CN114774389A - 基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的基因编辑方法、组合物及应用 - Google Patents

基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的基因编辑方法、组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的基因编辑方法、组合物及应用。本发明中的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在未受到光刺激的条件下游离失活的存在于细胞内；在受到光刺激条件下，结合形成具有功能的完整的Cas13蛋白酶，与靶向crRNA结合，特异性的敲低靶基因的表达。本发明具有时间‑空间特异性，能够精准靶向调控RNA，从而实现特异性RNA敲低、编辑和检测；进一步本发明能适用于骨折治疗，作用于活体局部，脱靶的风险小，生物风险低，为骨折愈合提供新的治疗策略，提供了一种Cas13蛋白酶的新用途。

Description

基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的基因编辑方法、组 合物及应用
技术领域
本发明涉及于基因编辑技术领域，特别涉及一种基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的方法、组合物及应用。
背景技术
基于CRISPR系统的第三代基因编辑技术，具有效率高、操作简便、成本低等优点，是医学研究的最前沿领域。现阶段，正有针对于β-地中海贫血、镰刀状细胞贫血、多发性骨髓瘤、Leber先天性黑蒙症等多种疾病的临床试验正在开展，其安全可行性已在CRISPR编辑T细胞治疗肺癌中得到证实，具备广阔的应用前景和巨大的市场潜力。
CRISPR基因编辑技术应用于临床的前提是精准与可控，开发具有高时空分辨率的基因编辑技术，是目前亟需解决的核心问题。光遗传是精准控制细胞行为的技术，具有高度的时间-空间特异性。现已经报道了多种光控基因编辑体系，分别将不同效应蛋白与CRISPR系统结合，可实现特异性基因编辑和转录调控。Cas13d是一种小巧而强大的CRISPR核酸酶，Cas13d酶的平均长度约为930个氨基酸，比其他Cas13酶小20％，比Cas9更是小33％。这种尺寸使其更容易包装到容量较小的载体中，如腺相关病毒载体。但目前CRISPR/Cas13d系统尚无有效光学开关，其潜在的非特异性作用可能影响临床应用。
在骨折治疗相关的医疗领域，目前认为靶向抑制骨硬化蛋白(SOST基因)或DKK-1蛋白(DKK-1基因)有望促进骨折愈合。SOST基因主要表达于成熟骨细胞中，DKK-1基因主要表达于成骨细胞和骨细胞中，二者均能够调控Wnt信号通路，从而抑制骨形成活动。现有方法主要利用二者抗体进行中和治疗，存在分子结构复杂、生产成本高、需通过注射给药等弊端，使其应用受到一定限制。相比之下，核酸类药物拥有明显的优势。核酸类药物基于碱基互补原理对目的蛋白进行调节，如CRISPR系统，通过合适的递送系统可有效进入机体内发挥作用，避免了传统小分子化药和抗体类药物面临的靶点不可成药问题。但目前尚未有基于CRISPR技术促进成骨能力及加速骨折愈合的治疗方案。本发明提供了一种光控CRISPR/Cas13d基因编辑方法，具有结构简单、易于制备、作用精准等优势，可应用于靶向抑制SOST和DKK-1促进成骨加速骨折愈合过程。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的方法、组合物及应用。
一方面，本发明提供了一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统，包括分割型Cas13d蛋白酶、由X部分和Y部分构成的双组分光控系统以及靶向crRNA；
所述分割型Cas13d蛋白酶包括Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分，所述Cas13d(N)与Cas13d(C)分别与双组分光控系统分中的X部分和Y部分相连形成Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白；
所述靶向crRNA包括靶向目标基因的向导序列和与Cas13d蛋白酶相结合的骨架序列。
进一步的，所述Cas13d(N)与Cas13d(C)由Cas13d蛋白酶从位于非功能区的切割位点分割开得到。
进一步的，所述双组分光控系统为光敏蛋白对：CIBN-CRY2PHR、pMagnet-nMagnet、iLID-SspB、BphP1-PpsR2、PhyB-PIF、BphP1-Q-PAS1中的任意之一。
进一步的，所述靶向crRNA的向导序列为SEQ ID NO.1-10中的任意之一。
另一方面，本发明提供了光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统对细胞内的靶序列进行基因编辑的非治疗方法，在未受到光刺激的条件下Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白互相游离，失活的存在于细胞内；在受到光刺激条件下，Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白形成完整具有功能的Cas13d核酸酶，与靶向crRNA结合，特异性的敲低靶基因的表达。
第三方面，本发明提供了包含光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的试剂盒，所述试剂盒用于对细胞内的靶序列进行基因敲低、编辑和检测。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，包括分割型Cas13d蛋白酶、由X部分和Y部分构成的双组分光控系统、靶向crRNA以及药物载体；
所述分割型Cas13d蛋白酶包括Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分，所述Cas13d(N)与Cas13d(C)分别与双组分光控系统分中的X部分和Y部分相连形成Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白；
所述靶向crRNA包括靶向目标基因的向导序列和与Cas13d蛋白酶相结合的骨架序列；
所述药物载体为脂质体、纳米颗粒载体、阳离子多聚物载体及病毒递送载体中的一种或多种；
所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
第五方面，本发明提供了光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备促进骨组织的成骨能力的产品中的应用。
第六方面，本发明提供了光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备治疗骨折的药物的用途。
第七方面，本发明提供了光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备治疗骨折的药物的用途，所述靶向crRNA靶向的目的基因为SOST基因和/或DKK-1基因，所述靶向crRNA的向导序列为：SEQ ID NO.6-9中的任意一种或多种组合。
本发明提供的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统具有时间-空间特异性，能够精准靶向调控RNA，从而实现特异性RNA敲低和编辑，与其他RNA调控方法相比，CRISPR/Cas13具有更高的效率和特异性，并可以靶向细胞核内RNA，而且与Cas9介导的DNA编辑不同，Cas13介导的RNA改变是暂时、非永久性的，因此在生物安全性方面有显著的优势。
本发明提供的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统适用于制备加速骨折愈合的药物，作用于活体局部，脱靶风险小，结合上转换纳米颗粒或近红外光响应光敏蛋白，可利用具有组织穿透性的近红外光触发光控开关，降低生物风险，为骨折愈合提供新的治疗策略，提供了一种Cas13蛋白酶的新用途。
附图说明
图1是本发明中光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统中光控分割型Cas13d蛋白酶和crRNA的结构示意图；
图2是本发明中光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的工作原理示意图；
图3是本发明中试验例1中Split-Cas13d切割位点筛选方法示意图，其中Cas13d蛋白酶连接的crRNA靶向萤火虫萤光素酶(Fluc)，海肾荧光素酶(Rluc)为表达对照，本实验X部分为pMagnet，Y部分为nMagnet，光照条件：470nm蓝光(0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)；
图4是本发明中Split-Cas13d切割位点Cas13d蛋白酶活性比较结果图，图中横坐标代表该组所使用的Cas13d切割位点，完整Cas13代表的是完整Cas13d蛋白酶对照，空载代表的是空载体对照；黑暗与光照条件比较，不同切割位点Cas13d活性均有统计学差异：K582位点差异最为显著，黑暗条件下靶基因的表达是光照条件下的6.2倍；
图5是本发明中光控分割型Cas13d蛋白酶RNA敲低功能的验证实验的结果，其中暗：黑暗，光照条件：470nm蓝光(0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，全长：完整Cas13d蛋白酶对照；可以看出光控分割型Cas13d蛋白酶在光照条件下能够显著抑制内源性靶基因CXCR4、ANXA4和LncRNA-HOTTIP的表达；
图6是本发明中光控分割型Cas13d蛋白酶时间特异性作用验证实验流程示意图；
图7是本发明中光控分割型Cas13d蛋白酶时间特异性作用验证实验的结果图，可以看出本发明中的系统能够时间特异性敲低内源性靶基因的表达，光控分割型Cas13d时间特异性靶向敲低CXCR4；图7A：随光照时间延长，CXCR4表达逐渐降低；图7B：光照12h后撤除光源，CXCR4表达经36h逐渐恢复至正常水平；光照条件：470nm蓝光，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环；
图8是本发明中光控分割型Cas13d蛋白酶空间特异性作用验证实验流程示意图和结果图；显微镜下mCherry表达分布状态图示，光照条件：470nm蓝光，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环，区域细胞mCherry表达显著减少；
图9是本发明中光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统和siRNA技术的特异性比较；A,光控型CRISPR/Cas13d组RNA测序结果；B,siRNA组RNA测序结果。RNA测序分析示光控型CRISPR/Cas13d系统和siRNA均能显著敲低靶基因CXCR4基因表达，但前者非特异性作用少于siRNA技术。差异基因阈值：Log2[(TPM of NT组)/(TPM of CXCR4组)]≥1或≤-1，TPM(Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads)：RNA测序数据定量的表示方法；虚线：Log2[(TPM of NT组)/(TPM of CXCR4组)]＝1或-1的阈值线，NT：无关对照crRNA组，即crRNA-1，向导序列如SEQ ID NO.1所示；
图10是本发明中光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统靶向抑制MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞SOST和DKK-1基因，使茜素红阳性染色显著增强的实验结果图，表明光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统可以通过抑制SOST和DKK-1基因加强小鼠成骨能力；
图11是光控CRISPR/Cas13d系统靶向抑制SOST和DKK-1基因促进人间充质干细胞成骨分化，使茜素红阳性染色显著增强的实验结果图，表明光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统可以通过抑制SOST基因和DKK-1基因加强人成骨能力；
图12是本发明中靶向抑制SOST和DKK-1基因的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统可以显著促进小鼠骨折愈合的体内试验结果图；造模后第14天，右1：治疗组骨痂明显，骨折线模糊，左侧3组可见明显骨折线；造模后第21天，右1：治疗组骨折局部可见骨痂吸收，骨折线基本消失，左侧三组：其余三组骨折线仍可见；以上表明治疗组骨折愈合显著加快。
具体实施方式
下面结合附图和试验例对本发明做进一步的说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本申请基于EsCas13d-crRNA复合物晶体结构(PBD编号：6E9E)，对RfxCas13d蛋白酶(序列如SEQ ID NO.13所示)进行同源建模及结构分析(Protein Homology/analogYRecognition Engine V2.0)，在非功能性区域将RfxCas13d蛋白酶分为N端与C端两部分，即Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分，双组分光控系统分为X部分和Y部分，并将Cas13d蛋白酶的Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分分别与X部分和Y部分相连，得到游离失活的Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白，如图1所示，构建基于光遗传技术的分割型CRISPR/Cas13d系统。其中Cas13d蛋白酶可选择的切割位点为N84、E248、S342、F405、G437、K582、G641、K657、K683、A877中任意之一，除了试验例1之外，其他试验例中使用的均为RfxCas13d蛋白从K582位点分割开得到Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分。
所述双组分光控系统可以为CIBN-CRY2PHR、pMagnet-nMagnet、iLID-SspB、BphP1-PpsR2、PhyB-PIF、BphP1-Q-PAS1光敏蛋白对中任意之一。在本申请中试验例中采用的是CIBN-CRY2PHR光敏蛋白对，即将光敏蛋白CIBN及CRY2PHR分别与Cas13d蛋白酶的Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分相连，得到Cas13d(N)-CIBN蛋白和Cas13d(C)-CRY2PHR蛋白。
本申请中使用的靶向crRNA包括靶向目标基因的向导序列和与Cas13d蛋白酶相结合的骨架序列，其中本申请中CRISPR/Cas13d基因编辑系统中使用的骨架序列如SEQ IDNO.11所示。
本申请所使用的RfxCas13d蛋白酶(包括Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分)、光敏蛋白CIBN及CRY2PHR、Cas13d(N)-CIBN蛋白和Cas13d(C)-CRY2PHR蛋白、以及crRNA-1～crRNA-10质粒均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
试验例1：筛选Cas13d蛋白酶最优切割位点
本申请中的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统中，在未经光照射的条件下Cas13d蛋白酶分为两部分Cas13d(N)-CIBN蛋白、Cas13d(C)-CRY2PHR蛋白，互相游离而处于失活状态；在蓝光(波长470nm)照射条件下，CIBN与CRY2PHR相互作用发生结合，Cas13d(N)-CIBN蛋白、Cas13d(C)-CRY2PHR蛋白形成完整具有功能的Cas13蛋白酶，从而特异性的敲低靶基因的表达。
以293T细胞(中国科学院细胞库，货号：SCSP-502)为研究对象，以96孔板为例，细胞密度70-80％，使用Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：11668019)共转染Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA-2(靶向萤火虫萤光素酶，向导序列如SEQ ID NO.2所示)及pmirGLO双荧光素酶报告载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P0198)，(四质粒质量比为1：1：1：1，总质量0.4ug，Lipofectamine 2000体积1ul)，比较不同Split-Cas13位点的RNA敲低功能(图3)。
细胞转染24小时后，予以470nm蓝光(0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，48小时后使用双萤光素酶报告基因检测系统(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：E1960)检测报告基因活性，比较分析不同位点黑暗与光照条件下萤火虫荧光素酶表达差异(Fluc)，筛选Cas13d蛋白分割的最佳位点。
验证试验分12组进行，其中10组的RfxCas13d蛋白酶切割位点分别为N84、E248、S342、F405、G437、K582、G641、K657、K683、A877，另外还有一组完整Cas13d蛋白酶对照组和一组空载体对照组，实验结果如图4所示。从实验结果图中可以看出黑暗与光照条件比较，不同切割位点的Cas13d活性均有统计学差异，其中K582位点统计学差异最为显著，黑暗条件下靶基因的表达是光照条件下的6.2倍，取此位点进行后续验证。
试验例2：验证光控分割型Cas13d系统RNA敲低功能
以293T细胞为研究对象，使用包含Lipofectamine 2000和不同靶向crRNA的转染液对细胞进行转染。以96孔板为例，转染液中包含Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA质粒质量比为1：1：2，总质量0.4ug，Lipofectamine2000体积1ul。
其中靶向crRNA选用靶向内源性mRNA CXCR4的crRNA-3(向导序列为SEQ IDNO.3)、靶向内源性mRNA ANXA4的crRNA-4(向导序列为SEQ ID NO.4)和靶向内源性LncRNA-HOTTIP的crRNA-5(向导序列为SEQ ID NO.5)，本试验例中设计靶向两种不同类型内源性RNA以验证光控分割型Cas13d系统RNA敲低功能的通用性。
细胞接受转染24小时后，蓝光光照48小时(波长470nm，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，收取细胞提取RNA，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测靶基因的表达改变，qRT-PCR使用诺唯赞逆转录(货号：R312-02)及qPCR(货号:Q111-02)试剂盒，引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供(纯化方式：HAP)。
表1.qRT-PCR实验引物
Figure BDA0003589987540000071
实验结果如图5所示，光控分割型Cas13d系统在光照条件下能够显著抑制内源性靶基因CXCR4、ANXA4和LncRNA-HOTTIP的表达。
试验例3：光控分割型Cas13d系统于可以实现时间-空间特异性RNA敲低功能，且脱靶现象较少。
1.时间特异性
以293T细胞为研究对象，使用Lipofectamine 2000转染光控分割型Cas13d系统，靶向内源性mRNA CXCR4 crRNA-3序列为SEQ ID NO.3。以96孔板为例，Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA质粒质量比为1：1：2，总质量0.4ug，Lipofectamine 2000体积1ul。
如图6所示，在96孔板接种293T细胞，16小时后细胞密度约70-80％，使用上述条件进行转染，转染24小时后，分别给与不同时长相同光照条件的光照处理(光照条件：470nm蓝光，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，收取细胞提取RNA，qRT-PCR检测靶基因的表达改变，引物序列见表1。
实验结果如图7所示，光控分割型Cas13d系统能够时间特异性敲低内源性靶基因的表达，光控分割型Cas13d时间特异性靶向敲低CXCR4。图7A中可以看出随光照时间延长，CXCR4表达逐渐降低；图7B中可以看出光照12h后撤除光源，CXCR4表达经36h逐渐恢复至正常水平。
2.空间特异性
以293T细胞为研究对象，使用Lipofectamine 2000转染光控分割型Cas13d系统、mCherry报告基因载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号:P0151)以及靶向mCherrymRNA序列的crRNA-10(向导序列为SEQ ID NO.10)。以6孔板为例，Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA及mCherry报告基因载体质量比为1：1：1：1，总质量4ug，Lipofectamine2000体积10ul。
实验条件：细胞转染24小时后，部分细胞予以470nm蓝光光照48小时(0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，而后通过共聚焦显微镜观察mCherry表达分布状态，如图8所示，光照区域细胞mCherry表达显著减少，表明光控分割型Cas13d系统可以空间特异性敲低靶基因表达。
3.脱靶现象少
以293T细胞为研究对象，使用光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统与传统siRNA技术分别靶向敲低CXCR4表达，通过RNA测序比较光控分割型Cas13d系统与传统siRNA技术的脱靶现象。
实验条件：光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统：与本试验例中“时间特异性”小节中相同。
传统siRNA技术：人源CXCR4 siRNA购自上海拓然生物科技有限公司(向导序列为SEQ ID NO.12)。涉及siRNA实验均需在无RNA酶、无菌条件下进行，以6孔板为例，使用siRNA120pmol，Lipofectamine 2000体积10ul。细胞转染24小时后，细胞予以蓝光光照48小时，而后收取细胞行RNA测序，分析整体mRNA表达改变(测序实验由北京诺禾致源科技股份有限公司进行)。
实验结果：图9可以看出光控分割型Cas13d系统与传统siRNA均能够显著沉默靶基因CXCR4表达，但siRNA非特异性作用明显高于光控Cas13d系统。
试验例4：光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在促进骨组织的成骨能力中的应用
进行体外实验以验证本发明建立的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统能够靶向抑制SOST和DKK-1基因表达，从而显著促进骨组织的成骨能力。
在体外实验中，以小鼠成骨样细胞MC3T3-E1为研究模型(购自中国科学院细胞库，货号：GNM15)，利用光控CRISPR/Cas13d系统靶向抑制SOST和DKK-1基因的表达。
实验条件：以6孔板为例，细胞密度达到70％-80％时，使用Lipofectamine 2000进行转染，Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA-6(向导序列为SEQ ID NO.6，靶向小鼠骨硬化蛋白)、crRNA-8(向导序列为SEQ ID NO.8，靶向小鼠DKK-1)载体质量比为1：1：1：1，总质量4ug，Lipofectamine 2000体积10ul。转染24小时后换成骨诱导培养基(α-MEM+50μg/ml维生素C，5mMβ-甘油磷酸盐及100nM地塞米松)，并予以黑暗或蓝光光照(470nm蓝光，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，十四天后进行茜素红染色。茜素红可以将组织细胞的钙盐成分着色，从而分析骨组织的成骨能力。
由图10可以看出，光控CRISPR/Cas13d靶向抑制SOST基因和DKK-1基因后，成骨细胞茜素红阳性染色显著增强，表明成骨能力加强。
试验例5：光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在促进人干细胞成骨分化中的应用
进行体外实验以验证本发明建立的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统能通过靶向抑制SOST和DKK-1基因表达促进人干细胞的成骨分化能力。
在体外实验中，以骨髓来源的人间充质干细胞为研究模型(购自中国科学院细胞库，货号：SCSP-405)，利用光控CRISPR/Cas13d系统靶向抑制SOST基因和DKK-1基因的表达。
实验条件：以6孔板为例，细胞密度达到70％-80％时，使用Lipofectamine 2000进行转染，Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA-7(SEQ ID NO.7，靶向人骨硬化蛋白)、crRNA-9(SEQ ID NO.9，靶向人DKK-1)载体质量比为1：1：1：1，总质量4ug，Lipofectamine 2000体积10ul。转染24小时后换成骨诱导培养基(α-MEM+50μg/ml维生素C，5mMβ-甘油磷酸盐及100nM地塞米松)，并予以黑暗或不同时长蓝光光照(470nm蓝光，0.02mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环)，十四天后进行茜素红染色。
由图11可以看出，随着光照时间延长，光控CRISPR/Cas13d系统靶向抑制SOST基因和DKK-1基因的表达，能够促进人间充质干细胞成骨分化能力增强。
试验例6：体内实验以验证光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备治疗骨折的药物中的用途
取6-8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠(天津市奥臣实验动物销售有限公司)共40只，体质量18-25g。将小鼠随机分为4组(骨折模型组，骨折+单独Cas13d组，骨折+单独光照组，骨折+光+Cas13d组)，每组10只，使用1％戊巴比妥钠1mL/kg腹腔注射，待小鼠完全麻醉后，备皮、消毒小鼠右下肢，在小鼠右侧膝关节下切开约0.5cm纵行切口，由膑腱处插入0.3mm髓内固定针，于胫骨中上1/3处分离肌肉及筋膜，使用锯片锯断胫骨骨干后立即使用0.9％生理盐水冲洗胫骨表面，再将髓内固定针完全插入并对合。逐层缝合切口，制成小鼠右侧胫骨干骨折模型。术后清洁环境下单笼饲养，室温22-26℃，湿度50％，定期消毒与排风。常规给水及饮食，小鼠可自由活动。Cas13d干预组在造模第0、7及第14天，于骨折局部注射负载光控CRISPR/Cas13d系统的功能化上转换纳米颗粒(购自西安瑞禧生物科技有限公司，货号：R-GMR048)，Cas13d(N)-CIBN、Cas13d(C)-CRY2PHR、crRNA-6、crRNA-8载体质量比为1：1：1：1，总质量10ug，功能化上转换纳米颗粒20ug，均匀混合溶于100ul生理盐水溶液中。上转换纳米颗粒兼具活体递送及光遗传元件激活功能，能将具有组织穿透性的980nm近红外光转换为470nm蓝光，在活体骨组织内激活光控CRISPR/Cas13d系统；光照组在造模后第一天开始980nm近红外光照射(13mW/mm2，3s光照/60s黑暗循环，2小时/天)。于造模后第7、14、21天行X线检查，评估骨折愈合情况。
由图12可以看出，光控CRISPR/Cas13d靶向抑制SOST和DKK-1基因可以显著促进骨折愈合。造模后第14天，治疗组骨痂明显，骨折线模糊(右1)，其余三组可见明显骨折线(左侧3组)；第21天，治疗组骨折局部可见骨痂吸收(右1)，骨折线基本消失，其余三组骨折线仍可见(左侧3组)，表明治疗组骨折愈合显著加快。
本具体实施方式的试验例均为本发明的较佳试验例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津市天津医院
<120> 基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的基因编辑方法、组合物及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaccagaag cgtaccatac tcacgaacag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcacccaaca cgggcatgaa gaactgcaag 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgataatg caatagcagg acaggatga 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattaggcag ccctcatcag tgccggctcc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agggataggg gctcctaaat gcagtccaag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcagcgtgc acaagtaggc agatgaggca 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcggcagctg tactcggaca cgtctttggt 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agaactgagt tcaaggtggc actggctcct 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcacaacaca atcctgaggc acagtctgat 30
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatggtctt cttctgcatt acgggg 26
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aacccctacc aactggtcgg ggtttgaaac 30
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctaatttc aataaaatct tcc 23
<210> 13
<211> 967
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ile Glu Lys Lys Lys Ser Phe Ala Lys Gly Met Gly Val Lys Ser
1 5 10 15
Thr Leu Val Ser Gly Ser Lys Val Tyr Met Thr Thr Phe Ala Glu Gly
20 25 30
Ser Asp Ala Arg Leu Glu Lys Ile Val Glu Gly Asp Ser Ile Arg Ser
35 40 45
Val Asn Glu Gly Glu Ala Phe Ser Ala Glu Met Ala Asp Lys Asn Ala
50 55 60
Gly Tyr Lys Ile Gly Asn Ala Lys Phe Ser His Pro Lys Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Val Val Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Thr Gly Pro Val Gln Gln Asp Met
85 90 95
Leu Gly Leu Lys Glu Thr Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Gly Glu Ser Ala
100 105 110
Asp Gly Asn Asp Asn Ile Cys Ile Gln Val Ile His Asn Ile Leu Asp
115 120 125
Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Tyr Ile Thr Asn Ala Ala Tyr Ala Val
130 135 140
Asn Asn Ile Ser Gly Leu Asp Lys Asp Ile Ile Gly Phe Gly Lys Phe
145 150 155 160
Ser Thr Val Tyr Thr Tyr Asp Glu Phe Lys Asp Pro Glu His His Arg
165 170 175
Ala Ala Phe Asn Asn Asn Asp Lys Leu Ile Asn Ala Ile Lys Ala Gln
180 185 190
Tyr Asp Glu Phe Asp Asn Phe Leu Asp Asn Pro Arg Leu Gly Tyr Phe
195 200 205
Gly Gln Ala Phe Phe Ser Lys Glu Gly Arg Asn Tyr Ile Ile Asn Tyr
210 215 220
Gly Asn Glu Cys Tyr Asp Ile Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Arg His
225 230 235 240
Trp Val Val His Asn Asn Glu Glu Glu Ser Arg Ile Ser Arg Thr Trp
245 250 255
Leu Tyr Asn Leu Asp Lys Asn Leu Asp Asn Glu Tyr Ile Ser Thr Leu
260 265 270
Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ile Thr Asn Glu Leu Thr Asn Ser Phe Ser
275 280 285
Lys Asn Ser Ala Ala Asn Val Asn Tyr Ile Ala Glu Thr Leu Gly Ile
290 295 300
Asn Pro Ala Glu Phe Ala Glu Gln Tyr Phe Arg Phe Ser Ile Met Lys
305 310 315 320
Glu Gln Lys Asn Leu Gly Phe Asn Ile Thr Lys Leu Arg Glu Val Met
325 330 335
Leu Asp Arg Lys Asp Met Ser Glu Ile Arg Lys Asn His Lys Val Phe
340 345 350
Asp Ser Ile Arg Thr Lys Val Tyr Thr Met Met Asp Phe Val Ile Tyr
355 360 365
Arg Tyr Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn Lys Ser
370 375 380
Leu Pro Asp Asn Glu Lys Ser Leu Ser Glu Lys Asp Ile Phe Val Ile
385 390 395 400
Asn Leu Arg Gly Ser Phe Asn Asp Asp Gln Lys Asp Ala Leu Tyr Tyr
405 410 415
Asp Glu Ala Asn Arg Ile Trp Arg Lys Leu Glu Asn Ile Met His Asn
420 425 430
Ile Lys Glu Phe Arg Gly Asn Lys Thr Arg Glu Tyr Lys Lys Lys Asp
435 440 445
Ala Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Asp Val Ser Ala
450 455 460
Phe Ser Lys Leu Met Tyr Ala Leu Thr Met Phe Leu Asp Gly Lys Glu
465 470 475 480
Ile Asn Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn Ile Gln
485 490 495
Ser Phe Leu Lys Val Met Pro Leu Ile Gly Val Asn Ala Lys Phe Val
500 505 510
Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Lys Asp Ser Ala Lys Ile Ala Asp Glu Leu
515 520 525
Arg Leu Ile Lys Ser Phe Ala Arg Met Gly Glu Pro Ile Ala Asp Ala
530 535 540
Arg Arg Ala Met Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ile Leu Gly Thr Asn Leu
545 550 555 560
Ser Tyr Asp Glu Leu Lys Ala Leu Ala Asp Thr Phe Ser Leu Asp Glu
565 570 575
Asn Gly Asn Lys Leu Lys Lys Gly Lys His Gly Met Arg Asn Phe Ile
580 585 590
Ile Asn Asn Val Ile Ser Asn Lys Arg Phe His Tyr Leu Ile Arg Tyr
595 600 605
Gly Asp Pro Ala His Leu His Glu Ile Ala Lys Asn Glu Ala Val Val
610 615 620
Lys Phe Val Leu Gly Arg Ile Ala Asp Ile Gln Lys Lys Gln Gly Gln
625 630 635 640
Asn Gly Lys Asn Gln Ile Asp Arg Tyr Tyr Glu Thr Cys Ile Gly Lys
645 650 655
Asp Lys Gly Lys Ser Val Ser Glu Lys Val Asp Ala Leu Thr Lys Ile
660 665 670
Ile Thr Gly Met Asn Tyr Asp Gln Phe Asp Lys Lys Arg Ser Val Ile
675 680 685
Glu Asp Thr Gly Arg Glu Asn Ala Glu Arg Glu Lys Phe Lys Lys Ile
690 695 700
Ile Ser Leu Tyr Leu Thr Val Ile Tyr His Ile Leu Lys Asn Ile Val
705 710 715 720
Asn Ile Asn Ala Arg Tyr Val Ile Gly Phe His Cys Val Glu Arg Asp
725 730 735
Ala Gln Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Tyr Asp Ile Asn Leu Lys Lys Leu
740 745 750
Glu Glu Lys Gly Phe Ser Ser Val Thr Lys Leu Cys Ala Gly Ile Asp
755 760 765
Glu Thr Ala Pro Asp Lys Arg Lys Asp Val Glu Lys Glu Met Ala Glu
770 775 780
Arg Ala Lys Glu Ser Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ala Asn Pro Lys Leu
785 790 795 800
Tyr Ala Asn Tyr Ile Lys Tyr Ser Asp Glu Lys Lys Ala Glu Glu Phe
805 810 815
Thr Arg Gln Ile Asn Arg Glu Lys Ala Lys Thr Ala Leu Asn Ala Tyr
820 825 830
Leu Arg Asn Thr Lys Trp Asn Val Ile Ile Arg Glu Asp Leu Leu Arg
835 840 845
Ile Asp Asn Lys Thr Cys Thr Leu Phe Arg Asn Lys Ala Val His Leu
850 855 860
Glu Val Ala Arg Tyr Val His Ala Tyr Ile Asn Asp Ile Ala Glu Val
865 870 875 880
Asn Ser Tyr Phe Gln Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Ile Ile Met
885 890 895
Asn Glu Arg Tyr Glu Lys Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Tyr Phe Asp
900 905 910
Ala Val Asn Asp Glu Lys Lys Tyr Asn Asp Arg Leu Leu Lys Leu Leu
915 920 925
Cys Val Pro Phe Gly Tyr Cys Ile Pro Arg Phe Lys Asn Leu Ser Ile
930 935 940
Glu Ala Leu Phe Asp Arg Asn Glu Ala Ala Lys Phe Asp Lys Glu Lys
945 950 955 960
Lys Lys Val Ser Gly Asn Ser
965

Claims (10)

1.一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统，其特征在于：包括分割型Cas13d蛋白酶、由X部分和Y部分构成的双组分光控系统以及靶向crRNA；
所述分割型Cas13d蛋白酶包括Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分，所述Cas13d(N)与Cas13d(C)分别与双组分光控系统分中的X部分和Y部分相连形成Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白；
所述靶向crRNA包括靶向目标基因的向导序列和与Cas13d蛋白酶相结合的骨架序列。
2.根据权利要求1所述的一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统，其特征在于：所述Cas13d(N)与Cas13d(C)由Cas13d蛋白酶从位于非功能区的切割位点分割开得到。
3.根据权利要求1所述的一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统，其特征在于：所述双组分光控系统为光敏蛋白对：CIBN-CRY2PHR、pMagnet-nMagnet、iLID-SspB、BphP1-PpsR2、PhyB-PIF、BphP1-Q-PAS1中的任意之一。
4.根据权利要求1所述的一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统，其特征在于：所述靶向crRNA的向导序列为SEQ ID NO.1-10中的任意之一。
5.一种如权利要求1中所述的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统对细胞内的靶序列进行基因编辑的非治疗方法，其特征在于：在未受到光刺激的条件下Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白互相游离，失活的存在于细胞内；在受到光刺激条件下，Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白形成完整具有功能的Cas13d核酸酶，与靶向crRNA结合，特异性的敲低靶基因的表达。
6.一种包含如权利要求1所述的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统的试剂盒，所述试剂盒用于对细胞内的靶序列进行基因敲低、编辑和检测。
7.一种药物组合物，其特征在于：包括分割型Cas13d蛋白酶、由X部分和Y部分构成的双组分光控系统、靶向crRNA以及药物载体；
所述分割型Cas13d蛋白酶包括Cas13d(N)与Cas13d(C)两部分，所述Cas13d(N)与Cas13d(C)分别与双组分光控系统分中的X部分和Y部分相连形成Cas13d(N)-X蛋白和Cas13d(C)-Y蛋白；
所述靶向crRNA包括靶向目标基因的向导序列和与Cas13d蛋白酶相结合的骨架序列；
所述药物载体为脂质体、纳米颗粒载体、阳离子多聚物载体及病毒递送载体中的一种或多种；
所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
8.一种如权利要求1所述的包含光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备促进骨组织的成骨能力的产品中的应用。
9.一种如权利要求1所述的光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备治疗骨折的药物的用途。
10.根据权利要求9所述的一种光控型CRISPR/Cas13d基因编辑系统在制备治疗骨折的药物的用途，其特征在于，所述靶向crRNA靶向的目的基因为SOST基因和/或DKK-1基因，所述靶向crRNA的向导序列为：SEQ ID NO.6-9中的任意一种或多种组合。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170298330A1 (en) * 2015-04-13 2017-10-19 The University Of Tokyo Set of Polypeptides Exhibiting Nuclease Activity or Nickase Activity with Dependence on Light or in Presence of Drug or Suppressing or Activating Expression of Target Gene
CN111041049A (zh) * 2019-12-04 2020-04-21 江苏大学 一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a系统制备方法及其应用
CN111206053A (zh) * 2019-10-23 2020-05-29 马信龙 基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及应用
CN111748583A (zh) * 2020-07-17 2020-10-09 池嘉栋 一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统
CN112852868A (zh) * 2020-04-22 2021-05-28 天津市天津医院 一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用
WO2021167994A1 (en) * 2020-02-17 2021-08-26 The Regents Of The University Of California Light-inducible gene activation systems and methods for making and using them

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170298330A1 (en) * 2015-04-13 2017-10-19 The University Of Tokyo Set of Polypeptides Exhibiting Nuclease Activity or Nickase Activity with Dependence on Light or in Presence of Drug or Suppressing or Activating Expression of Target Gene
CN111206053A (zh) * 2019-10-23 2020-05-29 马信龙 基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及应用
CN111041049A (zh) * 2019-12-04 2020-04-21 江苏大学 一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a系统制备方法及其应用
WO2021167994A1 (en) * 2020-02-17 2021-08-26 The Regents Of The University Of California Light-inducible gene activation systems and methods for making and using them
CN112852868A (zh) * 2020-04-22 2021-05-28 天津市天津医院 一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用
CN111748583A (zh) * 2020-07-17 2020-10-09 池嘉栋 一种基于CRISPR/dCas9的诱导型DNA甲基化编辑系统

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHAO J等: "Photoactivatable RNA N6 -Methyladenosine Editing with CRISPR-Cas13", 《SMALL》, vol. 16, no. 30, pages 1 - 8 *
刘红等: "光控CRISPR技术的研究进展", 《高等学校化学学报》, vol. 42, no. 11, pages 3321 - 3333 *
蓝丽婷等: "光诱导CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的研究进展", 《国际药学研究杂志》, vol. 44, no. 03, pages 215 - 219 *

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