CN108559732A - 基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组定点修饰技术建立KI‑T2A‑luciferase细胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技术在基因组上mmp12基因的3’端原位整合入T2A‑luciferase报告基因，建立了MMP12‑T2A‑luciferase的knock‑in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对mmp12有激活作用的转录因子STAT3对MMP12‑T2A‑luciferase细胞系进行转录激活，结果表明MMP12‑T2A‑luciferase细胞系内的luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内MMP12蛋白表达水平。该细胞系的建立将有助于mmp12基因功能研究及筛选影响mmp12表达的小分子化学药物，为癌细胞的迁移及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

Description

基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A- luciferase细胞系的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及利用CRISPR/Cas9介导的靶向基因 组插入技术建立细胞系，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰 技术建立HEK293-MMP12-KI-T2A-luciferase细胞系的新方法，用于监测内 源性mmp12表达活性，可以用于对mmp12有作用的药物筛选。
背景技术
CRISPR/Cas9技术由细菌和古细菌中存在的II型CRISPR/Cas9获得性 免疫系统经人工改造而成，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编 辑。该系统是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通过碱基配对与 trans-activating RNA结合形成复合物，Cas9内切酶在此复合物引导下对与 crRNA配对的序列进行定点切割。所以，通过人工设计具有引导作用的与 目标DNA片段匹配的sgRNA(single guide RNA)，可以引导Cas9蛋白对宿主细胞基因组进行识别并发生定点切割，然后通过非同源末端连接 (non-homologousend joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因靶向编辑。
传统报告基因系统一般通过体外克隆目标基因的启动子来驱动报告基 因的表达，检测基因的表达调控主要是通过RT-PCR、Western Blot和将目 标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。 RT-PCR过程繁琐且不稳定，Western Blot抗体标记费时昂贵，这些都不利 于高通量筛选；由于基因组本身存在表观遗传学修饰，将启动子克隆到携带 报告基因的表达检测载体中的方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准 确反映基因组上基因表达情况。
而利用CRISPR/Cas9技术，将报告基因靶向性插入到目标基因下游， 使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实 的转录水平。与锌指核酸内切酶(Zinc finger endonuclease，ZFN)以及类转 录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease， TALEN)相比，CRISPR/Cas9技术具有构建方法简单快捷、突变效率高、 成本低廉、安全直观、适用范围广的优点，不仅普遍应用于探索构建分子通 路的分子生物学实验，而且越来越广泛用于筛选药物所构建的细胞系。
发明内容
本发明的目的在于，利用CRISPR/Cas9技术，提供一种基于CRISPR/Cas9 靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的新方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细 胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：
1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：
在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下 游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后 获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对 打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打 靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；
2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：
将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体， 获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA；
3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor：
所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor的结构为 两部分，其中：
第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；
第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的 T2A-luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)KEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立：
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的 pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA与8μg的打靶载体 pUC19/MMP12-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL 的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待 细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进 行luciferase活性检测；选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定 并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组， 最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系；
5)克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体 pUC19/CMV-STAT3，该表达载体pUC19/CMV-STAT3被用于mmp12基因 的转录激活实验研究；
6)验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中luciferase表达变 化是否能够真实反映内源性mmp12基因的相对表达量及表达变化；使用所 构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3 分别转染HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞 系，并对HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性及 HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中luciferase表达活性与HEK293细胞中mmp12的mRNA表 达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞 系中的luciferase活性是否能够准确反映MMP12分子的相对表达变化。
根据本发明，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA引物为针对mmp12 的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：
MMP12-sgRNA1序列为：CTCTAAGTAGTGGTACACTG；
MMP12-sgRNA2序列为：GGTAACACCACTTGTGTCCT；
MMP12-sgRNA3序列为：CTAGGCTACACACAACCCCA；
MMP12-sgRNA4序列为：GCATGGTAAGCACATCATTC。
进一步地，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。
本发明的基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase 细胞系的新方法，具有如下优点：
采用CRISPR/Cas9技术在基因组上mmp12基因的3’端原位整合入 T2A-luciferase报告基因，建立了MMP12-T2A-luciferase的knock-in细胞系， 并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对 mmp12有激活作用的转录因子STAT3对MMP12-T2A-luciferase细胞系进行 转录激活，结果表明MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系内的luciferase表达水 平可以准确灵敏地反映细胞系内mmp12分子表达水平。
该细胞系的建立将有助于mmp12基因功能研究及筛选影响mmp12表达 的小分子化学药物，为癌细胞的迁移及其相关研究提供一种新的实验思路及 解决方案。同时，通过在靶基因下游整合入报告基因来检测靶基因表达的方 法也可广泛应用于其它各种基因的相关研究。
附图说明
图1是携带sgRNA及Cas9的表达载体结构示意图。
图2是打靶Donor载体结构示意图。
图3是所建立的KI-T2A-luciferase细胞系的结构示意图。
图4是细胞正负筛选稳定后倒置荧光显微镜下观察结果图，其中(A) 图为白光图，(B)图为荧光图。
图5是对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的luciferase活性检 测图。
图6是对有luciferase活性的单克隆细胞PCR检测电泳图。其中(A) 图为PCR结果显示克隆化后所得高luciferase活性的阳性克隆分别有野生型 大小条带和整合型大小条带两条带，(B)图为显示对上下游同源臂进行PCR 分别得到2.0kb和1.3kb的目的条带。
图7是对MMP12-T2A-luciferase细胞克隆化后所得3号克隆的野生型 大小条带和整合型大小条带的PCR产物和上、下游同源臂大小条带的PCR 产物分别进行胶回收测序结果。其中(A)图是获得单一稳定的 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系，(B)图是上游同源臂测序结果， (C)图是下游同源臂测序结果。
图8是转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3转染 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系后luciferase的检测结果。
图9是转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3转染野生型 HEK293细胞系后，mmp12分子的mRNA表达水平的检测结果。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立 KI-T2A-luciferase细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9系统在特定位置 产生双链切口(DSBs)，在Cas9-sgRNA组分中加入一个供体载体(Donor DNA)，Donor DNA上带有靶向位点侧翼的同源序列，DSBs的修复会以供 体DNA为模板进行，进而将特定片段插入到目的基因的基因组特定位置上。
利用该方法，luciferase基因可以被定点整合到mmp12基因下游，在自 剪切小肽T2A介导下，与mmp12基因同时受mmp12启动子调控转录起始， 实现了内源性靶基因mmp12活性与luciferase酶活性直接相关。从而可以利 用此细胞系筛选对mmp12基因具有转录调控作用的上游转录因子或者活性 小分子药物。
HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立方法，包括筛选靶向 mmp12基因3′非编码区的sgRNA；构建携带Cas9、靶向mmp12基因的 sgRNA的打靶载体；构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体； 将打靶载体与打靶供体共同导入HEK293细胞用筛选基因筛选，将筛选稳定 后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行luciferase活性检测，并 进行PCR鉴定后测序；证明携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点 处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细 胞系；证明在该靶向性报告系统中，报告基因与目标基因的活性直接相关； 证明该报告系统能够在上游转录因子及小分子活性药物筛选中发挥作用。
具体按以下步骤实施：
1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：
在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下 游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后 获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对 打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打 靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；
2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：
将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体， 获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA；
3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor：
所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor结构为两 部分，其中：
第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；
第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的 T2A-luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)KEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立：
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的 pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA与8μg的pUC19/MMP12-donor 共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天， 待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对 细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行luciferase活性检 测。选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧 光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的 HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系；
5)克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体 pUC19/CMV-STAT3，该表达载体pUC19/CMV-STAT3将被用于mmp12基 因的转录激活实验研究；
6)验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中luciferase表达变 化是否可以真实反映内源性mmp12基因的相对表达量及表达变化；使用所 构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3 分别转染HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞 系，并对HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性及 HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中luciferase表达活性与HEK293细胞中mmp12的mRNA 表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细 胞系中的luciferase活性是否可以准确反映MMP12分子的相对表达变化。
本实施例中，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA引物为针对mmp12 的终止密码子下游设计的sgRNA引物，其中：
MMP12-sgRNA1引物序列为：CTCTAAGTAGTGGTACACTG；
MMP12-sgRNA2引物序列为：GGTAACACCACTTGTGTCCT；
MMP12-sgRNA3引物序列为：CTAGGCTACACACAACCCCA；
MMP12-sgRNA4引物序列为：GCATGGTAAGCACATCATTC。
本实施例中，所述的打靶Donor和Cas9-sgRNA表达载体共转染的细胞 系为人胚肾细胞系HEK293。
本实施例的基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立 KI-T2A-luciferase细胞系的方法，涉及两个关键载体构建，一个是表达 sgRNA及Cas9的表达载体，另一种是包含上下游同源臂的打靶Donor载体。 其中：
所提供的表达sgRNA及Cas9的表达载体是将sgRNA表达组件和Cas9 基因克隆至同一个表达载体所构建。
所提供的打靶Donor载体，是将打靶断裂位点上游835bp和其下游 1112bp的两段序列分别作为打靶载体的上下游同源臂，再将其与申请人实 验室保存的T2A-luciferase报告基因、正筛元件CMV-eGFP-T2A- Neomycin-SV40pA及负筛元件PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA分别连接到 pU19表达载体中所构建。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1：靶向目的基因mmp12的终止密码子下游sgRNA引物的设计、合 成及载体构建
(1)选取mmp12基因的终止密码子下游作为打靶区(TSF)，长度大 约为1000bp；
(2)在TSF区找出所有NGG及其前12位碱基在NCBI进行Blast，筛 选出与目标序列完全匹配并且唯一匹配的序列(若无符合要求的NGG，反 向查找CCN)，减少潜在脱靶位点；
本实施例针对mmp12的终止密码子下游设计了4个sgRNA引物，序列 如下：
MMP12-sgRNA1引物序列为：CTCTAAGTAGTGGTACACTG；
MMP12-sgRNA2引物序列为：GGTAACACCACTTGTGTCCT；
MMP12-sgRNA3引物序列为：CTAGGCTACACACAACCCCA；
MMP12-sgRNA4引物序列为：GCATGGTAAGCACATCATTC。
分别在四个MMP12-sgRNA for引物的5’加上ACCG得到正向寡核苷 酸，并且在其reverse引物的5’加上AAAC得到反向寡核苷酸，最终得到的 四个MMP12-sgRNA的for与reverse引物，MMP12-sgRNA的for与reverse 引物在擎科公司合成，各序列如下：
MMP12-sgRNA1 for：ACCGCTCTAAGTAGTGGTACACTG；
MMP12-sgRNA1 reverse：AAACCAGTGTACCACTACTTAGAG；
MMP12-sgRNA2 for：ACCGGGTAACACCACTTGTGTCCT；
MMP12-sgRNA2 reverse：AAACAGGACACAAGTGGTGTTACC；
MMP12-sgRNA3 for：ACCGCTAGGCTACACACAACCCCA；
MMP12-sgRNA3 reverse：AAACTGGGGTTGTGTGTAGCCTAG；
MMP12-sgRNA4 for：ACCGGCATGGTAAGCACATCATTC；
MMP12-sgRNA4 reverse：AAACGAATGATGTGCTTACCATGC；
将合成的正向和反向寡核苷酸室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，获得 sgRNA表达组件。
实施例2：表达sgRNA组件与Cas9基因的载体构建
(1)通过T7E1酶检测后，筛选出打靶效率高的sgRNA表达载体；
(2)将打靶效率高的sgRNA表达载体和Cas9的表达载体分别用Kpn Ⅰ和SpeⅠ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收后，将得到的 片段与载体连接，经过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将获得的克隆命名为 pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA(如图1所示)。
实施例3：构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor的构建
所构建的打靶载体包含打靶断裂位点上游835bp和其下游1112bp的两 段序列作为打靶载体的上下游同源臂，其中：
上游同源臂使用引物MMP12up arm ClaⅠfor序列
CATCGATGGTTGTCTAGCAGGCAGAGG、MMP12up arm SpeⅠ reverse序 列GACTAGTACAACCAAACCAGCTATTGC得到；
下游同源臂使用引物MMP12down arm SalⅠfor序列
CGTCGACTAACTCAGGAGGGAGGCGTT、MMP12down arm BglⅡ reverse序列AAGATCTAGTCCACAAGGTAGACAGTCCT得到。
再将其与本实验室保存的T2A-luciferase报告基因、正筛元件
CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA及负筛元件
PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA分别连接到pU19表达载体，将获得的载体 命名为pUC19/MMP12-donor(如图2所示)。
实施例4：对克隆化后的细胞系进行PCR测序
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将实施例2和 实例3得到的载体以质量比4μg(pCMV-Cas9-SV40pA-U6- sgRNA3-SV40pA)：8μg(pUC19/MMP12-donor)配置，使用磷酸钙法共同 转染HEK293细胞，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待 细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，用倒 置荧光显微镜观察细胞eGFP的表达情况(图4，(A)图为白光图，(B) 图为荧光图)，之后对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的luciferase 活性检测(图5)，选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测 序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系。
PCR引物由擎科公司合成，序列为：
MMP12 integration detection for序列P1：序列为 TGACTGGCTGTTGGTAGACG；
MMP12 integration detection reverse序列P2：序列为 AACTACAGTTCTGGCAGGCT(引物在基因组上位置如图3箭头所示)。PCR结 果显示克隆化后所得高luciferase活性的阳性克隆分别有野生型大小条带和 整合型大小条带两条带(如图6(A)所示)。
选择克隆3号分别对其进行上游同源臂和下游同源臂的PCR鉴定，其 中：
上游同源臂PCR for引物P3：序列为GGCCCAGGATTTTTCCCTGA；
上游同源臂PCR reverse引物P4：序列为CGTCGGTAAAGGCGATGGT；
下游同源臂PCR for引物P5：序列为CCTCTACAAATGTGGTATGGCTGAT；
下游同源臂PCR reverse引物P2：序列为AACTACAGTTCTGGCAGGCT(引 物在基因组上位置如图3箭头所示)。
结果显示对上下游同源臂进行PCR分别得到2.0kb和1.3kb的目的条带 (如图6(B)所示)。
实施例5：TA克隆对克隆化后的细胞系进行测序
(1)分别将实例4获得的克隆3号的野生型大小条带和整合型大小条 带两条带的纯化产物3μL与0.5μL pGEM-T连接并转化大肠杆菌DH 5α感 受态细胞；挑取单克隆用引物T7序列TAATACGACTCACTATAGGG、引 物SP6序列ATTTAGGTGACACTATAG测序，测序结果表明携带荧光素酶 报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系(如图7(A)所示)。
(2)分别将实例4获得的克隆3号的上游同源臂大小条带和下游同源 臂大小条带两条带的纯化产物4μL与0.5μL pGEM-T连接并转化大肠杆菌 DH 5α感受态细胞；挑取单克隆用引物T7序列 TAATACGACTCACTATAGGG、引物SP6序列ATTTAGGTGACACTATAG 测序，上游同源臂测序结果如图7(B)所示，下游同源臂测序结果如图7 (C)所示，测序结果表明携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处 的正确重组，再次确定克隆3号是单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系。
实施例6：克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体
使用引物STAT3CDS KpnⅠfor序列AGGTACC ATGGCCCAATGGAATCAG、引物STAT3CDSXbaⅠ reverse序列 TTCTAGATCACATGGGGGAGGTAGCG得到mmp12基因的转录激活因子 STAT3，并构建转录激活因子STAT3的表达载体，经过酶切及测序鉴定获 得阳性克隆。将获得的克隆命名为pUC19/CMV-STAT3。
实施例7：验证所构建的细胞系中luciferase表达变化是否可以真实反映内 源性stat3基因的相对表达量及表达变化
使用所构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体 pUC19/CMV-STAT3分别转染所构建的knock-in细胞系和野生型HEK293 细胞系，所构建的knock-in细胞系中的luciferase活性检测(如图8所示) 和HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平检测(如图9所示)显 示，与对照组相比，实验组均有显著性增强，证实了所构建的knock-in细胞 系中的luciferase活性可以准确反映MMP12分子的相对表达变化，所建立 的细胞系命名为HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
<160>
<210> 1
<211> 20
<212> MMP12-sgRNA1引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
CTCTAAGTAGTGGTACACTG
<210> 2
<211> 20
<212> MMP12-sgRNA2引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
GGTAACACCACTTGTGTCCT
<210> 3
<211> 20
<212> MMP12-sgRNA3引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
CTAGGCTACACACAACCCCA
<210> 4
<211> 20
<212> MMP12-sgRNA4引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
GCATGGTAAGCACATCATTC
<210> 5
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA1 for引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGCTCTAAGTAGTGGTACACTG
<210> 6
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA1 reverse引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACCAGTGTACCACTACTTAGAG
<210> 7
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA2 for引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGGGTAACACCACTTGTGTCCT
<210> 8
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA2 reverse引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACAGGACACAAGTGGTGTTACC
<210> 9
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA3 for引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGCTAGGCTACACACAACCCCA
<210> 10
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA3 reverse 引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACTGGGGTTGTGTGTAGCCTAG
<210> 11
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA4 for引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGGCATGGTAAGCACATCATTC
<210> 12
<211> 24
<212> MMP12-sgRNA4 reverse引物序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACGAATGATGTGCTTACCATGC
<210> 13
<211> 27
<212> 上游同源臂使用引物MMP12 up arm ClaⅠfor序列
<213> DNA
<220>
<400>
CATCGATGGTTGTCTAGCAGGCAGAGG
<210> 14
<211> 27
<212> 上游同源臂使用引物MMP12 up arm SpeⅠreverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
GACTAGTACAACCAAACCAGCTATTGC
<210> 15
<211> 27
<212> 下游同源臂使用引物MMP12 down arm SalⅠfor序列
<213> DNA
<220>
<400>
CGTCGACTAACTCAGGAGGGAGGCGTT
<210> 16
<211> 29
<212> 下游同源臂使用引物MMP12 down arm Bgl Ⅱ reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAGATCTAGTCCACAAGGTAGACAGTCCT
<210> 17
<211> 20
<212> PCR引物MMP12 integration detection for序列P1
<213> DNA
<220>
<400>
TGACTGGCTGTTGGTAGACG
<210> 18
<211> 20
<212> PCR引物MMP12 integration detection reverse序列P2
<213> DNA
<220>
<400>
AACTACAGTTCTGGCAGGCT
<210> 19
<211> 20
<212>上游同源臂PCR for引物P3
<213> DNA
<220>
<400>
GGCCCAGGATTTTTCCCTGA
<210> 20
<211> 19
<212>上游同源臂reverse引物P4
<213> DNA
<220>
<400>
CGTCGGTAAAGGCGATGGT
<210> 21
<211> 25
<212>下游同源臂PCR for引物P5
<213> DNA
<220>
<400>
CCTCTACAAATGTGGTATGGCTGAT
<210> 22
<211> 20
<212>下游同源臂PCR reverse引物P2引物P5
<213> DNA
<220>
<400>
AACTACAGTTCTGGCAGGCT
<210> 23
<211> 20
<212>引物T7序列
<213> DNA
<220>
<400>
TAATACGACTCACTATAGGG
<210> 24
<211> 18
<212>引物SP6 T7序列
<213> DNA
<220>
<400>
ATTTAGGTGACACTATAG
<210> 25
<211> 25
<212>引物STAT3 CDS KpnⅠ for序列
<213> DNA
<220>
<400>
AGGTACC ATGGCCCAATGGAATCAG
<210> 26
<211> 26
<212>引物STAT3 CDS XbaⅠreverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
TTCTAGATCACATGGGGGAGGTAGCG

Claims (3)

1.一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：
1)筛选靶向mmp12基因3′非编码区的sgRNA：
在NCBI查找mmp12基因组序列，在目的基因mmp12的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA引物，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，转染HEK293细胞72小时后提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，将PCR产物变性退火后，利用T7E1酶检测其打靶效率，确定具有最高切割活性的sgRNA；
2)构建携带Cas9、sgRNA表达组件的真核表达载体：
将打靶效率高的sgRNA3表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA；
3)构建靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor：
所构建的靶向mmp12基因的打靶载体pUC19/MMP12-donor的结构为两部分，其中：
第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；
第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；
4)HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系的建立：
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNA3-SV40pA与8μg的打靶载体pUC19/MMP12-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行luciferase活性检测；选择luciferase活性高的克隆化细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系；
5)克隆并构建mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3，该表达载体pUC19/CMV-STAT3被用于mmp12基因的转录激活实验研究；
6)验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中luciferase表达变化是否能够真实反映内源性mmp12基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的mmp12基因的转录激活因子STAT3表达载体pUC19/CMV-STAT3分别转染HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性及HEK293细胞系中mmp12分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中luciferase表达活性与HEK293细胞中mmp12的mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-MMP12-T2A-luciferase-KI细胞系中的luciferase活性是否能够准确反映MMP12分子的相对表达变化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA引物为针对mmp12的终止密码子下游设计的sgRNA引物，其中：
MMP12-sgRNA1引物序列为：CTCTAAGTAGTGGTACACTG；
MMP12-sgRNA2引物序列为：GGTAACACCACTTGTGTCCT；
MMP12-sgRNA3引物序列为：CTAGGCTACACACAACCCCA；
MMP12-sgRNA4引物序列为：GCATGGTAAGCACATCATTC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。
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