JP6500293B2 - Dnaメチル化編集用キットおよびdnaメチル化編集方法 - Google Patents
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Description
[1](1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
(2)タグペプチド結合部位(tag peptide binding portion)と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
(3)メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。
[2]前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位(TET1CD)である、[1]に記載のDNAメチル化編集用キット。
[3]前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、[1]に記載のDNAメチル化編集用キット。
[4]前記タグペプチドがペプチドエピトープであり、前記タグペプチド結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体である、[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[5]前記ペプチドエピトープがGeneral Control Non-derepressible 4(GCN4)ペプチドエピトープであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗GCN4ペプチドエピトープ抗体である、[4]に記載のDNAメチル化編集用キット。
[6]前記ペプチドエピトープがHisタグまたはEEタグであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗Hisタグ抗体または抗EEタグ抗体である、[4]に記載のDNAメチル化編集用キット。
[7]前記抗体が一本鎖抗体(scFv)である、[4]〜[6]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[8]前記タグペプチドがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり、前記タグペプチド結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである、[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[9]前記スプリットタンパク質がGFPである、[8]に記載のDNAメチル化編集用キット。
[10]前記タグペプチドがGVKESLVであり、前記タグペプチド結合部位がPDZ proteinである、[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[11]前記リンカーが5〜100アミノ酸である、[1]〜[10]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[12]前記リンカーが5〜50アミノ酸である、[1]〜[11]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[13]前記リンカーが10〜50アミノ酸である、[1]〜[12]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[14]前記(1)および/または(2)の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、[1]〜[13]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[15]前記gRNAが複数である、[1]〜[14]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[16]前記(1)〜(3)のDNAが全て一つのベクターに含まれている、[1]〜[15]のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
[17]下記(1)〜(3)を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法。
(1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
(2)タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
(3)メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)、またはそれを発現するDNA。
[18]前記(1)および/または(2)の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、[17]に記載のDNAメチル化編集方法。
[19]前記選択マーカーを発現する細胞を選択して回収する工程をさらに含む、[18]に記載のDNAメチル化編集方法。
CRISPR/Casでは、DNA切断酵素のCas9が、ターゲットと相補的な約20塩基の配列を含む短いRNA(ガイドRNA(gRNA))と複合体を形成し、ターゲットのDNAを切断する(非特許文献2)。ここで、dCas9というDNA切断活性のない変異体酵素を用いると、ターゲットを切断せずにターゲットへの結合のみを行うことができる。そこで、dCas9に様々な構成要素を結合させることで、メチル化や脱メチル化を行う因子をリクルートすると、特定の遺伝子のメチル化制御を行うことが可能である。またdCas9と、それと融合させたタグペプチドが複数つながったタグペプチドアレイと、タグペプチド結合部位、例えば、タグペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)などのタグペプチド結合部位にメチル化や脱メチル化をおこなう因子を融合させたシステムを用いると、1つのdCas9に対して複数のメチル化因子や脱メチル化因子をリクルートでき、そのメチル化あるいは脱メチル化の能力を増強することができる(図3a)。
本発明は、(1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、GCN4などのタグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、(2)抗タグペプチド抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれらをコードするRNAもしくはDNA、および(3)脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)、またはそれを発現するDNAを含む、DNAメチル化編集用キットに関する。また、本発明は、上記(1)〜(3)を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法に関する。
CRISPR-associated endonuclease Cas9(Cas9)は、RECローブ(REC: recognition、認識)とNUCローブ(NUC: nuclease、ヌクレアーゼ)の2つのローブからなり、NUCローブがヌクレアーゼ活性を担う部位である(非特許文献2)。よって、本発明におけるヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型Cas9(dCas9)は、Cas9のNUCローブに変異を導入したものである。これにより、ターゲット部位への結合能を保持したまま、Cas9のヌクレアーゼ活性を不活化させることができる。NUCローブへの変異導入部位は、ヌクレアーゼ活性のみを不活化させることができる限りにおいて制限はないが、たとえば、Cas9(UniProtKB/Swiss-Prot: Q99ZW2)におけるAsp10のアラニンへの変異(D10A)、His840のアラニンへの変異(H840A)、およびAsn863のアラニンへの変異(N863A)が好ましい。当該変異は、1種であっても、2種以上を組み合わせたものであってもよい。
本発明におけるタグペプチドアレイとは、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったものである。
タグペプチドは後述するタグペプチド結合部分との組み合わせで任意に選択できる。例えば、タグペプチドとタグペプチド結合部分の組み合わせとして、ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせ、スプリットタンパク質のスモールフラグメントとラージフラグメントの組み合わせなどが例示される。
ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせとしては、GCN4と抗GCN4抗体、Hisタグと抗Hisタグ抗体、EEヘキサペプチドと抗EEヘキサペプチド抗体、c-Mycタグと抗c-Mycタグ抗体、HAタグと抗HAタグ抗体、Sタグと抗Sタグ抗体、FLAGタグと抗FLAGタグ抗体などが例示される(Protein Engineering, Design & Selection vol. 24 no. 5 pp. 419-428, 2011)。この中ではGCN4に含まれるペプチドが好適に使用され、GCN4のアミノ酸配列は、たとえば、PDBから入手することができ、DNA配列は、GenBank等から入手可能である。また、当業者であれば、塩基配列変換ソフト等を用い、当該DNA配列情報に基づいて、それに対応するRNA配列も入手可能である。GCN4ペプチドエピトープとしては、GCN4におけるエピトープであれば制限なく使用できるが、配列番号1で表されるアミノ酸配列が好ましい。その他のタグペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列も公知のデータベース等から情報を入手することができる。
dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したdCas9をコードするDNAとタグペプチドアレイをコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
上記の通り、タグペプチド結合部位はタグペプチドの種類に応じて抗タグペプチド(ペプチドエピトープ)抗体、スプリットタンパク質のラージフラグメントなどを使用することができる。ここで、抗タグペプチド抗体は、タグペプチドを特異的に認識する抗体を意味する。抗タグペプチド抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれ得る。当該モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F(ab')化抗体、短鎖抗体(scFv)、ダイアボディ(Diabodies)およびミニボディ(Minibodies)を含むものとする。抗タグペプチド抗体をコードするDNAは、公知の分子生物学的手法により入手可能であり、たとえば、Addgeneプラスミド60904等の市販のプラスミドからPCRにより増幅して得ることができ、または、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。抗タグペプチド抗体またはそれをコードするRNAは、上記抗タグペプチド抗体をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
本発明におけるメチル化酵素としては、非メチル化部位のメチル化を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、DNA塩基配列上の特定の塩基をメチル化する酵素であるメチラーゼ、特定の塩基にメチル基を転移する酵素であるメチルトランスフェラーゼが含まれ、より具体的にはDNA Methyltransferase 3 beta(DNMT3B)、DNA Methyltransferase 3 alpha(DNMT3A)、DNA Methyltransferase 1(DNMT1)が挙げられる。本発明における脱メチル化酵素としては、メチル化部位の脱メチル化にいたる一連の反応を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、Ten-eleven translocation 1(TET1)、Ten-eleven translocation 2(TET2)、Ten-eleven translocation 3(TET3)、Thymine-DNA glycosylase(TDG)が含まれる。それら酵素は、酵素蛋白質の一部分であってもよいし、全体であってもよい。酵素蛋白質の一部分としては、酵素触媒部位が好ましく例示される。それら酵素をコードするDNAは、GenBank等から配列情報を入手可能であり、ヒト等の対象動物のcDNAからPCRにより作製可能である。または、それら酵素をコードするDNAは、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。それら酵素またはそれらをコードするRNAは、上記DNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
抗ペプチドエピトープ抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したタグペプチド結合部位をコードするDNAと、メチル化酵素または脱メチル化酵素をコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択して回収することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。なお、選択マーカーをコードするDNA配列が、上記dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAに挿入されている場合、当該選択マーカーとは異なる選択マーカーを、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAに挿入してもよい。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
本発明におけるガイドRNA(gRNA)は、CRISPER/Cas法におけるtracrRNAとcrRNAを人工的に連結させたものである。tracrRNAを発現するDNAは、非特許文献2(第1698頁)に記載されているRNA配列を基に、公知の手法によりそれに対応するDNAを得ることが可能である。たとえば、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて、当該DNAを人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。または、任意のcrRNAに対応するDNA配列を挿入することにより所望のgRNAを発現させることができるプラスミドが市販されている(Addgeneプラスミド41824等)ので、それを使用してもよい。crRNAとしては、メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を使用する。gRNAは、1種類であってもよいし、それぞれ異なるcrRNAを含むgRNAを複数使用してもよい。
上記で述べた2つの融合蛋白質をコードするDNAを、さらに連結させて、dCas9、タグペプチドアレイ、タグペプチド結合部位、およびメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質をコードするDNAをベクターに組み込み、使用してもよい。当該DNAを含むベクターを、オールインワンベクターと称する。当該融合蛋白質をコードするDNAには、適宜リンカーを挿入してもよい。たとえば、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質(構成要素1とする)と、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質(構成要素2とする)との間に、リンカーとして、ウイルス由来の2Aペプチドを挿入すると、当該2Aペプチドが細胞内で2Aペプチターゼにより切断されるため、構成要素1と2は連結されておらず、分離した2つの蛋白質として発現することになる。また、当該オールインワンベクターには、gRNAを含めても良い。
細胞へのDNA、RNA、および蛋白質のトランスフェクションは、公知の任意の手段を使用することにより可能であり、市販のトランスフェクション用試薬を使用してもよい。たとえば、DNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine2000(Invitrogen)、jetPRIME Kit(ポリプラストランスフェクション)、DreamFect(オズバイオサイエンス)、GenePorter3000(オズバイオサイエンス)、Calcium Phosphate Transfection Kit(オズバイオサイエンス)等を使用可能である。RNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine 3000(Invitrogen)、RNAi Max(Invitrogen)、MessengerMAX(Invitrogen)等を使用可能である。蛋白質のトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine CRISPRMAX(Invitrogen)、PULSin(ポリプラストランスフェクション)、Pro-DeliverIN(オズバイオサイエンス)、BioPORTER Protein Delivery Reagent(Genlantis)等を使用可能である。細胞へのトランスフェクションは、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質とgRNAとで予め複合体を形成させ、当該複合体を細胞にトランスフェクションしてもよい。また受精卵にマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによりDNA、RNA、蛋白質を導入することも可能である。
<標的脱メチル基のためのプラスミド構築>
dCas9−TET1触媒部位(CD)融合蛋白質発現ベクター(pCAG−dCas9TET1CD)は、触媒として不活性なヌクレアーゼであるコドン最適化S.pyogenes Cas9(dCas9)をコードするcDNAを、ヒトTET1CDのN末端にある触媒ドメインに融合することにより作製された(システム1)。dCas9フラグメントは、PCRによりAddgeneプラスミド48240から増幅された。TET1CDフラグメントはヒトcDNAからPCRにより増幅された。
GfapおよびH19のためのgRNAベクターは、Addgeneプラスミド41824の中にターゲットシークエンスを挿入することにより作製した。クローニングは、AflII部位の直線化と、gRNAフラグメントの挿入を媒介するギブソンアセンブリーシステムにより行った。
ターゲットシークエンスを表1に示す。
胚性幹細胞(ESCs)は、37℃、5%CO2下で、1%FBS、17.5%KSR100(10828028, Gibco)、0.2%の2−メルカプトエタノール(21985-023, Gibco)、およびESGRO mLIF,を1x103 ユニット/mL (ESG1107, Millipore)添加したダルベッコ改変イーグル培地−高濃度グルコース(D6429-500ML, Sigma)にて培養した。ESCsは、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を添付のプロトコールに従って使用してトランスフェクションを行い、トランスフェクションから48時間後に細胞を回収し、それらを、アッセイやFACSAriaII (BD Biosciences)によるソートに、直接使用した。
ゲノムDNAは、Epitect Plus DNA Bisulfite Kit (QIAGEN)を添付の指示書に従って使用して処置された。修飾DNAは、下記表2のPCRプライマーを使用して増幅された。
サンプル脱メチル化(%)=(コントロールのメチル化-サンプルのメチル化)/コントロールのメチル化×100・・・数式1
まず、メチル化処置のために、不活性化Cas9ヌクレアーゼ(dCas9)とTET1との直接融合タンパクというシンプルな設計を作製した。TET1は、C末端に保存された触媒ドメインを有しており、このドメインはフルレングスのタンパク質よりも高い触媒活性を有する。そのため、このTET1触媒ドメイン(TET1CD)を、触媒作用が不活性であるdCas9に融合させた(図1のシステム1)。
部位において、それぞれ3%、14%、および9%の脱メチル化を示した(図2b)。一方、無関係のgRNA(UR1、UR2、およびUR3)は脱メチル化を示さなかった。よって、このシンプルなシステムはgRNA依存的特異的脱メチル化を誘発するが、脱メチル化の程度はせいぜい14%であることが示された。
ターゲットにメチル化を導入するためシステム3(リンカー22aa)を用いてH19のm2部位のメチル化をおこなった。TET1CDの代わりに(1)Dnmt3b、(2)Dnmt3bNLS、(3)Dnmt3bNLS_N662Rを用いて実験を行った(図7)。(1)はDe novoメチル化酵素Dnmt3bで、(2)は(1)のDnmt3bのC末にNLS(核移行シグナル)をつけたもの、(3)は(2)の662番目のアミノ酸をアスパラギン(N)からアルギニン (R)に変えたものである。このアミノ酸置換はメチル化活性を向上させることが報告されている(下記のShen L et al.)。用いたプラスミドは以下の通り。
(1)Dnmt3b: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bF(配列番号41)
(2)Dnmt3bNLS: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bFNLS(配列番号42)
(3)Dnmt3bNLS_N662R: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1(配列番号43)
これらの(1)〜(3)の系をES細胞に導入して2日目にGFPの蛍光によりセルソーターで遺伝子が導入されて蛍光を発する細胞のみを単離し、脱メチル化のときと同様にH19のm2のメチル化を調べた。メチル化は数式2のようにコントロールで標準化したメチル化(%)として計算した。その結果、ターゲットのメチル化は(1)54%、(2)74%、(3)84%となり、メチル化効率はDnmt3bだけよりはNLSをつけた方がよく、さらにN662Rのアミノ酸置換をいれたものの方がよいことがわかった(図8)。
コントロールで標準化したメチル化(%)=(サンプルのメチル化-コントロールのメチル化)/コントロールのメチル化×100・・・数式2
参考文献
Shen L, Gao G, Zhang Y, Zhang H, Ye Z, Huang S, Huang J, Kang J. A single amino acid substitution confers enhanced methylation activity of mammalian Dnmt3b on chromatin DNA. Nucleic Acids Res. 38:6054-6064, 2010. doi: 10.1093/nar/gkq456.
配列番号2:リンカー5
配列番号3:リンカー22
配列番号4:リンカー43
配列番号5:2Aペプチド
配列番号6:pCAG-dCas9TET1CD
配列番号7:pCAG-dCas9-10xGCN4_v4
配列番号8:pCAG-scFvGCN4sfGFPTET1CD
配列番号9:pCAG-dCas9-5xPlat2AflD
配列番号10:pCAG-dCas9-3.5xSuper
配列番号11:pPlatTET-gRNA2
配列番号12:Gfap_1
配列番号13:Gfap_2
配列番号14:Gfap_3
配列番号15:H19DMR_1
配列番号16:H19DMR_2
配列番号17:H19DMR_3
配列番号18:H19DMR_4
配列番号19:UR_1
配列番号20:UR_2
配列番号21:UR_3
配列番号22:GfapSTAT3-B3
配列番号23:GfapSTAT3-B4
配列番号24:H19DMR-B1
配列番号25:H19DMR-B2
配列番号26:Gfap_O1B1
配列番号27:Gfap_O1B2
配列番号28:Gfap_O2B1
配列番号29:Gfap_O2B2
配列番号30:Gfap_O3B1
配列番号31:Gfap_O3B2
配列番号32:GfapSTAT3-B1
配列番号33:GfapSTAT3-B2
配列番号34:H19DMR-B3
配列番号35:H19DMR-B4
配列番号36:H19DMR-B5
配列番号37:H19DMR-B6
配列番号38:off target 1
配列番号39:off target 2
配列番号40:off target 3
配列番号41:pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bF
配列番号42:pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bFNLS
配列番号43:pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1
配列番号44:タグペプチドGVKESLV
配列番号45:GSリンカー
配列番号46:GSリンカー
配列番号47:GSリンカー
Claims (22)
- (1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、タグペプチドが15〜50アミノ酸からなるペプチドリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、(2)タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
(3)メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)、またはそれを発現するRNAもしくはDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。 - 前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位(TET1CD)である、請求項1に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、請求項1に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがペプチドエピトープであり、前記タグペプチド結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記ペプチドエピトープがGeneral Control Non-derepressible 4(GCN4)ペプチドエピトープであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗GCN4ペプチドエピトープ抗体である、請求項4に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記ペプチドエピトープがHisタグまたはEEタグであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗Hisタグ抗体または抗EEタグ抗体である、請求項4に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記抗体が一本鎖抗体(scFv)である、請求項4〜6のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり、前記タグペプ
チド結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。 - 前記スプリットタンパク質がGFPである、請求項8に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがGVKESLV(配列番号44)であり、前記タグペプチド結合部位がPDZ proteinである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記リンカーが15〜40アミノ酸である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記(1)および/または(2)の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記gRNAが複数である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記(1)〜(3)のDNAが全て一つのベクターに含まれている、請求1〜13のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 下記(1)〜(3)を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法。
(1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、タグペプチドが15〜50アミノ酸からなるペプチドリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、(2)タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
(3)メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)、またはそれを発現するRNAもしくはDNA。 - 前記(1)および/または(2)の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、請求項15に記載のDNAメチル化編集方法。
- 前記選択マーカーを発現する細胞を選択して回収する工程をさらに含む、請求項16に記載のDNAメチル化編集方法。
- 前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位(TET1CD)である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集方法。
- 前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集方法。
- (1)ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9(dCas9)と、タグペプチドが15〜50アミノ酸からなるペプチドリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするRNAもしくはDNA、
(2)タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするRNAもしくはDNA、および
(3)メチル化または脱メチル化を所望する部位から1kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA(gRNA)を発現するRNAもしくはDNA
を含む、ベクター。 - 前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位(TET1CD)である、請求項20に記載のベクター。
- 前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、請求項20に記載のベクター。
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