CN114085894A - 核酸甲基化胞嘧啶转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于其步骤包括：（1）对DNA或RNA样本进行TET酶氧化处理；（2）在反应体系中加入吡啶硼烷处理；（3）磁珠回收反应系统中的DNA或RNA。本发明的核酸甲基化胞嘧啶转化方法整个过程只包括TET酶氧化、吡啶硼烷处理和DNA磁珠回收3个步骤，不仅提高了TAPS的转化效率，而且简化了TAPS的操作难度和流程，我们将其命名为eTAPS（Enhanced TET‑assisted pyridine borane sequencing）。eTAPS具有转化率高、DNA损伤小、操作简单、自动化方便等优点，此外我们发现eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化上也具有高效灵敏的检测效率。这表明eTAPS技术在核酸甲基化检测上具有重要价值，尤其在肿瘤早筛和疾病诊断领域。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，属于生物技术领域。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学领域的重要研究方向。胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA上最常见的修饰碱基，占所有胞嘧啶的1%-8%，有些特定的胞嘧啶位点如细菌的Dam甲基化位点或真核生物的CpG岛中的胞嘧啶位点发生甲基化修饰的比例可高达近100%，因此5mC也被称为“第五种碱基”。DNA甲基化是细菌识别区分内外源DNA的主要方式，是细菌识别自身的身份标记。近年来，大量研究表明DNA甲基化水平异常与肿瘤发生、恶化和细胞癌变进程有着密切的联系。因此，血液的cfDNA甲基化检测是临床上进行肿瘤早筛的重要手段，具有很高的灵敏度和特异性。RNA胞嘧啶甲基化（5mC）是RNA上常见的核酸修饰，存在于各种RNA分子中，包括tRNA，rRNA，mRNA和非编码RNA（ncRNA）。 在mRNA和ncRNA中至少发现了10,275个5-mC候选位点，覆盖了转录组中总胞嘧啶残基的10.6％。RNA胞嘧啶甲基化对RNA的命运具有直接的决定性作用，参与到免疫、分化、细胞通讯等各种复杂细胞进程。因此，核酸甲基化检测在生理病理上都具有重要的应用价值。
目前市面上用于检测胞嘧啶甲基化位点和水平的产品主要分为两种：一种是重亚硫酸盐转化试剂盒，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶通过脱氨反应转变成尿嘧啶，再使用耐尿嘧啶的DNA聚合酶通过PCR扩增将尿嘧啶转变成胸腺嘧啶。最终达到将未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶的效果，而发生甲基化的胞嘧啶位点不会发生改变。但这种方法会导致严重的DNA损伤（约90%的DNA会发生断裂），且具有较高的假阴性，影响了甲基化检测的灵敏度和准确性。第二种是酶转化法试剂盒（EM-seq），其原理是先利用TET酶将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5caC，再利用APOBEC脱氨酶将未甲基化的C通过脱氨反应转变成U，最后通过PCR转变成T。这种方法对DNA的损伤小，能够检测低至10 ng的DNA样本中的甲基化位点和水平。但是这种方法具有较高的假阳性和假阴性，且操作较为复杂。此外，DNA甲基化检测方法需要将所有的未甲基化胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，这影响了测序数据的质量和比对准确性。
2019年， Nature Biotechnology上发表了一种基于TET酶的DNA甲基化检测方法TAPS（Liu Y, Siejka-Zielińska P, Velikova G, Bi Y, Yuan F, Tomkova M, Bai C,Chen L, Schuster-Böckler B, Song CX. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. NatBiotechnol. 2019 Apr;37(4):424-429. doi: 10.1038/s41587-019-0041-2. Epub 2019Feb 25. PMID: 30804537.），其原理是使用NgTET1或者mTET1利用两次重复氧化流程将大部分5mC转化成5fC或5caC，然后使用吡啶硼烷将5fC或5caC转化成二羟尿嘧啶（DHU）。TAPS的流程包括TET酶氧化、蛋白酶K处理、DNA磁珠回收、TET酶二次氧化、蛋白酶K处理、DNA磁珠回收、吡啶硼烷处理、DNA柱回收等8个主要流程。这导致DNA损失严重、操作复杂、转化率低和难以自动化，极大地阻碍了TAPS技术的商业化应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种低刺激性的凝集素磁珠。
本发明采取的技术方案为：一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于其步骤包括：
（1）对DNA或RNA样本进行TET酶氧化处理 ；
（2）在反应体系中加入吡啶硼烷处理；
（3）磁珠回收反应系统中的DNA或RNA。
优选的，步骤（1）的反应体系包括DNA或RNA样本、eTET1反应缓冲液、eTET1辅助液及eTET1酶液 ，其中eTET1反应缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、α-酮戊二酸、氯化钠和二硫苏糖醇，eTET1辅助液包括硫酸亚铁铵和维生素C。
优选的，步骤（1）的反应体系中，DNA或RNA样本的投入质量为0.1-300 ng，三羟甲基氨基甲烷浓度为20-100 mM，α-酮戊二酸浓度为0.5-2 mM，氯化钠浓度为20-100 mM，二硫苏糖醇浓度为0.1-1 mM，硫酸亚铁铵浓度为0.05-1 mM，维生素C浓度为1-10 mM，eTET1酶投入质量为0.5-10 ug。
优选的，步骤（1）的反应温度为30-37℃ 。
优选的，步骤（1）的反应时间为1-3 h。
优选的，步骤（2）的反应体系包括：步骤（1）的反应体系、辅助缓冲液、蛋白酶K、吡啶硼烷，所述辅助缓冲液包括醋酸钠、十二烷基硫酸钠和乙二胺四乙酸。
优选的，步骤（2）的反应体系各组分体积比为步骤（1）的反应体系：辅助缓冲液：20mg/mL的蛋白酶K：10 M吡啶硼烷=30:10：1:1，其中辅助缓冲液中各组分的浓度为醋酸钠2.5-3 M、十二烷基硫酸钠0.1-1%质量比、乙二胺四乙酸5-50 mM。
优选的，步骤（2）的反应时间为12-16 h，然后在反应体系中加入3 M 氢氧化钠终止反应。
本发明的有益效果为：
本发明的核酸甲基化胞嘧啶转化方法整个过程只包括TET酶氧化、吡啶硼烷处理和DNA磁珠回收3个步骤，不仅提高了TAPS的转化效率，而且简化了TAPS的操作难度和流程，我们将其命名为eTAPS（Enhanced TET-assisted pyridine borane sequencing）。eTAPS具有转化率高、DNA损伤小、操作简单、自动化方便等优点，此外我们发现eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化上也具有高效灵敏的检测效率。这表明eTAPS技术在核酸甲基化检测上具有重要价值，尤其在肿瘤早筛和疾病诊断领域。
附图说明
图1 eTAPS与TAPS流程对比。
图2 eTAPS与TAPS DNA回收率对比。
图3 eTAPS与TAPS DNA文库产量对比。
图4 eTAPS与TAPS 对DNA甲基化转化率和假阳性率对比。
图5 eTAPS与TAPS 对RNA甲基化转化率和假阳性率对比。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：TAPS和eTAPS性能比较
在本实施例中，比较TAPS和eTAPS的转化率、DNA回收率和准确性（见图1）。具体实施方式如下：
1)TAPS流程：
第一步，TET氧化。按照下表进行体系配制。
表1
| 组分 | 用量 |
| Methylated pUC19 DNA（Zymo Reasearch, Cat#D5017） | 10μL (10 ng) |
| 10× eTET1反应缓冲液 | 3μL |
| 30× eTET1辅助液 | 1μL |
| eTET1（Yeasen, Cat#12219） | 1μL |
| H2O | 15μL |
| 总共 | 30μL |
10× eTET1反应缓冲液中包括500 mM 三羟甲基氨基甲烷、10 mM α-酮戊二酸、500 mM氯化钠和2 mM二硫苏糖醇。
30× eTET1辅助液中包括3 mM 硫酸亚铁铵和60 mM维生素C。
第二步，蛋白酶K处理。加入1μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应0.5 h。
第三步，磁珠法DNA回收。加入60 μL DNA Selected beads（Yeasen, Cat#12601）混匀后，室温静置孵育5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇；再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇，室温静置晾干3 min。加入26 μL ddH2O悬浮磁珠后，室温静置5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，取上清。
第四步，第二次TET氧化。按照下表进行体系配制。
表2
| 组分 | 用量 |
| 上述回收DNA | 25μL |
| 10× eTET1反应缓冲液 | 3μL |
| 30× eTET1辅助液 | 1μL |
| eTET1（Yeasen, Cat#12219） | 1μL |
| 总共 | 30μL |
37℃反应1.5 h。
第五步，第二次蛋白酶K处理。加入1μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应0.5 h。
第六步，第二次磁珠法DNA回收。加入60 μL DNA Selected beads（Yeasen, Cat#12601）混匀后，室温静置孵育5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇；再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇，室温静置晾干3 min。加入21 μL ddH2O悬浮磁珠后，室温静置5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，取上清。
第七步，吡啶硼烷处理。按照下表进行体系配制。
表3
| 组分 | 用量 |
| 上述回收DNA | 20μL |
| 3 M 醋酸钠 | 6μL |
| 10 M 吡啶硼烷 | 4μL |
| 总共 | 30μL |
37℃反应16 h。
第八步，DNA柱回收。使用Zymo-Spin IC Columns （Zymo Research）进行DNA回收，并使用Qubit进行定量分析。回收后的DNA使用翌圣生物的一步法DNA建库试剂盒（Cat#12219）进行文库构建并测序分析。
2）eTAPS流程：
第一步，TET氧化。按照下表进行体系配制。
表4
| 组分 | 用量 |
| Methylated pUC19 DNA（Zymo Reasearch, Cat#D5017） | 10μL (10 ng) |
| 10× eTET1反应缓冲液 | 3μL |
| 30× eTET1辅助液 | 1μL |
| eTET1（Yeasen, Cat#12219） | 1μL |
| H2O | 15μL |
| 总共 | 30μL |
37℃反应1.5 h。
第二步，吡啶硼烷处理。
表5
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 30 μL |
| 辅助缓冲液 | 10 μL |
| 蛋白酶K(20 mg/mL) | 1 μL |
| 10 M 吡啶硼烷 | 1 μL |
辅助缓冲液中包含2.7 M醋酸钠、0.5%十二烷基硫酸钠和20 mM乙二胺四乙酸。37℃反应12-16 h。反应使用24μL 3 M 氢氧化钠进行终止。
第三步，磁珠法DNA回收。加入120 μL DNA Selected beads（Yeasen, Cat#12601）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上文描述的方法进行DNA回收，并使用Qubit进行定量分析。回收后的DNA使用翌圣生物的一步法DNA建库试剂盒（Cat#12219）进行文库构建并测序分析。
结果如图2-图4所示，eTAPS具有更高的DNA回收率、更高的转化率和更低的假阳性率。
实施例2：eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化检测上的应用。
在本实施例中，我们使用eTAPS对RNA胞嘧啶甲基化进行了检测，5mC RNA使用CELLSCRIPT的INCOGNITO™ T7 ARCA 5mC RNA Transcription Kit （Cat#C-ICTAMY110510）获得。RNA eTAPS检测方法的实施方式如下：
第一步，TET氧化。按照下表进行体系配制。
表6
| 组分 | 用量 |
| 5mC RNA标准品（CELLSCRIPT, Cat# C-ICTAMY110510） | 10μL (10 ng) |
| 10× eTET1反应缓冲液 | 3μL |
| 30× eTET1辅助液 | 1μL |
| eTET1（Yeasen, Cat#12219） | 1μL |
| H2O | 15μL |
| 总共 | 30μL |
37℃反应1.5 h。
第二步，吡啶硼烷处理。
表7
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 30 μL |
| 辅助缓冲液 | 10 μL |
| 蛋白酶K(20 mg/mL) | 1 μL |
| 10 M 吡啶硼烷 | 1 μL |
辅助缓冲液中包含2.7 M醋酸钠、0.5%十二烷基硫酸钠和20 mM乙二胺四乙酸。37℃反应12-16 h。反应使用24μL 3 M 氢氧化钠进行终止。
第三步，磁珠法RNA回收。加入120 μL RNA Selected beads（Yeasen, Cat#12603）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上文描述的方法进行RNA回收，并使用Qubit进行定量分析。回收后的RNA使用翌圣生物的双模式RNA建库试剂盒（Cat#12252）进行文库构建并测序分析。
结果如图5所示，eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化检测上也具有很高的效率和准确性。
综上，本发明提供了一种简单高效的核酸甲基化检测方法，整个过程只包括TET酶氧化、吡啶硼烷处理和DNA磁珠回收3个步骤，不仅提高了TAPS的转化效率，而且简化了TAPS的操作难度和流程，将其命名为eTAPS（Enhanced TET-assisted pyridine boranesequencing）。eTAPS具有转化率高、DNA损伤小、操作简单、自动化方便等优点，此外eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化上也具有高效灵敏的检测效率。这表明eTAPS技术在核酸甲基化检测上具有重要价值，尤其在肿瘤早筛和疾病诊断领域。
Claims (8)
1.一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于其步骤包括：
（1）对DNA或RNA样本进行TET酶氧化处理；
（2）在反应体系中加入吡啶硼烷处理；
（3）磁珠回收反应系统中的DNA或RNA。
2.根据权利要求1所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（1）的反应体系包括DNA或RNA样本、eTET1反应缓冲液、eTET1辅助液及eTET1酶液，其中eTET1反应缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、α-酮戊二酸、氯化钠和二硫苏糖醇，eTET1辅助液包括硫酸亚铁铵和维生素C。
3.根据权利要求2所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（1）的反应体系中，DNA或RNA样本的投入质量为0.1-300 ng，三羟甲基氨基甲烷浓度为20-100 mM，α-酮戊二酸浓度为0.5-2 mM，氯化钠浓度为20-100 mM，二硫苏糖醇浓度为0.1-1 mM，硫酸亚铁铵浓度为0.05-1 mM，维生素C浓度为1-10 mM，eTET1酶投入质量为0.5-10 ug。
4.根据权利要求3所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（1）的反应温度为30-37℃。
5.根据权利要求3所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（1）的反应时间为1-3 h。
6.根据权利要求1所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（2）的反应体系包括：步骤（1）的反应体系、辅助缓冲液、蛋白酶K、吡啶硼烷，所述辅助缓冲液包括醋酸钠、十二烷基硫酸钠和乙二胺四乙酸。
7.根据权利要求5所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（2）的反应体系体积比为步骤（1）的反应体系：辅助缓冲液：20 mg/mL的蛋白酶K：10 M吡啶硼烷=30:10：1:1，其中辅助缓冲液中各组分的浓度为醋酸钠2.5-3 M、十二烷基硫酸钠0.1-1%质量比、乙二胺四乙酸5-50 mM。
8.根据权利要求6所述的核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于：步骤（2）的反应时间为12-16 h，然后在反应体系中加入3 M 氢氧化钠终止反应。
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