JPWO2017090724A1 - Ｄｎａメチル化編集用キットおよびｄｎａメチル化編集方法 - Google Patents
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Abstract
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。
Description
本発明は、ＤＮＡメチル化編集用キットおよびＤＮＡメチル化編集方法に関するものである。
遺伝子DNAのシトシンのメチル化は遺伝子発現を制御するエピジェネティクス（エピゲノム）の代表的修飾である。特定の遺伝子のメチル化を制御できれば、癌などのエピゲノム疾患の解明やモデル作製、さらにはエピゲノム治療への応用が可能である。現在は、5-アザシトシンなどによるゲノム全体の脱メチル化を使った癌の治療が実用化されているが、すべての遺伝子に影響するので安全性に関しては疑問が残る。そのため、特定部位のメチル化を制御する技術の開発が望まれていた。
特定部位のメチル化を制御する技術としては、これまでに、脱メチル化に関与する酵素であるTET1の触媒部位とTALENを融合させたタンパク質を用いた、特定遺伝子の脱メチル化技術の報告がある（非特許文献１）。しかし、旧世代のゲノム編集技術TALENを用いているので、非常に手間がかかる上に、脱メチル化できる程度はそれほど高くなかった。
新世代のゲノム編集法としては、CRISPR/Cas（非特許文献２）を用いる方法が挙げられる。CRISPR/Cas ゲノム編集法としては、ペプチドエピトープが複数つながったアレイと、一本鎖抗体であるscFvを用いて、シグナル増幅に適用することは報告されているものの（非特許文献３）、当該方法をDNAメチル化の制御に適用することは知られていない。
Maeder ML et al. Nat Biotechnol, 31, 1137-1142, 2013
実験医学（羊土社）2014年7月号 第1690〜1714頁
Tanenbaum ME et al. Cell 159, 635−646, 2014
本発明は、上記の問題点に鑑み、DNAメチル化編集用キットおよびDNAメチル化編集方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、CRISPR/Cas ゲノム編集法を用いることにより、特定部位のメチル化を効果的に制御することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下を要旨とする。
［１］（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位（tag peptide binding portion）と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。
［２］前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位（TET1CD）である、［１］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［３］前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、［１］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［４］前記タグペプチドがペプチドエピトープであり、前記タグペプチド結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体である、［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［５］前記ペプチドエピトープがGeneral Control Non-derepressible 4（GCN4）ペプチドエピトープであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗GCN4ペプチドエピトープ抗体である、［４］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［６］前記ペプチドエピトープがHisタグまたはEEタグであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗Hisタグ抗体または抗EEタグ抗体である、［４］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［７］前記抗体が一本鎖抗体（scFv）である、［４］〜［６］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［８］前記タグペプチドがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり、前記タグペプチド結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである、［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［９］前記スプリットタンパク質がGFPである、［８］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［１０］前記タグペプチドがGVKESLVであり、前記タグペプチド結合部位がPDZ proteinである、［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１１］前記リンカーが５〜１００アミノ酸である、［１］〜［１０］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１２］前記リンカーが５〜５０アミノ酸である、［１］〜［１１］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１３］前記リンカーが１０〜５０アミノ酸である、［１］〜［１２］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１４］前記（１）および／または（２）の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、［１］〜［１３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１５］前記gRNAが複数である、［１］〜［１４］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１６］前記（１）〜（３）のDNAが全て一つのベクターに含まれている、［１］〜［１５］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［１７］下記（１）〜（３）を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法。
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA。
［１８］前記（１）および／または（２）の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、［１７］に記載のDNAメチル化編集方法。
［１９］前記選択マーカーを発現する細胞を選択して回収する工程をさらに含む、［１８］に記載のDNAメチル化編集方法。
［１］（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位（tag peptide binding portion）と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。
［２］前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位（TET1CD）である、［１］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［３］前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、［１］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［４］前記タグペプチドがペプチドエピトープであり、前記タグペプチド結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体である、［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［５］前記ペプチドエピトープがGeneral Control Non-derepressible 4（GCN4）ペプチドエピトープであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗GCN4ペプチドエピトープ抗体である、［４］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［６］前記ペプチドエピトープがHisタグまたはEEタグであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗Hisタグ抗体または抗EEタグ抗体である、［４］に記載のDNAメチル化編集用キット。
［７］前記抗体が一本鎖抗体（scFv）である、［４］〜［６］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［８］前記タグペプチドがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり、前記タグペプチド結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである、［１］〜［３］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
［９］前記スプリットタンパク質がGFPである、［８］に記載のDNAメチル化編集用キット。
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［１５］前記gRNAが複数である、［１］〜［１４］のいずれかに記載のDNAメチル化編集用キット。
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［１７］下記（１）〜（３）を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法。
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA。
［１８］前記（１）および／または（２）の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、［１７］に記載のDNAメチル化編集方法。
［１９］前記選択マーカーを発現する細胞を選択して回収する工程をさらに含む、［１８］に記載のDNAメチル化編集方法。
本発明によれば、特定部位のDNAメチル化を制御すること、たとえば、メチル化部位を脱メチル化すること、および、非メチル化部位をメチル化することが可能となる。
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
CRISPR/Casでは、DNA切断酵素のCas9が、ターゲットと相補的な約20塩基の配列を含む短いRNA（ガイドRNA(gRNA)）と複合体を形成し、ターゲットのDNAを切断する（非特許文献２）。ここで、dCas9というDNA切断活性のない変異体酵素を用いると、ターゲットを切断せずにターゲットへの結合のみを行うことができる。そこで、dCas9に様々な構成要素を結合させることで、メチル化や脱メチル化を行う因子をリクルートすると、特定の遺伝子のメチル化制御を行うことが可能である。またdCas9と、それと融合させたタグペプチドが複数つながったタグペプチドアレイと、タグペプチド結合部位、例えば、タグペプチドに対する一本鎖抗体（scFv）などのタグペプチド結合部位にメチル化や脱メチル化をおこなう因子を融合させたシステムを用いると、１つのdCas9に対して複数のメチル化因子や脱メチル化因子をリクルートでき、そのメチル化あるいは脱メチル化の能力を増強することができる（図３ａ）。
CRISPR/Casでは、DNA切断酵素のCas9が、ターゲットと相補的な約20塩基の配列を含む短いRNA（ガイドRNA(gRNA)）と複合体を形成し、ターゲットのDNAを切断する（非特許文献２）。ここで、dCas9というDNA切断活性のない変異体酵素を用いると、ターゲットを切断せずにターゲットへの結合のみを行うことができる。そこで、dCas9に様々な構成要素を結合させることで、メチル化や脱メチル化を行う因子をリクルートすると、特定の遺伝子のメチル化制御を行うことが可能である。またdCas9と、それと融合させたタグペプチドが複数つながったタグペプチドアレイと、タグペプチド結合部位、例えば、タグペプチドに対する一本鎖抗体（scFv）などのタグペプチド結合部位にメチル化や脱メチル化をおこなう因子を融合させたシステムを用いると、１つのdCas9に対して複数のメチル化因子や脱メチル化因子をリクルートでき、そのメチル化あるいは脱メチル化の能力を増強することができる（図３ａ）。
本発明においては、まず、メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列（ターゲット配列）を作製し、そして、当該ターゲット配列を含むgRNAを作製する。gRNAは、ヌクレアーゼ活性を有しないdCas9と複合体を形成する性質を有する。ここで、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質を作製すると、gRNAはdCas9を介して当該融合蛋白質と複合体を形成するため、gRNA-dCas9-タグペプチドアレイ複合体が形成される。gRNAは、自身に含まれるターゲット配列と相補的な配列に結合するため、これによって、gRNA-dCas9-タグペプチドアレイ複合体は、メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列に結合することとなる。そして、タグペプチド結合部位とメチル化酵素または脱メチル化酵素との融合蛋白質は、タグペプチド結合部位がタグペプチドアレイに結合することにより、メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内にリクルートされる。リクルートされたメチル化酵素または脱メチル化酵素は、自身から１kb以内にある部位をメチル化または脱メチル化する（図３ａ）。
（DNAメチル化編集用キットおよびDNAメチル化編集方法）
本発明は、（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、GCN4などのタグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、（２）抗タグペプチド抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれらをコードするRNAもしくはDNA、および（３）脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNAを含む、DNAメチル化編集用キットに関する。また、本発明は、上記（１）〜（３）を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法に関する。
本発明は、（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、GCN4などのタグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、（２）抗タグペプチド抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれらをコードするRNAもしくはDNA、および（３）脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNAを含む、DNAメチル化編集用キットに関する。また、本発明は、上記（１）〜（３）を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法に関する。
DNAメチル化編集とは、DNAの非メチル化部位をメチル化すること、およびDNAのメチル化部位を脱メチル化することの両方を含む。
（ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型Cas9）
CRISPR-associated endonuclease Cas9（Cas9）は、RECローブ（REC: recognition、認識）とNUCローブ（NUC: nuclease、ヌクレアーゼ）の２つのローブからなり、NUCローブがヌクレアーゼ活性を担う部位である（非特許文献２）。よって、本発明におけるヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型Cas9（dCas9）は、Cas9のNUCローブに変異を導入したものであり得る。これにより、ターゲット部位への結合能を保持したまま、Cas9のヌクレアーゼ活性を不活化させることができる。NUCローブへの変異導入部位は、ヌクレアーゼ活性のみを不活化させることができる限りにおいて制限はないが、たとえば、Cas9（UniProtKB/Swiss-Prot: Q99ZW2）におけるAsp10のアラニンへの変異（D10A）、His840のアラニンへの変異（H840A）、およびAsn863のアラニンへの変異（N863A）が好ましい。当該変異は、１種であっても、２種以上を組み合わせたものであってもよい。
CRISPR-associated endonuclease Cas9（Cas9）は、RECローブ（REC: recognition、認識）とNUCローブ（NUC: nuclease、ヌクレアーゼ）の２つのローブからなり、NUCローブがヌクレアーゼ活性を担う部位である（非特許文献２）。よって、本発明におけるヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型Cas9（dCas9）は、Cas9のNUCローブに変異を導入したものであり得る。これにより、ターゲット部位への結合能を保持したまま、Cas9のヌクレアーゼ活性を不活化させることができる。NUCローブへの変異導入部位は、ヌクレアーゼ活性のみを不活化させることができる限りにおいて制限はないが、たとえば、Cas9（UniProtKB/Swiss-Prot: Q99ZW2）におけるAsp10のアラニンへの変異（D10A）、His840のアラニンへの変異（H840A）、およびAsn863のアラニンへの変異（N863A）が好ましい。当該変異は、１種であっても、２種以上を組み合わせたものであってもよい。
dCas9をコードするDNAは、GenBank等から入手可能なCas9をコードするDNAに変異を導入することにより、作製可能である。または、市販のdCas9を含むプラスミドをAddgene等から入手して使用してもよいし、当該プラスミドを鋳型としたPCRによりｄCas9をコードするDNAを得てもよいし、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。dCas9をコードするRNAは、公知の分子生物学的手法により入手することができ、いずれの方法を用いてもよい。たとえば、前記dCas9をコードするDNAを鋳型とし、RNAポリメラーゼを作用させることにより入手することができる。
（タグペプチドアレイ）
本発明におけるタグペプチドアレイとは、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったものである。
タグペプチドは後述するタグペプチド結合部分との組み合わせで任意に選択できる。例えば、タグペプチドとタグペプチド結合部分の組み合わせとして、ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせ、スプリットタンパク質のスモールフラグメントとラージフラグメントの組み合わせなどが例示される。
ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせとしては、GCN4と抗GCN4抗体、Hisタグと抗Hisタグ抗体、EEヘキサペプチドと抗EEヘキサペプチド抗体、c-Mycタグと抗c-Mycタグ抗体、HAタグと抗HAタグ抗体、Sタグと抗Sタグ抗体、FLAGタグと抗FLAGタグ抗体などが例示される（Protein Engineering, Design & Selection vol. 24 no. 5 pp. 419-428, 2011）。この中ではGCN4に含まれるペプチドが好適に使用され、GCN4のアミノ酸配列は、たとえば、PDBから入手することができ、DNA配列は、GenBank等から入手可能である。また、当業者であれば、塩基配列変換ソフト等を用い、当該DNA配列情報に基づいて、それに対応するRNA配列も入手可能である。GCN4ペプチドエピトープとしては、GCN4におけるエピトープであれば制限なく使用できるが、配列番号１で表されるアミノ酸配列が好ましい。その他のタグペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列も公知のデータベース等から情報を入手することができる。
本発明におけるタグペプチドアレイとは、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったものである。
タグペプチドは後述するタグペプチド結合部分との組み合わせで任意に選択できる。例えば、タグペプチドとタグペプチド結合部分の組み合わせとして、ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせ、スプリットタンパク質のスモールフラグメントとラージフラグメントの組み合わせなどが例示される。
ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせとしては、GCN4と抗GCN4抗体、Hisタグと抗Hisタグ抗体、EEヘキサペプチドと抗EEヘキサペプチド抗体、c-Mycタグと抗c-Mycタグ抗体、HAタグと抗HAタグ抗体、Sタグと抗Sタグ抗体、FLAGタグと抗FLAGタグ抗体などが例示される（Protein Engineering, Design & Selection vol. 24 no. 5 pp. 419-428, 2011）。この中ではGCN4に含まれるペプチドが好適に使用され、GCN4のアミノ酸配列は、たとえば、PDBから入手することができ、DNA配列は、GenBank等から入手可能である。また、当業者であれば、塩基配列変換ソフト等を用い、当該DNA配列情報に基づいて、それに対応するRNA配列も入手可能である。GCN4ペプチドエピトープとしては、GCN4におけるエピトープであれば制限なく使用できるが、配列番号１で表されるアミノ酸配列が好ましい。その他のタグペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列も公知のデータベース等から情報を入手することができる。
スプリットタンパク質とはあるタンパク質を2分したときに、2分したタンパク質が再集合して元と同じ構造をつくることができるタンパク質のペアのことをいう。特に元のタンパク質を2分するときに片方を短いペプチド（スモールフラグメント）としてタグペプチドと使用し、長い方の片割れ（ラージフラグメント）をタグペプチド結合部位として用いることができる(Current Opinion in Chemical Biology 2011, 15:789-797)。このような目的で使用できるスプリットタンパク質は公知のものを使用することができるが、例えば、GFP（Green Fluorescent Protein）が例示される。
さらに、ペプチドとタンパク質のドメインとの結合はデータベース化されており、例えばPeptide Binding Proteins Database (http://pepbind.bicpu.edu.in/home.php)を参照することにより、タグペプチドとタグペプチド結合部分の組み合わせを見出すことができる。例えばPDZAlpha-Syntrophin PDZ protein interaction domainはGVKESLV（配列番号４４）と結合できるのでGVKESLVをタグペプチドと使用し、PDZ domainをタグペプチド結合部分として使用することができる。
さらにペプチドとペプチド結合部位のペアの結合力は別の不活性なドメインをリンカーを用いて結合させ進化工学で改良することにより強くすることができる。このようなペアを用いればさらに効率よくメチル化を制御できる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, vol. 105 no. 18, 6578-6583)。
上記のようなタグペプチドを複数含むタグペプチドアレイに挟まれるリンカーとしては、ペプチドとペプチド結合部位の結合を妨げず、本発明における所望の効果を妨げないものであれば、どのような配列のものでもよいが、たとえば、グリシンとセリンの繰り返し配列が挙げられる。また、当該リンカーの長さは、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の種類等に合わせて適宜設定可能であるが、５〜１００アミノ酸が好ましく、５〜５０アミノ酸がより好ましく、１０〜５０アミノ酸がさらにより好ましい。後述のTETやDNMTの場合、１５〜４０アミノ酸がより好ましく、１７〜３０アミノ酸がさらにより好ましく、２２アミノ酸が最も好ましい。グリシン（G）とセリン（S）の繰り返し配列でリンカーの長さを１０アミノ酸とする場合には、例えば、リンカー配列はGSGSG（配列番号４５）、GSGSGGSGSGSGGSGSGGSGSG（配列番号４６）またはGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSG（配列番号４７）のようにすることができる。
本発明におけるタグペプチドアレイとは、タグペプチドおよびリンカーの組み合わせを１単位とした場合、この単位が１または複数繰り返してつながったものを指す。複数とは、２以上の数であり、繰り返し数は、ターゲット部位からメチル化または脱メチル化部位までの距離や、メチル化酵素または脱メチル化酵素の種類等に応じて、適宜増減可能であり、たとえば３〜５回の繰り返しであってよい。
タグペプチドアレイをコードするDNAは、GenBank等から入手可能なタグペプチドをコードするDNAに、所望のリンカーをコードするDNA配列を付加することにより、作製可能である。当該DNAは、当該DNAの配列情報に基づいて、分子生物学的手法により得る方法が公知であり、たとえば、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製することができ、その入手方法に制限はない。また、当業者であれば、塩基配列変換ソフト等を用い、当該DNA配列情報に基づいて、それに対応するRNA配列も入手可能である。
（dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA）
dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したdCas9をコードするDNAとタグペプチドアレイをコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したdCas9をコードするDNAとタグペプチドアレイをコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
（タグペプチド結合部位）
上記の通り、タグペプチド結合部位はタグペプチドの種類に応じて抗タグペプチド（ペプチドエピトープ）抗体、スプリットタンパク質のラージフラグメントなどを使用することができる。ここで、抗タグペプチド抗体は、タグペプチドを特異的に認識する抗体を意味する。抗タグペプチド抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれ得る。当該モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F（ab'）化抗体、短鎖抗体（scFv）、ダイアボディ（Diabodies）およびミニボディ（Minibodies）を含むものとする。抗タグペプチド抗体をコードするDNAは、公知の分子生物学的手法により入手可能であり、たとえば、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６０９０４等の市販のプラスミドからPCRにより増幅して得ることができ、または、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。抗タグペプチド抗体をコードするRNAは、上記抗タグペプチド抗体をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
上記の通り、タグペプチド結合部位はタグペプチドの種類に応じて抗タグペプチド（ペプチドエピトープ）抗体、スプリットタンパク質のラージフラグメントなどを使用することができる。ここで、抗タグペプチド抗体は、タグペプチドを特異的に認識する抗体を意味する。抗タグペプチド抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれ得る。当該モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F（ab'）化抗体、短鎖抗体（scFv）、ダイアボディ（Diabodies）およびミニボディ（Minibodies）を含むものとする。抗タグペプチド抗体をコードするDNAは、公知の分子生物学的手法により入手可能であり、たとえば、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６０９０４等の市販のプラスミドからPCRにより増幅して得ることができ、または、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。抗タグペプチド抗体をコードするRNAは、上記抗タグペプチド抗体をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
（メチル化酵素、脱メチル化酵素）
本発明におけるメチル化酵素としては、非メチル化部位のメチル化を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、ＤＮＡ塩基配列上の特定の塩基をメチル化する酵素であるメチラーゼ、特定の塩基にメチル基を転移する酵素であるメチルトランスフェラーゼが含まれ、より具体的にはDNA Methyltransferase 3 beta（DNMT3B）、DNA Methyltransferase 3 alpha（DNMT3A）、DNA Methyltransferase 1（DNMT1）が挙げられる。本発明における脱メチル化酵素としては、メチル化部位の脱メチル化にいたる一連の反応を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、Ten-eleven translocation 1（TET1）、Ten-eleven translocation 2（TET2）、Ten-eleven translocation 3（TET3）、Thymine-DNA glycosylase(TDG)が含まれる。それら酵素は、酵素蛋白質の一部分であってもよいし、全体であってもよい。酵素蛋白質の一部分としては、酵素触媒部位が好ましく例示される。それら酵素をコードするDNAは、GenBank等から配列情報を入手可能であり、ヒト等の対象動物のcDNAからPCRにより作製可能である。または、それら酵素をコードするDNAは、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。それら酵素またはそれらをコードするRNAは、上記DNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
本発明におけるメチル化酵素としては、非メチル化部位のメチル化を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、ＤＮＡ塩基配列上の特定の塩基をメチル化する酵素であるメチラーゼ、特定の塩基にメチル基を転移する酵素であるメチルトランスフェラーゼが含まれ、より具体的にはDNA Methyltransferase 3 beta（DNMT3B）、DNA Methyltransferase 3 alpha（DNMT3A）、DNA Methyltransferase 1（DNMT1）が挙げられる。本発明における脱メチル化酵素としては、メチル化部位の脱メチル化にいたる一連の反応を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ、Ten-eleven translocation 1（TET1）、Ten-eleven translocation 2（TET2）、Ten-eleven translocation 3（TET3）、Thymine-DNA glycosylase(TDG)が含まれる。それら酵素は、酵素蛋白質の一部分であってもよいし、全体であってもよい。酵素蛋白質の一部分としては、酵素触媒部位が好ましく例示される。それら酵素をコードするDNAは、GenBank等から配列情報を入手可能であり、ヒト等の対象動物のcDNAからPCRにより作製可能である。または、それら酵素をコードするDNAは、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。それら酵素またはそれらをコードするRNAは、上記DNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
（タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA）
抗ペプチドエピトープ抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したタグペプチド結合部位をコードするDNAと、メチル化酵素または脱メチル化酵素をコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択して回収することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。なお、選択マーカーをコードするDNA配列が、上記dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAに挿入されている場合、当該選択マーカーとは異なる選択マーカーを、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAに挿入してもよい。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
抗ペプチドエピトープ抗体などのタグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAは、周知の遺伝子操作法を含む任意の方法を用いて、上記において定義したタグペプチド結合部位をコードするDNAと、メチル化酵素または脱メチル化酵素をコードするDNAとを結合させることにより作製することができ、特に限定されない。また、当該融合蛋白質をコードするDNAには、選択マーカーをコードするDNA配列を挿入してもよい。当該選択マーカーにより、融合蛋白質をコードするDNAが導入された細胞を、セルソーティング等により選択して回収することが可能となる。当該選択マーカーとしては、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、ピューロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。なお、選択マーカーをコードするDNA配列が、上記dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質をコードするDNAに挿入されている場合、当該選択マーカーとは異なる選択マーカーを、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質をコードするDNAに挿入してもよい。また、上記融合蛋白質またはそれをコードするRNAは、上記融合蛋白質をコードするDNAを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ、たとえば、上記融合蛋白質をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより、得ることができる。
（ガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA）
本発明におけるガイドRNA（ｇRNA）は、CRISPER/Cas法におけるtracrRNAとcrRNAを人工的に連結させたものである。tracrRNAを発現するDNAは、非特許文献２（第1698頁）に記載されているRNA配列を基に、公知の手法によりそれに対応するDNAを得ることが可能である。たとえば、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて、当該DNAを人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。または、任意のcrRNAに対応するDNA配列を挿入することにより所望のｇRNAを発現させることができるプラスミドが市販されている（Addgeneプラスミド41824等）ので、それを使用してもよい。crRNAとしては、メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を使用する。gRNAは、１種類であってもよいし、それぞれ異なるcrRNAを含むgRNAを複数使用してもよい。
本発明におけるガイドRNA（ｇRNA）は、CRISPER/Cas法におけるtracrRNAとcrRNAを人工的に連結させたものである。tracrRNAを発現するDNAは、非特許文献２（第1698頁）に記載されているRNA配列を基に、公知の手法によりそれに対応するDNAを得ることが可能である。たとえば、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて、当該DNAを人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。または、任意のcrRNAに対応するDNA配列を挿入することにより所望のｇRNAを発現させることができるプラスミドが市販されている（Addgeneプラスミド41824等）ので、それを使用してもよい。crRNAとしては、メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を使用する。gRNAは、１種類であってもよいし、それぞれ異なるcrRNAを含むgRNAを複数使用してもよい。
（オールインワンベクター：all in one vector）
上記で述べた２つの融合蛋白質をコードするDNAを、さらに連結させて、dCas9、タグペプチドアレイ、タグペプチド結合部位、およびメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質をコードするDNAをベクターに組み込み、使用してもよい。当該DNAを含むベクターを、オールインワンベクターと称する。当該融合蛋白質をコードするDNAには、適宜リンカーを挿入してもよい。たとえば、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質（構成要素１とする）と、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質（構成要素２とする）との間に、リンカーとして、ウイルス由来の２Aペプチドを挿入すると、当該２Aペプチドが細胞内で２Aペプチターゼにより切断されるため、構成要素１と２は連結されておらず、分離した２つの蛋白質として発現することになる。また、当該オールインワンベクターには、gRNAを含めても良い。
上記で述べた２つの融合蛋白質をコードするDNAを、さらに連結させて、dCas9、タグペプチドアレイ、タグペプチド結合部位、およびメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質をコードするDNAをベクターに組み込み、使用してもよい。当該DNAを含むベクターを、オールインワンベクターと称する。当該融合蛋白質をコードするDNAには、適宜リンカーを挿入してもよい。たとえば、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質（構成要素１とする）と、タグペプチド結合部位とメチル化酵素もしくは脱メチル化酵素の融合蛋白質（構成要素２とする）との間に、リンカーとして、ウイルス由来の２Aペプチドを挿入すると、当該２Aペプチドが細胞内で２Aペプチターゼにより切断されるため、構成要素１と２は連結されておらず、分離した２つの蛋白質として発現することになる。また、当該オールインワンベクターには、gRNAを含めても良い。
本発明において目的遺伝子を含むベクターとしては、真核生物細胞において複製可能なベクター、ならびにエピソームを維持するベクターあるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが挙げられるが、ウイルスベクターが好ましく、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターがより好ましい。ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントをいい、一般には、遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える遺伝子である。具体的には、例えば、Ｎｅｏ遺伝子、Ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子が挙げられる。選択マーカーの存在を選択するために有用な薬物としては、例えば、Ｎｅｏに対してはＧ４１８、Ｈｙｇに対してはハイグロマイシン、ｈｉｓＤに対してはヒスチジノール、Ｇｐｔに対してはキサンチン、そしてＢｌｅに対してはブレオマイシンが挙げられる。
（細胞へのトランスフェクション）
細胞へのDNA、RNA、および蛋白質のトランスフェクションは、公知の任意の手段を使用することにより可能であり、市販のトランスフェクション用試薬を使用してもよい。たとえば、DNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine2000（Invitrogen）、jetPRIME Kit（ポリプラストランスフェクション）、DreamFect（オズバイオサイエンス）、GenePorter3000（オズバイオサイエンス）、Calcium Phosphate Transfection Kit（オズバイオサイエンス）等を使用可能である。RNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine 3000（Invitrogen）、RNAi Max（Invitrogen）、MessengerMAX（Invitrogen）等を使用可能である。蛋白質のトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine CRISPRMAX（Invitrogen）、PULSin（ポリプラストランスフェクション）、Pro-DeliverIN（オズバイオサイエンス）、BioPORTER Protein Delivery Reagent（Genlantis）等を使用可能である。細胞へのトランスフェクションは、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質とgRNAとで予め複合体を形成させ、当該複合体を細胞にトランスフェクションしてもよい。また受精卵にマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによりDNA、RNA、蛋白質を導入することも可能である。
細胞へのDNA、RNA、および蛋白質のトランスフェクションは、公知の任意の手段を使用することにより可能であり、市販のトランスフェクション用試薬を使用してもよい。たとえば、DNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine2000（Invitrogen）、jetPRIME Kit（ポリプラストランスフェクション）、DreamFect（オズバイオサイエンス）、GenePorter3000（オズバイオサイエンス）、Calcium Phosphate Transfection Kit（オズバイオサイエンス）等を使用可能である。RNAのトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine 3000（Invitrogen）、RNAi Max（Invitrogen）、MessengerMAX（Invitrogen）等を使用可能である。蛋白質のトランスフェクションには、エレクトロポレーション、Lipofectamine CRISPRMAX（Invitrogen）、PULSin（ポリプラストランスフェクション）、Pro-DeliverIN（オズバイオサイエンス）、BioPORTER Protein Delivery Reagent（Genlantis）等を使用可能である。細胞へのトランスフェクションは、dCas9とタグペプチドアレイとの融合蛋白質とgRNAとで予め複合体を形成させ、当該複合体を細胞にトランスフェクションしてもよい。また受精卵にマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによりDNA、RNA、蛋白質を導入することも可能である。
以下に非限定的な例を参照して、本発明を更に説明する。なお、本実施例ではタグペプチドとしてGCN4を使用したが、これを他のタグペプチドに置き換えられることは当然のことである。
実施例１．ＴＥＴ１ＣＤを用いたターゲットの脱メチル化
＜標的脱メチル基のためのプラスミド構築＞
ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１触媒部位（ＣＤ）融合蛋白質発現ベクター（ｐＣＡＧ−ｄＣａｓ９ＴＥＴ１ＣＤ）は、触媒として不活性なヌクレアーゼであるコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＴＥＴ１ＣＤのＮ末端にある触媒ドメインに融合することにより作製された（システム１）。ｄＣａｓ９フラグメントは、ＰＣＲによりＡｄｄｇｅｎｅプラスミド48240から増幅された。ＴＥＴ１ＣＤフラグメントはヒトｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅された。
＜標的脱メチル基のためのプラスミド構築＞
ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１触媒部位（ＣＤ）融合蛋白質発現ベクター（ｐＣＡＧ−ｄＣａｓ９ＴＥＴ１ＣＤ）は、触媒として不活性なヌクレアーゼであるコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＴＥＴ１ＣＤのＮ末端にある触媒ドメインに融合することにより作製された（システム１）。ｄＣａｓ９フラグメントは、ＰＣＲによりＡｄｄｇｅｎｅプラスミド48240から増幅された。ＴＥＴ１ＣＤフラグメントはヒトｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅された。
図１におけるシステム１−４のｄＣａｓ９フラグメントは、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６０９０３からＰＣＲにより増幅された。使用されたＧＣＮ４のアミノ酸シークエンスはEELLSKNYHLENEVARLKK（配列番号１）である。GCN4間のリンカーシークエンスは、GSGSG（配列番号２：システム２）、GSGSGGSGSGSGGSGSGGSGSG（配列番号３：システム３）、およびGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSG（配列番号４：システム４）である。GFPフラグメントはＡｄｄｇｅｎｅプラスミド６０９０４から増幅された。ＳｃＦｖフラグメントもまた、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６０９０４から増幅された。全ての融合タンパク質は、ＣＡＧプロモーターのコントロール下において発現させた。オールインワンベクターは、システム３のコンポーネント１及び２を、２Ａペプチド（配列番号５：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP）を挟んで融合して作製した。ベクターシークエンスは、配列番号６〜１１（それぞれ、システム１（pCAG-dCas9TET1CD）、システム２のｄCas9-GCN4融合蛋白質（pCAG-dCas9-10xGCN4_v4）、システム２〜４のｓｃFv-TET1CD融合蛋白質（pCAG-scFvGCN4sfGFPTET1CD）、システム３のｄCas9-GCN4融合蛋白質（pCAG-dCas9-5xPlat2AflD）、システム４のｄCas9-GCN4融合蛋白質（pCAG-dCas9-3.5xSuper）、およびオールインワンベクター（pPlatTET-gRNA2））に示す。
＜ｇRNA構築＞
GfapおよびH19のためのｇRNAベクターは、Addgeneプラスミド４１８２４の中にターゲットシークエンスを挿入することにより作製した。クローニングは、AflII部位の直線化と、ｇRNAフラグメントの挿入を媒介するギブソンアセンブリーシステムにより行った。
ターゲットシークエンスを表１に示す。
GfapおよびH19のためのｇRNAベクターは、Addgeneプラスミド４１８２４の中にターゲットシークエンスを挿入することにより作製した。クローニングは、AflII部位の直線化と、ｇRNAフラグメントの挿入を媒介するギブソンアセンブリーシステムにより行った。
ターゲットシークエンスを表１に示す。
＜細胞培養＞
胚性幹細胞（ESCｓ）は、３７℃、５％CO2下で、１％FBS、１７．５％ＫＳＲ１００（10828028, Gibco）、０．２％の２−メルカプトエタノール（21985-023, Gibco）、およびESGRO mLIF,を1x103 ユニット/mL (ESG1107, Millipore)添加したダルベッコ改変イーグル培地−高濃度グルコース（D6429-500ML, Sigma）にて培養した。ＥＳＣｓは、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添付のプロトコールに従って使用してトランスフェクションを行い、トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収し、それらを、アッセイやFACSAriaII (BD Biosciences)によるソートに、直接使用した。
胚性幹細胞（ESCｓ）は、３７℃、５％CO2下で、１％FBS、１７．５％ＫＳＲ１００（10828028, Gibco）、０．２％の２−メルカプトエタノール（21985-023, Gibco）、およびESGRO mLIF,を1x103 ユニット/mL (ESG1107, Millipore)添加したダルベッコ改変イーグル培地−高濃度グルコース（D6429-500ML, Sigma）にて培養した。ＥＳＣｓは、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添付のプロトコールに従って使用してトランスフェクションを行い、トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収し、それらを、アッセイやFACSAriaII (BD Biosciences)によるソートに、直接使用した。
＜ＤＮＡメチル化解析＞
ゲノムＤＮＡは、Epitect Plus DNA Bisulfite Kit (QIAGEN)を添付の指示書に従って使用して処置された。修飾ＤＮＡは、下記表２のＰＣＲプライマーを使用して増幅された。
ゲノムＤＮＡは、Epitect Plus DNA Bisulfite Kit (QIAGEN)を添付の指示書に従って使用して処置された。修飾ＤＮＡは、下記表２のＰＣＲプライマーを使用して増幅された。
ＧｆａｐのＳＴＡＴ３部位、およびＨ１９のｍ１−ｍ４部位における脱メチル化パーセントは、Combined Bisulfite Restriction Analysis（ＣＯＢＲＡ）により決定された。下記表３のプライマーを使用して増幅されたフラグメントを、上記部位の中に認識部位を有する下記表３において示す制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
メチル化は、エチジウムブロマイドで染色したゲルのデンシトメトリー解析で、切断ＤＮＡの比として計算された。各々のアッセイにおいて、コントロールベクター（空のｇＲＮＡベクター）でトランスフェクトされた細胞のメチル化は、１００％メチル化（０％脱メチル化）として定義され、各々のサンプルの脱メチル化は、以下の数式１を使用してコントロールによって標準化された。
サンプル脱メチル化（％）＝（コントロールのメチル化-サンプルのメチル化）/コントロールのメチル化×１００・・・数式１
サンプル脱メチル化（％）＝（コントロールのメチル化-サンプルのメチル化）/コントロールのメチル化×１００・・・数式１
周辺領域のメチル化解析およびオフターゲット解析のために、バイサルファイトシークエンスが行われた。増幅されたフラグメントをＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、少なくとも１４クローンのシークエンスを行った。シークエンスは、QUantification tool for Methylation Analysis (QUMA)と呼ばれるメチル化解析ツールにより解析された。ＣｐＧ部位における全セットのうちの２グループ間における統計的有意性は、ノンパラメトリック統計的有意性の検定に使用されるマンホイットニーＵテスト（ウィルコクソンの順位和検定とも呼ばれる）を用いて評価した。
＜結果＞
まず、メチル化処置のために、不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）とＴＥＴ１との直接融合タンパクというシンプルな設計を作製した。ＴＥＴ１は、Ｃ末端に保存された触媒ドメインを有しており、このドメインはフルレングスのタンパク質よりも高い触媒活性を有する。そのため、このＴＥＴ１触媒ドメイン（ＴＥＴ１ＣＤ）を、触媒作用が不活性であるｄＣａｓ９に融合させた（図１のシステム１）。
まず、メチル化処置のために、不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）とＴＥＴ１との直接融合タンパクというシンプルな設計を作製した。ＴＥＴ１は、Ｃ末端に保存された触媒ドメインを有しており、このドメインはフルレングスのタンパク質よりも高い触媒活性を有する。そのため、このＴＥＴ１触媒ドメイン（ＴＥＴ１ＣＤ）を、触媒作用が不活性であるｄＣａｓ９に融合させた（図１のシステム１）。
アストロサイト特異的マーカーであるＧｆａｐ遺伝子をコードするグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の上流におけるＳＴＡＴ３−結合部位内のシトシン残基は、ターゲットとして使用された。当該部位は、アストロサイトを除く多くの細胞タイプにおいてメチル化され、当該部位の脱メチル化は、神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）のアストロサイトへの分化において、重要な役割を有する。ＳＴＡＴ３−結合部位周辺の３つのターゲットを設計し（図２ａ）、それらのためのｇＲＮＡベクターを作製して、当該ｇＲＮＡベクターを、ｄＣＡＳ９−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質発現ベクター（ｐＣＡＧ−ｄＣａｓ９ＴＥＴ１ＣＤ）と共に、一過性に胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）に導入した。ＳＴＡＴ３−結合部位のメチル化は、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）により解析された。各々のアッセイにおいて、コントロールベクター（空のｇＲＮＡベクター）と共に遺伝子導入した細胞のメチル化は、０％脱メチル化（１００％メチル化）と定義され、各々のサンプルの脱メチル化は、コントロールにより標準化された。
これら３つのｇＲＮＡ、Ｇｆａｐ１、Ｇｆａｐ２、およびＧｆａｐ３は、ＳＴＡＴ３部位において、それぞれ３％、１４％、および９％の脱メチル化を示した（図２ｂ）。一方、無関係のｇＲＮＡ（ＵＲ１、ＵＲ２、およびＵＲ３）は脱メチル化を示さなかった。よって、このシンプルなシステムはｇＲＮＡ依存的特異的脱メチル化を誘発するが、脱メチル化の程度はせいぜい１４％であることが示された。
次に、抗体融合ＴＥＴ１ヒドロキシラーゼ触媒ドメインの複数コピーをリクルートするために、反復ペプチド配列に融合されたｄＣａｓ９を使用して、脱メチル化能を増幅することを試みた（図３ａ）。Ｇｆａｐ ＳＴＡＴ３部位の脱メチル化のために、ＥＳＣｓにおいて、Ｇｆａｐ２ｇＲＮＡ、ＧＣＮ４ペプチドを１０コピー有するｄＣａｓ９、およびＧＣＮ４ペプチド抗体（ｓｃＦｖ）−スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質の発現ベクターを使用した（図１のシステム２）。しかし、このシステム２の使用により、脱メチル化の程度は改善されなかった（図４ａ）。
システム２により脱メチル化の程度が改善されなかった原因を探るために、１９アミノ酸からなるＧＣＮ４ペプチドエピトープの配列を分離しているリンカーの長さを検証した。もしリンカーの長さが短すぎるのであれば、抗体−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質にとって、ＧＣＮ４ペプチド配列に接近し結合するためのスペースが狭すぎるため、脱メチル化活性が不十分となると考えられる。もしリンカーの長さが長すぎるのであれば、抗体−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質はターゲットメチル化部位に近づくことができないと考えられる（図３ｂ）。システム２のリンカーの長さは、５アミノ酸であった（図１システム２）。
２２アミノ酸長のリンカーを有する抗体−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質（図１のシステム３）、および４３アミノ酸長のリンカーを有するＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質（図１のシステム４）を作製し、脱メチル化活性を比較した。合成遺伝子技術における技術的制限のために、２２アミノ酸長のリンカーおよび４３アミノ酸長のリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドのコピー数は、それぞれ５および４に減少させた。ＧＣＮ４ペプチドのコピー数の減少にも関わらず、２２アミノ酸長のリンカーが４３％と最も良い脱メチル化を示した。４４アミノ酸長のリンカーは２番目に活性が高く、プロトタイプである５アミノ酸長は最も低かった（図４ａ）。
これらの結果は、脱メチル化活性には、ＧＣＮ４のコピー数よりも、ｄＣａｓ９に融合する各々のＧＣＮ４ペプチドユニット配列を分離するリンカーの長さが重要であることを示唆した。リンカーの長さを５アミノ酸から２２アミノ酸に拡張することにより、脱メチル化活性は顕著に改善した。これは、２２アミノ酸が、抗体−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質がペプチド配列に近づくために十分な広さであったことによると思われる。一方、４３アミノ酸のリンカー長では、抗体−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質がターゲットであるメチル化部位に近づくには長すぎたと思われる。
さらに脱メチル化効率を改善するために、fluorescence activated cell sorting （ＦＡＣＳ）を使用して、ＧＦＰ発現ベクター導入細胞を選択した。この目的のために、ｇＲＮＡ、システム３のＧＣＮ４配列を含むｄＣａｓ９、および抗体−ｓｆＧＦＰ−ＴＥＴ１ＣＤ融合タンパク質を含むオールインワン（all-in-one）ベクターを作製した（図１）。ＧＦＰでソートされたオールインワン導入ＥＳＣｓは、ほぼ完全な脱メチル化を示した（図４）。また、期待に反して、システム３を導入しＧＦＰでソートされたＥＳＣｓもまた、ほぼ完全な脱メチル化を示した（図４）。脱メチル化能の促進とソーティング技術により、ターゲット領域における完全な脱メチル化が達成された。
次に、ソートされたサンプルを使用して、バイサルファイトシークエンスにより、ターゲット部位からの脱メチル化の範囲を検証した。脱メチル化は、ターゲット部位から少なくとも１００ｂｐ以上離れた部位でも起こっていた（図４ｂ）。また、同じサンプルを使用して、バイサルファイトシークエンスにより、オフターゲット活性も検証したところ、顕著なオフターゲット活性は観察されなかった（図５）。
次に、同様の実験を、父系メチル化インプリンティング遺伝子であるＨ１９のメチル化可変領域（differential methylation region;ＤＭＲ）を用いて行った。Ｈ１９のＤＭＲには、４つのメチル化感受性ＣＴＣＦ結合部位（ｍ１−ｍ４）があり、Ｈ１９インプリンティングの調整に重要である（図６ａ）。ｍ２をターゲットとするｇＲＮＡ（Ｈ１９ＤＭＲ２）を、ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１ＣＤまたはシステム３と共にＥＳＣｓに導入し、システム３導入細胞は、導入後に細胞ソーティングを行ったものも作製した。
その結果、システム３はｄＣａｓ９−ＴＥＴ１ＣＤと比較して、顕著なメチル化の改善が観察された。ＧＦＰでソートした細胞では、ｍ２部位において完全な脱メチル化が観察された（図６ｂ）。ＧＦＰでソートした細胞は、さらに周辺領域のメチル化について解析をしたところ、ターゲット領域から２００ｂｐ離れたｍ１部位において完全な脱メチル化が示された（図６ｃ）。一方、ターゲット部位から１ｋｂ以上離れたｍ３とｍ４部位は、わずかに脱メチル化されただけであり（図６ｃ）、脱メチル化効果は１ｋｂ以上反れた部位にはおよばないことが示唆された。また、複数部位ターゲティングの可能性をテストするために、ｍ１−ｍ４のｇＲＮＡをシステム３と共に導入した（Ｈ１９ＤＭＲ１−４）。その結果、ＧＦＰでソートされた細胞において、４つの部位（ｍ１〜ｍ４）全てにおいてほぼ完全な脱メチル化が観察された（図６ｃ）。このことは、複数のｇＲＮＡを使用することにより、複数部位を脱メチル化することが可能であることが示された。
実施例２．Dnmt3bを用いたターゲットのメチル化
ターゲットにメチル化を導入するためシステム３（リンカー２２aa）を用いてH19のm2部位のメチル化をおこなった。ＴＥＴ１ＣＤの代わりに（１）Dnmt3b、（２）Dnmt3bNLS、（３）Dnmt3bNLS_N662Rを用いて実験を行った(図７)。（１）はDe novoメチル化酵素Dnmt3bで、（２）は（１）のDnmt3bのC末にNLS（核移行シグナル）をつけたもの、（３）は（２）の662番目のアミノ酸をアスパラギン(Ｎ)からアルギニン (Ｒ)に変えたものである。このアミノ酸置換はメチル化活性を向上させることが報告されている(下記のShen L et al.)。用いたプラスミドは以下の通り。
（１）Dnmt3b: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bF（配列番号４１）
（２）Dnmt3bNLS: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bFNLS（配列番号４２）
（３）Dnmt3bNLS_N662R: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1（配列番号４３）
これらの（１）〜（３）の系をES細胞に導入して2日目にGFPの蛍光によりセルソーターで遺伝子が導入されて蛍光を発する細胞のみを単離し、脱メチル化のときと同様にH19のm2のメチル化を調べた。メチル化は数式２のようにコントロールで標準化したメチル化（％）として計算した。その結果、ターゲットのメチル化は（１）５４％、（２）７４％、（３）８４％となり、メチル化効率はDnmt3bだけよりはNLSをつけた方がよく、さらにN662Rのアミノ酸置換をいれたものの方がよいことがわかった(図８)。
コントロールで標準化したメチル化（％）＝（サンプルのメチル化-コントロールのメチル化）/コントロールのメチル化×１００・・・数式2
参考文献
Shen L, Gao G, Zhang Y, Zhang H, Ye Z, Huang S, Huang J, Kang J. A single amino acid substitution confers enhanced methylation activity of mammalian Dnmt3b on chromatin DNA. Nucleic Acids Res. 38:6054-6064, 2010. doi: 10.1093/nar/gkq456.
ターゲットにメチル化を導入するためシステム３（リンカー２２aa）を用いてH19のm2部位のメチル化をおこなった。ＴＥＴ１ＣＤの代わりに（１）Dnmt3b、（２）Dnmt3bNLS、（３）Dnmt3bNLS_N662Rを用いて実験を行った(図７)。（１）はDe novoメチル化酵素Dnmt3bで、（２）は（１）のDnmt3bのC末にNLS（核移行シグナル）をつけたもの、（３）は（２）の662番目のアミノ酸をアスパラギン(Ｎ)からアルギニン (Ｒ)に変えたものである。このアミノ酸置換はメチル化活性を向上させることが報告されている(下記のShen L et al.)。用いたプラスミドは以下の通り。
（１）Dnmt3b: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bF（配列番号４１）
（２）Dnmt3bNLS: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bFNLS（配列番号４２）
（３）Dnmt3bNLS_N662R: pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1（配列番号４３）
これらの（１）〜（３）の系をES細胞に導入して2日目にGFPの蛍光によりセルソーターで遺伝子が導入されて蛍光を発する細胞のみを単離し、脱メチル化のときと同様にH19のm2のメチル化を調べた。メチル化は数式２のようにコントロールで標準化したメチル化（％）として計算した。その結果、ターゲットのメチル化は（１）５４％、（２）７４％、（３）８４％となり、メチル化効率はDnmt3bだけよりはNLSをつけた方がよく、さらにN662Rのアミノ酸置換をいれたものの方がよいことがわかった(図８)。
コントロールで標準化したメチル化（％）＝（サンプルのメチル化-コントロールのメチル化）/コントロールのメチル化×１００・・・数式2
参考文献
Shen L, Gao G, Zhang Y, Zhang H, Ye Z, Huang S, Huang J, Kang J. A single amino acid substitution confers enhanced methylation activity of mammalian Dnmt3b on chromatin DNA. Nucleic Acids Res. 38:6054-6064, 2010. doi: 10.1093/nar/gkq456.
配列番号１：GCN4
配列番号２：リンカー５
配列番号３：リンカー２２
配列番号４：リンカー４３
配列番号５：２Ａペプチド
配列番号６：pCAG-dCas9TET1CD
配列番号７：pCAG-dCas9-10xGCN4_v4
配列番号８：pCAG-scFvGCN4sfGFPTET1CD
配列番号９：pCAG-dCas9-5xPlat2AflD
配列番号１０：pCAG-dCas9-3.5xSuper
配列番号１１：pPlatTET-gRNA2
配列番号１２：Gfap_1
配列番号１３：Gfap_2
配列番号１４：Gfap_3
配列番号１５：H19DMR_1
配列番号１６：H19DMR_2
配列番号１７：H19DMR_3
配列番号１８：H19DMR_4
配列番号１９：UR_1
配列番号２０：UR_2
配列番号２１：UR_3
配列番号２２：GfapSTAT3-B3
配列番号２３：GfapSTAT3-B4
配列番号２４：H19DMR-B1
配列番号２５：H19DMR-B2
配列番号２６：Gfap_O1B1
配列番号２７：Gfap_O1B2
配列番号２８：Gfap_O2B1
配列番号２９：Gfap_O2B2
配列番号３０：Gfap_O3B1
配列番号３１：Gfap_O3B2
配列番号３２：GfapSTAT3-B1
配列番号３３：GfapSTAT3-B2
配列番号３４：H19DMR-B3
配列番号３５：H19DMR-B4
配列番号３６：H19DMR-B5
配列番号３７：H19DMR-B6
配列番号３８：off target 1
配列番号３９：off target 2
配列番号４０：off target 3
配列番号４１：pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bF
配列番号４２：pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bFNLS
配列番号４３：pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1
配列番号４４：タグペプチドGVKESLV
配列番号４５：GSリンカー
配列番号４６：GSリンカー
配列番号４７：GSリンカー
配列番号２：リンカー５
配列番号３：リンカー２２
配列番号４：リンカー４３
配列番号５：２Ａペプチド
配列番号６：pCAG-dCas9TET1CD
配列番号７：pCAG-dCas9-10xGCN4_v4
配列番号８：pCAG-scFvGCN4sfGFPTET1CD
配列番号９：pCAG-dCas9-5xPlat2AflD
配列番号１０：pCAG-dCas9-3.5xSuper
配列番号１１：pPlatTET-gRNA2
配列番号１２：Gfap_1
配列番号１３：Gfap_2
配列番号１４：Gfap_3
配列番号１５：H19DMR_1
配列番号１６：H19DMR_2
配列番号１７：H19DMR_3
配列番号１８：H19DMR_4
配列番号１９：UR_1
配列番号２０：UR_2
配列番号２１：UR_3
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配列番号４３：pCAG-scFvGCN4sfGFPDnmt3bS1
配列番号４４：タグペプチドGVKESLV
配列番号４５：GSリンカー
配列番号４６：GSリンカー
配列番号４７：GSリンカー
本発明によって特定の遺伝子のメチル化を制御することができる。それにより、癌やインプリンティング疾患などDNAメチル化異常により発症する疾患（エピゲノム疾患）のモデル細胞、動物を作製することが可能である。またウイルスベクターその他のデリバリーシステムを用いれば、それらの疾患の治療に用いることが可能である。またiPS細胞作製において、Oct-４等の万能遺伝子を、本発明によって脱メチル化し活性化することにより、効果的にiPS細胞を作製することができる。
Claims (19)
- （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA
を含む、DNAメチル化編集用キット。 - 前記脱メチル化酵素が、Ten-eleven translocation 1の触媒部位（TET1CD）である、請求項１に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記メチル化酵素が、DNA Methyltransferase 3 beta (DNMT3B)である、請求項１に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがペプチドエピトープであり、前記タグペプチド結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記ペプチドエピトープがGeneral Control Non-derepressible 4（GCN4）ペプチドエピトープであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗GCN4ペプチドエピトープ抗体である、請求項４に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記ペプチドエピトープがHisタグまたはEEタグであり、前記抗ペプチドエピトープ抗体が抗Hisタグ抗体または抗EEタグ抗体である、請求項４に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記抗体が一本鎖抗体（scFv）である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり、前記タグペプチド結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記スプリットタンパク質がGFPである、請求項８に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記タグペプチドがGVKESLV（配列番号４４）であり、前記タグペプチド結合部位がPDZ proteinである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記リンカーが５〜１００アミノ酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記リンカーが５〜５０アミノ酸である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記リンカーが１０〜５０アミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記（１）および／または（２）の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記gRNAが複数である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 前記（１）〜（３）のDNAが全て一つのベクターに含まれている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のDNAメチル化編集用キット。
- 下記（１）〜（３）を細胞にトランスフェクションする工程を含む、DNAメチル化編集方法。
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型CRISPR-associated endonuclease Cas9（dCas9）と、タグペプチドがリンカーを挟んで複数つながったタグペプチドアレイとの融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、
（２）タグペプチド結合部位と、メチル化酵素もしくは脱メチル化酵素との融合蛋白質、またはそれをコードするRNAもしくはDNA、および
（３）メチル化または脱メチル化を所望する部位から１kb以内のDNA配列と相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）、またはそれを発現するDNA。 - 前記（１）および／または（２）の融合蛋白質が、さらに選択マーカーを含む、請求項１７に記載のDNAメチル化編集方法。
- 前記選択マーカーを発現する細胞を選択して回収する工程をさらに含む、請求項１８に記載のDNAメチル化編集方法。
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