CN107586847A

CN107586847A - 一种环形接头及其应用

Info

Publication number: CN107586847A
Application number: CN201711039852.1A
Authority: CN
Inventors: 赵新泰; 王明; 潘文健
Original assignee: Shanghai Saian Biological Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Current assignee: Beijing Zhongmei Technology Co ltd
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2037-10-30
Also published as: CN107586847B

Abstract

本发明涉及一种基于Ion Torrent二代测序平台的环形接头包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签和Ion接头A的部分序列和互补序列区域；互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。本发明的环形接头相对于普通接头更稳定能够实现高效、高灵敏度与低成本的二代文库构建，实验操作简单。

Description

一种环形接头及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于Ion Torrent二代测序平台的环形接头，以及该环形接头的应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。

新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion Torrent^TM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的快速发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。

二代测序技术靶向测序同样具有巨大优势，由于测序的区域小，可以对某些区域进行深度测序，使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多，适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序，得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。虽然高通量测序在肿瘤诊断方面应用前景广阔，但当下仍存在技术上的不足限制了其更为深入的应用，如：针对cfDNA的检测，其检测灵敏度有必要进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够更稳定地实现高效、高灵敏度与低成本的二代文库构建，实验操作简单的环形接头，以及该环形接头的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种环形接头，包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。

上述Ion接头A部分和互补序列区域通过自身折叠互补的序列相间隔，所述互补序列区域中与Ion接头A部分互补的序列和与样本barcode互补的序列通过与正负链标签相同的序列相间隔。

上述任意碱基区域是12个随机碱基。

上述正负链标签为1个碱基。

上述样本barcode区域的碱基个数为8个。

上述Ion接头A部分的碱基个数为15个。

上述环形接头还包括设置在5’端的磷酸化修饰和公共序列，所述公共序列的碱基个数为13～16个。

上述环形接头的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：上述环形接头用于I onTorrent二代测序平台中文库构建的应用。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明的环形接头基于Ion Torrent二代测序平台，具有灵敏度高，特异性强，与样本DNA连接效率高，可以提高低频突变的灵敏度等特点，最低可以检测出样本DNA中0.01％的突变，满足了对cfDNA中极少量突变ctDNA检出的要求。

(2)本发明的环形接头是独特的闭环接头，包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的互补序列区域，相对于普通接头更稳定，连接效率更高。任意碱基区域有12个随机碱基，理论上能够产生4¹²种分子标签序列，以确保将每个源分子带上独一无二的分子标签，从而使建库和测序过程中引入的错误降到最低，提高检测突变的灵敏度。正负链标签为1个固定的碱基，相较于现有的多碱基随机正负链标签，有效的节约了测序读长并简化了对链标签的分析。样本barcode碱基序列为8个，能够识别不同样本的片段化产物。

(3)本发明的环形接头中包括单碱基链标签，可以根据该碱基区分DNA双链正义链和反义链，更进一步提高了其灵敏度。

(4)本发明的环形接头中5’端磷酸化有利于文库构建中与接头序列结合。

附图说明

图1是本发明实施例的环形接头的溶解曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

主要试剂：

所有试剂购买自正规厂家，接头反应试剂包括：Klenow片段(3’→5’exo-，北京NEB，货号：M0212V)、dTTP(上海博彩生物科技有限公司，货号：C2104)VAhtstm Nano DNAlibrary prep Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司End Prep Mix，货号：602-02)；文库构建试剂包括：VAhtstm Nano DNA library prep Kit(诺唯赞包括dA-Tailing Mix、LigationMix、Amplification Mix2，货号：602-02)、Takara Taq HS试剂(大连宝生物，货号：AC1401A)。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与Ion Torrent二代测序平台相配套，包括PGM Template OT2kit和Ion 316chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂：75％乙醇(100％乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。

主要仪器：

PCR仪(厂家：EXcell Bio)、Ion Torrent PGM测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪等。

实施例

1、接头制作。

本实施例的环形接头的核苷酸序列如下：

5’-pAGATCGAGAGCGTCNNNNNNNNNNNNATCGAATCACTGCTGAGTCGGAGACACTGCGTGTCTCCGACTCAGGAGTGATTCGAT-3’(SEQ ID No.1)。

其中，N代表任何一个碱基序列；5’端的p表示磷酸化修饰，能够在文库构建过程接头反应中与样本DNA 3’端形成磷酸二酯键。

从5’端至3’端依次是：公共序列为AGATCGAGAGCGTC，样本barcode区域序列为ATCGAATCACT，正负链标签序列为G，Ion接头A部分序列为CTGAGTCGGAGACACTGC，自身折叠互补的相间隔序列为CTG，折叠后与Ion接头A部分互补序列为GTGTCTCCGACTCAG，与正负链标签相同的相间隔序列为G,折叠后与样本barcode互补序列为AGTGATTCGAT。

本实施例中的引物对的设计和制备采用现有的常规方法。接头序列选择综合评价，设计效率和实验结果最好的接头序列。

1.1、接头退火延伸反应。

将合成的环形接头采用1*TE按照说明书溶解，稀释成浓度为100μM的工作液。取30μl的工作液，加入3.3μl的10*PCR反应buffer中，加热到95℃，缓慢冷却到室温，制作好接头，将退火后的产物各取1μl用Sybgreen的方法进行质控反应。

体积为10μl的质控反应体系配比如下：5μl的SYBR Green Mix，1μl退火后的产物，4μl的dH₂O。

制作溶解曲线反应程序：40℃到95℃(环形比线性的退火效率更高)。

将退火后的双链接头，按如下反应体系进行末端补齐反应。

体积为100μl的反应体系配比如下：20μl的End Prep Mix，30μl的浓度为50μM的AdapterF，R Mix，ddH₂O补足100μl。

在PCR仪上以30℃的温度反应30min，室温保持。

环形接头的溶解曲线图如图1所示，退火后的接头熔解曲线有明显的峰。

1.2、酚氯仿酒精沉淀纯化。

1)在反应液中加入50μl的酚、氯仿和异戊醇混合液，上下颠倒并振荡后，12000rpm离心10分钟，取上清；

2)加入50μl的氯仿，上下颠倒并振荡后，12000rpm离心10分钟，取上清；

3)加入1μl的浓度为3M的NaAC溶液，加入300μl的-20℃无水乙醇；

4)振荡混匀-20℃放置过夜,15000rpm离心10分钟；

5)轻轻倒去上清，用移液枪小心吸掉上清残液，然后加入200μl的冰冻的浓度为70％乙醇水溶液；

6)15000rpm离心5分钟；

7)重复5)和6)步骤；

8)轻轻倒去上清，用移液枪小心尽可能吸掉上清残液，10min晾干；

9)加入30μl的1XTE溶解；

10)Qiubit定量。

1.3、加“T”反应。

加“T”反应的反应体系配比如下：29μl的Adapter，1μl的Klenow exo-，1μl的dTTP(浓度为1mM)，3.3μl的Buffer2(10*)。

24℃反应15min。反应后，用酚氯仿酒精沉淀进行纯化，步骤同1.2。

2、样本DNA文库构建。

本实施例中的检测样本为能提取核酸的任意形式的样品，包括但不限于：全血、血清、血浆和组织样品；组织样品包括但不限于：石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。

2.1、样本抽提。

采用试剂盒(Hipure circulating DNA Midi Kit)提取肺癌患者血浆游离DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。

2.2样本DNA浓度测定。

采用3.0对抽提后的DNA浓度测定：

1)向样本管加入1μl的Qubit dsDNA HS Reagent和199μl的Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s；

2)向已添加工作液的样品管内吸弃1μl工作液，加入1μl的DNA样本，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200μl；

3)所有管在室温避光孵育2分钟；

4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNA High Sensitivity分析模式；

5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；

6)选择Calculate Initial初始浓度，然后选择Volume of Sample Used:1μl，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/μl；

7)读取下一个样本：取出Qubit3.0荧光光度计中样本。

若是组织样本，则需打断成片段(机械法或酶打断法)，然后进行末端补齐反应；cfDNA样本直接进行末端补齐反应。

2.3末端补齐反应。

100μl的末端补齐反应反应体系配比如下：12μl的End Prep Mix，20μl的初始扩增产物，ddH₂O补足100μl。

在PCR仪上30℃反应30min。

反应后，磁珠纯化(1.5:1)，20μl的H₂O洗脱，定量，参照步骤2.2。

2.4加“A”反应。

加“A”反应的反应体系配比如下：17.5μl的上一步的产物和12.5μl的d A-TailingMix。

在PCR仪上温度为37℃，反应30min，温度为70℃，再反应5min。

此步产物直接进行下一步反应。

2.5连接反应。

拿出Switch Solution，室温混匀，漩涡充分混匀，瞬间离心2秒,反应体系如表1所示。

表1接头连接反应的反应体系表

将上述反应体系放入PCR仪内，PCR仪上温度为30℃，反应10min。

反应结束在反应管中加入5μl的Stop Ligation Mix，使用移液器轻轻吹打混匀。

使用PCR产物纯化磁珠(1.5:1)纯化产物，20μl的H₂O洗脱，Quibit定量。2.6通过PCR扩增片段

上一步接头连接产物作为模板，进行PCR扩增，反应体系如表2所示。

表2 PCR扩增的反应体系表

primer A1的核苷酸序列为GCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID No.2)。该引物的序列中包含折叠后与Ion接头A部分互补序列。

PCR扩增的反应条件如表3所示。

表3 PCR扩增反应条件表

反应结束进行磁珠(1.5:1)纯化，30μl的H₂O洗脱回收产物，定量，参考步骤2.2。

2.7探针延伸。

用设计好的捕获探针进行捕获延伸，反应体系如表4所示。

表4探针延伸反应体系表

Probe Mix(1μM)为目的捕获区域的引物序列，且另一端为Ion文库的P端序列。

探针延伸的反应条件如表5所示。

表5探针延伸反应条件表

1.5倍磁珠纯化，30μl的dH₂O洗脱。

2.8扩增。

扩增的反应体系如表6所示。

表6扩增的反应体系表

其中，Primer A2的核苷酸序列为CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ IDNo.3)，Primer P的核苷酸序列为CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG(SEQ ID No.4)。

扩增的反应条件如表7所示。

表7扩增的反应条件表

反应结束后，1.5倍磁珠纯化，Qiubit定量。

2.9上机测序。

采用常规的方法进行上机测序。

3、数据分析。

由测序的原始数据分析，得出On-Target率、均一度等信息。部分数据如表8和表9所示。

表8测序结果数据表(1)

Barcode Name	Sample	Mapped Reads	On Taret	Mean Depth	Uniformity
						gao-4-1	gao-4-1	16232	85.54％	544.2	89.55％
gao-4-2	gao-4-2	8026	67.54％	207.8	90.88％

表9测序结果数据表(2)

Barcode Name	Sample	Bases	≥Q20Bases	Reads	Mean Read Length
						gao-4-1	gao-4-1	2042523	1887663	16635	123bp
gao-4-2	gao-4-2	1042969	958366	8477	123bp

从上表中可以看出，采用本发明的环形接头进行测序，灵敏度高，准确率高与现有技术相比具有明显的优势。

本发明所用引物、探针由上海生工生物工程有限公司合成。没有公布核苷酸序列的探针均采用现有技术，根据相关疾病的人类基因组进行设计。

上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海赛安生物医药科技股份有限公司

<120> 一种环形接头及其应用

<130> 无

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

agatcgagag cgtcnnnnnn nnnnnnatcg aatcactgct gagtcggaga cactgcgtgt 60

ctccgactca ggagtgattc gat 83

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 2

gcgtgtctcc gactcag 17

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 3

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 4

ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28

Claims

1.一种环形接头，其特征在于：包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A的部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。

2.根据权利要求1所述的环形接头，其特征在于：所述互补序列区域中与Ion接头A部分互补的序列和与样本barcode互补的序列通过与正负链标签相同的序列相间隔。

3.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于：所述任意碱基区域是12个随机碱基。

4.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于：所述正负链标签为1个碱基。

5.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于：所述样本barcode区域的碱基个数为8个。

6.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于：所述Ion接头A部分的碱基个数为15个。

7.根据权利要求1所述的环形接头，其特征在于：还包括设置在5’端的磷酸化修饰和公共序列，所述公共序列的碱基个数为13～16个。

8.根据权利要求1所述的环形接头，其特征在于：所述环形接头的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.一种如权利要求1所述的环形接头用于Ion Torrent二代测序平台中文库构建的应用。