CN115928225A - 游离dna甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒，构建方法包括：提供游离DNA样本并将其变性为单链DNA；将单链DNA两端连接胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列；将连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，形成延伸片段，得到双链DNA；将双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶；除去带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；将带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应，得到带有尿嘧啶的DNA；将带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。本公开实施例的构建方法可以提高甲基化检测的准确性和文库产量。
Description
技术领域
本公开实施例涉及但不限于基因测序技术领域，尤其涉及一种游离DNA甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒。
背景技术
基因组DNA中的CpG位点甲基化是基因表达、组织分化、器官发育、衰老和肿瘤发生的重要表观遗传学调控机制。DNA甲基化是指胞嘧啶碱基的嘧啶环第5位碳原子上，原有的一个氢原子被替换成甲基，形成5-甲基胞嘧啶。游离DNA、循环游离DNA(Circulating freeDNA，cfDNA)或者细胞游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)，是释放到血浆中的降解的DNA片段，大小约为185bp至200bp。有研究表明，在临床癌症诊断前四年就能在cfDNA中检测到甲基化的变化。此外，近3000万个甲基化位点分布在人类基因组中，为癌症检测提供了丰富的信号。DNA甲基化发生在肿瘤发生的早期，有时甚至发生在基因突变之前，因此，基于表观遗传改变(甲基化)的cfDNA测序被认为是有希望的癌症早期检测方法。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本公开的保护范围。
本公开实施例提供了一种游离DNA甲基化文库构建方法，所述构建方法包括：
提供游离DNA样本；
将所述游离DNA样本变性为单链DNA；
将所述单链DNA与含有胞嘧啶且所述胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列进行连接反应，使所述单链DNA两端各连接一个接头序列，得到两端连接有接头序列的单链DNA；
将所述两端连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，所述延伸反应形成延伸片段，所述延伸片段的两端分别与所述两端连接有接头序列的单链DNA两端的接头序列连接，形成两端连接有接头序列的双链DNA；
将所述双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶，得到带有受保护胞嘧啶的双链DNA；
除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；
将所述带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应形成尿嘧啶，得到带有尿嘧啶的DNA；
将所述带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸片段中含有至少一个尿嘧啶。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应所采用的试剂可以包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和KlenowFragment。
在本公开的示例性实施例中，
脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液的工作浓度可以为0.1mM至0.4mM；
在所述吐温20水溶液中，吐温20的质量与水的体积之比为(0.03至0.1)g:100ml；
所述Klenow Fragment的工作浓度可以为0.02U/μL至0.08U/μL。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应的反应条件可以包括：反应温度为20℃，反应时间为15min；所述延伸反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
在本公开的示例性实施例中，所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段可以包括：
采用UDG酶进行消化反应，使所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解，从而除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段。
在本公开的示例性实施例中，所述消化反应可以包括第一消化阶段和第二消化阶段；所述第一消化阶段的反应温度可以为37℃，反应时间可以为20min；所述第二消化阶段的反应温度可以为50℃，反应时间可以为5min。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列可以包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列可以由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列可以由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
在本公开的示例性实施例中，所述连接反应所采用的试剂还可以包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶。
在本公开的示例性实施例中，
在所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的质量与水的体积之比可以为(5至20)g:100ml；
所述二硫苏糖醇的工作浓度可以为0.01M至0.05M；
所述腺嘌呤核苷三磷酸的工作浓度可以为0.5mM至2mM；
所述多核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1U/μL至0.4U/μL；
所述DNA连接酶的工作浓度可以为2U/μL至5U/μL。
在本公开的示例性实施例中，所述连接反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为45min。
在本公开的示例性实施例中，所述受保护胞嘧啶可以为羧基胞嘧啶。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应所采用的试剂可以包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为60min；所述氧化反应结束后加入终止液，并在37℃下孵育30min。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应所采用的试剂可以包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为180min。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应所采用的试剂还可以包括：IndexPrimer Mix和HiFi HotStart Uracil Mix。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应的反应条件可以包括：在98℃下反应30s；接着在98℃下反应10s，在62℃下反应30s，在65℃下反应60s，循环7次至16次；在65℃下反应5min；所述扩增反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
在本公开的示例性实施例中，所述构建方法还可以包括纯化处理，所述纯化处理包括以下任意一种或多种：
在所述延伸反应之后，在所述氧化反应之前，采用磁珠捕获所述延伸反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述延伸反应的产物；
在所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段之后，在所述脱氨基反应之前，采用磁珠捕获除去所述延伸片段后得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的除去所述延伸片段后得到的产物；
在所述脱氨基反应之后，在所述扩增反应前，采用磁珠捕获所述脱氨基反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述脱氨基反应的产物。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化文库，所述游离DNA甲基化文库通过如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法得到。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化测序方法，所述测序方法包括：采用如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法构建游离DNA甲基化文库，再进行测序。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化文库构建试剂盒，所述试剂盒用于执行如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法；
所述试剂盒包括：所述接头序列、接头序列连接试剂、延伸试剂、氧化保护试剂、用于除去所述延伸片段的试剂、脱氨基试剂、扩增试剂。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列可以包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列可以由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列可以由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列连接试剂可以包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸试剂可以包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化保护试剂可以包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)。
在本公开的示例性实施例中，所述用于除去所述延伸片段的试剂可以包括：UDG酶。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基试剂可以包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增试剂可以包括：Index Primer Mix和HiFiHotStart Uracil Mix。
本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法无需采用重亚硫酸盐对cfDNA进行甲基化转化处理，并且反应条件温和，解决了cfDNA过度降解、损伤丢失的问题；而且，本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法未进行末端修复，解决了3’端甲基化失真的问题，并且先将双链DNA样本变性为单链DNA，之后在单链状态下进行接头连接，可保证cfDNA链缺口在变性后形成的单链均被有效利用，避免传统双链连接引起的链丢失问题。因此，本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法可以避免游离DNA的片段丢失，从而可以提高甲基化文库产量，并且可以提高甲基化率检测的准确性。
本公开的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得更加清楚，或者通过实施本公开而了解。本公开的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本公开技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本公开的实施例一起用于解释本公开的技术方案，并不构成对本公开技术方案的限制。
图1为本公开示例性实施例的游离DNA甲基化文库构建方法的流程示意图；
图2为本公开对比例的酶转化双链建库方法的流程示意图；
图3为本公开示例性实施例所采用的第一接头序列的结构示意图；
图4为本公开示例性实施例所采用的第二接头序列的结构示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本公开的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
本文中的实施方式可以以多个不同形式来实施。所属技术领域的普通技术人员可以很容易地理解一个事实，就是实现方式和内容可以在不脱离本公开的宗旨及其范围的条件下被变换为各种各样的形式。因此，本公开不应该被解释为仅限定在下面的实施方式所记载的内容中。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
在本公开的描述中，“第一”、“第二”等序数词是为了避免构成要素的混同而设置，而不是为了在数量方面上进行限定的。
目前市场上的cfDNA甲基化测序，其甲基化文库构建方法主要有2种。其一，是基于重亚硫酸盐转化的的单链建库方法(如Swift Biosciences试剂盒
Methyl-Seq DNA Library Kit)，该方法将cfDNA处于高盐、高温环境下反应2小时至5小时，会造成cfDNA断裂降解，并且由于cfDNA本身就有一些缺口损伤，因此该方法在文库构建过程中会造成大量的cfDNA片段丢失，而丢失的片段可能就包含甲基化变异的位点，所以该方法较难检测出低起始量的cfDNA甲基化变异，检测灵敏度大幅降低。其二，是基于酶学转化法的双链建库方法，该方法可以避免重亚硫酸盐处理cfDNA导致片段降解的问题，大致流程是直接对双链cfDNA进行末端修复，随后添加接头序列，接头序列包含的胞嘧啶(C碱基)均有甲基化修饰，在双链状态下通过TET2酶等作用使甲基化的胞嘧啶转化为羧基胞嘧啶，未甲基化的C碱基则不发生变化，随后双链变性为单链，采用APOBEC酶将未甲基化的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶(U碱基)，最后通过扩增富集形成甲基化文库。由于cfDNA带有黏性末端，且可能突出端的单链DNA长度占比较长，该方法在末端修复时，修复所用的原材料之一是脱氧胞苷三磷酸(dCTP)，dCTP中的碳原子均未被甲基化，在测序完成后往往出现末端甲基化偏低的问题；除此之外，由于cfDNA链本身存在的损伤缺口问题，在接头连接步骤后，DNA链变性会形成单端接头的DNA单链，后续步骤无法扩增导致DNA链的丢失。
本公开实施例提供了一种游离DNA甲基化文库构建方法。图1为本公开示例性实施例的游离DNA甲基化文库构建方法的流程示意图。如图1所示，所述构建方法包括：
提供游离DNA样本；
将所述游离DNA样本变性为单链DNA；
将所述单链DNA与含有胞嘧啶且所述胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列进行连接反应，使所述单链DNA两端各连接一个接头序列，得到两端连接有接头序列的单链DNA；
将所述两端连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，所述延伸反应形成延伸片段，所述延伸片段的两端分别与所述两端连接有接头序列的单链DNA两端的接头序列连接，形成两端连接有接头序列的双链DNA；
将所述双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶，得到带有受保护胞嘧啶的双链DNA；
除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；
将所述带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应形成尿嘧啶，得到带有尿嘧啶的DNA；
将所述带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。
本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法无需采用重亚硫酸盐对cfDNA进行甲基化转化处理，并且反应条件温和，解决了cfDNA过度降解、损伤丢失的问题；而且，本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法未进行末端修复，解决了3’端甲基化失真的问题，并且先将双链DNA样本变性为单链DNA，之后在单链状态下进行接头连接，可保证cfDNA链缺口在变性后形成的单链均被有效利用，避免传统双链连接引起的链丢失问题。因此，本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法可以避免游离DNA的片段丢失，从而可以提高甲基化文库产量，并且可以提高甲基化率检测的准确性。
在本公开的示例性实施例中，所述游离DNA样本的变性可以包括：将所述游离DNA样本加热至一定温度，使所述游离DNA样本的双链解链成单链，所述变性的温度可以为95℃，所述变性的时间可以为5min。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸片段中含有至少一个尿嘧啶。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应所采用的试剂可以包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温(Twteen)20和KlenowFragment。
在本公开的示例性实施例中，
脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液的工作浓度可以为0.1mM至0.4mM；
在所述吐温20水溶液中，吐温20的质量与水的体积之比为(0.03至0.1)g:100ml，也可以理解为所述吐温20水溶液的质量浓度为0.03％至0.1％；
所述Klenow Fragment的工作浓度可以为0.02U/μL至0.08U/μL。
在本公开的示例性实施例中，所述Klenow反应缓冲液的工作浓度可以为0.5×至2×。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸反应的反应条件可以包括：反应温度为20℃，反应时间为15min；所述延伸反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
在本公开的示例性实施例中，所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段可以包括：
将所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解，从而除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段。
本公开实施例的游离DNA甲基化文库构建方法在单链DNA完成连接反应之后，可以采用含有dUTP的原料形成延伸片段，且该延伸片段中含有随机分布的尿嘧啶，有利于在后续步骤将延伸片段中的尿嘧啶降解，从而实现除去延伸片段的目的。
在本公开的示例性实施例中，所述将所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解可以包括：
采用UDG酶进行消化反应，使所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解。
在本公开的示例性实施例中，所述消化反应可以包括第一消化阶段和第二消化阶段；所述第一消化阶段的反应温度可以为37℃，反应时间可以为20min；所述第二消化阶段的反应温度可以为50℃，反应时间可以为5min。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列可以包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列可以由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列可以由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
在本公开的示例性实施例中，所述连接反应所采用的试剂还可以包括：聚乙二醇水溶液(例如，PEG 8000)、DNA连接酶缓冲液(例如，T4 DNA连接酶缓冲液)、二硫苏糖醇(DTT)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、多核苷酸激酶(例如，T4 PNK)和DNA连接酶(例如，T4 DNA连接酶)。
在本公开的示例性实施例中，
在所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的质量与水的体积之比可以为(5至20)g:100ml，也可以理解为所述聚乙二醇水溶液的质量浓度为20g/120g至5g/105g，约为5％至20％；
所述二硫苏糖醇的工作浓度可以为0.01M至0.05M；
所述腺嘌呤核苷三磷酸的工作浓度可以为0.5mM至2mM；
所述多核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1U/μL至0.4U/μL；
所述DNA连接酶的工作浓度可以为2U/μL至5U/μL。
在本公开的示例性实施例中，所述DNA连接酶缓冲液的工作浓度可以为0.5×至2×。
在本公开的示例性实施例中，所述连接反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为45min。
在本公开的示例性实施例中，所述受保护胞嘧啶可以为羧基胞嘧啶。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应所采用的试剂可以包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水(Nuclease-free water)和Fe(II)。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为60min；所述氧化反应结束后加入终止液，并在37℃下孵育30min。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应所采用的试剂可以包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白(BSA)和无核酸酶水。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基反应的反应条件可以包括：反应温度为37℃，反应时间为180min。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应所采用的试剂还可以包括：IndexPrimer Mix(指数引物混合物)和2x HiFi HotStart Uracil Mix(HiFi HotStart尿嘧啶混合物)。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增反应的反应条件可以包括：在98℃下反应30s；接着在98℃下反应10s，在62℃下反应30s，在65℃下反应60s，循环7次至16次；在65℃下反应5min；所述扩增反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
在本公开的示例性实施例中，所述构建方法还可以包括纯化处理，所述纯化处理包括以下任意一种或多种：
在所述延伸反应之后，在所述氧化反应之前，采用磁珠捕获所述延伸反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述延伸反应的产物；
在所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段之后，在所述脱氨基反应之前，采用磁珠捕获除去所述延伸片段后得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的除去所述延伸片段后得到的产物；
在所述脱氨基反应之后，在所述扩增反应前，采用磁珠捕获所述脱氨基反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述脱氨基反应的产物。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化文库，所述游离DNA甲基化文库通过如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法得到。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化测序方法，所述测序方法包括：采用如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法构建游离DNA甲基化文库，再进行测序。
在本公开的示例性实施例中，所述游离DNA样本可以来自于细胞、组织、血液、血清等样品材料，例如，可以来自于疑似肿瘤患者的血液。
本公开实施例还提供一种游离DNA甲基化文库构建试剂盒，所述试剂盒用于执行如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法；
所述试剂盒包括：所述接头序列、接头序列连接试剂、延伸试剂、氧化保护试剂、用于除去所述延伸片段的试剂、脱氨基试剂、扩增试剂。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列可以包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列可以由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列可以由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
在本公开的示例性实施例中，所述接头序列连接试剂可以包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶。
在本公开的示例性实施例中，所述延伸试剂可以包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment。
在本公开的示例性实施例中，所述氧化保护试剂可以包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)。
在本公开的示例性实施例中，所述用于除去所述延伸片段的试剂可以包括：UDG酶。
在本公开的示例性实施例中，所述脱氨基试剂可以包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水。
在本公开的示例性实施例中，所述扩增试剂可以包括：Index Primer Mix和HiFiHotStart Uracil Mix。
在本公开的示例性实施例中，所述试剂盒还可以包括操作手册，所述操作手册可以包括按照如上本公开实施例提供的所述游离DNA甲基化文库构建方法操作试剂盒。
实施例1
本实施例提供了一种游离DNA甲基化文库构建方法和游离DNA甲基化测序方法，包括：
(1)标准品制备：从菁良基因定制cfDNA标准品，包括全甲基化修饰的标准品(即标准品的序列中的C碱基均有甲基化修饰)与全未甲基化修饰的标准品(即标准品的序列中C碱基均非甲基化修饰)，将标准品按一定比例混合成1μg的50％甲基化率的标准品，随后将50％甲基化率的标准品加入到0.6mL PCR管中存放；
(2)变性：分别取50％甲基化率的标准品1ng、10ng、50ng至0.2mL PCR管中，标记为样本1、2、3，将样本1、2、3放置于PCR仪中，在95℃下孵育5min，随后立即将PCR置于冰上冷却，静置2min，使标准品中的DNA充分解链成单链DNA；
(3)连接反应：将下表所示的试剂解冻后颠倒混匀，并进行瞬时离心，随后依次加入含有16μL步骤(2)得到的产物的PCR管中，该步骤的操作在冰上进行；轻轻吹打或振荡PCR管使PCR管中的反应液混匀，并瞬时离心使反应液至管底，离心结束后将PCR管放入PCR仪中，在37℃下进行连接反应，反应时间为45min；
表1
其中，接头序列由4条寡核苷酸退火而成，寡核苷酸序列如表2所示：
表2
接头序列退火步骤：
步骤1：分别将带有氨基修饰的寡核苷酸1至4重悬至浓度为100μM，体积分别为100μL的溶液；
步骤2：配制缓冲液试剂100μL，试剂组成：
10mM(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)-HCl)缓冲液，该缓冲液的pH为7.5，2mM EDTA，50mM NaCl；
步骤3：分别取10μL寡核苷酸1与寡核苷酸2置于第一PCR管中，10μL寡核苷酸3与寡核苷酸4置于第二PCR管中，以上PCR管中分别加入80μL缓冲液试剂，充分混匀，并离心10s；
步骤4：将上述PCR管放置于PCR仪中，在95℃变性10min；
步骤5：反应结束后，直接关掉PCR仪，待温度降至室温，取出PCR管。
第一PCR管中的产物为第一接头序列，第二PCR管中的产物为第二接头序列。
图3为本公开示例性实施例所采用的第一接头序列的结构示意图；图4为本公开示例性实施例所采用的第二接头序列的结构示意图。如图3和图4所示，Pho表示磷酸基团修饰，利于DNA连接；N表示简并碱基；AmMC6:AmM表示氨基修饰，C6表示氨基与DNA之间的亚甲基直链的碳原子数量，主要起到防止接头自连的作用；AmMC12:AmM表示氨基修饰，C6表示氨基与DNA之间的亚甲基直链的碳原子数量，主要起到防止接头自连的作用。
(4)延伸反应：待上一步反应完成，立即按照下表在PCR管中配制如下反应体系，轻轻吹打或振荡PCR管使PCR管中的反应液混匀，并瞬时离心使反应液至管底，离心结束后将PCR管放入PCR仪中进行延伸反应；其中，热盖温度为100℃，延伸反应的反应温度为20℃，反应时间为15min，反应结束后将PCR管的温度维持在4℃；
表3
(5)产物纯化：向步骤(4)的产物中加入80μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清；加入200μL新配制的80体积％乙醇进行漂洗，室温孵育30s至60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入22μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取20μL上清液待用；
(6)氧化反应：将下表所示的试剂解冻后颠倒混匀，并进行瞬时离心，随后依次加入含有20μL步骤(5)得到的产物的PCR管中，该步骤的操作在冰上进行；轻轻吹打或振荡PCR管使PCR管中的反应液混匀，并瞬时离心，随后加入5μL Fe(II)溶液，再次充分混匀并短暂离心，离心结束后将PCR管放入PCR仪中进行氧化反应，其中，氧化反应的反应温度为37℃，反应时间为60min；反应结束后，静置于冰上加入1μL终止液并在37℃孵育30min；
表4
在本实施例中，该步骤采用NEB公司的酶法甲基化转化模块试剂盒(货号：E7125)；
(7)UDG消化反应：待上一步反应完成，立即按照下表在PCR管中配制如下反应体系，轻轻吹打或振荡PCR管使PCR管中的反应液混匀，并瞬时离心使反应液至管底，离心结束后将PCR管放入PCR仪中进行消化反应；其中，第一消化阶段的反应温度为37℃，反应时间为20min；第二消化阶段的反应温度为50℃，反应时间为5min；
表5
(8)产物纯化：向步骤(7)的产物中加入80μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清；加入200μL新配制的80体积％乙醇进行漂洗，室温孵育30s至60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入18μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取16μL上清液待用；
(9)脱氨基反应：加入4μL甲酰胺至步骤(8)的产物中，充分混匀，短暂离心，在85℃下孵育10min，反应完成立即置于冰上并在PCR管中配制下表所示的反应体系；轻轻吹打PCR管使PCR管中的反应液混匀，并短暂离心，离心结束后将PCR管放入PCR仪中进行脱氨基反应，其中，热盖温度为75℃，脱氨基反应的反应温度为37℃，反应时间为180min；
表6
在本实施例中，该步骤采用NEB公司的酶法甲基化转化模块试剂盒(货号：E7125)；
(10)产物纯化：向步骤(9)的产物中加入100μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清；加入200μL新配制的80体积％乙醇进行漂洗，室温孵育30s至60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入22μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取20μL上清液待用；
(11)产物扩增：将Index Primer Mix、KAPA HiFi HotStart Uracil解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如表7所示的反应体系；轻轻吹打PCR管使PCR管中的反应液混匀，并短暂离心，离心结束后将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，扩增反应的反应条件如表8所示；
表7
表8
PCR扩增引物包含2条引物，引物中可以包含以下编号1-16中的任意一种标记序列，可用于区分样本，标记序列如下：
表9
(12)产物纯化：向步骤(11)的产物中加入45μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架大约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清；加入200μL新配制的80体积％乙醇进行漂洗，室温孵育30s至60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入32μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取30μL上清液待用；
(13)上机测序：将步骤(12)得到的甲基化文库稀释到1ng/μL，取出1μL采用安捷伦4200Tapestation system(美国安捷伦公司)检测；另外，再取出1μL用于qPCR检测，根据检测结果决定上机浓度。根据上步所得的浓度，将文库稀释到上机要求后(2nmoL)，在Illumina公司的Novaseq测序平台上进行PE150测序，每个样本数据量1.5G。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于实施例1的标准品中不加质控品，而实施例2的标准品中加入质控品：分别取50％甲基化率标准品1ng、10ng、50ng至0.2mL PCR管中，标记为样本4、5、6，并且样本4、5、6中分别加入1μL0.1ng/μL的pUC19质粒DNA和1μL 2ng/μL的Lambda DNA作为质控品，并采用Lamda DNA和pUC19质粒DNA作为对照DNA(Control DNA)，其加入的量根据样本cfDNA的数据量不同而不同。
pUC19质粒DNA采用CpG methylated pUC19，其所有的胞嘧啶(C碱基)是完全甲基化的，因此理论上pUC19质粒DNA的甲基化率为100％，用于指示实验中对甲基化的胞嘧啶的保护是否有效，pUC19质粒DNA的甲基化率大于99％时可以视为甲基化保护成功。同时，加入的1μL 2ng/μL的Lamda DNA采用Unmethylated lambda DNA，其是完全未甲基化的，即包含的所有的胞嘧啶(C碱基)是完全不甲基化的。Lambda DNA的甲基化率可以指示实验中对未甲基化C碱基的转化是否有效。如果最终分析DNA的甲基化率低于1％则可以视为试验成功。因此，样本4、5、6中加入的Lambda DNA与pUC19质粒DNA均可以作为内参DNA。
对比例1
本对比例采用亚硫酸盐单链建库方法构建游离甲基化文库：采用购买自SwiftBioscience的试剂盒
Methyl-Seq DNA Library Kit，具体操作详见试剂盒操作手册，测试样本取50％甲基化率标准品1ng、10ng、50ng至0.2mL PCR管中，标记为样本7、8、9。
对比例2
本对比例采用酶转化双链建库方法构建游离DNA甲基化文库。图2为本对比例的酶转化双链建库方法的流程示意图。
分别取50％甲基化率标准品1ng、10ng、50ng至0.2mL PCR管中，标记为样本10、11、12，并按照图2所示的流程将cfDNA利用TET2酶等直接对带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化保护，接着进行脱氨基处理，将未甲基化修饰的C碱基脱氨基形成U碱基同时将双链DNA解链为单链DNA，随后使单链DNA一端与接头序列进行连接反应，以及通过引物延伸反应形成双链，再使双链DNA两端分别与接头序列进行连接反应，后续扩增富集形成游离DNA甲基化文库。
上述实施例和对比例的样本的测序结果如表10至表12所示。
表10
表11
表12
可以看出，样本4至6的pUC19质粒DNA的甲基化率均大于99％，Lambda DNA的甲基化率均明显低于1％，说明样本4至6的甲基化保护和对未甲基化C碱基的转化是都是成功的。因此，本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法是可行的。
样本1至6的不同片段的甲基化率均比较接近理论值50％，说明本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法可以维持游离DNA的原始甲基化情况，保证甲基化率检测的准确性。而且样本1至6的甲基化文库产量明显高于样本7至12，说明本公开实施例提供的游离DNA甲基化文库构建方法可以提高甲基化文库产量。
虽然本公开所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本公开而采用的实施方式，并非用以限定本公开。任何所属领域内的技术人员，在不脱离本公开所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本公开的保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (14)
1.一种游离DNA甲基化文库构建方法，其特征在于，包括：
提供游离DNA样本；
将所述游离DNA样本变性为单链DNA；
将所述单链DNA与含有胞嘧啶且所述胞嘧啶均有甲基化修饰的接头序列进行连接反应，使所述单链DNA两端各连接一个接头序列，得到两端连接有接头序列的单链DNA；
将所述两端连接有接头序列的单链DNA进行延伸反应，所述延伸反应形成延伸片段，所述延伸片段的两端分别与所述两端连接有接头序列的单链DNA两端的接头序列连接，形成两端连接有接头序列的双链DNA；
将所述双链DNA中带有甲基化修饰的胞嘧啶进行氧化反应形成受保护胞嘧啶，得到带有受保护胞嘧啶的双链DNA；
除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段，得到带有受保护胞嘧啶的单链DNA；
将所述带有受保护胞嘧啶的单链DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应形成尿嘧啶，得到带有尿嘧啶的DNA；
将所述带有尿嘧啶的单链DNA进行扩增反应，得到游离DNA甲基化文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述延伸片段中含有至少一个尿嘧啶。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述延伸反应所采用的试剂包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment；和/或
脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液的工作浓度为0.1mM至0.4mM；
在所述吐温20水溶液中，吐温20的质量与水的体积之比为(0.03至0.1)g:100ml；
所述Klenow Fragment的工作浓度为0.02U/μL至0.08U/μL；
所述延伸反应的反应条件包括：反应温度为20℃，反应时间为15min；所述延伸反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段包括：
采用UDG酶进行消化反应，使所述延伸片段中的所述尿嘧啶降解，从而除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段；
其中，所述消化反应包括第一消化阶段和第二消化阶段；所述第一消化阶段的反应温度为37℃，反应时间为20min；所述第二消化阶段的反应温度为50℃，反应时间为5min。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述接头序列包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述连接反应所采用的试剂还包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶；和/或，
在所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的质量与水的体积之比可以为(5至20)g:100ml；
所述二硫苏糖醇的工作浓度为0.01M至0.05M；
所述腺嘌呤核苷三磷酸的工作浓度为0.5mM至2mM；
所述多核苷酸激酶的工作浓度为0.1U/μL至0.4U/μL；
所述DNA连接酶的工作浓度为2U/μL至5U/μL；
所述连接反应的反应条件包括：反应温度为37℃，反应时间为45min。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述受保护胞嘧啶为羧基胞嘧啶；
所述氧化反应所采用的试剂包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)；
所述氧化反应的反应条件包括：反应温度为37℃，反应时间为60min；所述氧化反应结束后加入终止液，并在37℃下孵育30min。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述脱氨基反应所采用的试剂包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水；
所述脱氨基反应的反应条件包括：反应温度为37℃，反应时间为180min。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述扩增反应所采用的试剂还包括：Index Primer Mix和HiFi HotStart Uracil Mix；
所述扩增反应的反应条件包括：在98℃下反应30s；接着在98℃下反应10s，在62℃下反应30s，在65℃下反应60s，循环7次至16次；在65℃下反应5min；所述扩增反应结束后将反应器的温度维持在4℃。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，还包括纯化处理，所述纯化处理包括以下任意一种或多种：
在所述延伸反应之后，在所述氧化反应之前，采用磁珠捕获所述延伸反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述延伸反应的产物；
在所述除去所述带有受保护胞嘧啶的双链DNA中的所述延伸片段之后，在所述脱氨基反应之前，采用磁珠捕获除去所述延伸片段后得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的除去所述延伸片段后得到的产物；
在所述脱氨基反应之后，在所述扩增反应前，采用磁珠捕获所述脱氨基反应得到的产物，并采用乙醇和水清洗所述磁珠捕获到的所述脱氨基反应的产物。
11.一种游离DNA甲基化文库，其特征在于，通过根据权利要求1至10中任一项所述的游离DNA甲基化文库构建方法得到。
12.一种游离DNA甲基化测序方法，其特征在于，包括：采用根据权利要求1至10中任一项所述的游离DNA甲基化文库构建方法构建游离DNA甲基化文库，再进行测序。
13.一种游离DNA甲基化文库构建试剂盒，其特征在于，用于执行根据权利要求1至10中任一项所述的游离DNA甲基化文库构建方法；
所述试剂盒包括：所述接头序列、接头序列连接试剂、延伸试剂、氧化保护试剂、用于除去所述延伸片段的试剂、脱氨基试剂、扩增试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，
所述接头序列包括第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列由第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列形成，所述第二接头序列由第三寡核苷酸序列和第四寡核苷酸序列形成，所述第一寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.1所示，所述第二寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.2所示，所述第三寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.3所示，所述第四寡核苷酸序列的序列号如SEQ ID NO.4所示；和/或
所述接头序列连接试剂包括：聚乙二醇水溶液、DNA连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、腺嘌呤核苷三磷酸、多核苷酸激酶和DNA连接酶；和/或
所述延伸试剂包括：Klenow反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸的混合液、吐温20水溶液和Klenow Fragment；和/或
所述氧化保护试剂包括：TET2酶、TET2反应缓冲液、氧化补充剂、二硫苏糖醇、氧化增强剂、无核酸酶水和Fe(II)；和/或
所述用于除去所述延伸片段的试剂包括：UDG酶；和/或
所述脱氨基试剂包括：APOBEC蛋白、APOBEC反应缓冲液、牛血清蛋白和无核酸酶水；和/或
所述扩增试剂包括：Index Primer Mix和HiFi HotStart Uracil Mix。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20230407 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |