CN115820807B - 一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用。该方法包括:将长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育,然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交;利用分离磁珠捕获探针‑目标片段复合物,再使用清洗缓冲液清洗;经PCR富集和纯化后,得到捕获产物。本发明建立了一种高效捕获达到5Kb以上长片段的富集方法,本发明对5Kb片段的富集效率是传统方法的2倍以上。同时,本发明的实验体系更简单,操作更方便,实验流程更加简便。此外,本发明通过降低探针密度,使得25%探针密度仍然保持与100%探针密度相近的富集效率,能够有效节省探针,显著降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种长片段捕获富集方法,更具体地,本发明涉及一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用。
背景技术
第二代测序(NGS)的出现,改变了基因组学和相关临床领域研究,但在某些应用中,NGS技术仍然受到测序读长较短的限制,例如长重复序列或假基因变异检测等。而在临床检测应用中,长Indels、结构变异以及单倍型检测是NGS技术的瓶颈。
NGS的读长只能达到600bp(300PE),而第三代测序(TGS)则可以达到1Kb以上的测序长度,某些第三代测序仪甚至可以获得大于10kb的读长[Van D,Yan J,Delphine N,etal.The Third Revolution in Sequencing Technology[J].Trends in Genetics,2018:S0168952518300969-.],因此,TGS技术的长读长优势可以帮助克服上述限制,包括长Indel和结构变异检测等[Min,Wang,Christine,et al.PacBio-LITS:a large-insert targetedsequencing method for characterization of human disease-associatedchromosomal structural variations[J].Bmc Genomics,2015.]。
虽然TGS的测序成本在不断降低,但全基因组检测仍然非常昂贵。基于杂交捕获的靶向富集(靶向捕获)技术通过探针与感兴趣的目标区域片段结合,靶向富集目标区域片段,可以有效节约测序数据,降低成本,并提高检测准确性。
在NGS领域,靶向捕获技术已经广泛应用。但在TGS技术中,靶向捕获技术研究较少。其中有几个方面的问题需要进一步解决,首先,传统杂交缓冲液是否适合长片段DNA的杂交捕获,其次,传统杂交流程较为繁琐,能否进一步减少试剂种类和操作步骤;最后,针对长片段DNA杂交捕获,如何进行探针设计,实现用更少的探针保证高效的目标区域富集。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景,不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于建立一种更简便的长片段杂交捕获方法,一方面,在探针设计上,在保证富集效率的同时减少探针数量,使得检测方法更经济。另一方面,通过优化杂交清洗缓冲液组分,提高长片段富集效率,并简化杂交捕获流程,实现高效、简便的长片段DNA靶向富集。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供一种长片段捕获富集方法,其包括如下步骤:
(1)将长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育,然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交;
(2)利用分离磁珠捕获探针-目标片段复合物,再使用清洗缓冲液清洗;
(3)经PCR富集和纯化后,得到捕获产物。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,所述长片段的长度为1-10Kb,优选为1-8Kb,还优选为1-5Kb,例如1、2、3、4、5Kb或期间任意数值范围的片段长度。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,所述探针的密度为5%-100%,优选为5%-75%,例如5%、15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%或期间任意数值范围的探针密度。
本发明中,“探针密度”定义如下:探针密度计算是在探针首尾相连,即平铺的前提下进行计算,不存在有Overlap的情况。首先,“理论探针数量”=“目标区域长度”除以“探针长度”,并取整数但不四舍五入;此外,目标区域长度<探针长度的情况不纳入计算。然后,“实际探针数量”除以“理论探针数量”得到“探针密度”,用百分数表示。例如,对120个碱基长度的目标区域采用1条120个碱基长度的探针进行捕获,“理论探针数量”=120/120=1,“探针密度”=1/1=100%。例如,对1280个碱基的目标区域采用5条120个碱基长度的探针进行捕获,“理论探针数量”=1250/120=10.67,取整但不四舍五入后等于10;“探针密度”=5/10=50%。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,所述分离磁珠包括链霉亲和素磁珠。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,步骤(1)中所述待检测样本包含DNA,特别是基因组DNA。在另外的实施方案中,步骤(1)中所述待检测样本包含RNA,如总RNA。
在某些实施方案中,探针为5’端生物素修饰的120ntDNA探针。在一些方面,所述探针的修饰可以是3’端修饰的。在一些方面,所述探针的长度可以是60-150nt,优选为90-130nt,还优选120nt。在一些方面,所述探针也可以是RNA或DNA/RNA杂合链探针。探针和引物的具体序列不特别限定,本领域技术人员能够根据目标序列或感兴趣的位点进行设计。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,所述杂交缓冲液包含0.1-0.8M MOPS(3-吗啉丙磺酸)、0.5-1.5M海藻糖(Trehalose)、0.5-1.5M四甲基氯化铵(TMACl)、10-30%(v/v)甲酰胺(Formamide)。示例性的杂交缓冲液的组分为0.5MMOPS、1.0M海藻糖(Trehalose)、1.0M TMACl、20%(v/v)甲酰胺(Formamide)。在一些方面,MOPS为具有更佳的缓冲能力的缓冲液,本领域技术人员可以理解的是,也可以使用其它缓冲液替代上述的MOPS,合适的缓冲液包括但不限于HEPES、MES等缓冲液。在一些方面,Trehalose用于降低高GC目标区域的退火温度,本领域技术人员也可以使用其它试剂替代上述的Trehalose,合适的试剂包括但不限于Betaine,DMSO等。在一些方面,TMACl用于提高低GC目标区域的退火温度,本领域技术人员也可以使用其它试剂替代上述的TMACl,合适的试剂包括但不限于TEACl、TPACl等。在一些方面,上述不同组分的浓度可以是一个范围区间或该区间的任意数值。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,所述清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液;其中,所述热清洗缓冲液组分包含0.05-1.15MMOPS、0.05-0.15%Tween-20、0.05-0.15% SDS,pH6.3,所述室温清洗缓冲液组分包含0.05-0.15M MOPS,pH5.8。示例性地,热清洗缓冲液组分为0.1M MOPS、0.1%Tween-20、0.1%SDS pH6.3。室温清洗缓冲液组分为0.1M MOPS pH5.8。上述缓冲液也可以采用上文提到的其它合适的缓冲液,在此不再赘述。在一些方面,缓冲液的pH值以及不同组分的浓度可以是一个范围区间或该区间内的任意数值,例如热清洗缓冲液pH可以是5.8-7.0,例如可以是5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0,室温清洗缓冲液的pH可以是5.0-6.5,例如可以是5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5。
在某些实施方案中,根据本发明所述的长片段捕获富集方法,其中,步骤(1)中,适于杂交的条件是指55-70℃,5-24h。
本发明的第二方面,提供一种用于长片段捕获富集的试剂盒,其包括:
I.杂交缓冲液;和
II.清洗缓冲液;
其中,所述杂交缓冲液包含0.3-0.8M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液,和用于降低高GC目标区域退火温度的试剂以及用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂和10-40%(v/v)的甲酰胺;
所述清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液;
本发明的第三方面,提供本发明所述的试剂盒在长片段靶向测序中的用途。
本发明进一步提供靶向测序方法,在本发明的靶向测序中,可以包括例如预文库构建、杂交捕获以及高通量测序等步骤。预文库构建、杂交捕获以及高通量测序的具体步骤不特别限定,例如可以将待检测样本片段化至长片段后,经修复并在末端加dA,连接测序接头后,加入纯化磁珠纯化连接产物,得到与磁珠结合的预文库;使预文库与捕获探针在杂交液中进行杂交,随后利用分离磁珠捕获探针-目标片段复合物,再使用清洗缓冲液清洗,经PCR富集和纯化后,得到测序文库;对所述测序文库进行基于第三代高通量的测序得到捕获数据。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中在连接测序接头后,进行Index PCR富集并添加样本标签,纯化后得到预文库。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,所述纯化磁珠不特别限定,可以采用本领域已知的纯化磁珠。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,使用转座酶完成片段化和接头连接工序。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,接头连接包括但不限于T/A粘性末端链接或平末端连接。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,DNA片段方法包括但不限于通过脉冲场电泳(Blue Pippin),纯化磁珠(Beckman Ampure XP)进行分选。
本领域技术人员可以理解,上述DNA或RNA预文库构建也可以不进行PCR富集,在添加接头后直接用于杂交捕获。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,纯化后的连接产物以核酸磁珠复合物的形式存在,IndexPCR富集在含磁珠体系中开展。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,预文库/磁珠复合物中加入封闭试剂、杂交缓冲液和探针进行杂交,随后利用链霉亲和素磁珠捕获探针/目标片段,再使用清洗缓冲液清洗,经PCR富集和纯化后质检,得到测序文库。封闭试剂包括封闭DNA和接头的封闭试剂,其中封闭DNA是指具有封闭基因组重复序列的功能的DNA,其实例包括但不限于Cot-1 DNA和/或鲑鱼精DNA。接头封闭试剂可以采用Index一对一的针对性寡核苷酸,也可以是兼容不同Index的通用性封闭寡核苷酸。
在某些实施方案中,根据本发明所述的靶向测序方法,其中,靶向测序包括第三代高通量测序,例如利用第三代高通量测序仪对所述捕获文库进行测序,得到捕获数据。在一些方面,第三代高通量测序仪包括但不限于Pacific Biosciences、Oxford Nanopore和齐碳科技等公司的长读长测序仪。
本发明的技术效果包括但不限于:
本发明利用新型杂交缓冲液和清洗缓冲液,同时长片段捕获的探针密度大大降低,但依然能够保持高效捕获,从而能够节省50-75%的探针用量,使得捕获富集操作更简便。
通过优化杂交与清洗缓冲液和调整实验流程以及摸索探针密度,本发明建立了一种高效捕获达到5Kb以上长片段的富集方法。本发明对5Kb片段的富集效率是传统方法的2倍以上,更加高效。同时,本发明的实验体系更简单,操作更方便,本发明的清洗缓冲液由2种试剂组成,只需要清洗4次,而传统方法则由4种试剂组成,需要清洗6次,本发明的实验流程更加简便;通过降低探针密度,25%探针密度仍然保持与100%探针密度相近的富集效率,能够有效节省探针,降低成本。
附图说明
图1传统杂交与清洗缓冲液与本发明方法对长片段捕获的富集效率比较。
图2对PhiX174基因组分别设计不同探针密度的探针Pool。
图3使用本发明杂交与清洗缓冲液条件下,使用不同探针密度的探针Pool的捕获结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。
本发明对长片段杂交捕获过程中的探针密度、杂交缓冲液体系、清洗缓冲液体系、杂交步骤以及清洗步骤进行了深入研究并优化,从而确定了适于长片段,尤其是长片段DNA靶向富集的方法。具体如下。
杂交步骤
首先将DNA与杂交缓冲液进行室温混合孵育,时间优选为1-8min,还优选3-6min。需要说明的是,本发明的杂交缓冲液相较于传统杂交缓冲液组分减少,但依然提高了片段富集效率。室温孵育后,置于PCR仪进行高温变性,温度优选为90-100℃,还优选92-98℃,变性时间为5-15min,优选为8-12min。
高温变性处理后加入探针,探针与目标DNA摩尔比为1-200:1,优选为50-150:1,还优选为100:1。混匀后在55-70℃孵育5-24h,优选在60-68℃孵育10-20h,还优选62-67℃孵育12-18h。所用探针密度不特别限定,本发明人发现,采用本发明的捕获富集方法,即使在极低的探针密度,例如2%-25%的探针密度,依然保持与100%探针密度接近的富集效率,从而显著降低成本。
用于杂交的DNA可以是基因组DNA,也可以是连接测序接头后并扩增后的DNA。探针可以在DNA高温变性后加入反应液,也可以在DNA高温变性前加入体系,采用共同变性的方式进行。
杂交完成后进行磁珠捕获分离,分离磁珠可以使用链霉亲和素磁珠,对于分离磁珠的选择,本领域技术人员可以采用其他任何合适的磁珠,其可以根据例如探针的修饰基团进行选择。分离磁珠首先进行清洗,对此步骤不特别限定,例如可以使用本领域已知的磁珠清洗液产品进行清洗。但清洗后优选使用上文提到的杂交缓冲液混匀,储存待用。
捕获步骤
将上述处理后的磁珠探针-目标片段复合物混匀,置于PCR仪在55-70℃孵育25-65min,优选在60-68℃孵育35-55min,还优选在62-67℃孵育40-50min。期间进行数次混匀以确保磁珠处于悬浮状态。
清洗步骤
待反应结束后,使用清洗缓冲液进行清洗。首先,本发明的清洗缓冲液相较于传统缓冲液,组分减少,仅含有2种试剂,其次清洗步骤相较于传统方法,清洗步骤减少,虽然试剂和清洗步骤减少,但依然提高了片段富集效率。
本发明的清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液。热清洗缓冲液用于热清洗步骤,热清洗步骤包括:将磁珠-目标片段复合物与热清洗缓冲液在60-70℃下孵育1-10分钟,优选在62-68℃下孵育2-8分钟,还优选在63-67℃下孵育3-7分钟,然后待磁珠-目标片段复合物吸附到底部后,弃上清。重复上述步骤,然后离心,弃上清。
本发明室温清洗缓冲液用于室温清洗步骤,室温热清洗步骤包括:将热清洗处理后的磁珠-目标片段复合物与室温清洗缓冲液在室温下涡旋混匀1-5分钟,优选1-4分钟,还优选1-3分钟,然后离心,弃上清。重复上述步骤,然后待磁珠-目标片段复合物吸附到底部后,弃上清。
清洗步骤结束后,进一步使用无酶无菌水重悬。
PCR扩增
使上述得到的磁珠-目标片段复合物与引物和扩增预混液混合并进行PCR扩增。其中扩增预混液包含引物和模板之外扩增反应必需成分,其可以采用本领域已知的扩增预混液。优选地,PCR扩增程序如下:90-100℃,30-60s,90-100℃,5-20s,1-3个循环;55-65℃,25-35s,65-75℃,25-35s,15-25个循环;65-75℃,55-65s,1-3个循环。还优选地,PCR扩增程序如下:95-99℃,40-50s,95-99℃,10-18s,1-2个循环;58-62℃,28-32s,70-74℃,28-32s,18-22个循环;68-74℃,58-62s,1-2个循环。
在PCR扩增后进一步包括对捕获产物纯化步骤,优选使用纯化磁珠进行纯化过程,纯化磁珠不特别限定,可以采用本领域已知的纯化磁珠。
实施例1
本实施例示出了长片段捕获的杂交与清洗方法。具体如下。
1.探针设计与合成
对长度为5384bp的PhiX 174基因组参考序列设计长度为120nt 5’端生物素修饰的捕获探针(伯科生物),探针密度为100%,共44条探针(下文简称为100% PPanel)。
2.PhiX 174基因组捕获
2.1探针与PhiX 174基因组杂交
如下表所示,将5ng(约1.4fmol)PhiX 174DNA(3040,Takara)与杂交缓冲液混合后加入相关试剂后,涡旋混匀,室温孵育5分钟。随后在PCR仪上95℃变性10分钟,随后加入4μL100% PPanel(140fmoleach,探针/目标DNA摩尔比为100:1),涡旋混匀,65℃孵育16小时。
表1
2.2链霉亲和素磁珠准备
将链霉亲和素磁珠(供应商:伯科生物;货号:TC00322.1)从冰箱中(4℃)取出恢复到室温(约30分钟)。涡旋混匀15秒。取50μL链霉亲和素磁珠加入到新的1.5mL低吸附离心管中。将离心管放到磁力架上,直到溶液澄清。
吸弃上清,切勿扰动磁珠。按以下步骤对链霉亲和素磁珠进行清洗:
(1)将离心管从磁力架上取下,加入100μL1X Beads Wash Buffer(1MNaCl、10mMTris-HCl pH 7.5、1mM EDTA、0.1%(v/v)Tween-20),涡旋振荡10秒。
(2)将离心管瞬时离心,放到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清,切勿扰动磁珠。
重复步骤(1)和(2)。
将离心管从磁力架上取下,加入与杂交步骤相对应的不含有探针的杂交缓冲液(17μL),例如如果使用“传统杂交缓冲液”杂交则加入“传统杂交缓冲液”,然后吹吸混匀后待用。
2.3链霉亲和素磁珠捕获
吹吸混匀链霉亲和素磁珠后转移至杂交管中(2.1环节)。使用移液器轻柔吹吸10次混匀。使用PCR仪(热盖温度设置为75℃)65℃孵育45分钟。每12分钟涡旋混匀3秒,确保磁珠处于悬浮状态。
2.4捕获后清洗
如表2所示,传统清洗缓冲液含有4种试剂,需6步清洗;本发明清洗缓冲液含2种试剂,需4步清洗。详细试剂配方如表3所示。
表2
表3
2.4.1传统清洗缓冲液清洗
1.65℃热清洗步骤:
将100μL预热的Wash Buffer I加入到含有杂交混合物的离心管中。吹吸混匀后,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
继续按以下步骤进行清洗:
(1)加入150μL预热的Wash Buffer S,吹吸混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
(2)再次加入150μL预热的Wash Buffer S,吹吸混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
2.室温清洗
加入150μL Wash Buffer I,涡旋混匀2分钟。将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。加入150μL Wash Buffer II,涡旋混匀1分钟。将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。加入150μL Wash Buffer III,涡旋混匀30秒。将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
3.磁珠重悬
立即加入20μL无酶无菌水。使用移液器吹吸10次,重悬磁珠,进入步骤3。
2.4.2本发明清洗缓冲液清洗
1.65℃热清洗步骤:
(1)加入150μL预热的Wash Buffer H,吹吸混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
(2)再次加入150μL预热的Wash Buffer H,吹吸混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
2.室温清洗
(1)加入150μL预热的Wash Buffer R,涡旋混2分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
(2)再次加入150μL预热的Wash Buffer R,涡旋混2分钟。瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
立即加入20μL无酶无菌水。使用移液器吹吸10次,重悬磁珠,进入步骤3。
3.PCR扩增
按照表4配制PCR反应体系。
表4
表5
涡旋混匀使磁珠保持悬浮状态,立即进入PCR步骤。使用PCR仪按表6程序运行,热盖温度105℃。
表6
4.捕获产物纯化
每个PCR管中加入75μLVAHTS DNA Clean Beads(供应商:诺唯赞;货号:N411-03),纯化捕获产物。使用22μLTris-HCl(10mM,pH 8.5)进行洗脱。转移30μL捕获产物到新的1.5mL低吸附离心管(Eppendorf)中。
5.捕获产物检测
使用荧光定量PCR(qPCR,Library Quantification Kit forIllumina)测量捕获产物摩尔浓度。
6.结果分析
在分别使用传统方法和本发明的杂交清洗缓冲液的实验条件下,使用100%PPanel对约5Kb的PhiX基因组DNA进行捕获,并分析捕获产量摩尔量,用于评估捕获效率。使用传统方法的100%PPanel捕获产物摩尔量作为参考(100%捕获效率),不添加100%PPanel的实验作为阴性对照。
如表7所示,在加入100% PPanel的条件下,传统方法与本发明最终获得的捕获产物分别为0.17pmol和0.13pmol,均具有较低的背景信号(3.1%和2.5%)。在加入100%PPanel的条件下,传统方法与本发明最终获得的捕获产物分别为5.34pmol和11.10pmol,本发明的富集效率达到208%,是传统方法的两倍以上。上述实验表明,本发明杂交与清洗缓冲液具有更优异的捕获效果(图1)。
表7不同杂交与清洗缓冲液对长片段捕获的表现
实施例2
本实施例示出了探针密度对长片段捕获的影响。具体如下。
1.探针设计与合成:
如图2所示,对长度为5384bp的PhiX 174基因组参考序列设计长度为120nt 5’端生物素修饰的捕获探针(伯科生物),探针密度分别为2%、5%、7%、14%、25%、50%和100%,共7种不同密度的探针Pool(下文简称分别2%-100%PPanel)。
2.PhiX 174基因组捕获及结果
按照实施例1所描述的实验方法,采用本发明的杂交与清洗缓冲液对5ng(约1.4fmol)PhiX 174DNA(3040,Takara)进行杂交捕获,分别使用7种不同探针密度的探针Pool,分别为2%、5%、7%、14%、25%、50%和100%PPanel(140fmoleach,探针/目标DNA摩尔比为100:1),在65℃杂交孵育16小时后,进行磁珠捕获、清洗、PCR富集、纯化和qPCR检测。
使用探针密度为100%的探针Pool(100% PPanel)的捕获产物摩尔量作为参考(100%捕获效率),不添加探针Pool的实验作为阴性对照。如表8所示,随着探针密度的下降,25%和50%探针密度达到98.5%的富集效率,与100%探针密度结果接近。14%、7%、5%和2%探针密度的富集效率分别为83.9%、77.2%、69.9%和60.2%,即使在2%探针密度时仍可达到100%探针密度的富集效率的50%以上。
表8不同密度探针Pool的捕获结果
实施例3
本实施例为人类DNA背景中进行长片段捕获。具体如下。
将5ng(约1.4fmol)PhiX 174DNA(3040,Takara)掺入500ng(2079fmol)人类基因组文库(IlluminaTruseq)中进行杂交捕获,分别使用4种不同探针密度的探针Pool,分别为2%、14%、25%和100% PPanel(140fmoleach,探针/目标DNA摩尔比为100:1),在65℃杂交孵育16小时后,进行磁珠捕获、清洗、PCR富集、纯化和qPCR检测。实验操作与实施例2相同,不同之处在于人类基因组文库采用P5/P7引物进行qPCR检测。
如表9所示,2%、14%、25%和100%探针密度的PPanel在人类背景DNA存在的条件下,仍能有效富集目标基因序列(PhiX174 DNA),分别达到不加入人类背景DNA的100%、93.0%、75.9%和40.7%;25%探针密度与100%探针密度的富集效率相近,25%探针密度的富集数倍达到100%探针密度的约93%。
表9不同密度探针在人类基因组背景中捕获结果
综上所述,通过优化杂交与清洗缓冲液和调整实验流程以及摸索探针密度,本发明建立了一种高效捕获达到5Kb以上长片段的富集方法。本发明对5Kb片段的富集效率是传统方法的2倍以上,更加高效。同时,本发明的实验体系更简单,操作更方便,本发明的清洗缓冲液由2种试剂组成,只需要清洗4次,而传统方法则由4种试剂组成,需要清洗6次,本发明的实验流程更加简便;通过降低探针密度,25%探针密度仍然保持与100%探针密度相近的富集效率,能够有效节省探针,降低成本。综上所述,本发明是一种更为方便、高效和经济的长片段捕获方法。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述,但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (4)
1.一种用于第三代测序靶向捕获的长片段捕获富集方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1) 将5Kb以上的长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育,然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交,所述杂交缓冲液包含0.3-0.8 M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液,和用于降低高GC目标区域退火温度的试剂以及用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂和10-40% (v/v)的甲酰胺所述用于降低高GC目标区域退火温度的试剂为0.5-1.5 M海藻糖;所述用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂为0.5-1.5 M 四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和/或四丙基氯化铵;
(2) 利用分离磁珠捕获探针-目标片段复合物,再使用包含热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液的清洗缓冲液清洗,具体包括用热清洗缓冲液与磁珠-目标片段复合物在60-70℃下清洗,然后将热清洗处理后的磁珠-目标片段复合物与室温清洗缓冲液在室温下涡旋混匀,其中,所述热清洗缓冲液组分包含0.05-1.15M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液,和0.05-0.15%Tween-20、0.05-0.15% SDS,pH5.8-7.0;所述室温清洗缓冲液组分包含0.05-0.15M 3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液,pH 5.0-6.5;
(3) 将磁珠-目标片段复合物经PCR富集和纯化后,得到捕获产物。
2.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法,其特征在于,所述探针的密度为5%-100%。
3.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法,其特征在于,步骤(1)中所述待检测样本包含DNA和/或RNA。
4.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法,其特征在于,步骤(1)中,适于杂交的条件是指55-70℃,5-24h。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103884816A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 戴安公司 | 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法 |
CN106459965A (zh) * | 2014-04-30 | 2017-02-22 | 凯杰有限公司 | 分离多聚(a)核酸的方法 |
US10704094B1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
CN112955568A (zh) * | 2018-08-15 | 2021-06-11 | Illumina公司 | 用于改善文库富集的组合物和方法 |
CN114480579A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-13 | 上海英基生物科技有限公司 | 一种用于基因组目标区域测序的杂交捕获试剂盒、捕获方法及应用 |
-
2022
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103884816A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 戴安公司 | 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法 |
CN106459965A (zh) * | 2014-04-30 | 2017-02-22 | 凯杰有限公司 | 分离多聚(a)核酸的方法 |
CN112955568A (zh) * | 2018-08-15 | 2021-06-11 | Illumina公司 | 用于改善文库富集的组合物和方法 |
US10704094B1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
CN114480579A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-13 | 上海英基生物科技有限公司 | 一种用于基因组目标区域测序的杂交捕获试剂盒、捕获方法及应用 |
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