CN112852868A - 一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用，包括功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接元件，功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接元件和向导元件；其中，刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合；与刺激响应蛋白C和D连接的功能蛋白A与功能蛋白B为待连接蛋白，功能蛋白A与功能蛋白B中的一个或两个为Cpf1。本发明的有益效果是将光遗传学与DNA编辑相结合，实现了DNA编辑的精准时空调控，通过建立一种基于CRISPR/Cpf1的响应型基因编辑系统和方法，可以实现基因编辑和转录调控的条件性启动和关闭，从而降低脱靶率，这对于基因编辑领域具有重大意义和研究价值。

Description

一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是重要的遗传信息载体，携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。基因编辑技术是一种新兴的能对生物体DNA进行精准修饰的基因工程技术，以CRISPR/Cas9为代表的第3代基因编辑技术可以对特定基因位点进行敲除、敲入、单碱基替换等操作，成本低廉，正在成为基础研究和临床应用的主流技术。目前，有大量研究对CRISPR系统进行了进一步拓展和优化，进而构建出多种能够应用于哺乳动物细胞的基因编辑工具，其中Cpf1(即Cas12)与Cas9相比优势明显，包括：Cpf1基因通常小于Cas9，有利于转染或病毒包装；Cpf1依赖5’T富集的PAM序列，在基因组中频率更高，可编辑位点更多；Cpf1切割DNA后会产生粘性末端，而Cas9切割后产生平末端，前者更有利于基因敲入；Cpf1脱靶率更低，更为安全；Cpf1同时具有crRNA加工活性和核酸内切酶活性，可以一次性导入靶向多个基因的crRNA array，同时对多个靶点进行编辑，比Cas9更为简便。所以CRISPR/Cpf1等新型基因编辑系统对于研究特定基因的功能发挥至关重要的作用。但基因编辑技术的重点在于精准，实现基因编辑的时间和空间特异性对于这项技术的进一步发展必不可少。CRISPR/Cpf1系统进入细胞后会对基因组发生持续性的编辑效应，目前的基因编辑技术无法对其活性进行精准调控，可能造成严重的脱靶现象。

近年来智能响应型系统和合成生物学技术快速发展，如光、声、温度及化学小分子刺激响应的生物调控体系，同时兼备时间、空间及可逆性操控的特点。因此，结合目前条件响应型体系，建立可控型CRISPR基因编辑系统，对于研究复杂的分子功能及生物学表型将具有重要意义。前期研究已经报道了光响应、化学小分子响应及温度响应的CRISPR/Cas9基因编辑和转录调控系统，进一步发展能够精准调控的CRISPR/Cpf1系统是目前的研究重点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统及其应用。

本发明采用的技术方案是：一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，包括功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接元件，功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接元件和向导元件；

刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合；

功能蛋白A与功能蛋白B为待连接蛋白，功能蛋白A与功能蛋白B中的至少一个为Cpf1或部分Cpf1。

其中，功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接得到靶向元件，功能蛋白A为失活型AsCpf1(catalytically dead AsCpf1,dAsCpf1)；

功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接得到编辑效应元件，功能蛋白B为DNA编辑效应蛋白。

优选地，DNA编辑效应蛋白为作用于DNA的特异性效应分子；

优选地，DNA编辑效应蛋白为转录激活元件、转录抑制元件、腺嘌呤碱基编辑元件(ABE)、胞嘧啶碱基编辑元件(CBE)、DNA去甲基化酶或甲基化酶、组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶中的一种。

其中，功能蛋白A与功能蛋白B分别为将AsCpf1分割形成的N端和C端。

优选地，刺激作用为光刺激；

优选地，光刺激的光为蓝光、紫外光、近红外或绿光；

优选地，刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D为能够相互配对的光敏蛋白。

优选地，刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D为CIB1与CRY2、pMag与nMag、PhyB与PIF3、BphP1与PpsR2、BphP1与Q-PAS1和UVR8与COP1中的一种；

优选地，CIB1为截短体CIBN；

优选地，CRY2为截短体CRY2PHR。

优选地，导向元件为Cpf1向导RNA。

基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统在光控DNA转录调控中的应用，基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统为光控转录激活系统Optic-CRISPR-Activin或光控转录抑制系统Optic-CRISPR-Rep。

优选地，功能蛋白A为dAsCpf1，功能蛋白B为转录激活元件或转录抑制元件；

优选地，转录激活元件为sp65×3-HSF；转录抑制元件为KRAB×3。

基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统在AsCpf1活性控制中的应用。

本发明具有的优点和积极效果是：将光遗传学与DNA编辑相结合，实现了DNA编辑的精准时空调控，通过建立一种基于CRISPR/Cpf1的响应型基因编辑系统和方法，可以实现基因编辑和转录调控的条件性启动和关闭，从而降低脱靶率，这对于基因编辑领域具有重大意义和研究价值。

附图说明

图1.Optic-Split-AsCpf1系统质粒组成示意图；

图2.Optic-Split AsCpf1 HDR途径基因编辑效应检测示意图；

图3.Optic-split-AsCpF1系统HDR修复荧光素酶表达结果，其中，Empty：转染空载体对照；(+)：蓝光；(-)：黑暗；N＝3，**p<0.01；

图4.Optic-split-AsCpf1空间特异性NHEJ途径基因编辑效应检测示意图；

图5.Optic-split-AsCpf1空间特异性NHEJ途径基因编辑效应结果；

图6.Optic-split-AsCpf1 NHEJ途径编辑内源性基因DNMT1、GRIN2b、FANCF结果，其中，(+)：蓝光；(-)：黑暗；N＝3，**p<0.01；

图7.Optic-split-AsCpf1系统时间依赖性编辑内源性基因DNMT1结果，其中，N＝3；

图8.Optic-CRIPSR-Activin系统质粒组成示意图；

图9.Optic-CRISPR-Rep系统质粒组成示意图；

图10.Optic-CRISPR-Activin系统激活内源性基因表达，其中，D：黑暗；L：蓝光；Empty：转染空载体对照；Activin：转染Optic-CRISPR-Activin靶向目的基因；(+)：转染阳性对照dAsCpf1-Activin融合蛋白靶向目的基因；N＝3，**p<0.01；

图11.Optic-CRISPR-Rep系统抑制内源性基因表达，其中，D：黑暗；L：蓝光；Empty：转染空载体对照；Rep：转染Optic-CRISPR-Rep靶向目的基因；(+)：转染阳性对照dAsCpf1-Rep融合蛋白靶向目的基因；N＝3，**p<0.01；

图12.Optic-CRISPR-Activin系统空间特异性激活mCherry表达。

具体实施方式

目前的基因编辑技术无法对其活性进行精准调控，CRISPR/Cpf1系统进入细胞后会对基因组发生持续性的编辑效应，可能造成严重的脱靶现象。针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于CRISPR/Cpf1的DNA编辑系统及其应用，通过将光遗传学与DNA编辑相结合，构建了基于CRISPR/Cas系统的光控DNA编辑系统，实现了DNA编辑的精准时空调控，使基因编辑和转录调控的条件性启动和关闭，从而降低脱靶率。

基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，包括功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接元件，功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接元件和向导元件；功能蛋白A与功能蛋白B为待连接蛋白，刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合，从而实现功能蛋白A与功能蛋白B之间的靶向连接和分离。功能蛋白A与功能蛋白B中的一个或两个为Cpf1。导向元件为Cpf1向导RNA。

刺激作用可以为光刺激，具体为蓝光、紫外光、近红外或绿光；刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D为能够相互配对的光敏蛋白。例如刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D为CIB1(或为截短体CIBN)与CRY2(或CRY2为截短体CRY2PHR)、pMag与nMag、PhyB与PIF3、BphP1与PpsR2、BphP1与Q-PAS1和UVR8与COP1中的一种。

本发明某些实施例中，功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接得到靶向元件，功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接得到编辑效应元件，功能蛋白A可以为dAsCpf1，功能蛋白B可以为DNA编辑效应蛋白，形成CRISPR-dAsCpf1的DNA编辑系统，DNA编辑效应蛋白具体可为作用于DNA的特异性效应分子，如为转录激活元件、转录抑制元件、腺嘌呤碱基编辑元件(ABE)、胞嘧啶碱基编辑元件(CBE)、DNA去甲基化酶或甲基化酶、组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶中的一种。

以转录激活/抑制为例，构建基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统为光控转录激活系统Optic-CRISPR-Activin或光控转录抑制系统Optic-CRISPR-Rep，功能蛋白A为dAsCpf1，功能蛋白B为转录激活元件sp65×3-HSF或转录抑制元件KRAB×3；在哺乳动物细胞内验证光控CRISPR/AsCpf1系统进行转录调控的可行性，由此推广，通过更换不同DNA编辑效应元件，可以实现不同类型DNA编辑的精准时空调控。

本发明某些实施例中，功能蛋白A与功能蛋白B分别为将AsCpf1分割形成的N端和C端。通过分析AsCpf1-crRNA-target DNA晶体结构(PDB：5B43)，确定控制AsCpf1活性的分割位点，将AsCpf1分为N端和C端两部分，黑暗条件下两部分各自游离从而抑制AsCpf1功能，在刺激下刺激响应蛋白C与刺激响应蛋白D发生相互作用，使AsCpf1两部分重新组装成完整结构从而发挥NHEJ或HDR途径基因编辑功能。

下面通过具体实施例对本方案做出进一步说明。

实施例1

1.1Optic-split-AsCpf1系统的构建

Optic-split-AsCpf1由三质粒系统组成，如图1所示，先通过分析AsCpf1-crRNA-target DNA晶体结构(PDB：5B43)，确定控制AsCpf1活性的分割位点，将AsCpf1分为N端和C端两部分，分别连接在蓝光刺激下能够相互作用的CIBN与CRY2PHR上，利用全基因合成的方法构建SV40NLS-Flag-AsCpf1N端-CRY2PHR和CIBN-HA-AsCpf1 C端-SV40NLS序列，并使用无缝克隆技术克隆进入pCDNA3.1⁺载体CMV启动子下游中。AsCpf1 crRNA克隆在人源U6启动子下游并由U6启动表达。

Optic-split-AsCpf1系统在黑暗条件下两部分各自游离从而抑制AsCpf1功能，在蓝光照射下发生相互作用，使AsCpf1两部分重新组装成完整结构从而发挥功能。本实施例中蓝光响应光敏蛋白CIBN与CRY2PHR可替换为其他波长光敏蛋白或化学分子、温度等其他刺激响应的蛋白元件，从而实现智能响应型基因编辑。1.2Optic-split-AsCpf1基因编辑系统验证

以HEK293T为细胞模型，将Optic-split AsCpf1系统组分瞬时转染进入细胞中并进行如下实验：

1.Optic-split-AsCpf1同源直接修复(HDR)效应检测

构建荧光素酶报告基因载体，将荧光素酶编码区R69突变为终止密码子，评估Optic-split-AsCpF1系统HDR修复荧光素酶表达效率,确定光控Optic-split-AsCpf1最佳分割位点。具体实验设计如图2所示，构建报告基因载体，在Luciferase编码区引入终止密码子使其翻译过程提前终止而无法发挥正常生物活性，而在蓝光照射条件下，AsCpf1恢复完整结构和活性，对Luciferase序列进行编辑使其正常表达。将Optic-split-AsCpF1体系、Luciferase修复模板和报告基因载体共转染进入HEK293T细胞中，转染24h后予以蓝光照射(0.02mW/mm²)48h，然后检测Luciferase活性恢复情况，评估Optic-split-AsCpf1系统HDR途径基因编辑效率。如图3所示，结果表明在585K、664G、776K和1232T位点将AsCpf1分为N端和C端两部分，四个分割位点均可有效控制AsCpf1 HDR途径基因编辑活性，其中776K位点效果最明显。因此，选择效果最佳的split-AsCpf1776K位点用于后续进一步试验。

2.Optic-split-AsCpf1空间特异性非同源末端链接(NHEJ)效应检测

构建mCherry-DNMT1序列-GFP融合报告基因，DNMT1序列3’端有终止密码子，未经过编辑时下游GFP无法表达。当AsCpf1在DNMT1基因序列特定位点切割后，DNA会以NHEJ方式修复，开放阅读框序列随机移码使GFP能够正常表达，从而可以通过GFP表达水平评估Optic-split-AsCpF1系统的作用及空间特异性。具体实验设计如图4所示，将Optic-split-AsCpf1体系、GFP报告基因载体共转染进入HEK293T细胞中，使用锡箔纸遮挡特定区域后予以蓝光照射(0.02mW/mm²)刺激48h检测GFP表达情况，评估Optic-split-AsCpf1系统NHEJ途径基因编辑效率。结果如图5所示，光照区域GFP明显表达，而黑暗区域GFP不表达，说明Optic-split-AsCpf1(776K)可以实现光控空间特异性NHEJ途径基因编辑。

3.Optic-split-AsCpf1内源性基因编辑效率检测

在HEK293T细胞中，转染Optic-split-AsCpf1系统，以DNMT1、GRIN2b、FANCF为靶点，转染24h后蓝光照射(0.02mW/mm²)48h通过T7E1实验评估Optic-split-AsCpF1系统NHEJ途经编辑内源性基因效率。

其中，各靶点序列如下：

DNMT1 crRNA序列：CCTCACTCCTGCTCGGTGAATTT，

T7E1实验上游引物：AGCCCGAGA GAGTGCCTCAGGT，

下游引物：CCACACATGTGAACGGACAGATTG AC；

GRIN2b crRNA序列：GTGC TCAA TGAAAGGAGATAAGG，

T7E1实验上游引物：GCATACTCGCATGGCTACCT，

下游引物：TAAA A AGGGGCTGCAGGGAG；

FANCF crRNA序列：GGCGGGGTCCAGTTC CGGGATTA，

T7E1实验上游引物：GCCCTACATCTGCTCTCCC TCC，

下游引物：CAGCAACTCTTTC CCGGCCC。

结果如图6所示，Optic-split-AsCpf1(776K)系统可以有效编辑内源性基因DNMT1、GRIN2b和FANCF发生Indel mutation。

4.Optic-split-AsCpf1时间特异性作用检测：

在HEK293T细胞中，转染Optic-split-AsCpf1系统，以DNMT1为靶点，分别给予细胞6h、12h、24h、48h蓝光刺激，通过T7E1实验评估Optic-split-AsCpF1系统基因编辑的时间特异性作用。结果如图7所示，DNMT1基因Indel mutation频率随光照时间延长而增加，证明Optic-split-AsCpf1(776K)系统能够以时间依赖性方式对内源性DNMT1基因进行编辑。

实施例2：

2.1Optic-CRIPSR-Activin系统的构建

Optic-CRISPR-Activin由三质粒系统组成，如图8所示，AsCpf1 D908A和E993E突变使其失去核酸内切酶活性但保留crRNA加工活性，因此称为dead AsCpf1(dAsCpf1)，同样采用蓝光刺激下能够相互作用的CIBN与CRY2PHR上，利用全基因合成方法构建CIBN-SV40NLS-FLAG-dAsCpf1-CIBN-NLS融合蛋白作为靶向元件，另一方面，将CRY2PHR与转录激活分子sp65×3-HSF1融合作为效应元件。AsCpf1 crRNA克隆在人源U6启动子下游并由U6启动表达。

黑暗条件下，crRNA引导dAsCpf1蛋白到基因组指定位置，但激活元件游离于细胞核中；在蓝光照射下，CIBN募集CRY2PHR同时携带激活元件到指定位置，激活基因转录。

2.2Optic-CRISPR-Rep系统的构建

Optic-CRISPR-Rep与Optic-CRIPSR-Activin组成类似，如图9所示，区别在于激活元件替换为转录抑制元件KRAB×3，因此在蓝光照射条件下可以抑制基因的转录过程。

转录激活元件可替换为腺嘌呤碱基编辑元件(ABE)；胞嘧啶碱基编辑元件(CBE)；DNA去甲基化酶或甲基化酶；组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶等作用于DNA的特异性效应分子，从而实现不同类型的特异性基因编辑。

2.3Optic-CRIPSR转录调控系统验证

以HEK293T为细胞模型，将Optic-CRISPR-Activin/Rep元件瞬时转染进入HEK293T细胞中进行如下实验。

1.Optic-CRISPR-Activin系统激活内源性基因转录水平检测

选取ASCL1、HBG1及IL1RN1作为靶基因，构建同时靶向三个基因的AsCpf1crRNAarray，

ASCL1 crRNA靶向序列：CAAGGAGCGGGAGAAAGGAA C；

HBG1 crRNA靶向序列：TATCTCAATGCAAATATCTGTCT；

IL1RN1 crRNA靶向序列：TGCTAGCCTGAGTCACCCTCCTG。

转染24h后，予以蓝光刺激48h，通过qRT-PCR分析靶基因表达情况，结果表明Optic-CRISPR-Activin系统能够有效促进靶基因的表达。如图10所示，光照条件下Optic-CRISPR-Activin系统调控基因转录的能力与阳性对照(dAsCpf1-Activitor)相比无显著差别，而在黑暗条件Optic-CRISPR-Activin系统对于基因转录水平无显著影响。

2.Optic-CRISPR-Rep系统抑制内源性基因转录水平检测

选取RAB7A、RAB9A及FZD1作为靶基因，构建AsCpf1 crRNA array，

RAB7A crRNA靶向序列：GTCTCCTCCTCGGCGGGAGC；

RAB9A crRNA靶向序列：GTACTCGCTGTCGCCCGAAC；

FZD1 crRNA靶向序列：TGCCTGAGTA GTGCCACCAC。

转染24h后，予以蓝光刺激48h，通过qRT-PCR分析靶基因表达情况，结果如图11所示，Optic-CRISPR-Rep系统能够有效抑制靶基因的表达。

3.Optic-CRISPR系统时空特异性作用检测

构建mCherry报告基因，利用Optic-CRISPR-Activin系统靶向调控Tet-On诱导型启动子-mCherry表达质粒，给予蓝光照射刺激，激活mCherry表达，明确Optic-CRISPR系统的空间特异性作用。实验结果如图12所示，Optic-CRISPR-Activin系统能以空间特异性方式激活mCherry表达。

上述实施例中均使用了CRY2PHR与CIBN这对光敏蛋白，建立了蓝光响应的DNA编辑系统，由此推广，蓝光响应光敏蛋白可替换为其他波长光敏蛋白，从而实现智能响应型转录激活；通过更换不同的光敏蛋白，可以实现不同波长调控的DNA编辑系统，如紫外、近红外、绿光等。同时，将光敏蛋白更换为化学小分子、温度、机械作用或其他刺激响应的蛋白分子，该系统可以推广为不同刺激响应的条件性DNA编辑系统。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：包括功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接元件，功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接元件和向导元件；

所述刺激响应蛋白C与所述刺激响应蛋白D能够在刺激作用下相互结合，刺激作用消失后解除结合；

所述功能蛋白A与所述功能蛋白B为待连接蛋白，所述功能蛋白A与所述功能蛋白B中的至少一个为Cpf1或部分Cpf1。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：功能蛋白A与刺激响应蛋白C连接得到靶向元件，功能蛋白A为失活型AsCpf1；

功能蛋白B与刺激响应蛋白D连接得到编辑效应元件，功能蛋白B为DNA编辑效应蛋白。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：所述DNA编辑效应蛋白为作用于DNA的特异性效应分子；

优选地，所述DNA编辑效应蛋白为转录激活元件、转录抑制元件、腺嘌呤碱基编辑元件、胞嘧啶碱基编辑元件、DNA去甲基化酶或甲基化酶、组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶中的一种。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：功能蛋白A与功能蛋白B分别为将AsCpf1分割形成的N端和C端。

5.根据权利要求1-4中任一所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：所述刺激作用为光刺激；

优选地，所述光刺激的光为蓝光、紫外光、近红外或绿光；

优选地，所述刺激响应蛋白C与所述刺激响应蛋白D为能够相互配对的光敏蛋白。

6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：所述刺激响应蛋白C与所述刺激响应蛋白D为CIB1与CRY2、pMag与nMag、PhyB与PIF3、BphP1与PpsR2、BphP1与Q-PAS1和UVR8与COP1中的一种；优选地，CIB1为截短体CIBN；

优选地，CRY2为截短体CRY2PHR。

7.根据权利要求1-4中任一所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统，其特征在于：所述导向元件为Cpf1向导RNA。

8.权利要求1-3和5-7中任一所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统在光控DNA转录调控中的应用，其特征在于：基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统为光控转录激活系统Optic-CRISPR-Activin或光控转录抑制系统Optic-CRISPR-Rep。

9.根据权利要求8所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统在光控DNA转录调控中的应用，其特征在于：功能蛋白A为dAsCpf1，功能蛋白B为转录激活元件或转录抑制元件；

优选地，所述转录激活元件为sp65×3-HSF；所述转录抑制元件为KRAB×3。

10.权利要求4-7中任一所述的基于CRISPR/Cpf1的响应型DNA编辑系统在AsCpf1活性控制中的应用。

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