CN113637053B - 重组蛋白结构域及其编码dna、增强tet酶及全基因组dna甲基化检测方法 - Google Patents

重组蛋白结构域及其编码dna、增强tet酶及全基因组dna甲基化检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1‑4的氨基酸序列如SEQ ID 1‑4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD‑TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT对5mC的氧化活性。此外，本发明还提供了简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性。

Description

重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基 化检测方法
技术领域
本发明专利涉及重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常见的碱基修饰方式，约占所有胞嘧啶的1%-8%，被称为“第五种碱基”。DNA甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性，是预测基因表达水平的有效依据。因此，DNA甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。现有的DNA甲基化检测技术主要是依赖于反向筛选的重亚硫酸盐转化法，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，再通过PCR扩增转变成胸腺嘧啶。这种方法具有DNA损伤大、背景噪音高和准确性低等缺陷。近年来，酶转化法甲基化检测技术因为具备DNA损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为DNA甲基化检测领域的重要关注点。
DNA羟甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一种α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依赖的双加氧酶，在生物进化过程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化过程的关键蛋白，可以将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5caC。目前的酶转化法DNA胞嘧啶甲基化检测技术都是依赖于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶转化法DNA甲基化检测技术的核心蛋白，具有极大的工程改造和应用价值。获得一种高活性的重组TET酶突变体，对于体外DNA甲基化技术的发展和在疾病诊断领域的应用，具有重要的价值。
本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ ID 1-4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD-TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本发明还提供了适用于MBD-TET的反应缓冲液和简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，能够有效增强MBD-TET对5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可增强TET酶活性的重组蛋白结构域。
所述的重组蛋白结构域是DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4氨基酸序列如SEQID 1-4所示，其中MBD1效果最优。
以及上述MBD的编码DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.10-13中任一项所示。
本发明的第二个目的是提供一种增强TET酶，为在NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD或hTET2CDT的氨基端通过GGGS连接肽连接上述的重组蛋白结构域MBD1、MBD2、MBD3或MBD4，NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD、的hTET2CDT氨基酸序列分别如SEQ ID 5-9所示，其中NgTET1最优。
本发明的又一目的是提供一种全基因组DNA甲基化检测方法，其特征在于其步骤包括：
（1）采用上述的增强TET酶对模板DNA进行氧化；
（2）还原剂处理，碱中和；
（3）DNA回收；
（4）DNA文库构建。
优选的，步骤（1）中所述的氧化反应时加入TET酶反应缓冲液，该TET酶反应缓冲液可以提高TET酶氧化5mC反应中5caC产物的占比。
优选的，所述TET酶反应缓冲液含有：1-100 mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐、1-100mM双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、1-100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300 mM氯化钠、0.1-10 mM抗坏血酸、0.1-10 mM柠檬酸、0.1-20 mMα-酮戊二酸、0.1-20 mM 1,3-丙酮二羧酸、0.1-20 mM三磷酸腺苷、0.1-10 mM四氟对苯醌、0.1-10 mM四氯对苯醌、 0.1-10 mM四溴对苯醌、0.1-10 mM四碘苯醌、0.01-2 mM三(2-羧乙基)膦、0.01-2 mM二硫苏糖醇的一种或多种。
优选的，所述TET酶反应缓冲液还含有铁盐化合物。
优选的，所述铁盐化合物的使用浓度为0.1-50 mM，其中1-10 mM最优。
优选的，所述铁盐化合物为硫酸亚铁、乙二胺硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、柠檬酸亚铁、氯化亚铁、2,6-双（1,1-双（2-吡啶）乙基）吡啶-氧化铁络合物（[FeIV(O)(Py5Me2H)]2+）中的一种或数种，其中硫酸亚铁和[FeIV(O)(Py5Me2H)]2+最优。
优选的，所述TET酶反应缓冲液中还包括0.001-1%浓度的过氧化氢和0.001-1%浓度的高锰酸钾。
优选的，步骤（1）中所述的氧化反应的反应温度为10-40℃，其中30-40℃最优。
优选的，步骤（1）中所述的氧化反应的反应时间为0.5-2 h。
优选的，步骤（2）中所述的还原剂包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N,N-二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物中的一种或多种。其中氢化铝锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、氨硼烷锂、叔丁胺硼烷、硼烷吗啉络合物和硼烷四氢呋喃络合物最佳。
优选的，步骤（2）中还原剂的处理浓度为100-2000 mM，其中200-500 mM最佳。
优选的，步骤（2）中还原剂的处理温度为20-50℃，其中30-40℃最佳。
优选的，步骤（2）中还原剂的处理时间为2-24 h，其中4-12 h最佳。
优选的，步骤（2）中所述的碱中和使用的是氢氧化钠或氢氧化钾，在反应体系中的终浓度为0.5-1.5 M。
优选的，步骤（3）中所述的DNA回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收，其中磁珠法回收最优。
步骤（4）中的DNA建库方法采用常规的双链DNA建库或者单链DNA建库方法即可。
本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ ID 1-4所示。通过MBD与TET酶活性结构区域融合形成的重组蛋白MBD-TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本发明还提供了适用于MBD-TET的反应缓冲液和简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，能够有效增强MBD-TET对5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性，可以应用于疾病诊断，尤其是在疾病诊断和肿瘤早筛领域。
附图说明
图1 传统TAPS和优化后的TAPS转化率对比示意图。
图2 MBD结构域对TET酶活性的影响。
图3 MBD融合TET酶对m5C氧化产物占比的影响。
图4 传统TAPS和优化后的TAPS流程示意图。
图5 传统TAPS和优化后的TAPS文库产量对比。
图6 TET酶处理时间对TAPS转化率的对比。
图7 还原剂种类对TAPS转化率的对比。
图8 还原剂处理时间对TAPS转化率的对比。
图9 MBD-NgTET1和优化流程对TAPS检测DNA甲基化效果的比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。序列表中，SEQ ID No.1是MBD1的氨基酸序列，SEQ ID No.2是MBD2的氨基酸序列，SEQ ID No.3是MBD3的氨基酸序列，SEQ ID No.4是MBD4的氨基酸序列，SEQ ID No.5是NgTET1的氨基酸序列，SEQ ID No.6是mTET1CD的氨基酸序列，SEQ ID No.7是mTET2CDT的氨基酸序列，SEQ ID No.8是hTET1CD的氨基酸序列，SEQ ID No.9是hTET2CDT的氨基酸序列，SEQ ID No.10是MBD1的核苷酸序列，SEQ ID No.11是MBD2的核苷酸序列，SEQ ID No.12是MBD3的核苷酸序列，SEQ ID No.13是MBD4的核苷酸序列。
所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：MBD-TET各重组蛋白酶比活性的测试。
使用Epigentek的Epigenase 5mC-羟化酶TET活性/抑制分析试剂盒（荧光法）按照说明书的流程来测定各MBD-TET重组蛋白的酶比活性。
改造后的酶活效果示意图见图1，结果见图2，融合MBD的TET酶能够显著增强各TET酶的活性。
实施例2：MBD-TET各重组蛋白酶对5mC oligo的氧化能力的测定。
在本实施例中，测定了MBD-TET酶对5mC的氧化产物占比，具体实施方式如下：
表1
组分 用量
5mC oligo 1-100 ng
10×TET酶反应缓冲液 3 μL
10 μM 各TET酶 2-10 μL
补ddH<sub>2</sub>O至 30 μL
10×TET酶反应缓冲液包含1-100 mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐、1-100 mM双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、1-100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300 mM氯化钠、0.1-10mM抗坏血酸、0.1-10 mM柠檬酸、0.1-20 mMα-酮戊二酸、0.1-20 mM 1,3-丙酮二羧酸、0.1-20 mM三磷酸腺苷、0.1-10 mM四氟对苯醌、0.1-10 mM四氯对苯醌、 0.1-10 mM四溴对苯醌、0.1-10 mM四碘苯醌、0.01-2 mM三(2-羧乙基)膦、0.01-2 mM二硫苏糖醇、0.1-50 mM亚铁盐（硫酸亚铁、乙二胺硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、柠檬酸亚铁、氯化亚铁、2,6-双（1,1-双（2-吡啶）乙基）吡啶-氧化铁络合物（[FeIV(O)(Py5Me2H)]2+））和0.001%-1%的过氧化氢或高锰酸钾等。
37℃反应0.5-2 h。
反应结束后，加入1 ul终止反应液，50℃反应3-10 min。使用磁珠法或者QIAquickNucleotide Removal Kit (Qiagen)回收DNA进行LC-MS/MS分析。5mC、5hmC、5fC和5caC含量占比分析流程见Hideharu Hashimoto et al（Nature，2013）。
表2
Figure 56297DEST_PATH_IMAGE001
实验结果如表2和图3所示， 融合MBD的TET酶能够显著增强各TET酶的活性，最终氧化产物5caC要显著高于未融合MBD的TET酶。其中，MBD1-NgTET1的最终氧化产物的占比最大，可达到90.4%，要明显高于其他几个MBD功能结构域。
实施例3：基于MBD1-NgTET1的简便高通量测序方法。
在实施例2中，我们验证了NgTET1在氧化5mC过程中产生的最终产物5caC占比最多，且融合了MBD1的NgTET1能够显著提高氧化产物中5caC的占比，这些结果表明MBD1-NgTET1蛋白具有应用在基于TET蛋白的高通量DNA甲基化检测技术TAPS(Liu Y, Siejka-Zielińska P, et al. Nature Biotechnology, 2019)上的潜力。但是，目前的TAPS技术流程操作复杂、耗时长、损失大，难以实现大范围工业化。我们根据MBD-NgTET1及相应的TET酶反应缓冲液优化的TAPS流程和处理条件，极大简化了TAPS的操作，缩短了TAPS的处理时长，提高了TAPS检测DNA甲基化的灵敏度和准确性。具体实施方式如下：
（1）MBD1-NgTET1对模板DNA进行氧化：
表3
组分 用量
Control DNA CpG methylated pUC19 1-100 ng
10×TET酶反应缓冲液 3 μL
10 μM 各TET酶 2-10 μL
补ddH<sub>2</sub>O至 30 μL
37℃处理0.5-2 h。
（2）还原剂处理，碱中和：
加入6-12 μL醋酸钠和100-4000 mM还原剂（包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、叔丁胺硼烷、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N,N-二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物）。室温反应4-12 h。反应结束后，加入5-30 ul 3 M NaOH，混匀。
（3）DNA回收：
磁珠法回收：加入1.6 x DNA Hieff NGS® DNA Selection Beads，室温孵育5-10min后。将PCR管置于磁力架上。待溶液澄清后吸去上清。80%的乙醇清洗磁珠两次后，吸干上清。室温静置3-5 min后，加入21 ul ddH2O洗脱。
柱法回收：使用Zymo Research的DNA Clean & Concentrator-5按照说明书进行DNA回收。
抽提沉淀法：加入等体积DNA抽提试剂混匀后12000x g离心10 min，取上清后，加入1/10体积3 M 醋酸钠和等体积异丙醇。-80℃处理2 h后，12000x g 4℃离心20 min。75%预冷无水乙醇清洗沉淀一次室温晾干，溶解于21 ul ddH2O。
（4）DNA文库构建：
使用翌圣生物的Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit forIllumina进行DNA文库构建。
传统TAPS和优化后的TAPS流程对比见图4。结果如图5-图9所示，优化后的TAPS能够显著提高文库的产量（图5）。融合MBD1的NgTET1能够显著增强TAPS流程的转化率，且在处理1h后基本达到最高值（98%以上）（图6）。不同还原剂对TAPS的转化率不同（图7），其中，氢化铝锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、氨硼烷锂、叔丁胺硼烷、硼烷吗啉络合物和硼烷四氢呋喃络合物处理能够达到最高转化率（超过98%）。还原剂的处理时间在4h-8h时接近达到最高值（98.5%以上）。因此，我们检测了MBD-NgTET1、优化TET酶反应缓冲液、优化还原剂和优化TAPS流程对DNA甲基化检测的影响，发现MBD-NgTET1、优化TET酶反应缓冲液、优化还原剂都能够显著提高TAPS检测DNA甲基化的效率和准确性（图9）。优化流程并不会降低TAPS检测DNA甲基化的效率和准确性（图9）。这些说明优化后的TAPS准确性更好、效率更高、灵敏度更强。
综上，本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ ID 1-4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD-TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本发明还提供了适用于MBD-TET的反应缓冲液和简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，能够有效增强MBD-TET对5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性，可以应用于疾病诊断，尤其是在疾病诊断和肿瘤早筛领域。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Asp Trp Leu Asp Cys Pro Ala Leu Gly Pro Gly Trp Lys Arg
1 5 10 15
Arg Glu Val Phe Arg Lys Ser Gly Ala Thr Cys Gly Arg Ser Asp Thr
20 25 30
Tyr Tyr Gln Ser Pro Thr Gly Asp Arg Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu
35 40 45
Thr Arg Tyr Leu Gly Pro Ala Cys Asp Leu Thr Leu Phe Asp Phe Lys
50 55 60
Gln Gly Ile Leu
65
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Gly Lys Arg Met Asp Cys Pro Ala Leu Pro Pro Gly Trp Lys
1 5 10 15
Lys Glu Glu Val Ile Arg Lys Ser Gly Leu Ser Ala Gly Lys Ser Asp
20 25 30
Val Tyr Tyr Phe Ser Pro Ser Gly Lys Lys Phe Arg Ser Lys Pro Gln
35 40 45
Leu Ala Arg Tyr Leu Gly Asn Thr Val Asp Leu Ser Ser Phe Asp Phe
50 55 60
Arg Thr Gly Lys Met
65
<210> 3
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Arg Lys Arg Trp Glu Cys Pro Ala Leu Pro Gln Gly Trp Glu Arg
1 5 10 15
Glu Glu Val Pro Arg Arg Ser Gly Leu Ser Ala Gly His Arg Asp Val
20 25 30
Phe Tyr Tyr Ser Pro Ser Gly Lys Lys Phe Arg Ser Lys Pro Gln Leu
35 40 45
Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Ser Met Asp Leu Ser Thr Phe Asp Phe Arg
50 55 60
Thr Gly Lys Met Leu Met Ser
65 70
<210> 4
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Thr Ala Gly Thr Glu Cys Arg Lys Ser Val Pro Cys Gly Trp Glu
1 5 10 15
Arg Val Val Lys Gln Arg Leu Phe Gly Lys Thr Ala Gly Arg Phe Asp
20 25 30
Val Tyr Phe Ile Ser Pro Gln Gly Leu Lys Phe Arg Ser Lys Ser Ser
35 40 45
Leu Ala Asn Tyr Leu His Lys Asn Gly Glu Thr Ser Leu Lys Pro Glu
50 55 60
Asp Phe Asp Phe Thr Val Leu Ser Lys
65 70
<210> 5
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Thr Phe Lys Gln Gln Thr Ile Lys Glu Lys Glu Thr Lys Arg Lys
1 5 10 15
Tyr Cys Ile Lys Gly Thr Thr Ala Asn Leu Thr Gln Thr His Pro Asn
20 25 30
Gly Pro Val Cys Val Asn Arg Gly Glu Glu Val Ala Asn Thr Thr Thr
35 40 45
Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Ile Asn Lys Lys Ser Leu Leu Gln Asn
50 55 60
Leu Leu Ser Lys Cys Lys Thr Thr Phe Gln Gln Ser Phe Thr Asn Ala
65 70 75 80
Asn Ile Thr Leu Lys Asp Glu Lys Trp Leu Lys Asn Val Arg Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Val Cys Asp His Asp Gly Ser Val Glu Leu Ala Tyr Leu Pro
100 105 110
Asn Val Leu Pro Lys Glu Leu Val Glu Glu Phe Thr Glu Lys Phe Glu
115 120 125
Ser Ile Gln Thr Gly Arg Lys Lys Asp Thr Gly Tyr Ser Gly Ile Leu
130 135 140
Asp Asn Ser Met Pro Phe Asn Tyr Val Thr Ala Asp Leu Ser Gln Glu
145 150 155 160
Leu Gly Gln Tyr Leu Ser Glu Ile Val Asn Pro Gln Ile Asn Tyr Tyr
165 170 175
Ile Ser Lys Leu Leu Thr Cys Val Ser Ser Arg Thr Ile Asn Tyr Leu
180 185 190
Val Ser Leu Asn Asp Ser Tyr Tyr Ala Leu Asn Asn Cys Leu Tyr Pro
195 200 205
Ser Thr Ala Phe Asn Ser Leu Lys Pro Ser Asn Asp Gly His Arg Ile
210 215 220
Arg Lys Pro His Lys Asp Asn Leu Asp Ile Thr Pro Ser Ser Leu Phe
225 230 235 240
Tyr Phe Gly Asn Phe Gln Asn Thr Glu Gly Tyr Leu Glu Leu Thr Asp
245 250 255
Lys Asn Cys Lys Val Phe Val Gln Pro Gly Asp Val Leu Phe Phe Lys
260 265 270
Gly Asn Glu Tyr Lys His Val Val Ala Asn Ile Thr Ser Gly Trp Arg
275 280 285
Ile Gly Leu Val Tyr Phe Ala His Lys Gly Ser Lys Thr Lys Pro Tyr
290 295 300
Tyr Glu Asp Thr Gln Lys Asn Ser Leu Lys Ile His Lys Glu Thr Lys
305 310 315 320
<210> 6
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Glu Ala Ala Pro Cys Asp Cys Asp Gly Gly Thr Gln Lys Glu Lys
1 5 10 15
Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala Val
20 25 30
Arg Glu Leu Met Glu Thr Arg Phe Gly Gln Lys Gly Lys Ala Ile Arg
35 40 45
Ile Glu Lys Ile Val Phe Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gln Gly
50 55 60
Cys Pro Val Ala Lys Trp Val Ile Arg Arg Ser Gly Pro Glu Glu Lys
65 70 75 80
Leu Ile Cys Leu Val Arg Glu Arg Val Asp His His Cys Ser Thr Ala
85 90 95
Val Ile Val Val Leu Ile Leu Leu Trp Glu Gly Ile Pro Arg Leu Met
100 105 110
Ala Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Asn Leu Arg Ser Tyr Ser
115 120 125
Gly His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Lys Lys Arg Thr Cys
130 135 140
Thr Cys Gln Gly Ile Asp Pro Lys Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe
145 150 155 160
Gly Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser
165 170 175
Glu Asn Pro Arg Lys Phe Arg Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Leu His Asn
180 185 190
Tyr Tyr Lys Arg Ile Thr Gly Met Ser Ser Glu Gly Ser Asp Val Lys
195 200 205
Thr Gly Trp Ile Ile Pro Asp Arg Lys Thr Leu Ile Ser Arg Glu Glu
210 215 220
Lys Gln Leu Glu Lys Asn Leu Gln Glu Leu Ala Thr Val Leu Ala Pro
225 230 235 240
Leu Tyr Lys Gln Met Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr
245 250 255
Glu Glu Val Ala Gly Asp Cys Arg Leu Gly Asn Glu Glu Gly Arg Pro
260 265 270
Phe Ser Gly Val Thr Cys Cys Met Asp Phe Cys Ala His Ser His Lys
275 280 285
Asp Ile His Asn Met His Asn Gly Ser Thr Val Val Cys Thr Leu Ile
290 295 300
Arg Ala Asp Gly Arg Asp Thr Asn Cys Pro Glu Asp Glu Gln Leu His
305 310 315 320
Val Leu Pro Leu Tyr Arg Leu Ala Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Val
325 330 335
Glu Gly Met Lys Ala Lys Ile Lys Ser Gly Ala Ile Gln Val Asn Gly
340 345 350
Pro Thr Arg Lys Arg Arg Leu Arg Phe Thr Glu Pro Val Pro Arg Cys
355 360 365
Gly Lys Arg Ala Lys Met Lys Gln Asn His Asn Lys Ser Gly Ser His
370 375 380
Asn Thr Lys Ser Phe Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser His Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Glu Ser Thr Asp Phe Cys Pro Leu Gln Ala Ser Ser Ala Glu Thr
405 410 415
Ser Thr Cys Thr Tyr Ser Lys Thr Ala Ser Gly Gly Phe Ala Glu Thr
420 425 430
Ser Ser Ile Leu His Cys Thr Met Pro Ser Gly Ala His Ser Gly Ala
435 440 445
Asn Ala Ala Ala Gly Glu Cys Thr Gly Thr Val Gln Pro Ala Glu Val
450 455 460
Ala Ala His Pro His Gln Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ser Pro Val His
465 470 475 480
Ala Glu Pro Leu Thr Ser Pro Ser Glu Gln Leu Thr Ser Asn Gln Ser
485 490 495
Asn Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser Asn Ser Gln Lys Leu Ala Ser Cys
500 505 510
Gln Val Glu Asp Glu Arg His Pro Glu Ala Asp Glu Pro Gln His Pro
515 520 525
Glu Asp Asp Asn Leu Pro Gln Leu Asp Glu Phe Trp Ser Asp Ser Glu
530 535 540
Glu Ile Tyr Ala Asp Pro Ser Phe Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ile
545 550 555 560
His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg Lys Glu Leu His Ala Thr
565 570 575
Thr Ser Leu Arg Ser Pro Lys Arg Gly Val Pro Phe Arg Val Ser Leu
580 585 590
Val Phe Tyr Gln His Lys Ser Leu Asn Lys Pro Asn His Gly Phe Asp
595 600 605
Ile Asn Lys Ile Lys Cys Lys Cys Lys Lys Val Thr Lys Lys Lys Pro
610 615 620
Ala Asp Arg Glu Cys Pro Asp Val Ser Pro Glu Ala Asn Leu Ser His
625 630 635 640
Gln Ile Pro Ser Arg Val Ala Ser Thr Leu Thr Arg Asp Asn Val Val
645 650 655
Thr Val Ser Pro Tyr Ser Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn Arg
660 665 670
Trp Val
<210> 7
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Ser Gln Asn Gly Lys Cys Glu Gly Cys Asn Pro Asp Lys Asp Glu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Asp Val Ala Ala Ile
20 25 30
Arg Thr Leu Met Glu Glu Arg Tyr Gly Glu Lys Gly Lys Ala Ile Arg
35 40 45
Ile Glu Lys Val Ile Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gln Gly
50 55 60
Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Tyr Arg Arg Ser Ser Glu Glu Glu Lys
65 70 75 80
Leu Leu Cys Leu Val Arg Val Arg Pro Asn His Thr Cys Glu Thr Ala
85 90 95
Val Met Val Ile Ala Ile Met Leu Trp Asp Gly Ile Pro Lys Leu Leu
100 105 110
Ala Ser Glu Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Cys Gly
115 120 125
Ile Cys Thr Asn Arg Arg Cys Ser Gln Asn Glu Thr Arg Asn Cys Cys
130 135 140
Cys Gln Gly Glu Asn Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly
145 150 155 160
Cys Ser Trp Ser Met Tyr Tyr Asn Gly Cys Lys Phe Ala Arg Ser Lys
165 170 175
Lys Pro Arg Lys Phe Arg Leu His Gly Ala Glu Pro Lys Glu Glu Glu
180 185 190
Arg Leu Gly Ser His Leu Gln Asn Leu Ala Thr Val Ile Ala Pro Ile
195 200 205
Tyr Lys Lys Leu Ala Pro Asp Ala Tyr Asn Asn Gln Val Glu Phe Glu
210 215 220
His Gln Ala Pro Asp Cys Cys Leu Gly Leu Lys Glu Gly Arg Pro Phe
225 230 235 240
Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Ser Ala His Ser His Arg Asp
245 250 255
Gln Gln Asn Met Pro Asn Gly Ser Thr Val Val Val Thr Leu Asn Arg
260 265 270
Glu Asp Asn Arg Glu Val Gly Ala Lys Pro Glu Asp Glu Gln Phe His
275 280 285
Val Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ala Pro Glu Asp Glu Phe Gly Ser Thr
290 295 300
Glu Gly Gln Glu Lys Lys Ile Arg Met Gly Ser Ile Glu Val Leu Gln
305 310 315 320
Ser Phe Arg Arg Arg Arg Val Ile Arg Ile Gly Glu Leu Pro Lys Ser
325 330 335
Cys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Gly Gln Asp Ala Ala Ala
340 345 350
Val Gln Glu Ile Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Asn Phe Gln Asp
355 360 365
Pro Cys Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Thr His Gly Ser Ile Leu
370 375 380
Ile Glu Cys Ala Lys Cys Glu Val His Ala Thr Thr Lys Val Asn Asp
385 390 395 400
Pro Asp Arg Asn His Pro Thr Arg Ile Ser Leu Val Leu Tyr Arg His
405 410 415
Lys Asn Leu Phe Leu Pro Lys His Cys Leu Ala Leu Trp Glu Ala Lys
420 425 430
Met Ala Glu Lys Ala Arg Lys Glu Glu Glu Cys Gly Lys Asn
435 440 445
<210> 8
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Glu Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val Ile Gln Lys Asp
1 5 10 15
Lys Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala
20 25 30
Val Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly Gln Lys Gly Asn Ala Ile
35 40 45
Arg Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser His
50 55 60
Gly Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu
65 70 75 80
Lys Val Leu Cys Leu Val Arg Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr
85 90 95
Ala Val Met Val Val Leu Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro
100 105 110
Met Ala Asp Arg Leu Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr
115 120 125
Asn Gly His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr
130 135 140
Cys Thr Cys Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser
145 150 155 160
Phe Gly Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His
180 185 190
Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala
195 200 205
Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val Glu
210 215 220
Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu Gly Arg
225 230 235 240
Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala His Pro His
245 250 255
Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val Val Cys Thr Leu
260 265 270
Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile Pro Gln Asp Glu Gln
275 280 285
Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser Asp Thr Asp Glu Phe Gly
290 295 300
Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val
305 310 315 320
Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro
325 330 335
Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His
340 345 350
Lys Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys
355 360 365
Asn Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr
370 375 380
Leu Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr
385 390 395 400
Glu Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser
405 410 415
Leu Met Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe
420 425 430
Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn
435 440 445
Asp Ala Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His
450 455 460
Cys Thr Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Asp Gly Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr
485 490 495
Leu Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr
500 505 510
Gly Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser
515 520 525
Phe Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp
530 535 540
Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser
545 550 555 560
Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu
565 570 575
Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly
580 585 590
Val Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg
595 600 605
Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His Pro Asn Arg Asn His
610 615 620
Pro Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys
625 630 635 640
Pro Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu
645 650 655
Ala Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala
660 665 670
Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile
675 680 685
Pro Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val
690 695 700
Ser Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val
705 710 715 720
<210> 9
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Phe Pro Ser Cys Arg Cys Val Glu Gln Ile Ile Glu Lys Asp Glu
1 5 10 15
Gly Pro Phe Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Asn Val Ala Ala Ile
20 25 30
Arg Glu Ile Met Glu Glu Arg Phe Gly Gln Lys Gly Lys Ala Ile Arg
35 40 45
Ile Glu Arg Val Ile Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gln Gly
50 55 60
Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Glu Glu Lys
65 70 75 80
Leu Leu Cys Leu Val Arg Glu Arg Ala Gly His Thr Cys Glu Ala Ala
85 90 95
Val Ile Val Ile Leu Ile Leu Val Trp Glu Gly Ile Pro Leu Ser Leu
100 105 110
Ala Asp Lys Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Glu Thr Leu Arg Lys Tyr Gly
115 120 125
Thr Leu Thr Asn Arg Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Arg Thr Cys Ala
130 135 140
Cys Gln Gly Leu Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly
145 150 155 160
Cys Ser Trp Ser Met Tyr Tyr Asn Gly Cys Lys Phe Ala Arg Ser Lys
165 170 175
Ile Pro Arg Lys Phe Lys Leu Leu Gly Asp Asp Pro Lys Glu Glu Glu
180 185 190
Lys Leu Glu Ser His Leu Gln Asn Leu Ser Thr Leu Met Ala Pro Thr
195 200 205
Tyr Lys Lys Leu Ala Pro Asp Ala Tyr Asn Asn Gln Ile Glu Tyr Glu
210 215 220
His Arg Ala Pro Glu Cys Arg Leu Gly Leu Lys Glu Gly Arg Pro Phe
225 230 235 240
Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala His Ala His Arg Asp
245 250 255
Leu His Asn Met Gln Asn Gly Ser Thr Leu Val Cys Thr Leu Thr Arg
260 265 270
Glu Asp Asn Arg Glu Phe Gly Gly Lys Pro Glu Asp Glu Gln Leu His
275 280 285
Val Leu Pro Leu Tyr Lys Val Ser Asp Val Asp Glu Phe Gly Ser Val
290 295 300
Glu Ala Gln Glu Glu Lys Lys Arg Ser Gly Ala Ile Gln Val Leu Ser
305 310 315 320
Ser Phe Arg Arg Lys Val Arg Met Leu Ala Glu Pro Val Lys Thr Cys
325 330 335
Arg Gln Arg Lys Leu Glu Ala Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Leu Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Trp Ser Asp Ser Glu Gln Ser Phe
355 360 365
Leu Asp Pro Asp Ile Gly Gly Val Ala Val Ala Pro Thr His Gly Ser
370 375 380
Ile Leu Ile Glu Cys Ala Lys Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Leu
385 390 395 400
Lys Asn Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Ile Ser Leu Val Phe Tyr
405 410 415
Gln His Lys Ser Met Asn Glu Pro Lys His Gly Leu Ala Leu Trp Glu
420 425 430
Ala Lys Met Ala Glu Lys Ala Arg Glu Lys Glu Glu Glu Cys Glu Lys
435 440 445
Tyr Gly
450
<210> 10
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctgaagatt ggctggattg tccagcactg ggtccaggtt ggaaacgtcg cgaagtgttc 60
cgtaaatctg gtgcgacttg cggtcgttct gacacctatt accagagccc gactggcgat 120
cgcattcgtt ccaaagttga actgacccgt tacctgggcc cggcctgtga tctgactctg 180
ttcgatttca aacagggtat cctg 204
<210> 11
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaatctggta aacgtatgga ttgtccagca ctgccgcctg gttggaaaaa agaagaagtt 60
atccgtaaat ctggcctgtc tgcaggcaaa tccgacgtat actacttcag cccgtctggc 120
aaaaaattcc gctctaaacc acagctggcg cgttacctgg gtaacaccgt tgatctgtcc 180
tctttcgatt tccgtaccgg caaaatg 207
<210> 12
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaacgtaaac gttgggaatg tcctgctctg ccacagggtt gggaacgtga agaagttccg 60
cgtcgttctg gtctgtctgc tggccatcgt gatgtgttct actattctcc gtccggtaaa 120
aaattccgta gcaaaccgca gctggcacgt tacctgggcg gttctatgga tctgtctact 180
tttgatttcc gtactggcaa aatgctgatg tct 213
<210> 13
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctaccgctg gtaccgaatg tcgtaaatct gttccttgtg gttgggaacg tgtggtgaaa 60
cagcgtctgt tcggtaaaac tgcaggccgt ttcgatgttt attttatctc tccgcagggc 120
ctgaaattcc gcagcaaaag ctccctggcg aactacctgc acaagaacgg tgaaacttcc 180
ctgaaacctg aagacttcga cttcaccgtg ctgtccaaa 219

Claims (11)

1.重组TET酶在提高TET酶氧化产物中5caC占比的应用，其特征在于：所述重组TET酶为序列如SEQ ID No.1所示的重组蛋白结构域通过GGGS连接肽连接序列如SEQ ID No.5所示的NgTET1蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其步骤包括：
（1）采用权利要求1所述的重组TET酶对模板DNA进行氧化；
（2）还原剂处理，碱中和；
（3）DNA回收，回收产物构成全基因组DNA甲基化检测文库；
其中步骤（1）中添加TET酶反应缓冲液，所述TET酶反应缓冲液含有：1-100 mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐、1-100 mM双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、1-100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300 mM氯化钠、0.1-10 mM抗坏血酸、0.1-10 mM柠檬酸、0.1-20 mMα-酮戊二酸、0.1-20 mM 1,3-丙酮二羧酸、0.1-20 mM三磷酸腺苷、0.1-10 mM四氟对苯醌、0.1-10 mM四氯对苯醌、 0.1-10 mM四溴对苯醌、0.1-10 mM四碘苯醌、0.01-2 mM三(2-羧乙基)膦、0.01-2 mM二硫苏糖醇。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述TET酶反应缓冲液还含有0.1-50 mM的铁盐化合物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的氧化反应的反应温度为10-40℃。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的氧化反应的反应时间为0.5-2 h。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的还原剂包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N,N-二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物中的一种或多种。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理浓度为100-2000mM。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理温度为20-50℃。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理时间为2-24 h。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的碱中和使用的是氢氧化钠或氢氧化钾，在反应体系中的终浓度为0.5-1.5 M。
11.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（3）中所述的DNA回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收。
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