CN113943763A - 一种还原核酸的方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种还原核酸的方法及其检测方法,还原核酸的方法,包括对氧化后的核酸不进行纯化,直接进行还原。对氧化后的核酸直接还原,无需在氧化后、还原前进行纯化,实现同管还原,显著提升转化回收率,而且使得回收率更稳定。减少了氧化与还原步骤之间的纯化步骤,简化了实验操作步骤,缩短了时间,降低了检测成本,同时不影响后续文库扩增效率和转化率。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域,具体涉及一种还原核酸的方法及其检测方法。
背景技术
早在1925年,在DNA双螺旋结构鉴定之前,DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC及其衍生修饰,被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明,cell-free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。
重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U),在随后的PCR过程中,采用U耐受的聚合酶,将U识别为胸腺嘧啶(T),实现C到T的转化,从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS)将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95%的C会被转化为T),可覆盖全基因组70~99%的胞嘧啶,实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解,需要较高的DNA投入量,对于DNA含量较少的样本不友善,例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T,而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95%以上,因此使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库,碱基平衡性差(AT占比>80%),测序时需要添加15%的phix DNA平衡,造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差,而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark),比对率较差,通常只有70%左右,进一步造成数据的浪费。
公开号为CN 110820050 A的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》记载,在一定条件下,甲基化C可以被10-11转位酶(TET酶)转为羧基化C,通过有机硼烷(例如吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶,经过测序,可以识别为T,进而区分甲基化C与未甲基化C。鉴于此原理发明的全基因组甲基化非重亚硫酸盐文库构建技术,有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷,同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。
使用此非重亚硫酸盐方法构建的文库,不仅能在全基因组水平检测甲基化,而且能同时检测碱基突变,具有检测基因组多种特征的能力,因此具有重要的临床引用价值。近来研究发现,血浆cfDNA甲基化、突变和片段特征在肿瘤早期筛查方面具有重要的价值。但血浆cfDNA是不同组织释放的,而且绝大多数cfDNA来源于正常血细胞,对于早期癌症患者来说,肿瘤组织释放的循环肿瘤DNA(circulating DNA,ctDNA)在血浆中占比极低,因此在构建cfDNA二代测序文库过程中,需要最大限度减少DNA模板损失,提升ctDNA各特征检测的灵敏度。
现有技术中,TET酶氧化步骤结束后,需要用1.8x的磁珠纯化氧化后产物,但是氧化后回收率中位只有约70%,且非常不稳定,范围宽至30%~90%,波动很大。
发明内容
根据第一方面,在一实施例中,提供一种还原核酸的方法,包括对氧化后的核酸不进行纯化,直接进行还原。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶残基的存在和/或位置的方法,所述方法包括:
使用第一方面所述方法,获得含有二氢尿嘧啶残基的核酸,然后对所述含有二氢尿嘧啶残基的核酸进行扩增和测序或检测。
依据上述实施例的一种还原核酸的方法及其检测方法,对氧化后的核酸直接还原,无需在氧化后、还原前进行纯化,实现同管还原,显著提升转化回收率,而且使得回收率更稳定。减少了氧化与还原步骤之间的纯化步骤,简化了实验操作步骤,缩短了时间,降低了检测成本,同时不影响后续文库扩增效率和转化率。
附图说明
图1为实施例1、对比例1、对比例2的转化回收率结果图。
图2为实施例1、对比例1、对比例2的扩增效率结果图。
图3为实施例1、对比例1、对比例2的5mC到T转化率结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接,”如无特别说明,均包括直接和间接连接(联接)。
根据第一方面,在一实施例中,提供一种还原核酸的方法,包括对氧化后的核酸不进行纯化,直接进行还原。
在一实施例中,为了减少DNA模板损失,本发明提供一种方法,氧化后产物不进行磁珠纯化,直接进行还原(命名为“同管还原”),并且还原后使用增强型磁珠纯化法回收DNA模板。同管还原能极大地减少DNA模板损失,减少操作流程,并且几乎不影响PCR扩增效率和5mC到T的转化率。
在一实施例中,氧化后不纯化,减少了传统方法氧化后纯化的损失,有效提升回收率。
在一实施例中,磁珠纯化相比柱纯化具有更高的回收率。
在一实施例中,所述氧化包括TET酶氧化。
十-十一易位(Ten-Eleven Translocation,TET)酶是生物体内存在的一种α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶,TET酶家族有三个成员,分别为TET1、TET2和TET3,三种TET酶均具有将5-mC转化为5caC、5fC、5-hmC等等的能力。
在一实施例中,所述TET酶包括TET1、TET2、TET3中的至少一种。TET1、TET2、TET3可以从市场上购买得到,例如,可以购自NEB公司。也可以自行表达纯化得到。
在一实施例中,所述氧化包括将核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)中的至少一种转化为5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种。大部分的胞嘧啶修饰被氧化为5-羧甲基胞嘧啶(5caC),小部分的胞嘧啶修饰被氧化为5fC。在一实施例中,氧化过程主要是中5mC氧化为5caC。
在一实施例中,所述氧化后的核酸含有5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种。
在一实施例中,所述还原包括将氧化后的核酸中的5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种转化为二氢尿嘧啶(DHU)。DHU经过PCR测序识别为T,实现在非重亚硫酸氢盐条件下的DNA甲基化“C”到“T”转化。
在一实施例中,氧化体系中含有TET酶。
在一实施例中,所述氧化体系中TET酶的终浓度可以为2~10μM,包括但不限于2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM。
在一实施例中,每50μL所述氧化体系中加有4~8μL所述TET酶,优选为4μL。对于TET酶,如果是购买的,通常存在不知晓TET酶浓度的情况,因此,可以通过体积来定义酶的用量。
在一实施例中,每50μL所述氧化体系中加有4~8μL所述TET酶,优选为4μL。对于TET酶,如果是购买的,通常存在不知晓TET酶浓度的情况,因此,可以通过体积来定义酶的用量。
在一实施例中,氧化体系中还含有氧化缓冲液。
在一实施例中,所述氧化缓冲液含有如下组分中的至少一种:缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐(英文名α-ketoglutarate,亦称α-KG)、抗坏血酸(英文名ascorbate)、腺苷三磷酸(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)。
在一实施例中,所述氧化缓冲液含有如下浓度的组分中的至少一种:167±20mM缓冲剂、333±20mM金属盐、3.3±0.2mMα-酮戊二酸盐、6.67±1mM抗坏血酸、4±0.5mM三磷酸腺苷、8.33±1mM二硫苏糖醇。
在一实施例中,所述缓冲剂包括但不限于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羟甲基氨基甲烷(别名Tris,CAS No.77-86-1)中的至少一种。
在一实施例中,所述金属盐包括但不限于氯化钠(NaCl)。
在一实施例中,氧化体系中还含有Fe2+。
在一实施例中,含有Fe2+的化合物包括但不限于Fe(NH4)2(SO4)2、Fe2SO4中的至少一种。
在一实施例中,所述氧化体系中Fe2+的终浓度为50~100μM,优选为100μM。
在一实施例中,所述氧化体系还含有水,具体可以是无核酸酶的水等等,无核酸酶的水可以从市场上购买得到。
在一实施例中,氧化体系的pH<8,优选为4~7.5,更优选为4.3~7.5。
在一实施例中,每50μL所述氧化体系中加有7~15μL所述氧化缓冲液,优选为7.5~15μL,更优选为15μL。
在一实施例中,氧化的核酸为用于NGS测序的核酸。
在一实施例中,还原体系含有有机硼烷。用于有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱醛基,从而得到含有二氢尿嘧啶(DHU)残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA。
在一实施例中,所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。
在一实施例中,所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。
在一实施例中,所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。
在一实施例中,所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。
在一实施例中,所述氮杂环包含2-甲基吡啶,并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。
在一实施例中,所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。
在一实施例中,所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。
在一实施例中,所述有机硼烷包含吡啶硼烷。
在一实施例中,其中还原、脱氨基和脱羧基在不分离任何中间体的情况下进行。
在一实施例中,所述还原体系不含亚硫酸氢盐。
在一实施例中,所述还原体系还含有有机酸盐。
在一实施例中,所述有机酸盐包括但不限于醋酸钠。
在一实施例中,所述还原体系的pH为4.0~4.5,优选为4.3。
在一实施例中,还包括对还原后的核酸进行纯化。
在一实施例中,所述纯化包括磁珠纯化、离心柱纯化中的至少一种。
在一实施例中,用于纯化核酸的磁珠溶液含有磁珠以及聚乙二醇。聚乙二醇的加入,有效提高产物回收率,而常规磁珠纯化方法不能回收同管还原产物。
在一实施例中,所述磁珠为干粉状或悬浮液。
在一实施例中,所述磁珠为悬浮液时,所述磁珠的体积与聚乙二醇的质量之比为1:(0.25~0.75)。
在一实施例中,所述磁珠溶液包含磁珠以及聚乙二醇水溶液,所述磁珠为悬浮液时,所述磁珠与聚乙二醇水溶液的体积比为1:(0.5~1.5)。
在一实施例中,所述聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量体积百分比为50%。即每100mL聚乙二醇水溶液中含有50g聚乙二醇。
在一实施例中,所述聚乙二醇的分子量为200~20000,包括但不限于200、300、400、600、800、1000、1500、2000、3350、4000、6000、8000、10000、20000等等,优选为2000~20000,更优选为2000~10000,更优选为4000~10000,更优选为8000。
在一实施例中,所述磁珠包括但不限于Axygen磁珠。磁珠可以从市场上购买得到。磁珠可以是干粉、悬浮液等形态。
在一实施例中,所述核酸包括DNA、RNA中的至少一种。
在一实施例中,所述核酸分子来源于组织样本、体液样本中的至少一种;
在一实施例中,所述核酸分子包含来源于体液样本的cfDNA;
在一实施例中,所述核酸包括单链、双链核酸中的至少一种。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶残基的存在和/或位置的方法,所述方法包括:
使用第一方面所述方法,获得含有二氢尿嘧啶残基的核酸,然后对所述含有二氢尿嘧啶残基的核酸进行扩增和测序或检测。
在一实施例中,所述测序或检测包括但不限于NGS测序、三代测序或PCR检测。
在一实施例中,所述接头连接的DNA片段包含含有选自样品标识符序列、片段标识符序列和链标识符序列的至少一种分子条形码的接头。
在一实施例中,还包括将包含过程标识符序列的分子条形码固定至所述含有二氢尿嘧啶残基的核酸。
在一实施例中,本发明创新性地对TET酶氧化产物直接进行还原,省去了氧化后的纯化步骤,显著增加了转化回收率,不影响PCR扩增效率和转化率。
在一实施例中,本发明减少了操作工序,节约了时间和成本。
在一实施例中,提供一种用于非重亚硫酸盐DNA甲基化检测的氧化后直接还原方法,包括如下步骤:
步骤A:取30ng人源cfDNA,添加0.5%比例的140-160bp甲基化DNA标准品和0.5%的140-160bp非甲基化DNA标准品。
步骤B:对上步DNA进行末端修复和加A;
步骤C:使用连接酶连接修复-加A产物和接头以及分子条形码,得到加接头的dsDNA;
步骤D:对上述加接头DNA片段进行TET酶氧化,得到TET酶氧化后的DNA片段;
步骤E:将所述TET酶处理的DNA不进行纯化,直接进行有机硼烷还原处理,得吡啶硼烷还原产物;
步骤F:对有机硼烷还原后的产物进行增强型磁珠纯化操作,获得扩增模板DNA。
步骤G:对上述DNA模板进行PCR扩增,完成文库构建。
步骤H:对于构建好的文库,加入Taq酶进行PCR扩增外源性甲基化标准品,对PCR扩增产物进行TaqI-V2酶切,并使用凝胶电泳验证转化效率。
在一实施例中,步骤D中使用的TET酶反应体系含有如下组分:50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸,pH=4.3~7.5)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐(即α-ketoglutate,亦称α-KG)、2mM抗坏血酸(ascorbate acid)、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、100μMFe(NH4)2(SO4)2。HEPES为缓冲剂,TET酶反应体系的pH可以为4.3~7.5,优选为6。α-酮戊二酸盐和Fe(NH4)2(SO4)2盐为TET酶的辅酶。
在一实施例中,步骤E中有机硼烷还原体系组成如下:50μL DNA、600mM醋酸钠缓冲液(pH=4.3)和1M吡啶硼烷。
在一实施例中,步骤G中的PCR反应,需要特定的扩增酶,例如使用KAPA HIFIUrail聚合酶。步骤H所述文库的二代测序,依据步骤C和G中使用的接头和index,可采用相应的Illumina平台或者MGI、Gene+Seq平台进行。
在一实施例中,步骤H中的Taq酶PCR扩增反应体系包含Taq酶、甲基化内参的引物、步骤G中的文库DNA、Taq酶反应缓冲液。TaqI酶切反应体系包含甲基化内参的PCR产物、TaqI-V2酶、TaqI-V2酶缓冲液。凝胶电泳按照常规的dsDNA电泳条件进行。
在一实施例中,步骤C、G完成后,还包括纯化步骤。纯化采用Axygen磁珠进行。
实施例1:同管还原
本实施例中,如无特别说明,所使用的磁珠为购自美国Axygen公司的磁珠,亦称Axygen磁珠,产品名称为AxyPrep Magnetic Bead Purification Kits,货号为MAG-PCR-CL-250。该磁珠为悬浮液。
本实施例中,如无特别说明,“室温”是指23℃±2℃。
本实施例中,如无特别说明,“80%乙醇”均是指体积百分浓度为80%的乙醇,亦称“80%V/V乙醇”,是由乙醇与NF-H2O(无核酸酶水,亦称Nuclease-Free Water)按照80:20的体积比配制而成。
本实施例中,TE缓冲液(TE Buffer)购自Invitrogen,货号12090015。组成如下:10mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA。
本实施例在对核酸进行氧化后直接还原,然后进行磁珠纯化。
本实施例的操作步骤如下:
(1)取30例人源cfDNA样本,每一例样本质量为30ng,分别添加0.5%(甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)的140-160bp甲基化DNA标准品和0.5%(非甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)140-160bp非甲基化DNA标准品。
甲基化DNA标准品、非甲基化DNA标准品的制备方法参照申请号为202111145944.4的中国专利《一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途》(申请人:深圳吉因加医学检验实验室)说明书实施例1的步骤一进行。
甲基化DNA标准品序列如下:
sequence1:
ATATCTGATGATGCAAATTCCCTACCGGATCATTGACTTATGACATAGGCGGGAATTTTGCATCGCATCTGTTCAAGGGACGAGCATATGTACACTGCTGCATGCCCAACCTGGACGTTCGAGACATCATGCGGCACGAAGGCCAGAAAGACAGTATTGAAC(SEQ ID NO.1)。
sequence2:
GTGATGTACAATGCACTTTCAGAGTTATCCGGTGTTAAGGGAGTCTGACAAATTCGATGTTGATGTTTTTTCCCAGATGTGCCAATCTTTGGAAGTTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCGCGGTCATGAGCAATGAGAGCGGTCTGACTCTCACATTTGAAC(SEQ ID NO.2)。
sequence3:
TAGCTGGTCTTGCTGGAGATCATCCGGTCGATCGTCCGTACGAACGAACGAGCGAACGAACGAACGTTCGTTAGAGTTTCATATGGCAAGGCAGATTGTTAATTGTAAGCAGATGAGCTTGTGTACAGGGTCGGATTAAAGTTCAGCAAATGAAAAAC(SEQ ID NO.3)。
sequence4:
GAGTAGCTGTCAGCTCTGAGTCTGTTGTTATGTAACTCAGAACTCATTCCGAACGATGCGCTTCGAAC GGACCGCAGCGCAACGAAACGTCACGTTACGACTGCAGGTTGTTCTTGTCCCGGAGAGTTCGGCTGTGGGAAAACCAAAG(SEQ ID NO.4)。
Sequence5:
GACCCTGAGGAACTCATCAAGGAAGTCGAGGAAGTCCGGACAGCAAAAGAAATTGACCGCGCGTAACTAAGGCCAGAACGCGCGCGCAGAAGGGGTTCAAACGCGCGTCACAACCTTCATAGAGGCAAGGCACGTAAAGCACACAAAGCTAAGC(SEQ ID NO.5)。
非甲基化DNA标准品序列如下:
Sequence6:
TTGCATCTGGTATCAAAGAAAGAGCGGGGACCGGTCACGACGTTCATTGGAAACACTGTGATCATTGCTGCATGTTTGGCCTCGATGCTTCCGATGGAGAAAATAATCAAAGGAGCCTTTTGCGGTGACGATAGTCTGCTGTACTTTCCAAAGG(SEQ ID NO.6)。
Sequence7:
TTATATGCCCAATGGCACACTATACGCTGCAAATCCGGCGAATAGTGAGAACTTGGCGAGAGAACAACCTCGAACGCCGCAAGGACAAGAGAGGGCGGCGTGGCATAGACGAAAGGAAAAGGTTAAAGCCAAGAAACTCGCCGCACTTGAACAGGCACTAGCCAACA(SEQ ID NO.7)。
sequence8:
ACTGGAAGAGGCACTAAATGAACACGATTAACATCCGGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGT(SEQ ID NO.8)。
sequence9:
TGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCCGGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCAT(SEQ ID NO.9)。
sequence10:
GTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCCGGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGC(SEQ ID NO.10)。
(2)末端修复和加“A”及接头连接
1)末端修复和加“A”反应体系
表1
混合物组分 | 体积 |
cfDNA | 50μL |
末端修复&加“A”-缓冲液 | 7μL |
末端修复&加“A”-酶混合物 | 3μL |
总体积 | 60μL |
修复反应条件:
表2
步骤 | 温度 | 时间 |
末端修复 | 20℃ | 30min |
和加A | 65℃ | 30min |
HOLD | 4℃ | ∞ |
注:热盖温度为85℃。
2)连接反应:
表3
组分 | 体积 |
末端修复&加“A”产物 | 60μL |
接头储液(15μM) | 3μL |
PCR级水 | 16μL |
连接增强液 | 1μL |
DNA连接酶预混液 | 30μL |
总体积 | 110μL |
连接增强液、DNA连接酶预混液为NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的试剂。接头购自华大智造,MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit,货号:1000005282。孵育条件:20℃,时间30min。
3)连接后纯化反应体系如下:
表4
组分 | 体积 |
接头连接产物 | 110μL |
磁珠 | 88μL |
总体积 | 198μL |
a)震荡混匀,离心。
b)室温孵育5~10min,使DNA与磁珠结合。
c)将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
d)吸去上清。
e)加入200μL 80%乙醇。
f)静置30s。
g)吸掉乙醇。重复使用80%乙醇漂洗一次。
h)室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
i)加入22μL无酶水洗脱DNA。
(3)TET酶氧化反应
1)冰上配制如下TET酶氧化反应体系:
表5
注:TET酶购自NEB公司。
“-”表示无对应数据。
TET酶氧化缓冲液的组成如下:167mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸,pH6.0)、333mMNaCl、3.3mMα-KG(α-酮戊二酸盐)、6.67mM抗坏血酸、4mM腺苷三磷酸(ATP)、8.33mM二硫苏糖醇(DTT)。此为TET酶氧化缓冲液加入氧化反应体系前,各组分的初始浓度。
TET酶氧化缓冲液与其他组分混合,形成的TET酶氧化反应体系中,各组分的浓度如下:
50mM HEPES(pH=6.0)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐、2mM抗坏血酸(ascorbicacid)、1.2mM ATP、1mM DTT、100μM Fe(NH4)2(SO4)2。
2)反应条件:37℃,80min。
3)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中,50℃孵育1h。
(4)吡啶硼烷还原反应
1)配制如下还原反应体系:
表6
反应混合物 | 体积 |
3M醋酸钠(pH=4.3) | 14.6μL |
10M吡啶硼烷 | 7.3μL |
氧化后产物 | 51μL |
2)反应条件:37℃,1200rpm孵育16h。
(5)增强型磁珠纯化法纯化还原产物
1)配制RPB溶液:将Axygen磁珠与质量体积百分比为50%的PEG水溶液(本实施例的PEG具体为PEG8000)按照1:1体积混合,制得RPB溶液,配制完成后,2~8℃保存。
2)新鲜配制80%乙醇。
3)RPB涡旋混匀震荡,室温平衡半小时。
4)步骤(3)结束后,取下EP管,瞬离30s,然后向EP管中加入100μL RPB溶液。
5)放入Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪中,25℃,1000rpm,15min。
6)瞬时离心,将EP管置于磁力架,室温放置15min,待溶液澄清。
7)弃上清。加入200μL预冷的80%乙醇,静置30s。
8)去除上清,重复使用200μL预冷的80%乙醇漂洗一次,弃净上清。室温下晾干乙醇。
9)加入25μL TE缓冲液至磁珠表面,涡旋震荡15s,直至所有磁珠都从管壁表面分离至液体中,瞬离收集液体,37℃孵育5min。
10)瞬离,上架3min,取1μL life Qubit dsDNA HS定量,计算还原回收率,转化回收率=(还原后总量/氧化前投入量)*100%。
11)30个样品的还原回收率中位值为71.0%,变异系数为4.3%(见图1)。
(6)文库扩增
1)PCR扩增反应配置:
表7
注:*所用的引物依据所用平台和使用的接头而确定。推荐体系中的引物最终浓度为0.5~2μM,本实施例表7体系中的引物最终浓度为0.75μM。
2)反应条件如下:
表8
3)取上述PCR反应的产物,用0.9X Axygen磁珠纯化,纯化体系如下:
表9
组分 | 体积 |
上步扩增产物 | 50μL |
Axygen磁珠 | 45μL |
总体积 | 95μL |
纯化步骤如下:
A.震荡混匀,离心。
B.室温孵育5-10min,使DNA与磁珠结合。
C.将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
D.吸去上清。
E.加入200μL 80%乙醇。
F.静置30s。
G.吸掉乙醇。重复使用80%乙醇漂洗一次。
H.室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
I.加入25μL TE缓冲液洗脱文库DNA。并使用life Qubit HS检测浓度。并计算扩增效率。30个样品扩增效率平均值为75.59%(见图2)。
J.使用Qsep 100(台湾光鼎)检测文库片段分布。
(7)转化率验证
1)140~160bp甲基化DNA Taq酶扩增反应
将步骤(5)得到的纯化后PCR产物,取0.5μL进行PCR扩增。设置对照组:1ng/μL 140~160bp甲基化DNA,取0.5μL作为对照组。
表10
试剂 | 体积 | 终浓度 |
PCR产物DNA模板 | 0.5μL | - |
10X Taq缓冲液 | 2.5μL | 1X |
dNTP[10mM each] | 0.5μL | 0.2mM |
Sequence1-F[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
Sequence1-R[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
Taq DNA聚合酶 | 0.125μL | 0.625U |
无酶水 | 补足至25μL | - |
总体积 | 25μL | - |
引物序列如下:
sequence1-F:ATATCTGATGATGCAAATTCCCTA(SEQ ID NO.11);
sequence1-R:GTTCAATACTGTCTTTCTGGCCTT(SEQ ID NO.12)。
PCR扩增条件如下:
表11
2)取>100ng PCR扩增产物(此处具体为15μL),进行TaqI-V2酶切反应,反应体系配置如下:
表12
试剂 | 体积 | 终浓度 |
162bp PCR产物 | 15μL | - |
10X CutSmart缓冲液 | 2.5μL | 1X |
TaqI-V2 | 0.5μL | 10U |
无酶水 | 7μL | NA |
总体积 | 25μL | - |
TaqI-V2购自NEB,货号R0149L。
反应条件:65℃孵育0.5~1h。
3)取10μL步骤2)制得的酶切产物和10μL步骤1)制得的PCR产物,加入6X荧光黄、3%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果显示,140-160bp甲基化DNA成功转化为文库扩增产物,酶切后仅能看到一条带(162bp),未发生转化的阴性对照,可见清晰的两条带(43bp和118bp),未经酶切的PCR产物仅可见一条带。使用Image J计算5mC到T的转化率。30个样品平均转化率为99.21%(见图3)。表明本实施例的同管还原法不影响转化率。
对比例1:常规氧化还原法(氧化后进行纯化,再进行还原)
本对比例的操作步骤如下:
(1)取30例人源cfDNA样本,每例样本30ng,分别添加0.5%(甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)的140-160bp甲基化DNA标准品和0.5%(非甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)的140-160bp非甲基化DNA标准品。(2)末端修复和加A及接头连接
1)末端修复和加A反应体系如下:
表13
混合物组分 | 体积 |
cfDNA | 50μL |
末端修复&加“A”-缓冲液* | 7μL |
末端修复&加“A”-酶混合物* | 3μL |
总体积: | 60μL |
修复反应条件如下:
表14
步骤 | 温度 | 时间 |
末端修复 | 20℃ | 30min |
和加A | 65℃ | 30min |
HOLD | 4℃ | ∞ |
注:热盖温度为85℃。
2)连接反应体系如下:
表15
组分 | 体积 |
末端修复&加“A”产物 | 60μL |
接头储液(15μM) | 3μL |
PCR级水 | 16μL |
连接增强液 | 1μL |
DNA连接酶预混液 | 30μL |
总体积 | 110μL |
连接增强液、DNA连接酶预混液为NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的试剂。
接头购自华大智造,MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit,货号:1000005282。
孵育条件:20℃,时间30min。
3)连接后纯化
表16
a)震荡混匀,离心。
b)室温孵育5~10min,使DNA与磁珠结合。
c)将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
d)吸去上清。
e)加入200μL 80%乙醇。
f)静置30s。
g)吸掉乙醇。重复使用80%乙醇漂洗一次。
h)室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
i)加入22μL无酶水洗脱DNA。取1μL,使用life Qubit dsDNA HS定量。
(3)TET酶氧化反应
1)冰上配制如下TET酶氧化反应体系:
表17
反应混合物 | 体积 | 终浓度 |
接头连接的DNA | 20μL | 0.6ng/μL |
TET酶氧化缓冲液(pH为6) | 15μL | 1X |
1.5mM Fe(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub> | 3.33μL | 100μM |
TET酶酶 | 4μL | - |
无酶水 | 补足至50μL | - |
总体积 | 50μL |
注:TET酶购自NEB公司。
“-”表示无对应数据。
TET酶氧化缓冲液的组成如下:167mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸,pH6.0)、333mMNaCl、3.3mMα-KG(α-酮戊二酸盐)、6.67mM抗坏血酸、4mM腺苷三磷酸(ATP)、8.33mM二硫苏糖醇(DTT)。此为TET酶氧化缓冲液加入氧化反应体系前,各组分的初始浓度。
TET酶氧化缓冲液与其他组分混合,形成的TET酶氧化反应体系中,各组分的浓度如下:
50mM HEPES(pH=6.0)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐、2mM抗坏血酸(ascorbicacid)、1.2mM ATP、1mM DTT、100μM Fe(NH4)2(SO4)2。
2)反应条件:37℃,80min。
2)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中,50℃孵育1h。
3)产物加入1.8X磁珠。
4)震荡混匀,离心。
5)室温孵育5-10min,使DNA与磁珠结合。
6)将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
7)吸去上清。
8)加入200μL的80%乙醇。
9)静置30s。
10)吸掉乙醇。重复使用80%乙醇漂洗一次。
11)室温下挥发乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
12)使用37μL无酶水洗脱。
(4)吡啶硼烷还原反应
1)配制如下还原反应体系:
表18
反应混合物 | 体积 |
3M醋酸钠(pH=4.3) | 10μL |
10M吡啶硼烷 | 5μL |
DNA | 35μL |
2)反应条件:37℃,1200rpm孵育16h。
3)采用离心柱(本对比例为Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积25μL。
4)取1μL life Qubit dsDNA HS定量,计算转化回收率,转化回收率=(还原后总量/氧化前投入量)*100%。
5)30个样品转化回收率的中位值为34.6%,变异系数为22.49%(见图1)。
(5)文库扩增
1)配制如下PCR扩增反应体系:
表19
组分 | 体积 |
KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X) | 25μL |
MGI的引物* | 2.5μL |
吡啶硼烷处理的DNA | 22.5μL |
总体积 | 50μL |
注:*所用的引物依据所用平台和使用的接头而确定。推荐体系中的引物最终浓度为0.5~2μM,本对比例表19体系中的引物最终浓度为0.75μM。
2)反应条件如下:
表20
3)取上述PCR反应的产物,用0.9X Axygen磁珠纯化。
表21
组分 | 体积 |
上步扩增产物 | 50μL |
Axygen磁珠 | 45μL |
总体积 | 95μL |
纯化步骤如下:
A.震荡混匀,离心。
B.室温孵育5~10min,使DNA与磁珠结合。
C.将EP管置于磁力架2min,溶液澄清。
D.吸去上清。
E.加入200μL 80%乙醇。
F.静置30s。
G.吸掉乙醇。重复使用80%乙醇漂洗一次。
H.室温下或37℃挥干乙醇,磁珠没有明显的发亮或干裂。
I.加入25μL TE缓冲液洗脱文库DNA。并使用life Qubit HS检测浓度。并计算扩增效率。扩增效率平均值为77.17%(见图2)。
J.使用Qsep 100(台湾光鼎)检测文库片段分布。
(7)转化率验证
1)140~160bp甲基化DNA Taq酶扩增反应
将步骤(5)得到的纯化后PCR产物,取0.5μl进行PCR扩增。设置对照组:1ng/μl140-160bp甲基化DNA,取0.5μL作为对照组。
表22
试剂 | 体积 | 终浓度 |
PCR产物DNA模板 | 0.5μL | - |
10X Taq缓冲液 | 2.5μL | 1X |
dNTP[10mM each] | 0.5μL | 0.2mM |
Sequence1-F[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
Sequence1-R[10μM] | 0.5μL | 0.2μM |
Taq DNA聚合酶 | 0.125μL | 0.625U |
无酶水 | 补足至25μL | - |
总体积 | 25μL | - |
PCR扩增条件如下:
表23
2)取>100ng PCR扩增产物(此处具体为15μL),进行TaqI-V2酶切反应,配制如下反应体系:
表24
试剂 | 体积 | 终浓度 |
162bp PCR产物 | 15μL | - |
10X CutSmart缓冲液 | 2.5μL | 1X |
TaqI-V2 | 0.5μL | 10U |
无酶水 | 7μL | NA |
总体积 | 25μL | - |
TaqI-V2购自NEB,货号R0149L。
反应条件:65℃孵育0.5~1h。
3)取10μL步骤2)制得的10μl酶切产物和10μL步骤1)制得的PCR产物,加入6X荧光黄、3%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果显示,140~160bp甲基化DNA成功转化为文库扩增产物,酶切后仅能看到一条带(162bp),未发生转化的阴性对照,可见清晰的两条带(43bp和118bp),未经酶切的PCR产物仅可见一条带。使用Image J计算5mC到T的转化率。转化率平均值为98.57%(见图3)。
对比例2:氧化后纯化,再进行还原;还原后使用增强型磁珠纯化。
取30例人源cfDNA样本,每例样本30ng,分别添加0.5%(甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)的140-160bp甲基化DNA标准品和0.5%(非甲基化DNA标准品的加入质量为每例样本质量的0.5%)的140-160bp非甲基化DNA标准品。
DNA末端修复、加A、接头连接和氧化反应及还原反应按照对比例1进行,还原后纯化方式、文库扩增和转化率鉴定参照实施例1进行。
实验结果如图1、2、3所示,图1、2、3中,实施例1的方法为:同管还原,还原后RPB纯化;对比例1的方法为:氧化后纯化,还原后柱纯化;对比例2的方法为:氧化后纯化,还原后RPB纯化。
如图1、2、3所示,对比例2的实验结果转化回收率中位数为53.58%,变异系数为8.29%;文库扩增效率平均值76.37%,转化率平均值98.92%。
从图1所示的实施例和对比例的转化回收率可以发现,实施例1的同管还原法可显著提升转化回收率。
图2的扩增效率结果、图3的5mC到T的转化率结果显示,实施例1的同管还原法不会造成扩增效率、5mC到T的转化率降低。
在一实施例中,本发明提供一种氧化后无需纯化直接进行还原的方法,能显著提升转化回收率且回收率更稳定。
在一实施例中,本方法减少了氧化后磁珠纯化的步骤,减少了实验操作时间和成本。
在一实施例中,本方法不影响后续文库扩增效率和转化率。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳吉因加医学检验实验室
<120> 一种还原核酸的方法及其检测方法
<130> 21I32269
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atatctgatg atgcaaattc cctaccggat cattgactta tgacataggc gggaattttg 60
catcgcatct gttcaaggga cgagcatatg tacactgctg catgcccaac ctggacgttc 120
gagacatcat gcggcacgaa ggccagaaag acagtattga ac 162
<210> 2
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60
cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120
gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158
<210> 3
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60
cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120
gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagtagctgt cagctctgag tctgttgtta tgtaactcag aactcattcc gaacgatgcg 60
cttcgaacgg accgcagcgc aacgaaacgt cacgttacga ctgcaggttg ttcttgtccc 120
ggagagttcg gctgtgggaa aaccaaag 148
<210> 5
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaccctgagg aactcatcaa ggaagtcgag gaagtccgga cagcaaaaga aattgaccgc 60
gcgtaactaa ggccagaacg cgcgcgcaga aggggttcaa acgcgcgtca caaccttcat 120
agaggcaagg cacgtaaagc acacaaagct aagc 154
<210> 6
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgcatctgg tatcaaagaa agagcgggga ccggtcacga cgttcattgg aaacactgtg 60
atcattgctg catgtttggc ctcgatgctt ccgatggaga aaataatcaa aggagccttt 120
tgcggtgacg atagtctgct gtactttcca aagg 154
<210> 7
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttatatgccc aatggcacac tatacgctgc aaatccggcg aatagtgaga acttggcgag 60
agaacaacct cgaacgccgc aaggacaaga gagggcggcg tggcatagac gaaaggaaaa 120
ggttaaagcc aagaaactcg ccgcacttga acaggcacta gccaaca 167
<210> 8
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actggaagag gcactaaatg aacacgatta acatccggct aagaacgact tctctgacat 60
cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 120
cgaacagttg gcccttgagc atgagt 146
<210> 9
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgaccttgaa gctaagcact tcaagaaaaa cgttgaggaa caactcaaca agccggcgta 60
gggcacgtct acaagaaagc atttatgcaa gttgtcgagg ctgacatgct ctctaagggt 120
ctactcggtg gcgaggcgtg gtcttcgtgg cataaggaag actctattca t 171
<210> 10
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgccggg gtgtcgataa 60
ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg 120
cgctaagtct ccactggaga acacttggtg ggctgagc 158
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atatctgatg atgcaaattc ccta 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gttcaatact gtctttctgg cctt 24
Claims (10)
1.一种还原核酸的方法,其特征在于,包括对氧化后的核酸不进行纯化,直接进行还原。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氧化包括TET酶氧化。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氧化包括将核酸中的5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)中的至少一种转化为5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氧化后的核酸含有5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述还原包括将氧化后的核酸中的5-羧甲基胞嘧啶(5caC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)中的至少一种转化为二氢尿嘧啶(DHU)。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,氧化体系中含有TET酶;
和/或,氧化体系中TET酶的终浓度为2~10μM;
和/或,每50μL氧化体系中加有4~8μL TET酶。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,氧化体系中还含有氧化缓冲液;
和/或,所述氧化缓冲液含有如下组分中的至少一种:缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸腺苷三磷酸(ATP)、二硫苏糖醇(DTT);
和/或,所述氧化缓冲液含有如下浓度的组分中的至少一种:167±20mM缓冲剂、333±20mM金属盐、3.3±0.2mMα-酮戊二酸盐、6.67±1mM抗坏血酸、4±0.5mM三磷酸腺苷、8.33±1mM二硫苏糖醇;
和/或,所述缓冲剂包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种;
和/或,所述金属盐包括但不限于氯化钠(NaCl);
和/或,氧化体系中还含有Fe2+;
和/或,含有Fe2+的化合物包括Fe(NH4)2(SO4)2、Fe2SO4中的至少一种;
和/或,氧化体系中Fe2+的终浓度为50~100μM;
和/或,氧化体系的pH<8,优选为4.0~7.5,更优选为4.3~7.5;
和/或,每50μL氧化体系中加有7~15μL所述氧化缓冲液。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还原体系含有有机硼烷;
和/或,所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物;
和/或,所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物;
和/或,所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶;
和/或,所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶;
和/或,所述氮杂环包含2-甲基吡啶,并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷;
和/或,所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物;
和/或,所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺;
和/或,所述有机硼烷包含吡啶硼烷;
和/或,还原体系还含有有机酸盐;
和/或,所述有机酸盐包括醋酸钠;
和/或,所述还原体系的pH为4.0~4.5,优选为4.3。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括对还原后的核酸进行纯化;
和/或,所述纯化包括磁珠纯化、离心柱纯化中的至少一种;
和/或,用于纯化核酸的磁珠溶液含有磁珠以及聚乙二醇;
和/或,所述磁珠为干粉状或悬浮液;
和/或,所述磁珠为悬浮液时,所述磁珠的体积与聚乙二醇的质量之比为1:(0.25~0.75);
和/或,所述磁珠溶液包含磁珠以及聚乙二醇水溶液,所述磁珠为悬浮液时,所述磁珠与聚乙二醇水溶液的体积比为1:(0.5~1.5);
和/或,所述聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量体积百分比为50%;
和/或,所述聚乙二醇的分子量为200~20000;
和/或,所述核酸包括DNA、RNA中的至少一种;
和/或,所述核酸分子来源于组织样本、体液样本中的至少一种;
和/或,所述核酸分子包含来源于体液样本的cfDNA;
和/或,所述核酸包括单链、双链核酸中的至少一种。
10.一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶残基的存在和/或位置的方法,其特征在于,所述方法包括:使用权利要求1~9任意一项所述方法,获得含有二氢尿嘧啶残基的核酸,然后对所述含有二氢尿嘧啶残基的核酸进行扩增和测序或检测,获得核酸中5-甲基胞嘧啶残基的存在和/或位置。
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