CN111139533A

CN111139533A - 稳定性增加的测序文库接头

Info

Publication number: CN111139533A
Application number: CN201910927138.9A
Authority: CN
Inventors: 冯延叶; 柴智; 张会; 赖煦卉; 孙大鹏
Original assignee: Shanghai Yingji Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yingji Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: CN111139533B

Abstract

本发明公开了一种稳定性增加的测序文库接头。采用本发明的测序文库接头其建库产量优于或等于其他测序平台的接头；本发明的测序文库接头连接效率优秀，可减少接头二聚体的产生，用以满足科研单位及企业对于华大测序平台的需要。

Description

稳定性增加的测序文库接头

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种稳定性增加的测序文库接头。

背景技术

最早出现的测序方法即一代测序是由1977年Sanger发明的末端终止测序法和同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明的化学降解法。其中Sanger法测序读长可达1000bp,准确性高达99.999％，但是测序成本高,通量低等方面的缺点,已经不能完全满足研究的需要。随着科学技术的不断发展，人们对测序方法的不断改进与开发，第二代测序应运而生。新一代的测序因其具有费用更低、通量更高、速度更快等优势，进而迅速占据了测序行业的大部分市场，其中以Roche，illumina等国外测序平台为主。

随着我国技术的飞速发展，深圳华大基因股份有限公司(以下简称“华大基因”)也开发出一套自己的测序平台，弥补了我国测序平台的空白。华大基因的测序平台相比illumina等国外的测序平台价格便宜，测序数据又能够达到illumina等公司的水平，所以越来越被国内企业与科研单位所接受。

现在建库试剂盒中的接头主要有三种经典结构：即平端双链接头，U型结构接头和Y字型双链接头(图1、3所示)。与华大测序平台配合使用的接头较少，市场已出现的接头大都连接效率低，不利于一些含量较低样本的基因检测，影响检测的准确性与特异性，亟需开发出一种高连接效率的接头。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种稳定性增加的测序文库接头，具有连接效率高、稳定性好、建库产量高的特点，特别适用于华大测序平台。

为实现上述目的，本发明提供了一种窄泡形测序文库接头，它是通过改造现有U型结构接头所得；

所述U型结构接头包括两条链，其中一条链长于另一条链，且和另一条链的两端序列互补，两条链中间不互补部分形成突出的单个泡形结构；

所述窄泡形测序文库接头通过顺序替换两条链不互补的碱基为互补碱基，使得两条链不互补碱基数缩小为0～2个，从而使原有泡形结构变为狭长形泡形结构，泡形结构的数量不变。

上述方案的一种实施方式为，所述窄泡形测序文库接头的核苷酸序列如SEQ No.3和SEQ No.4所示。

本申请发明人研究发现，改进所得的窄泡形测序文库接头通过增加序列两臂的结合位点(如图2所示)，将泡型结构的开口由宽开口变成窄开口，可以减小张口之间所形成的张力，泡型结构两端的双链不易发生解链，使得结构更稳定。

本发明还提供了一种端部互补U型测序文库接头，它通过改造现有不对称Y型双链接头所得；

所述不对称Y型双链接头包括两条链，较长链和较短链；较长链长于较短链，较长链和较短链的仅一端序列互补，另一端不互补；

所述端部互补U型测序文库接头通过在较长链的不互补端向外增加与较短链互补的序列，且较长链上增加的序列与较短链上的不互补序列反向互补，使得较短链上与较长链上的不互补碱基数为0～6个；较长链与较短链配对结合后，其上原不互补的Y型区域成为单个泡形结构，位于较长链与较短链的端部。

上述方案的一种实施方式为，所述端部互补U型测序文库接头的核苷酸序列如SEQNo.5和SEQ No.6所示。

本申请发明人研究发现，将开放式的Y型端口，改为互补的U型端(如图4所示)，加入互补序列有效保证了泡型结构的张力过大而导致接头解链现象，同时有效地减少了接头二聚体，提高接头的连接效率。

本发明的有益效果：采用本发明的测序文库接头其建库产量优于或等于其他测序平台的接头；本发明的测序文库接头连接效率优秀，可减少接头二聚体的产生，用以满足科研单位及企业对于华大测序平台的需要。

附图说明

图1为现有技术中U型结构接头的结构示意图。

图2为现有技术中不对称Y型双链接头的结构示意图。

图3为本发明的窄泡形测序文库接头的结构示意图。

图4为本发明的端部互补U型测序文库接头的结构示意图。

图5为现有技术中Illumina短接头的结构示意图。

图6为同一样本1ng投入量下采用不同接头产生二聚体数量比较。

图7为同一样本10ng投入量下采用不同接头产生二聚体数量比较。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中所采用的未标明出处的序列均为人工合成。

实施例1：接头建库测试

一、Ecoli gDNA样本制备

取大肠杆菌菌液，选择细菌基因组提取试剂盒提取Ecoli gDNA依据说明书进行提取。提取后建库投入50ng，接头采用B1(B1为双链接头，B1R1序列如SEQ No.1，B1R2序列如SEQ No.2)，B2(B2为双链接头，B2 R1序列如SEQ No.3，B2R2序列如SEQ No.4)，B3(B3为双链接头，B3R1序列如SEQ No.5，B3R2序列如SEQ No.6)每组实验两个重复，并用Illumina短接头(如图5所示)作对照。

二、DNA文库构建

本实施例中，使用ABclonal商业化Mega with DDREs DNA Lib Prep Kit for MGI(RK20241)构建DNA文库，具体的文库准备步骤详见商业化试剂盒操作说明书。以下所示是基本的DNA文库构建步骤：

1、End Prep Reaction

1.1、配制反应体系如下

1.2运行反应程序

30℃/30min,65℃/30min,4℃/hold.

2、Ligation

2.1配制反应体系如下

组分	体积
		End Prep Product	60μl
H<sub>2</sub>O	5μl
		Ligation Buffer	30μl
Ligase Enzymes	10μl
		adapter(15μm)	5μl
Total volume	110μl

2.2运行反应程序

20℃/15min,12℃/hold.

3、Post-ligation Cleanup

按照1.0×AMPure XP磁珠比例进行DNA纯化。42μl洗脱磁珠。取40μl adapter-ligated DNA用于后续PCR反应。

4、PCR

4.1配制反应体系如下

组分	体积
		Adapter-ligated DNA	40μl
MGI PCR Index	5μl
		MGI Universal Primer	5μl
MGI 2X PCR Mix	50μl
		Total volume	100μl

4.2运行反应程序

98℃/45s；7cycles(98℃/15s,60℃/30s,72℃/30s)；72℃/1min；4℃/hold.

5、Post-PCR Cleanup

使用1.0×AMPure XP DNA纯化磁珠进行DNA的PCRcleanup。51μl水洗脱磁珠。

三、文库定量

使用Qubit对文库进行定量，定量结果定表6：

本设计中的接头B3的建库产量优于Illumina短接头，说明本发明接头连接效率高。

实施例2：接头不同模板不同投入量测试

一、Human gDNA，FFPE样本制备

取人样本组织，选择合适的基因组提取试剂盒提取Human gDNA依据说明书进行提取。取经石蜡固定样本，利用二甲苯提取方法，对FFPE样本进行提取。提取后经机械打断后浓度分别为24.6ng/ul；19ng/ul，150bp左右。建库投入50ng，10ng，1ng每组实验两个重复。

二、DNA文库构建

(1)具体建库流程与实施例1中建库流程相同

(2)接头浓度都为15μm

(3)循环数按照下表进行

三、文库定量

使用Qubit对文库进行定量，定量结果如下表所示：

本设计中的B1，B2，B3接头在50ng投入量下建库产量相差较小；10ng，1ng投入量时，B3接头在较差样本种的建库产量最高，继而说明B3接头连接效率更高。

四、2100分析

实施例2中制备好的DNA文库可用Agilent 2100Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围，结果见图6、7。本发明经2100分析发现在10ng投入量及以下越差的样本产生的接头二聚体越多(样本为FFRE)。其中B1接头二聚体较多，且大小呈现阶梯状增加，这说明B1接头不够稳定，发生自连；B2，B3接头表现比较稳定，接头二聚体产生比较少，且不会发生阶梯状增加现象。对于10ng以下投入量，只需将接头浓度降低，就可降低或消除接头二聚体的产生。

序列表

<110> 上海英基生物科技有限公司

<120> 稳定性增加的测序文库接头

<130> 20190924

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> B1R1

<400> 1

ttgtctacct aaggaacgac atgcctacga tccgactt 38

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> B1R2

<400> 2

agtcggaggc caagcggtct taggaagaca a 31

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> B2R1

<400> 3

gaccgcttgg ccgaacgaca tggctacgat ccgactt 37

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> B2R2

<400> 4

agtcggaggc caagcggtc 19

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> B3R1

<400> 5

ccggttcgcc aggaacgaca tggctacgat ccgactt 37

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> B3R2

<400> 6

agtcggaggc caagcggtc 19

Claims

1.一种窄泡形测序文库接头，其特征在于：所述窄泡形测序文库接头通过改造现有U型结构接头所得；

2.一种端部互补U型测序文库接头，其特征在于：所述端部互补U型测序文库接头通过改造现有不对称Y型双链接头所得；

3.根据权利要求1所述的窄泡形测序文库接头，其特征在于：所述窄泡形测序文库接头的核苷酸序列如SEQ No.3和SEQ No.4所示。

4.根据权利要求2所述的端部互补U型测序文库接头，其特征在于：所述端部互补U型测序文库接头的核苷酸序列如SEQ No.5和SEQ No.6所示。