productos de PCR se trataron con 5 pl de la mezcla de enzimas USER (1 U/pl - número de componente NEB M5505L) y se incubaron a 37 °C durante 30 min, seguido de una selección por tamaño, usando perlas paramagnéticas AMPure XP basadas en SPRI (Inmovilización Reversible en Fase Sólida) (n.° de catálogo de Beckman Coulter A63880) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En primer lugar, se mezclaron 100 pl de producto de PCR tratado con USER con 55 pl de agua y 105 pl de perlas paramagnéticas. La muestra se dejó fuera del imán durante 5 min, en el imán durante 5 min, seguido de la eliminación del sobrenadante en una segunda selección por tamaño (250 pl de sobrenadante 30 pl de perlas paramagnéticas). Las perlas se lavaron en etanol al 80 %, se secaron al aire y se eluyeron en 25 pl de RSB (Illumina).

El enriquecimiento de las muestras seleccionadas por tamaño y tratadas con enzimas USER se realizó con un panel de sondas TruSight One (Illumina) de acuerdo con el protocolo del kit de enriquecimiento de captura rápida NEXTERA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Illumina). Las muestras se secuenciaron en un HiSeq 2500 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Illumina).

Tabla 1: Enriquecimiento de lectura usando escisión enzimática de un enlazador escindible

Como se muestra en la Tabla 1, practicar la tagmentación y el enriquecimiento basados en soluciones (p. ej., Enriquecimiento de Captura Rápida NEXTERA) dio como resultado un 70 % de enriquecimiento de lectura. El % de enriquecimiento de lectura fue significativamente menor al 45% usando transposomas fijados a perlas a través de un enlazador que contiene uracilo pero sin el tratamiento de escisión enzimática. Sin embargo, cuando los uracilos en el enlazador se escinden mediante tratamiento enzimático, el enriquecimiento aumentó al 67 %, recuperando así el enriquecimiento al nivel de tagmentación y enriquecimiento sin inmovilización o basados en solución.

Ejemplo 4: Enriquecimiento con Exoma de 6 plex y 12 plex con y sin escisión enzimática de un enlazador de uracilo

El siguiente ejemplo demuestra un experimento de enriquecimiento con Exoma que usa un enlazador de 5 timinas (5T) en comparación con un enlazador de dos timinas y 3 uracilos (2T3U) sin escisión enzimática y con escisión enzimática (2T3U+ENZ) en comparación con el Kit TruSeq Rapid Exome (Illumina ).

El procedimiento experimental fue como se describe para el Ejemplo 3, excepto que se usaron 7,5 pl de perlas inmovilizadas con transposoma y se omitió el etapa de llenado de huecos. El enriquecimiento se realizó con el kit TruSeq Rapid Exome (Illumina). La secuenciación se realizó en HiSeq 2500 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Illumina).

Tabla 2: Enriquecimiento de lectura con Exoma usando escisión enzimática del enlazador

Como se muestra en la Tabla 2, solo el enlazador 2T3U con escisión enzimática mostró métricas de enriquecimiento comparables a NEXTERA basado en solución usando el kit TruSeq Rapid Exome (Illumina) o la tagmentación basada en superficie estándar con residuos 5T.

Ejemplo 5: Comparación de métodos de oligonucleótidos con adaptadores biotinilados en 5' y 3'

Ciertos enfoques de tagmentación basados en perlas usan secuencias adaptadoras que están biotiniladas en el extremo 5 'como se muestra en la FIG. 5A. Brevemente, los oligonucleótidos adaptadores biotinilados en 5' 501 y 502 unen transposomas a la superficie. El evento de tagmentación crea ADN genómico completo fragmentado y biotinilado en 5' que puede contaminar un etapa de enriquecimiento posterior. En una realización, la unión de biotina se cambia a una posición 3' en la cadena complementaria (segundo transposón) para unir transposomas a la superficie, como se muestra en la FIG. 5B. Brevemente, los oligonucleótidos 50l y 502 están libres de biotina. En este ejemplo, la biotina se une a la secuencia final del transposón 503 en la cadena complementaria (secuencia ME'). En esta configuración, el evento de tagmentación crea fragmentos de ADN genómico libres de biotina.

En otro aspecto adicional, un enlazador está entre el oligonucleótido 503 en 3' y la biotina. Esto puede ayudar a reducir cualquier impedimento estérico para la actividad de transposición que pueda ocurrir en la superficie sólida.

El siguiente ejemplo demuestra el uso de oligonucleótido biotinilado en 3' con un enlazador de Fórmula (I(a)) (enlazador de tipo glicerol) en la preparación de bibliotecas de secuenciación. Como reacción de control, el ADN se tagmentó y las bibliotecas se prepararon y enriquecieron siguiendo el protocolo de enriquecimiento de captura rápida NEXTERA, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Illumina). Se siguió el protocolo experimental descrito en el Ejemplo 3 excepto que el ADN amplificado tagmentado se enriqueció usando el protocolo del kit de captura de hibridación Xgen Lockdown (Integrated DNA Technologies, IDT) usando un panel Exome siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Fundamentalmente, se observó un enriquecimiento inferior al óptimo en general, ya que se usaron oligonucleótidos de bloqueo subóptimos como un sustituto de los oligonucleótidos de bloqueo universales recomendados suministrados con el kit de bloqueo Xgen. Sin embargo, el enfoque del experimento no requiere sondas de bloqueo óptimas, solo la capacidad de observar un cambio medible en el enfoque del experimento. No se espera que los oligonucleótidos de bloqueo subóptimos afecten el enfoque del experimento.

Tabla 3: Porcentaje de enriquecimiento de lectura para adaptadores 3' biotinilados, 3'-espaciador-biotina, 5' biotinilados en comparación con la tagmentación basada en solución

Como se ve en la Tabla 3, la biotina en 5' con enlazador de uracilo escisión enzimática mostró un enriquecimiento significativamente menor en comparación con el control y la biotina en 3' (con o sin enlazador). El menor enriquecimiento de lectura con biotina en 5' con enlazador de uracilo método de escisión enzimática puede ser el resultado de una escisión incompleta por la mezcla de enzimas. Se demostró que los experimentos con la conexión en 3' lograron un enriquecimiento de lectura comparable al control basado en solución.

Ejemplo 6: Preparación de perlas biotiniladas P para Inserto Pequeño (de 150 a 200 pb)

Etapa 1. Transposones de hibridación

A14-ME y B15-ME se hibridaron cada uno con el oligo ME'-Enlazador-Biotina (preparación discutida más adelante) lo que dio como resultado dos complejos de doble cadena, ambos con el extremo en mosaico (ME) reconocido específicamente por la transposasa y la secuencia A14 o B15 usada en la PCR para añadir adaptadores secundarios. Los oligos A14-ME, B15-ME y ME' se resuspendieron a 200 nM. En una placa de PCR de 96 pocillos, se añadieron las preparaciones que se muestran en la Tabla 4 a continuación en 2 pocillos (1 pocillo para A14:ME' y 1 pocillo para B15-ME'). La placa de pocillos se colocó en un termociclador durante 10 min a 95 °C, y luego se retiró del termociclador y se colocó en una mesa de trabajo a temperatura ambiente durante dos horas.

Tabla 4. Condiciones de preparación para las reacciones de hibridación (50 pM)

Etapa 2. Formación de transposomas

La transposasa Tn5 se añadió a los transposones hibridados anteriores formando un complejo de transposoma que contenía los complejos A14-ME/ME'-Enlazador-Biotina y B15-ME/ME'-Enlazador-Biotina. Los oligos hibridados preparados en el etapa anterior se usaron para configurar las siguientes reacciones en una placa de PCR de 96 pocillos. Había un pocillo para A14-ME y otro para B15-ME. Cada pocillo se incubó en un termociclador durante toda la noche a 37 °C, lo que proporcionó dos poblaciones de complejos de transposoma; luego se mezcló el contenido de los dos pocillos. Después del etapa de mezclado, se extrajeron aproximadamente 220 pl y se añadieron a otro pocillo. Se añadieron aproximadamente 220 pl de tampón de almacenamiento estándar (440 pl en total).

Tabla 5. Condiciones de formación de transposomas

Etapa 3. Carga de perlas con estreptavidina

Se añadieron a perlas de estreptavidina los complejos de transposoma formados anteriormente que contenían un enlace de biotina. Se puede ajustar la densidad de los complejos en las perlas para controlar el tamaño del inserto en los productos de tagmentación. Las perlas de estreptavidina se mezclaron bien. Se colocaron aproximadamente 200 pl de perlas de estreptavidina en un tubo de 1,5 ml y se colocaron en un imán de tubo. Las perlas se lavaron dos veces con 1 ml de HT1 y, a continuación, las perlas se volvieron a suspender y se centrifugaron entre lavados. Después del segundo lavado, las perlas se resuspendieron por completo con 600 pl de HT1. Se añadieron 400 pl del complejo de transposoma elaborado anteriormente al tubo con el HT1. La mezcla se mezcló en un mezclador rotatorio durante 1 hora y se colocó en un imán y se eliminó el sobrenadante. La mezcla se volvió a suspender en 500 pl de tampón de almacenamiento estándar al 15%. Las perlas se cargaron en presencia de complejos de transposoma 1.000 nM y los complejos resultantes de densidad 1.000 nM se diluyeron y almacenaron diluidos a una concentración de 400 nM. Por lo tanto, la solución madre incluía perlas con una densidad de complejo de 1.000 nM, diluida a una concentración de 400 nM. El etapa de dilución no cambia la densidad de los complejos en las perlas, sino solo la concentración final de complejos en la solución madre.

Etapa 4. Tagmentación

Se tagmentó una muestra de ADN para hacer fragmentos usando los transposomas cargados en perlas para cortar y añadir la secuencia del transposón a las muestras de ADN. En una placa de PCR de 96 pocillos, se combinaron tampón de tagmentación Mg 5x (10 pl), ADN (>50 ng; 10 pl), dH2O (20 pl) y perlas de transposoma (preparadas como en el Etapa 3; 10 pl). La mezcla se mezcló bien y se incubó a 55 °C durante 5 min seguido de 2 min a 20 °C. El proceso de tagmentación se detuvo inactivando la enzima transposasa mediante tratamiento con SDS. Se añadieron 10 pl de SDS y se mezclaron bien con la mezcla de reacción del etapa anterior. Luego, la mezcla se incubó a temperatura ambiente en la mesa de trabajo durante 5 minutos y se colocó en un agitador magnético. Una vez que la solución se volvió transparente, se eliminó el sobrenadante.

Etapa 5. Lavado de parada de tagmentación

El SDS se eliminó por lavado de las perlas para preparar la muestra para la PCR. La mezcla de reacción se retiró del imán después de detener la tagmentación y se añadieron 100 pl de tampón de lavado. La muestra se agitó durante 20 s a 1.600 rpm. Luego se colocó de nuevo en un agitador magnético y, una vez que la solución se volvió transparente, se eliminó el sobrenadante. El etapa de lavado se repitió un total de tres veces. Una vez finalizado el lavado, se eliminó todo el sobrenadante y se retiró la muestra del agitador magnético.

Etapa 6. PCR

La muestra del Etapa 5 se amplificó por PCR con cebadores que reconocen A14 y B15 y se añadieron adaptadores secundarios. Los cebadores también incluyen secuencias índice y cebadores de secuenciación (P5 y P7). La mezcla maestra que se muestra en la Tabla 6 se añadió a cada pocillo de muestra. Las perlas se volvieron a suspender en la mezcla maestra y se colocaron en un termociclador usando el programa que se muestra en la Tabla 7. Esta etapa sirvió para eliminar la cadena no transferida/biotinilada, extender y amplificar para introducir P5 y P7, todo en un solo proceso.

Tabla 6. Mezcla maestra de PCR

Tabla 7. Programa termociclador

La muestra se retiró del termociclador y se colocó en un agitador magnético. A continuación, se transfirieron 45 pl de la muestra de la placa de PCR a una placa MIDI. Se añadieron 77 pl de agua a las muestras de la placa MIDI y 88 pl de perlas Ampure SPRI a cada muestra/agua. La mezcla se mezcló bien, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en el agitador magnético. Una vez que la solución se volvió clara, se agregaron 200 pl de la muestra a un nuevo pocillo en la misma placa MIDI. Se añadieron 20 pl de perlas Ampure SPRI y la muestra se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se colocó nuevamente en un agitador magnético.

Una vez que la solución se volvió transparente, se retiró el sobrenadante y se descartó. La placa se dejó en el agitador magnético y se añadieron 200 pl de etanol al 80 % sin perturbar el sedimento. Posteriormente se eliminó el etanol. El etapa de lavado con etanol se repitió un total de dos veces más. Una vez que se completó el lavado, se eliminó el exceso de etanol con una pipeta mientras la placa estaba en el agitador. La muestra se secó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 27 pl de agua y se mezcló bien. La muestra se dejó a temperatura ambiente durante 2 min y se volvió a colocar en el agitador magnético. Se transfirieron 25 pl de la muestra a una placa limpia y se almacenó a -20 °C.

Ejemplo 7. Transposones A14-ME y B15-ME

Los transposones A14-ME y B15-ME se hibridaron cada uno con ME' que contenía una biotina en 3'. La biotina en 3' se acopló a ME' para formar enlazadores 3'-(I(a)) y 3'-(I(c)). La reacción de hibridación fue en un volumen de 25 pl usando un tampón de NaCl. Cada uno de los transposones de doble cadena resultantes se acomplejó con transposasa en reacciones durante toda la noche a 37 °C. Después de que se formaron los complejos de transposomas, los complejos de transposoma A14 y B15 se mezclaron en volúmenes iguales y se cargaron en perlas de estreptavidina a una concentración de 300 nM para producir complejos unidos a una densidad de 300 nM. Una vez unidos a las perlas, las mezclas de densidad de 300 nM (I(a)) y (I(c)) se diluyeron adicionalmente hasta una concentración de 120 nM. Así, las perlas todavía tienen una densidad de 300 nM, pero los complejos están presentes en una concentración de 120 nM en la solución diluida. El etapa de dilución no cambia la densidad de los complejos en las perlas y, por lo tanto, afecta al rendimiento de la biblioteca, pero no al tamaño del inserto.

Los dos tipos resultantes de transposomas unidos a perlas, 3'-(I(a)) y 3'-(I(c)), se almacenaron a 25 °C durante 28 y 56 días. Las ecuaciones de Arrhenius estiman que estos se aceleren hasta 4 (28 días) y 8 (56 días) meses. Una vez finalizada la fecha acelerada, los dos tipos de transposomas unidos a perlas se sometieron a etapas de tagmentación y preparación de bibliotecas como se discutió anteriormente para evaluar la actividad de los transposomas.

Los complejos de transposomas unidos a perlas se añadieron al ADNg junto con un tampón a base de magnesio y se colocaron a 55 °C durante 5 minutos. Una vez completado, se añadió tampón SDS a la reacción y se dejó incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, la mezcla se colocó en un agitador magnético y se lavó tres veces con un tampón de NaCl y T ris. Después de los lavados, se añadió a las perlas una mezcla maestra de PCR con transportadores de adaptadores secundarios que comprendían secuencias índice y se resuspendió por completo. Luego, la muestra se amplificó por PCR para crear amplicones adicionales. Después de la PCR, se realizó una limpieza SPRI para eliminar los transportadores adicionales. Las muestras se analizaron en un BioAnalyzer para medir la actividad (rendimiento del método de preparación de la biblioteca). Como se muestra en la FIG. 6A, se compararon los rendimientos de biblioteca a partir de la tagmentación en fase sólida basada en perlas de estreptavidina usando complejos de transposoma que tienen el enlazador biotinilado en 3' de Fórmula (I(a)) (3'-(I(a)); enlazador de glicerol) y Fórmula (I(c)); (3'-(I(c)); enlazador hexilo). El enlazador 3'-(I(c)) proporcionó un rendimiento de biblioteca significativo. El enlazador 3'-(I(a)) proporcionó un rendimiento más bajo, pero todavía un rendimiento secuenciable. La línea LSC en la figura era un límite de especificación inferior arbitrario.

La FIG.6B ilustra los datos de estabilidad acelerada de la biblioteca de muestras preparada a partir de la tagmentación en fase sólida basada en perlas de estreptavidina usando un complejo de transposoma que tiene el enlazador 3'-(I(a)) después de envejecimiento durante 4 meses (condición de almacenamiento acelerado a 25 °C durante 28 días), en comparación con una biblioteca de muestras preparada a partir de un control no envejecido del mismo enlazador a 4 °C durante 28 días. La FIG.6C muestra los datos de estabilidad acelerada de la biblioteca de muestras preparada a partir de un complejo de transposoma que tiene el enlazador 3'-(I(c)) después de un envejecimiento de 4 meses y 8 meses (condición de almacenamiento acelerado a 25 °C durante 28 días y 56 días), en comparación con bibliotecas de muestras preparadas a partir de controles no envejecidos del mismo enlazador a 4 °C durante 28 días y 56 días respectivamente.

Ejemplo 8. Transposones A14-ME y B15-ME

Los transposones A14-ME y B15-ME se hibridaron cada uno con ME' que contenía una biotina en 3'. La biotina en 3' se acopló al ME' a través del enlazador 3'-(I(c)). La reacción de hibridación se realizó en un volumen de 25 pl usando un tampón de NaCl. Cada uno de los transposones de doble cadena resultantes se unió a la transposasa en reacciones durante toda la noche a 37 °C. Después de que se formaron los transposomas, los complejos de transposoma A14 y B15 se mezclaron en volúmenes iguales y se cargaron en perlas de estreptavidina a varias densidades (de 10 nM a 800 nM).

Los transposomas unidos a perlas a varias densidades se añadieron al DNAg junto con un tampón a base de magnesio y se colocaron a 55 °C durante 5 minutos. Una vez completado, se añadió un tampón SDS a la reacción y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se colocó la mezcla en un agitador magnético y se lavó tres veces con un tampón NaCl y Tris. Después de los lavados, se añadió a las perlas una mezcla maestra de PCR con transportadores de adaptadores secundarios que comprendían secuencias índice y se resuspendieron por completo. A continuación, se realizó una reacción de PCR en las muestras para amplificar los fragmentos. Después de la PCR, se realizó una selección de tamaño SPRI a varias proporciones de SPRI que dieron como resultado diferentes tamaños de inserto. Las muestras se analizaron en un BA y un HiSeq 2500 Rapid Output para medir la actividad.

La FIG. 7A muestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de ADN en función de la densidad de las perlas usando la preparación de la biblioteca en fase sólida basada en perlas de estreptavidina donde las perlas comprenden un complejo de transposoma inmovilizado unido a ellas a través de 3'-(I(c)). La FIG. 7B muestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de ADN en función de la condición SPRI usando perlas de estreptavidina con un complejo de transposoma inmovilizado que comprende una transposasa Tn5 hiperactiva y el enlazador 3'-(I(c)), con una densidad de complejo de 100 nM; y la FIG. 7C muestra el tamaño del inserto diana de las moléculas de a Dn en función de la condición SPRI usando perlas de estreptavidina con un complejo de transposoma inmovilizado que comprende una transposasa Tn5 hiperactiva y el enlazador 3'-(I(c)), con una densidad de complejo de 600 nM.

Ejemplo 9. Protocolo integrado de extracción para sangre y saliva

Se procesó sangre completa fresca usando el kit Flex Lysis Reagent (Illumina, n.° de cat. 20015884). Se extrajo sangre completa fresca en tubos de extracción con EDTA y se almacenó a 4 °C antes del procesamiento. Se preparó una mezcla maestra de lisis mezclando los siguientes volúmenes para cada muestra: 7 pl de tampón de lisis de sangre, 2 pl de proteinasa K y 31 pl de agua libre de nucleasas. Para cada muestra, se añadieron 10 pl de sangre, 40 pl de la mezcla maestra de lisis y 20 pl de perlas SPRI a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y se mezcló pipeteando la solución 10 veces. La placa se selló y se incubó durante 10 minutos a 56 °C en un termociclador con tapa calentada. A continuación, la placa se colocó en un imán de placa durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se añadieron 150 pl de etanol al 80 %. Después de la incubación durante 30 segundos en el imán, se descartó el etanol y se retiró la placa del imán. Las perlas se resuspendieron en 30 pl de agua y quedaron listas para la preparación de la biblioteca.

La saliva se recogió en tubos Oragene DNA Saliva Collection (DNA Genotek, n.° de cat. OGR-500, OGD-510), que se incubaron durante al menos 1 hora a 50 °C para lisar las células antes de mezclarlas por completo mediante agitación vorticial. Para cada muestra, se añadieron 20 pl de agua y 30 pl de saliva a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y se mezclaron lentamente mediante pipeteo. Luego se añadieron 20 pl de perlas SPRI al pocillo de la muestra y las perlas se mezclaron completamente pipeteando la solución 10 veces. La placa se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de colocarla en un imán de placa durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 150 pl de etanol al 80 % al sedimento de perlas. A continuación, se dejó reposar la placa durante 30 segundos sobre el imán antes de retirar el etanol y luego retirar la placa del imán. Las perlas se resuspendieron en 30 pl de agua y quedaron listas para la preparación de la biblioteca.

Se han descrito varios aspectos. No obstante, se entenderá que se pueden realizar diversas modificaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un complejo de transposoma que comprende:

(i) una transposasa,

(ii) un primer transposón que comprende:

(a) una porción 3' que comprende una secuencia final del primer transposón; y

(b) una primera secuencia adaptadora en el extremo 5' de la secuencia final del primer transposón;

(iii) un segundo transposón que comprende una secuencia final del segundo transposón complementaria a al menos una porción de la secuencia final del primer transposón; y

(iv) un enlazador unido al segundo transposón y que comprende un elemento de afinidad, en donde el enlazador está unido al segundo transposón en el extremo 3' del segundo transposón, opcionalmente en donde un segundo extremo del enlazador está unido al elemento de afinidad.

2. El complejo de la reivindicación 1, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (I):

en donde:

AE es el elemento de afinidad;

Y es alquileno C2-6;

X1 es O, NR1, o S;

en donde R1 es H o alquilo C1-10;

n es un número entero de 1 a 6;

X2 es O, CH2, o S;

Ra es H u -OH; y

Z está ausente cuando Ra es H, o es CH2 cuando Ra es H u OH;

en donde >~w marca el punto de conexión con el segundo transposón, en donde opcionalmente el grupo fosfato en la Fórmula (I) está conectado a un hidroxilo 3' del nucleótido terminal del segundo transposón.

3. El complejo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde está presente una o más de las siguientes características:

(i) AE comprende o es una biotina opcionalmente sustituida o un grupo amino, en donde AE es opcionalmente biotina;

(ii) Y es alquileno C2-6, alquileno C2-5, alquileno C2-4, o alquileno C2-6, opcionalmente en donde Y es etileno, propileno o butileno;

(iii) X1 es NR1, en donde R1 es H o alquilo C1-10;

(iv) n es 1 o 2;

(v) X2 es CH2 u O; y;

(vi) Ra es H y Z está ausente; Ra es H y Z es CH2, o Ra es -OH y Z es CH2.

4. El complejo de la reivindicación 2, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (I'):

en donde Z está ausente o es CH2.

5. El complejo de la reivindicación 2, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (Ia):

6. El complejo de la reivindicación 2, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (Ib) o (Ic):

donde n es 1 o 2;

X2 es O o CH2; y

Z está ausente o es CH2.

7. El complejo de la reivindicación 2, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen una estructura seleccionada del grupo que consiste en:

8. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la transposasa es una transposasa Tn5, opcionalmente en donde la transposasa Tn5 es una transposasa Tn5 de tipo salvaje o una transposasa Tn5 hiperactiva, o un mutante de esta, en donde la transposasa está opcionalmente conjugada con un marcaje de purificación, y opcionalmente en donde la secuencia final del primer transposón y la secuencia final del segundo transposón son ME y ME'.

9. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la primera secuencia adaptadora comprende una secuencia de cebador.

10. El complejo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la primera secuencia adaptadora comprende una primera secuencia de cebador, en una mezcla que comprende un segundo complejo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la primera secuencia adaptadora del segundo complejo comprende una segunda secuencia de cebador, opcionalmente en donde la primera secuencia de cebador comprende A14 y la segunda secuencia de cebador comprende B15.

11. Un oligonucleótido modificado que comprende un primer transposón y un segundo transposón, en donde el primer transposón comprende (a) una porción 3' que comprende una secuencia final del primer transposón y (b) una primera secuencia adaptadora en el extremo 5' de la secuencia final del primer transposón, y el segundo transposón comprende una secuencia final del segundo transposón complementaria a al menos una porción de la secuencia final del primer transposón y se hibrida con esta, y en donde un primer extremo de un enlazador está unido al extremo 3' del segundo transposón y un segundo extremo del enlazador está unido a un elemento de afinidad.

12. El oligonucleótido modificado de la reivindicación 11, en donde el enlazador y el elemento de afinidad tienen la estructura de Fórmula (I), (I'), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b )), o (I(c)) como en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

13. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el elemento de afinidad está unido a una pareja de unión por afinidad sobre un soporte sólido, a través del cual está unido el complejo al soporte sólido, opcionalmente en donde el elemento de afinidad es biotina y la pareja de unión por afinidad es estreptavidina.

14. Un método para generar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico marcados a partir de un ácido nucleico diana de doble cadena, que comprende incubar el ácido nucleico diana con el complejo unido de acuerdo con la reivindicación 13 en condiciones suficientes para fragmentar el ácido nucleico diana en una pluralidad de fragmentos diana, y para unir el extremo 3' del primer transposón con los extremos 5' de los fragmentos diana para producir una pluralidad de fragmentos diana marcados en 5'.

15. Un método para preparar un complejo de transposoma unido a un soporte sólido, que comprende tratar una transposasa con el oligonucleótido modificado de la reivindicación 11 en condiciones suficientes para unir la transposasa y el oligonucleótido modificado en un complejo de transposoma.