CN111748583A - 一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于CRISPR/dCas9的DNA甲基化编辑系统及其应用，通过将光遗传学与DNA甲基化编辑相结合，构建了基于CRISPR/dCas9系统的光控DNA甲基化编辑系统，实现了DNA甲基化编辑的精准时空调控，提供一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，包括能够依次相互作用的向导元件、锚定元件和编辑效应元件；锚定元件包括刺激响应蛋白A和失活型SpCas9；编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和DNA甲基化编辑效应蛋白；刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B能够在刺激作用下相互结合。本发明的有益效果是：将光遗传学与DNA甲基化编辑相结合，实现了DNA甲基化编辑的精准时空调控；在光敏蛋白作用下建立了蓝光响应的DNA甲基化编辑系统，通过不同的光敏蛋白组合实现不同波长调控的DNA甲基化编辑系统，使用方法灵活，适用范围广泛。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统。
背景技术
DNA胞嘧啶甲基化修饰(methylation at 5-cytosine，5mC)在生物学过程中发挥重要作用，对于基因印记、细胞命运决定、染色质结构重构和基因表达调控等具有重要意义。DNA甲基化修饰改变与多种疾病密切相关，如胚胎发育异常和肿瘤等。DNA 5mC甲基化修饰过程主要是由DNA甲基化转移酶介导，其主要包括DNMT1,DNMT3A和DNMT3B；另一方面，DNA5mC修饰是一个动态可逆的过程，去甲基化过程首先由TET家族蛋白介导将5mC氧化生成5-羟甲基化胞嘧啶(5hmC)，再进一步被氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)，后者最后再一次被氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)。接下来，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)与碱基切除修复(BER)共同将5fC和5caC从DNA中去除，产生一个未甲基化修饰的胞嘧啶。
为了研究动态甲基化修饰过程对于基因表达和功能的影响，研究人员需要精确有效的方法对基因进行表观遗传学编辑。Clustered regularly interspaced palindromicrepeats(CRISPR)系统来源于细菌适应性免疫学系统，经过工程化改造后，目前可用于精准的基因编辑和表观遗传学调控。核酸酶失活型Cas9(dCas9)可以作为DNA锚定平台，将不同效应蛋白递送并作用于基因组特定区域，例如前期有研究工作报道了dCas9-DNMT3A和dCas9-TET1融合蛋白，能够在特定基因位点写入或消除DNA 5mC甲基化修饰，从而可以通过guideRNA依赖的方式进行灵活有效的DNA甲基化编辑。但甲基化修饰是一个高度动态化且精细的过程，上述方法无法实现精准的具有时空特异性的DNA甲基化编辑，CRISPR/Cas9系统进入细胞后会对基因组发生持续性的编辑效应，可能造成严重的脱靶现象。因此，建立一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统和方法，可以实现DNA甲基化编辑的条件性启动和关闭，从而降低脱靶率，这对于基因编辑领域具有重大意义和研究价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于CRISPR/dCas9的DNA甲基化编辑系统及其应用，通过将光遗传学与DNA甲基化编辑相结合，构建了基于CRISPR/dCas9系统的光控DNA甲基化编辑系统，实现了DNA甲基化编辑的精准时空调控，提供一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统。
本发明采用的技术方案是：一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，包括能够依次作用的向导元件、锚定元件和编辑效应元件；
锚定元件包括刺激响应蛋白A和失活型SpCas9；
编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和DNA甲基化编辑效应蛋白；
刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合。
优选地，DNA甲基化编辑效应蛋白为DNA甲基化转移酶或DNA去甲基化酶TET蛋白。
优选地，DNA甲基化转移酶为DNMT1，DNMT3A或DNMT3B；
DNA去甲基化酶TET蛋白为TET1，TET2或TET3。
优选地，DNA甲基化转移酶为DNMT3A，DNA去甲基化酶TET蛋白为TET1。
优选地，刺激作用为光刺激；
优选地，光刺激的光为蓝光、紫外光、近红外或绿光；
优选地，刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B为能够相互配对的光敏蛋白。
优选地，刺激响应蛋白A和刺激响应蛋白B为CIB1和CRY2、PhyB和PIF3、BphP1和PpsR2以及BphP1和Q-PAS1中的一对或至少两对的组合；
优选地，CIB1为截短体CIBN，CRY2为截短体CRY2PHR。
优选地，向导元件为SpCas9guideRNA。
具体为光控DNA甲基化写入系统或光控DNA去甲基化系统。
优选地，光控DNA甲基化写入系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-DNMT3A和向导元件guide RNA。
优选地，光控DNA去甲基化系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-TET1和向导元件guide RNA。
本发明具有的优点和积极效果是：首次提出了光控CRISPR/dCas9甲基化编辑的方案，将光遗传学与DNA甲基化编辑相结合，实现了DNA甲基化编辑的精准时空调控；本发明使用了光敏蛋白，建立了蓝光响应的DNA甲基化编辑系统，通过更换不同的光敏蛋白，可以实现不同波长调控的DNA甲基化编辑系统，如紫外、近红外、绿光等，使用方法灵活，适用范围广泛。
附图说明
图1.CLAMSd作用原理示意图；
图2.CLAMSt作用原理示意图；
图3.CLMAS系统特异性编辑靶基因甲基化修饰状态；
图4.CLAMS系统时间特异性编辑内源性基因DNA甲基化修饰；
图5.CLAMS系统空间特异性作用。
具体实施方式
光遗传学技术同时兼备时间、空间及可逆性操控的特点，建立基于光遗传学技术操控的CRISPR系统，对于研究复杂的分子功能及生物学表型具有重要意义。现有研究报道了基于蓝光响应光敏蛋白Magnet的CRISPR-Cas9系统，通过分析SpCas9-sgRNA复合物的晶体结构，将SpCas9分为两部分，分别与光敏蛋白相融合，如CIBN与CRY2PHR，光敏蛋白对在蓝光刺激下会聚集结合发生蛋白-蛋白相互作用，在黑暗条件下自动解聚，基于上述原已成功构建出光控Split-Cas9基因编辑系统。因此，进一步构建基于CRISPR-dCas9的光控DNA甲基化编辑系统对于深入研究基因的表观遗传学调控机制具有重要意义。
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，包括能够依次作用的向导元件、锚定元件和编辑效应元件，向导元件可以为SpCas9guideRNA；锚定元件包括相互连接的刺激响应蛋白A和失活型SpCas9(dCas9)；编辑效应元件包括相互连接的刺激响应蛋白B和DNA甲基化编辑效应蛋白；刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合。锚定元件在向导元件的引导作用下到基因组指定位置，在dCas9靶向作用下结合到基因组；在光刺激下锚定元件中的刺激响应蛋白A与编辑效应元件中的刺激响应蛋白B相互结合，从而带动DNA甲基化编辑效应蛋白结合到基因组中。
其中，DNA甲基化编辑效应蛋白为DNA甲基化转移酶或DNA去甲基化酶TET蛋白。DNA甲基化转移酶为DNMT1，DNMT3A或DNMT3B，优选为DNMT3A；DNA去甲基化酶TET蛋白为TET1，TET2或TET3，优选为TET1。
本发明某些实施例中，刺激作用为光刺激，光刺激的光为蓝光、紫外光、近红外或绿光，相应的，刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B为能够相互配对的光敏蛋白，刺激响应蛋白A和刺激响应蛋白B可以为CIB1和CRY2、PhyB和PIF3、BphP1和PpsR2以及BphP1和Q-PAS1中的一对或至少两对的组合；优选为CIB1和CRY2，进一步的CIB1为截短体CIBN，CRY2为截短体CRY2PHR。
在使用中，具体为光控DNA甲基化写入系统或光控DNA去甲基化系统。例如，光控DNA甲基化写入系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-DNMT3A和向导元件guide RNA；光控DNA去甲基化系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-TET1和向导元件guide RNA。
下面通过实施例结合附图对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：光控DNA甲基化写入系统(CLAMSd)的构建
如图1所示，CLAMSd由三质粒系统组成，SpCas9D10A和H840A突变使其失去核酸内切酶活性但保留DNA靶向活性，因此称为deadCas9(dCas9)，利用全基因合成方法构建SV40NLS-FLAG-dCas9-CIBN-NLS融合蛋白作为锚定元件，另一方面，将CRY2PHR与DNA甲基化转移酶DNMT3A融合作为效应元件。Cas9gRNA克隆在人源U6启动子下游并由U6启动表达。黑暗条件下，gRNA引导dCas9-CIBN蛋白到基因组指定位置，但DNA甲基化效应元件游离于细胞核中；在蓝光照射下，CIBN募集CRY2PHR同时携带激活元件到指定位置，对DNA甲基化进行编辑。
实施例2：光控DNA去甲基化系统(CLAMSt)的构建
CLAMSt与CLAMSd组成类似，原理如图2所示，CLAMSd同样由三质粒系统组成，利用全基因合成方法构建SV40NLS-FLAG-dCas9-CIBN-NLS融合蛋白作为锚定元件，另一方面，将CRY2PHR与去甲基化酶TET1融合作为效应元件。Cas9gRNA克隆在人源U6启动子下游并由U6启动表达。黑暗条件下，gRNA引导dCas9-CIBN蛋白到基因组指定位置，但DNA甲基化效应元件游离于细胞核中；在蓝光照射下，CIBN募集CRY2PHR同时携带激活元件到指定位置，对DNA去甲基化修饰的过程。
实施例3：CLAMSDNA甲基化编辑系统验证
以HEK293T为细胞模型，将CLAMS组分瞬时转染进入细胞中进行如下实验：
1.内源性基因DNA甲基化编辑效率检测：
以FMR1和RHOXF2作为CLAMSt靶基因，以CDKN2A作为CLAMSd靶基因，通过亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测靶基因甲基化修饰状态改变。
FMR1gRNA序列：GTGTTTACACCCGCAGCGGGC；
RHOXF2gRNA序列：GGAGAAGAAAAAGATGGCGG；
CDKN2AgRNA序列：GTGCCACATTCGCTAAGTGCT；
ScramblegRNA序列：CCCCCGGGGGAAAAATTTTT。
BSP引物序列：
FMR1：
F:GTTATTGAGTGTATTTTTGTAGAAATGGG，
R:CCCTCTCTCTTCAAATAACCTAAAAAC；
RHOXF2：
F:GGAGTTTTTGGTTATTTATGGGAAGGAGATTT，
R:ACAACAACACCAAACCCCAAATAAATTTTAATTC；
CDKN2A：
F：GTTTTTTTGTTTGGAAAGATAT，
R：AAAACTCCATACTACTCCCC。
检测结果如图3所示，其中(-)：黑暗；(+)：蓝光；a)FMR1启动子区BSP分析结果显示转染CLAMSt细胞光照后启动子区甲基化水平显著降低，而对照组细胞无明显差别；b)RHOXF2启动子区BSP分析结果显示转染CLAMSt细胞光照后启动子区甲基化水平显著降低，而对照组细胞无明显差别；c)CDKN2A启动子区BSP结果显示转染CLAMSd细胞光照后启动子区甲基化水平显著升高，而对照组细胞无明显差别。
2.时空特异性DNA甲基化编辑效率检测：
(1)CLAMS系统时间特异性作用。
以CDKN2A和RHOXF2为靶点，通过BSP实验验证CLAMS系统对于内源性基因甲基化编辑效应的时间特异性作用。
如图4所示，为CLAMS系统时间特异性编辑内源性基因DNA甲基化修饰。其中a)靶向CDKN2A的CLAMSd系统转染HEK293T细胞，转染24h后给与不同时间蓝光刺激，由图可见，随光照刺激时间延长CDKN2A甲基化修饰水平时间依赖性增加；b)为在a)中细胞接受光照24h后停止蓝光刺激，结果显示CDKN2A甲基化修饰水平随黑暗时间延长逐渐恢复对照组水平；c)为靶向RHOXF2的CLAMSt系统转染HEK293T细胞，转染24h后给与不同时间蓝光刺激，能够看出，随光照刺激时间延长RHOXF2甲基化修饰水平时间依赖性降低；d)为在c)中细胞接受光照24h后停止蓝光刺激，结果显示RHOXF2甲基化修饰水平随黑暗时间延长逐渐恢复对照组水平。
这些结果表明CLAMS系统能够通过时间特异性作用方式对DNA甲基化修饰进行精准编辑。
(2)构建GFP报告载体及细胞，验证CLAMS系统空间特异性作用。
构建GAPDH-CpG island(CGI)-SNPRNpromoter-GFP报告载体，通过CRISPR/Cas9技术将上述报告基因敲入HEK293T细胞的GAPDHCGI基因位点，由于GAPDH的CGI位点甲基化修饰程度较低，因此SNPRN promoter会同样维持低甲基化水平使GFP正常表达。当CLAMSd系统特异性作用于GAPDH CGI位点，会使局部区域甲基化水平升高从而抑制GFP的表达。
如图5所示为CLAMS系统空间特异性作用，其中a)为GAPDH-CpG island(CGI)-SNPRNpromoter-GFP报告载体构建及CRISPR-Cas9敲入HEK293T细胞示意图；b)CLAMSd系统编辑报告基因GAPHD位点甲基化水平从而调控GFP表达水平示意图；c)CLAMS系统光照依赖性空间特异性作用。结果表明，光照区域由于CLAMSd系统发挥功能使基因启动子区甲基化水平升高，从而显著抑制了GFP报告基因的表达；而黑暗区域GFP依然正常表达。
本发明某系实施例中蓝光响应光敏蛋白可替换为其他波长光敏蛋白或化学分子、温度等其他刺激响应的蛋白元件，从而实现智能响应型转录激活或智能响应型转录抑制。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：包括能够依次作用的向导元件、锚定元件和编辑效应元件；
所述锚定元件包括刺激响应蛋白A和失活型SpCas9；
所述编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和DNA甲基化编辑效应蛋白；
所述刺激响应蛋白A与所述刺激响应蛋白B能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述DNA甲基化编辑效应蛋白为DNA甲基化转移酶或DNA去甲基化酶TET蛋白。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述DNA甲基化转移酶为DNMT1，DNMT3A或DNMT3B；
所述DNA去甲基化酶TET蛋白为TET1，TET2或TET3。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述DNA甲基化转移酶为DNMT3A，所述DNA去甲基化酶TET蛋白为TET1。
5.根据权利要求1-4中任一所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述刺激作用为光刺激；
优选地，所述光刺激的光为蓝光、紫外光、近红外或绿光；
优选地，所述刺激响应蛋白A与所述刺激响应蛋白B为能够相互配对的光敏蛋白。
6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述刺激响应蛋白A和所述刺激响应蛋白B为CIB1和CRY2、PhyB和PIF3、BphP1和PpsR2以及BphP1和Q-PAS1中的一对或至少两对的组合；优选地，CIB1为截短体CIBN，CRY2为截短体CRY2PHR。
7.根据权利要求5所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述向导元件为SpCas9guideRNA。
8.根据权利要求1所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：具体为光控DNA甲基化写入系统或光控DNA去甲基化系统。
9.根据权利要求8所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述光控DNA甲基化写入系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-DNMT3A和向导元件guide RNA。
10.根据权利要求8所述的基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统，其特征在于：所述光控DNA去甲基化系统包括锚定元件dCas9-CIBN、编辑效应元件CRY2PHR-TET1和向导元件guide RNA。
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