JP2018522544A - 熱安定性cas9ヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
a.アミノ酸モチーフEKDGKYYC[配列番号2];および/または
b.アミノ酸モチーフX1X2CTX3X4[配列番号3](式中、X1はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、X2はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、X3はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、X4はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの1つである);および/または
c.アミノ酸モチーフX5LKX6IE[配列番号4](式中、X5はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、X6はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される);および/または
d.アミノ酸モチーフX7VYSX8K[配列番号5](式中、X7はグルタミン酸またはイソロイシンであり、X8はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの1つである);および/または
e.アミノ酸モチーフX9FYX10X11REQX12KEX13[配列番号6](式中、X9はアラニンまたはグルタミン酸であり、X10はグルタミンまたはリシンであり、X11はアルギニンまたはアラニンであり、X12はアスパラギンまたはアラニンであり、X13はリシンまたはセリンである)
を含む、単離されたCas(CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat:クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し)associated:CRISPR関連)タンパク質またはポリペプチドを提供する。
本発明のCasタンパク質のヌクレアーゼ活性の最適温度範囲を含む温度範囲は、既知のCas9タンパク質よりも著しく高い。その上、本発明のCasタンパク質がヌクレアーゼ活性を保持する範囲の最上方は、既知のCas9タンパク質よりもはるかに高い。より高い最適温度および機能範囲は高温での遺伝子工学に、したがって、例えば、好熱性生物のゲノムの編集に著しい利点を与え、この好熱性生物の多くが高温で行われる様々な工業、農業および製薬工程において有用性がある。
本発明のCasタンパク質は、高温での標的核酸の配列特異的切断、タグ付け、標識付けまたは改変を可能にする。標的核酸は、DNA(一本鎖または二本鎖)でもRNAでも合成核酸でもよい。本発明の特に有用な応用は、ゲノムDNAの標的配列に相補的に結合する1つまたは複数のガイドRNA(gRNA)と複合した本発明の1つまたは複数のCasタンパク質によるゲノムDNAの配列特異的ターゲティングおよび改変である。したがって、標的核酸は好ましくは二本鎖DNAである。そのようなターゲティングはin vitroでもin vivoでも実施することができる。好ましくは、そのようなターゲティングはin vivoで実施される。この方法で、本発明のCasタンパク質を使用して細胞のゲノムDNAに位置する特定のDNA配列を標的にして改変することができる。Cas系を使用して、異なる生物の種々の細胞型でおよび/または異なる生物でゲノムを改変することができることが想定されている。
有利なことに、任意のポリヌクレオチド配列を配列特異的に標的にする本発明のCasタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質複合体の能力は、何らかの方法で、例えば、標的核酸を切断および/または標識および/または修飾することにより、標的核酸を改変するために利用することができる。したがって、これを達成するためにはCasタンパク質またはポリペプチドと共に追加のタンパク質を提供してもよいことが認識されよう。したがって、本発明のCasタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体は、少なくとも1つのさらなるタンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供されてもよい。好ましい態様では、本発明は、Casタンパク質または少なくとも1つのさらなるタンパク質が少なくとも1つの機能的部分をさらに含む、Casタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。少なくとも1つの機能的部分は、Casタンパク質に融合または連結していてもよい。好ましくは、少なくとも1つの機能的部分は、天然のまたは人工的タンパク質発現系での発現を通じてCasタンパク質に翻訳によって融合してもよい。代わりに、少なくとも1つの機能的部分は、化学合成ステップによりCasタンパク質に共有結合によって連結してもよい。好ましくは、少なくとも1つの機能的部分は、Casタンパク質のN終端および/またはC終端、好ましくはN終端に融合または連結している。
本発明の任意の態様のCasリボ核タンパク質は、50℃と100℃の間で核酸切断活性を有する。本発明のリボ核タンパク質は、DNA、RNAまたは合成核酸を切断することができる。好ましい態様では、本発明のCasリボ核タンパク質は、DNAを、特に二本鎖DNAを配列特異的に切断することができる。
a.アミノ酸モチーフEKDGKYYC[配列番号2];および/または
b.アミノ酸モチーフX1X2CTX3X4[配列番号3](式中、X1はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、X2はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、X3はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、X4はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの1つである);および/または
c.アミノ酸モチーフX5LKX6IE[配列番号4](式中、X5はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、X6はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される);および/または
d.アミノ酸モチーフX7VYSX8K[配列番号5](式中、X7はグルタミン酸またはイソロイシンであり、X8はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの1つである);および/または
e.アミノ酸モチーフX9FYX10X11REQX12KEX13[配列番号6](式中、X9はアラニンまたはグルタミン酸であり、X10はグルタミンまたはリシンであり、X11はアルギニンまたはアラニンであり、X12はアスパラギンまたはアラニンであり、X13はリシンまたはセリンである)
を含むCasタンパク質であって、
少なくとも1つのターゲティングRNA分子、およびターゲティングRNA分子により認識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると50℃と100℃の間でDNAを切断することができるCasタンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。
本発明の核酸は単離されていてもよい。しかし、核酸感知構築物の発現が選ばれた細胞で実行されうるように、Casタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、発現構築物中に提供されている。いくつかの実施形態では、Casタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターの一部として提供されることになる。ある特定の実施形態では、本発明の発現ベクター(発現するとCasタンパク質に融合するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列ありまたはなしで)は、上文に定義されているターゲティングRNA分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。したがって、そのような発現ベクターを適切な宿主で使用して、所望のヌクレオチド配列を標的にすることが可能な本発明のリボ核タンパク質複合体を産生することができる。代わりに、上文に定義されるターゲティングRNA分子をコードするヌクレオチド配列は別の発現ベクターで提供してもよく、または代わりに他の手段によって標的細胞に送達してもよい。
a.上文で定義されるリボ核タンパク質複合体、または
b.上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体および上文で定義されるRNA分子
と接触させることを含む方法を提供する。
a.dsDNA分子で二本鎖切断を作るステップと、
b.非相同末端結合(NHEJ)により細胞中でdsDNA分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
a.所望の遺伝子座で二本鎖切断を作るステップと、
b.相同組換えにより細胞中でdsDNA分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
有利なことに、本発明は広範な適用性があり、本発明の宿主細胞は、培養することが可能であるいかなる遺伝的に扱いやすい生物に由来してもよい。したがって、本発明は上文に記載される方法により形質転換される宿主細胞を提供する。
驚くべきことに、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)は、嫌気性条件下でリグノセルロース基質を分解することができる好熱菌についての±500単離菌のライブラリーの探索中に発見された。当初、±500単離菌のライブラリーが確立され、これはセルロースおよびキシラン上での単離により数回の選択ラウンド後に、110単離菌にまで削減された。110単離菌のこのライブラリーはゲオバチルス(Geobacillus)単離菌のみからなり、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)がライブラリーの79%を占めていた。
以下のデータベース探索および整列が実施された。
pBLASTおよびnBLASTは社内BLASTサーバーで実施し、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)T12のタンパク質または遺伝子配列を問い合わせ配列として使用した。このデータベースは2014年5月に最後にアップデートされ、したがって、最も最近に追加されたゲオバチルス(Geobacillus)ゲノムを含有していないが、通常のオンラインBLASTはT12配列の公開を防ぐために使用されなかった。これの最も関連性の高い配列である、社内pBLASTのエクセルフォーマットでの結果は添付物1を参照されたい(40%よりも大きな配列同一性は図1に含まれている)。
上記整列されたタンパク質配列のパーセント同一性は図1に与えられている。T12−Cas9はII−C型に属している。II−C型系の最もよく研究され、最近結晶化された構造はアクチノマイセス・ネスランディ(Actinomyces naeslundii)由来である(Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997)。このタンパク質配列はT12−Cas9に対して20%の同一性しか示していないが、高度に保存された残基を推定するのに使用することが可能である。2つの十分に特徴付けられているII−A型系(化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)およびストレプトコッカス・サーモフィルス(S. thermophilus))も分析に含まれた(Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997;Nishimasu et al., 2014, Cell 156: 935-949)。これら4つのタンパク質配列の整列は図3に示されており、図4はアクチノマイセス・ネスランディ(A. naeslundii)について決定されたタンパク質構成(「Ana−Cas9」)を示している(Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997)。T12およびアクチノマイセス・ネスランディ(Actinomyces naeslundii)由来のCas9の長さは極めて類似しており(アクチノマイセス・ネスランディ(A. naeslundii)1101アミノ酸、T12 1082アミノ酸)、T12は類似するタンパク質構成を有すると予想されるが、Cas9−Anaに対する全体の配列同一性が20%にすぎないために、これはまだ確定されていない。Jinek et al.(Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997)により記載されているアクチノマイセス・ネスランディ(A. naeslundii)および化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)由来のCas9中の活性部位残基はすべてT12−Cas9において同定することができた(図3参照)。PAM結合ドメインは化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)II−A型系については決定されているが、いかなるII−C型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)配列においてのみ示されている。さらに、PAM認識部位は、CRISPR系間だけでなく、同じ系を含有する種間でも大きく変化する。PAMに関するさらなる情報については、問題点4および将来計画を参照されたい。
原核生物CRISPR系が適応免疫系としてその宿主に役立ち(Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821)、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能であること(Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963)は確立されている。
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)T12菌株のCRISPR II遺伝子座由来の2つの異なるスペーサーを、鋳型としてゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)T12ゲノムDNAを使用してPCRにより増幅させた。2対の縮重プライマーをそれぞれのスペーサーの増幅のために使用した。
一般公開されているいかなるCas9タンパク質にも今日まで温度範囲実験は実行されたことがない。研究で使用されるCas9タンパク質はすべて中温性起源を有し、宿主生物化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(ATCC_700294)で最大成長温度45℃である。
Claims (37)
- 配列番号1のアミノ酸配列またはそれと少なくとも77%の同一性の配列を有する、単離されたCasタンパク質またはポリペプチド断片であって、前記Casタンパク質が、標的核酸配列を認識する少なくとも1つのRNA分子と会合すると、50℃と100℃の間で前記標的配列を含むポリヌクレオチドを切断することができる、単離されたCasタンパク質またはポリペプチド断片。
- 50℃と75℃の間で、好ましくは60℃より上で、より好ましくは60℃と80℃の間で、さらにより好ましくは60℃と65℃の間で核酸を切断することができる、請求項1に記載のCasタンパク質またはポリペプチド断片。
- 前記核酸の切断がDNAの切断である、請求項1または請求項2に記載のCasタンパク質またはポリペプチド断片。
- 前記Casタンパク質が細菌、古細菌またはウイルスから入手可能である、請求項1から3のいずれかに記載のCasタンパク質またはポリペプチド断片。
- 前記Casタンパク質がゲオバチルス(Geobacillus)属種から、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス(Geobacillus thermodenitrificans)から入手可能である、請求項1から4のいずれかに記載のCasタンパク質またはポリペプチド断片。
- 請求項1から5のいずれかに記載のCasタンパク質を含み、標的ポリヌクレオチド中の配列を認識する少なくとも1つのターゲティングRNA分子を含む、リボ核タンパク質複合体。
- 前記ターゲティングRNA分子がcrRNAおよび任意選択でtracrRNAを含む、請求項6に記載のリボ核タンパク質複合体。
- 前記少なくとも1つのRNA分子の長さが35〜135ヌクレオチド残基の範囲である、請求項6または請求項7に記載のリボ核タンパク質複合体。
- 前記標的配列が31または32ヌクレオチド残基長である、請求項6または請求項7に記載のリボ核タンパク質複合体。
- 前記タンパク質またはポリペプチドが、少なくとも1つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供される、請求項1から5のいずれかに記載のCasタンパク質もしくはポリペプチドまたは請求項6から9のいずれかに記載のリボ核タンパク質複合体。
- 前記Casタンパク質もしくはポリペプチドおよび/または前記少なくとも1つのさらなるタンパク質が少なくとも1つの機能的部分をさらに含む、請求項10に記載のCasタンパク質、ポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- 前記少なくとも1つの機能的部分が、前記Casタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体のN終端および/またはC終端、好ましくはN終端に融合または連結している、請求項11に記載のCasタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- 前記少なくとも1つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、DNAメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写(共)活性化因子、転写リプレッサー、DNA結合タンパク質、DNA構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択される、請求項11または請求項12に記載のCasタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- Cas9ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、Casタンパク質が少なくとも1つの機能的部分に連結している、請求項13に記載のCasタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- 前記少なくとも1つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはFokIヌクレアーゼドメインである、請求項13または請求項14に記載のCasタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- 前記少なくとも1つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項13から15のいずれかに記載のCasタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
- 配列番号1のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも77%の同一性の配列を有するCas(CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat:クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し)associated:CRISPR関連)タンパク質、またはそのポリペプチド断片をコードする単離された核酸分子。
- 翻訳されると前記Casタンパク質またはポリペプチドと融合するアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの核酸配列をさらに含む、請求項17に記載の単離された核酸分子。
- 前記Casタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に融合する前記少なくとも1つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、DNAメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写(共)活性化因子、転写リプレッサー、DNA結合タンパク質、DNA構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタンパク質をコードする、請求項18に記載の単離された核酸分子。
- 請求項17から19のいずれかに記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 少なくとも1つのターゲティングRNA分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項20に記載の発現ベクター。
- 標的核酸を改変する方法であって、前記核酸を、
a.請求項6から9のいずれかに記載のリボ核タンパク質複合体、または
b.請求項10から16のいずれかに記載のタンパク質またはタンパク質複合体および請求項4から9のいずれかに記載の少なくとも1つのターゲティングRNA分子
と接触させることを含む方法。 - 細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を請求項21に記載の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに前記細胞を請求項20に記載の発現ベクターおよび請求項4から9のいずれかに記載のターゲティングRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入することを含む方法。
- 細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を請求項20に記載の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入し、次いで、請求項4から9のいずれかに記載のターゲティングRNA分子を前記細胞に、または前記細胞内に送達することを含む方法。
- 請求項22から24のいずれかに記載の標的核酸を改変する方法であって、前記少なくとも1つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、前記マーカータンパク質またはレポータータンパク質が前記標的核酸と会合し、好ましくは前記マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、方法。
- 前記標的核酸がDNA、好ましくはdsDNAである、請求項22から25のいずれかに記載の方法。
- 前記標的核酸がRNAである、請求項22から25のいずれかに記載の方法。
- 請求項26に記載の標的核酸を改変する方法であって、前記核酸がdsDNAであり、前記少なくとも1つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法。
- 請求項23、24、26または28に記載の方法のいずれかに従って所望の遺伝子座で遺伝子発現をサイレンシングする方法。
- 請求項23、24、26または28に記載の方法のいずれかに従って所望の位置で所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および/もしくは挿入する方法。
- 請求項22から26のいずれかに記載の方法に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がdsDNAであり、前記機能的部分がDNA修飾酵素(例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ)、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法。
- 請求項27に記載の方法に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がmRNAであり、前記機能的部分がリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレアーゼ、3’エキソヌクレアーゼまたは5’エキソヌクレアーゼから選択される、方法。
- 50℃と100℃の間の温度で実行される、請求項22から32のいずれかに記載の標的核酸を改変する方法。
- 60℃または60℃より上、好ましくは60℃と80℃の間、より好ましくは60℃と65℃の間の温度で実行される、請求項33に記載の標的核酸を改変する方法。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項22から34のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項22から35のいずれかに記載の方法。
- 請求項22から33のいずれかに記載の方法により形質転換される宿主細胞。
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