CN106868124A - 一组甲基化基因及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种一组甲基化基因及其检测方法，所述一组甲基化基因为p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因，DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，在肺癌病人血浆游离DNA样品中，上述基因特定CpG位点发生高度甲基化。本发明的这些基因是肺癌生物标志物；可作为设计肺癌诊断试剂的基础，适用于医院肺癌早期辅助检测，可对肺癌高危人群做早期风险评估。

Description

一组甲基化基因及其检测方法
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种一组甲基化基因及其检测方法。
背景技术
肺癌作为一种常见的恶性肿瘤，近几十年内其发病、死亡率于全球总体上呈上升趋势，在恶性肿瘤中往往处于首位。许多研究都表明，肺癌的发生发展是一个多基因、多因素及多阶段的复杂过程，其大致涉及两大机制，一是表观遗传学层面，二是遗传学层面。其中表观遗传学在肺癌发生发展过程中起着举足轻重的作用，而DNA甲基化则是表观遗传学最重要的一种修饰方式。
DNA甲基化是真核生物体内的一种内源性修饰过程，一般是指由于DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化，生物体把S-腺苷甲硫氨酸(SAM-CH3)中的甲基(-CH3)连接到胞嘧啶核苷酸(Cytosine，C)的第5位残基上，从而使胞嘧啶(C)甲基化为5'-甲基胞嘧啶(5'-Methylcytosine，5'-mC)的过程。胞嘧啶核苷酸(C)能与鸟嘌呤核苷酸(G)通过磷酸二酯键共价结合为二核苷酸(即CpG)。正常健康人基因组中约80％左右的CpG都分散分布在基因组内，且都处于甲基化状态，比如重复序列。另有一小部分CpG则呈高度密集状态，通常当胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的总和超过4种碱基总和的50％左右时，我们把这种富含CpG结构的DNA片段称为CpG岛。通常CpG岛位于5'端的基因启动子、第一外显子以及3'末端区域，且一般处于非甲基化状态。
肿瘤DNA异常甲基化一般有两种形式，即局部相关基因CpG岛的甲基化水平升高以及CpG岛以外的整体基因组DNA的甲基化水平降低。整体基因组DNA的低甲基化水平可能激活原来保持沉默的基因，尤其是ras及fos等原癌基因；而局部相关基因启动子CpG岛的异常高甲基化则可能导致某些基因(尤其是抑癌基因)的转录沉默。而近来一系列研究也已经证实，肿瘤发生发展中某些抑癌基因5'端CpG岛(尤其是启动子区域)会发生异常甲基化，从而使该基因转录受到抑制，这是抑癌基因表达失活的关键。同时研究发现，许多基因的异常甲基化都与肿瘤的发生发展有关，而目前的研究主要集中在4类基因，即抑癌基因(包括p16INK4a、p15INK4b、p14ARF、APC等)、DNA修复基因(MLH1与MGMT等)、代谢酶基因(GSTP1)与肿瘤分子侵袭转移相关基因(DAPK、CDH1等)。这些基因涉及细胞周期调控、细胞间信号转导、细胞凋亡、肿瘤的侵袭转移及DNA损伤修复等过程。
目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低。影像学检查(如常规CT检查)很难检出1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义；肿瘤标志物(尤其是血浆或血清中的分子标志物)的检测来进行肺癌的早期筛查，具有特异性强、敏感度高、标本易获取以及无创等优点，且便于观察预后。近些年，有关肺癌肿瘤标志物研究以及检测方法层出不穷，如“液体活检”技术。此技术就是一种直接从血浆或其他体液中检测循环肿瘤细胞或游离DNA(cfDNA)的技术，有望把肺癌的早期诊断推向一个新的高度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一组甲基化基因及其检测方法，旨在解决目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低，影像学方法(如常规CT检查)很难发现1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义的问题。
本发明是这样实现的，一组甲基化基因，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。
本发明另一目的在于提供一种一组甲基化基因的检测方法，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：
1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；
2)分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；
3)将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；
4)对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。
进一步，所述一组甲基化基因的检测方法具体包括：
步骤一，血浆样本的分离及保存：抽取受检者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短时间保存1h，备用；把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分血浆、白细胞、红细胞三层；用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层2/3的血浆，置于新的15ml离心管中；然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min；并把上清液分装到几管1.5ml离心管中，标记好后置于-80℃保存；
步骤二，血浆cfDNA的提取及其浓度测定；
步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶；并且等琼脂糖溶液温度降至65℃时加入花青素；制备胶板；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固；将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl血浆cfDNA与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果；
步骤四，血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰；
步骤五，血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR扩增；
步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化M引物扩增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；
步骤八：PCR结果的验证，包括：
(1)PCR产物的选取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物；
首先在这5个基因的所有M扩增成功的阳性样本里分别随机选取几个p16阳性样本、几个DLEC1阳性样本、几个CDH1阳性样本、几个DAPK阳性样本及几个RUNX3阳性样本，并挑出这些被选取的阳性样本的甲基化引物M扩增产物，用以验证其是否为真的阳性；
其次在这5个基因的所有只有U扩增成功的阴性样本里分别随机选取几个p16阴性样本、几个DLEC1阴性样本、几个CDH1阴性样本、几个DAPK阴性样本及几个RUNX3阴性样本，并挑出这些被选取的阴性样本的非甲基化引物U扩增产物，用以验证其是否为真的阴性；
(2)PCR产物的连接和转化；
(3)阳性克隆子的筛选；
(4)测序:挑取阳性克隆子对应编号平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液体培养基中，再置于摇床上，200rpm，37℃，过夜，进行扩大培养；作甲基化测序；
(5)验证：运用Bio analysis软件，结合NCBI上下载的参考序列，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阳性样本中甲基化引物M扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，观察目的片段上CpG岛异常甲基化情况，验证其是否为对应甲基化引物M的正确扩增产物，是否为假阳性；同时，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阴性样本中非甲基化引物U扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，对比目的片段上CpG岛甲基化情况验证其是否为对应非甲基化引物U的正确扩增产物，是否为假阴性；
步骤九，数据分析与统计处理：结合临床资料及健康对照血浆样本，运用SPSS20.0统计软件进行数据分析，主要运用卡方检验，P<0.05则差异有统计学意义。进一步，步骤五中，巢式甲基化特异性PCR扩增包括：将步骤四经过亚硫酸氢盐修饰过的cfDNA模板进行巢氏PCR扩增；nMSP分为两轮扩增，且两轮PCR都使用相同的聚合酶Takara Epi Taq HS，都在同一台PCR仪上进行；但第一轮PCR的模板为上一步经亚硫酸氢盐修饰过的血浆cfDNA，而第二轮PCR的模板为第一轮PCR后未稀释的产物；
50μl的PCR反应体系为：在PCR管中分别加入Takara Epi Taq HS 0.25μl，10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μl，MgCl25μl，dNTP Mixture 6μl，cfDNA Template 2μl及ddH2O 28μl，正向F与反向R引物各2μl；
p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因nMSP两轮PCR的条件：
p16第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
p16第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共29个循环，最后4℃保存；
DLEC1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
DLEC1第二轮PCR反应条件为为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共32个循环，最后4℃保存；
CDH1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
CDH1第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共34个循环，最后4℃保存；
DAPK第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
DAPK第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存；
RUNX3第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，44℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
RUNX3第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存；
同时，设置去离子水为空白对照，EpiTect Control DNA为阳性对照，正常外周血白细胞DNA为阴性对照。
进一步，步骤六中，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳包括：
制备2％的琼脂糖凝胶，并且等琼脂糖溶液温度降至65℃，加入花青素；
制备胶板:把制胶槽插于制胶板上，作为模子；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液小心倒入槽内，室温下静置，直至完全凝固；
点样:将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因第二轮PCR产物样品与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；
电泳:在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下分析结果。
本发明可以在肿瘤发生的早期就能在血浆cfDNA中检测出肿瘤相关基因的异常甲基化，且cfDNA中的异常甲基化总是与肿瘤细胞内的异常甲基化同时出现；同时，血浆cfDNA中基因异常甲基化的检测具有较高的敏感性和特异性。因此，血浆cfDNA作为“液体活检”中非常关键的检测物，具有“液体活检”无创，操作简单，易于取样及灵敏度高等优点，且能用于检测各种肿瘤生物标志物，尤其是肿瘤相关基因的异常甲基化，在肺癌等癌症的早期诊断及风险评估中具有极其重要的意义。
经实验证明，本发明联合检测时所有样本至少两个基因及其两个以上的基因发生甲基化的检测敏感度与特异度已经较符合肺癌检测与诊断水平，因此可将此方法应用到肺癌早期风险评估。
本发明结合临床资料及对照(10例健康正常人血浆样本)，运用SPSS 20.0等统计软件进行数据分析，如运用卡方检验(P<0.05则差异有统计学意义)，最终结果如下：血浆中五个目的基因甲基化检测的敏感度分别是:p16为45％，DLEC1为48％，CDH1为76％，DAPK为14％，RUNX3为29％，而五个目的基因的特异度都是100％。
本发明把至少一个基因有异常甲基化的样本判断为阳性，则此时甲基化检测的敏感度为95％，而根据健康对照组，其特异度为100％。同时，当把五个目的基因中至少两个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为71％，而特异度则为100％。当把五个目的基因中至少三个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为40％,而特异度则为100％。
具有很高的临床应用价值。本发明的检测方法只需要20ml外周血，为无损伤性检测，不给受试者带来痛苦，易于被人们接受和推广。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一组甲基化基因检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明致力于肺癌敏感基因甲基化的分析，经过广泛的筛选，筛选了5个甲基化敏感基因，它们是p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因。在血浆样品中，这些基因启动子相关区域的甲基化状态在肺癌患者和非癌患者之间存在显著的差异，即在肺癌患者的血浆样品中这些基因的CpG发生高度甲基化。因此，这些基因是肺癌的标志物；可作为肺癌早期风险评估的方法和肺癌早期筛查。
本发明的一组甲基化基因可用于：在所有人群特别是在肺癌高危人群中，对受检者血浆标本进行检测，分析和评估受检者是否有患肺癌的风险，以便临床医生对筛选出的肺癌高危者进行早期干预。
经验证，本发明把至少一个基因有异常甲基化的样本判断为阳性，则此时甲基化检测的敏感度为95％，而根据健康对照组，其特异度为100％。同时，当把五个目的基因中至少两个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为71％，而特异度则为100％。当把五个目的基因中至少三个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为40％,而特异度则为100％，具有很高的临床应用价值。本发明的检测方法只需要20ml外周血，为无损伤性检测，不给受试者带来痛苦，易于被人们接受和推广。
本发明的一组甲基化基因用途操作过程简单，快速，非常适合医院肺癌早期风险评估辅助检测，对肺癌高危人群筛查，以便临床早期干预。
在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述，
本发明实施例提供的一组甲基化基因，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。
SEQ ID NO：1序列为：
TCACCAGAGGGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTC。
SEQ ID NO：2序列为：
TGACCACAGCGATGACGGGATCCGAGAGAAAGGCAAGGCGGAAGGGGTGAGGCCGGAAGCCGAAGTGCCGCAGGGAGTTAGCGGCGTCTCGGTTGCCATGGAGACCAGGAGCTCCAAAACGCGGAGGTCTTTAGCGTCCCGGACCAACGAGTGCCAGGGGACAATGTGGGCGCCAACTTCGCCACCAGCCGGGT。
SEQ ID NO：3序列为：
TGCAGCCACGCACCCCCTCTCAGTGGCGTCGGAACTGCAAAGCACCTGTGAGCTTGCGGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCCCGCTCCAGCCCGGCCCGACCCGACCGCACCCG。
SEQ ID NO：4序列为：
GGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCGGAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAGGGTCTGGGGCCGGCGCCTGGGAGGGA。
SEQ ID NO：5序列为：
GCGTCGCACAGCCAATCGGCGGAGCCCCCATCGCGGGCACCTCGGTGGCGTTCGCGGGGAGGAACGGGGCCTGCCGGAGGCCGCCCAACGGGGAGGGGCGGAAGGCGCCACCCCGCGGAGGAG。
如图1所示，本发明实施例提供的一组甲基化基因的检测方法，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：
S101：抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；
S102:分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；
S103:将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；
S104:对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的应用原理。
本发明临床血浆样本52例，包括42例肺癌患者血浆样本，以及对照的10例正常人血浆样本，均来自云南省第一人民医院。本发明所有进行试验的临床标本，其采集过程符合医学伦理规范，并经伦理委员会同意。
实例1、对上述所有血浆样本中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行甲基化检测。
本实施例用nMSP方法检测上述五个基因的甲基化情况，具体步骤如下：
步骤一：血浆样本的分离及保存：
在上述所有血液样本中，对每例患者或正常人都取20ml左右的外周血，并立即置于4℃冰箱短时间保存(1h左右)，以便于之后分离血浆。
把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分三层(即血浆、白细胞、红细胞)。用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层的血浆(吸出2/3即可)，置于新的15ml离心管中。然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min。并小心轻柔的把上清液分装到几管1.5ml离心管中，注意上清液不需要吸完，可残余一些，避免吸上细胞。标记好后置于-80℃保存。
步骤二：血浆cfDNA的提取及其浓度测定：
肺癌患者及正常人血浆cfDNA的提取方法(参照QIAamp MinElute Virus SpinKit中说明书步骤)：
准备工作。首先加310μl的Buffer AVE到一管含310μg冻干Carrier RNA中，彻底溶解后进行分装，于-20℃保存。用时拿出一管，并加入适量Buffer AL(按试剂盒具体要求)，轻轻颠倒，充分混匀，避免起泡。其次，使Buffer AVE恢复到室温。
把25μl的Proteinase K加入到1.5ml离心管中。
选取血浆样本，并从中取200μl的血浆加到上一步中的离心管中。
再加200μl的Buffer AL(包含了Carrier RNA的)，关盖涡旋15s。
然后56℃水浴15min。
短暂离心，除去管壁上的残留。
加250μl的无水乙醇到离心管中，并关盖涡旋15s。然后室温静置5min，以便充分孵育裂解。
短暂离心，除去管壁上的残留。
小心的把上清转移到吸附柱(已置于2ml收集管上)中，不要碰到管壁及边缘。关盖，再6000g，25℃离心，1min。弃去包含废液的收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的Buffer AW1到柱中，关盖，再6000g，25℃离心，1min。弃去旧收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的Buffer AW2到柱中，关盖，再6000g，25℃离心，1min。弃去旧收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的无水乙醇到柱中，关盖，再6000g，25℃离心，1min。弃去旧收集管，把柱子放入新的收集管上。
然后20000g，25℃全速离心，3min，使柱子完全干燥。
把柱子放入新的收集管，并开盖，56℃孵育3min，使柱子干燥完全。
把柱子放入新的1.5ml离心管中，开盖，加入90μl的Buffer AVE到膜中央，并室温下静置5min。
然后20000g，25℃全速离心，1min，进行洗脱。
得到的cfDNA置于-20℃保存。
本发明血浆cfDNA浓度测定：(运用Qbit3.0，参照 dsDNA HS Assay Kit中说明书步骤)
计算所测样本需配制的A:Qubit dsDNA HS Reagent及B:Qubit dsDNA HS Buffer的体积，然后把A和B充分混合即为working solution。A＝(n+2)μl，B＝199*(n+2)μl，n为样本量。
取190μl的woking solution至试剂盒专用管。
取10μl的S1溶液加入一管含190μl woking solution的专用管中。混合2s左右，并去除气泡。同时取10μl的S2溶液加入另一管含190μlwoking solution的专用管中，充分混合。
取4μl的cfDNA样本至新的专用管中，并加入196μl的working solution使体积达到200μl,混合2s左右，并去除气泡。
室温下静置2min。
打开Qubit 3.0，并设置好，开始进入Run Samples。然后分别插上标准品S1及S2，并读数。
读样品前，再次进行设置，即把样品体积设置为4μl。然后插上样品管，进行读数。
步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：
制备1％的琼脂糖凝胶。在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液中加入花青素，混匀，并小心倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固。将凝固后的胶板放入电泳槽(已倒入1×TAE缓冲液)中浸润，然后开始点样。取4μl血浆cfDNA与2μl左右的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样。在100V电压下电泳20分钟左右，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果。
步骤四：血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰：
肺癌患者及正常人血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰方法(参照EZ DNA Methylation-Gold Kit中说明书步骤)。
步骤五：血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR(nMSP)。
步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化引物M扩增成功或者是甲基化引物M及非甲基化引物U都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；
步骤八：PCR结果的验证：
1：PCR产物的选取
取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物。
首先在这5个基因的所有阳性样本(即有M扩增成功的样本)里分别随机选取2个p16阳性样本、2个DLEC1阳性样本、2个CDH1阳性样本、2个DAPK阳性样本及2个RUNX3阳性样本，并挑出这10个阳性样本的甲基化引物(M)扩增产物，用以验证其是否为真的阳性。
其次在这5个基因的所有阴性样本(即只有U扩增成功的样本)里分别随机选取2个p16阴性样本、2个DLEC1阴性样本、2个CDH1阴性样本、2个DAPK阴性样本及2个RUNX3阴性样本，并挑出这10个阴性样本的非甲基化引物(U)扩增产物，用以验证其是否为真的阴性。
2：PCR产物的连接和转化；PCR产物连接和转化方法参照PEASY-T5Zero CloningKit中说明书步骤：
配制连接体系。在1.5ml离心管中依次加入2μl的纯化后PCR产物、1μl的T5CloningVector以及2μl的去离子水，
充分混合，并在室温(最好是25℃)下静置5min。然后将1.5ml离心管放在冰上。
把50μl的Trans1-T1感受态细胞加入连接产物中，轻轻混匀，然后25min冰浴。
迅速放入42℃水浴锅，进行30s热激。然后立即放到冰上2min。
加入250μl平衡到室温的液体LB培养基，并置于摇床(200rpm，37℃)，孵育1h。
为得到较多克隆，进行4,000rpm，25℃离心1min，弃掉150μl的上清液，然后轻弹剩下的，使之悬浮。
取150μl的悬浮菌液均匀涂抹在LB-Amp平板上，再倒置于37℃恒温培养箱中，培养12h左右。
3：阳性克隆子的筛选；参照PEASY-T5Zero Cloning Kit中说明书步骤：
配PCR体系。其中50μl的PCR反应体系为：在PCR管中分别加入Takara rTaq 0.25μl，10×rTaq PCR Buffer(含Mg2+)5μl，dNTP Mixture 4μl，通用引物M13F及M13R各1μl，ddH2O 39μl及Template(菌落)。
而PCR反应条件为为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存。
挑克隆子。先划在另一个LB-Amp平板的对应格中，再沾在配好的PCR体系里。每个样本挑5个左右的克隆子。而划好的平板则倒置培养在37℃恒温培养箱中12h左右。
轻弹混匀PCR管，短暂离心，然后进行PCR。
电泳，然后凝胶成像系统下观察是否有单一条带，如有，则观察PCR产物长度(载体一段163bp+目的片段长度)，从而筛选出阳性克隆子。
4：测序；挑取阳性克隆子对应编号平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液体培养基中，再置于摇床(200rpm，37℃)过夜，进行扩大培养。
作甲基化测序。
5：验证：
观察峰图，并运用Bio analysis软件，结合NCBI上下载的参考序列，与目的基因(p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3)各2个阳性样本(共10个)中甲基化引物(M)扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，观察目的片段上CpG岛异常甲基化情况，验证其是否为对应甲基化引物(M)的正确扩增产物，是否为假阳性。
同时，与目的基因(p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3)各2个阴性样本(共10个)中非甲基化引物(U)扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，观察目的片段上CpG岛甲基化情况，验证其是否为对应非甲基化引物(U)的正确扩增产物，是否为假阴性。
步骤九：血浆中五个目的基因甲基化检测：
本发明结合临床资料及对照(10例健康正常人血浆样本)，运用SPSS 20.0等统计软件进行数据分析，如运用卡方检验(P<0.05则差异有统计学意义)，最终结果如下：血浆中五个目的基因甲基化检测的敏感度分别是:p16为45％，DLEC1为48％，CDH1为76％，DAPK为14％，RUNX3为29％，而五个目的基因的特异度都是100％。
进一步，步骤五中，巢式甲基化特异性PCR扩增包括：将步骤四经过亚硫酸氢盐修饰过的cfDNA模板进行巢氏PCR扩增；nMSP分为两轮扩增，且两轮PCR都使用相同的聚合酶Takara Epi Taq HS，都在同一台PCR仪上进行；但第一轮PCR的模板为上一步经亚硫酸氢盐修饰过的血浆cfDNA，而第二轮PCR的模板为第一轮PCR后未稀释的产物；
50μl的PCR反应体系为：在PCR管中分别加入Takara Epi Taq HS 0.25μl，10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μl，MgCl25μl，dNTP Mixture 6μl，cfDNA Template 2μl及ddH2O 28μl，正向F与反向R引物各2μl；
p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因nMSP两轮PCR的条件：
p16第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存。
p16第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共29个循环，最后4℃保存。
DLEC1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存。
DLEC1第二轮PCR反应条件为为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共32个循环，最后4℃保存。
CDH1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存。
CDH1第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共34个循环，最后4℃保存。
DAPK第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存。
DAPK第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存。
RUNX3第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，44℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存。
RUNX3第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存。
同时，设置去离子水为空白对照，EpiTect Control DNA为阳性对照，正常外周血白细胞DNA为阴性对照。
进一步，步骤六中，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳包括：
制备2％的琼脂糖凝胶，并且等琼脂糖溶液温度降至65℃，加入花青素；
制备胶板:把制胶槽插于制胶板上，作为模子；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液小心倒入槽内，室温下静置，直至完全凝固；
点样:将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因第二轮PCR产物样品与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；
电泳:在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下分析结果。
本发明把至少一个基因有异常甲基化的样本判断为阳性，则此时甲基化检测的敏感度为95％，而根据健康对照组，其特异度为100％。同时，当把五个目的基因中至少两个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为71％，而特异度则为100％。当把五个目的基因中至少三个基因有异常甲基化的样本判断为阳性时，则甲基化检测的敏感度为40％,而特异度则为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 申请人名称 昆明理工大学
<120>一组甲基化基因及其检测方法
<160> 5
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TCACCAGAGGGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTC
<210> 2
<211> 194
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TGACCACAGCGATGACGGGATCCGAGAGAAAGGCAAGGCGGAAGGGGTGAGGCCGGAAGCCGAAGTGCCGCAGGGAGTTAGCGGCGTCTCGGTTGCCATGGAGACCAGGAGCTCCAAAACGCGGAGGTCTTTAGCGTCCCGGACCAACGAGTGCCAGGGGACAATGTGGGCGCCAACTTCGCCACCAGCCGGGT
<210> 3
<211> 112
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TGCAGCCACGCACCCCCTCTCAGTGGCGTCGGAACTGCAAAGCACCTGTGAGCTTGCGGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCCCGCTCCAGCCCGGCCCGACCCGACCGCACCCG
<210> 4
<211> 99
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
GGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCGGAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAGGGTCTGGGGCCGGCGCCTGGGAGGGA
<210> 5
<211>123
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
GCGTCGCACAGCCAATCGGCGGAGCCCCCATCGCGGGCACCTCGGTGGCGTTCGCGGGGAGGAACGGGGCCTGCCGGAGGCCGCCCAACGGGGAGGGGCGGAAGGCGCCACCCCGCGGAGGAG

Claims (5)

1.一种一组甲基化基因，其特征在于，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。
2.一种如权利要求1所述一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：
1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；
2)分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；
3)将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；
4)对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。
3.如权利要求2所述的一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法具体包括：
步骤一，血浆样本的分离及保存：抽取受检者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短时间保存1h，备用；把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分血浆、白细胞、红细胞三层；用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层2/3的血浆，置于新的15ml离心管中；然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min；并把上清液分装到几管1.5ml离心管中，标记好后置于-80℃保存；
步骤二，血浆cfDNA的提取及其浓度测定；
步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶；并且等琼脂糖溶液温度降至65℃时加入花青素；制备胶板；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固；将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl血浆cfDNA与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果；
步骤四，血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰；
步骤五，血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR扩增；
步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化M引物扩增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；
步骤八：PCR结果的验证，包括：
(1)PCR产物的选取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物；
首先在这5个基因的所有M扩增成功的阳性样本里分别随机选取几个p16阳性样本、几个DLEC1阳性样本、几个CDH1阳性样本、几个DAPK阳性样本及几个RUNX3阳性样本，并挑出这些被选取的阳性样本的甲基化引物M扩增产物，用以验证其是否为真的阳性；
其次在这5个基因的所有只有U扩增成功的阴性样本里分别随机选取几个p16阴性样本、几个DLEC1阴性样本、几个CDH1阴性样本、几个DAPK阴性样本及几个RUNX3阴性样本，并挑出这些被选取的阴性样本的非甲基化引物U扩增产物，用以验证其是否为真的阴性；
(2)PCR产物的连接和转化；
(3)阳性克隆子的筛选；
(4)测序:挑取阳性克隆子对应编号平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液体培养基中，再置于摇床上，200rpm，37℃，过夜，进行扩大培养；作甲基化测序；
(5)验证：运用Bio analysis软件，结合NCBI上下载的参考序列，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阳性样本中甲基化引物M扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，观察目的片段上CpG岛异常甲基化情况，验证其是否为对应甲基化引物M的正确扩增产物，是否为假阳性；同时，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阴性样本中非甲基化引物U扩增产物的阳性克隆子测序结果作比对，对比目的片段上CpG岛甲基化情况验证其是否为对应非甲基化引物U的正确扩增产物，是否为假阴性；
步骤九，数据分析与统计处理：结合临床资料及健康对照血浆样本，运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，主要运用卡方检验，P<0.05则差异有统计学意义。
4.如权利要求3所述的一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，步骤五中，巢式甲基化特异性PCR扩增包括：将步骤四经过亚硫酸氢盐修饰过的cfDNA模板进行巢氏PCR扩增；nMSP分为两轮扩增，且两轮PCR都使用相同的聚合酶Takara Epi Taq HS，都在同一台PCR仪上进行；但第一轮PCR的模板为上一步经亚硫酸氢盐修饰过的血浆cfDNA，而第二轮PCR的模板为第一轮PCR后未稀释的产物；
50μl的PCR反应体系为：在PCR管中分别加入Takara Epi Taq HS0.25μl，10×Epi TaqPCR Buffer(Mg2+free)5μl，MgCl25μl，dNTP Mixture6μl，cfDNATemplate 2μl及ddH2O 28μl，正向F与反向R引物各2μl；
p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因nMSP两轮PCR的条件：
p16第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
p16第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共29个循环，最后4℃保存；
DLEC1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
DLEC1第二轮PCR反应条件为为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共32个循环，最后4℃保存；
CDH1第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
CDH1第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共34个循环，最后4℃保存；
DAPK第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
DAPK第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存；
RUNX3第一轮PCR反应条件为98℃变性10s，44℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共40个循环，然后72℃终延伸5min，最后4℃保存；
RUNX3第二轮PCR反应条件为98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s为一个循环，共30个循环，最后4℃保存；
同时，设置去离子水为空白对照，EpiTect Control DNA为阳性对照，正常外周血白细胞DNA为阴性对照。
5.如权利要求3所述的一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，步骤六中，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳包括：
制备2％的琼脂糖凝胶，并且等琼脂糖溶液温度降至65℃，加入花青素；
制备胶板:把制胶槽插于制胶板上，作为模子；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液小心倒入槽内，室温下静置，直至完全凝固；
点样:将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因第二轮PCR产物样品与2μl的6×loading Dye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；
电泳:在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下分析结果。
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