WO2021167101A1 - 脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子を用いた特定遺伝子の相乗的発現誘導法 - Google Patents

脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子を用いた特定遺伝子の相乗的発現誘導法 Download PDF

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binding site
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nucleic acid
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出穂 畑田
純代 森田
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国立大学法人群馬大学
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    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to a method of enhancing the expression of a specific endogenous gene using dCas9-SunTag.
  • Overexpression of the target gene is used not only for basic research but also for treatment, and has been conventionally performed by introducing an exogenous gene.
  • Extrinsic expression of cDNA is a function elucidation method commonly used to elucidate gene function.
  • exogenous expression of some important transcriptional activators in differentiated cells results in cell state transitions and produces induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Exogenous expression of a functional gene by a viral vector, such as an adeno-associated virus (AAV) vector is a treatment for the disease caused by haplodeficiency by replacing the mutant gene as a gene therapy.
  • AAV adeno-associated virus
  • Activation of endogenous genes by artificial transcriptional activators has been used as an alternative approach to gene overexpression.
  • the artificial transcription activator composed of the DNA-binding protein and the effector domain binds to the promoter region of the target gene by the action of the DNA-binding protein to activate the expression.
  • Three types of DNA-binding proteins are known: zinc finger protein, transcriptional activator-like effector (TALE), and catalytically deactivated Cas9 (dCas9). Among these DNA-binding proteins. , The simplicity and versatility of dCas9 is attracting attention.
  • Targeting the target endogenous gene of this fusion protein is performed by a single guide RNA (sgRNA).
  • sgRNA single guide RNA
  • the degree of activation is low, and usually, in order to reliably activate transcription, several types of sgRNA are used in combination to form a plurality of fusion proteins in the promoter region of interest. It was necessary to induce (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Document 4 Patent Document 1
  • Non-Patent Document 5 The synergistic activation mediator (SAM) system consists of dCas9-VP64, a modified sgRNA containing RNA aptamers, and an MS2 bacteriophage coat protein fused to the transcriptional activation domain p65-HSF1. VP64 fused with dCas9 and MS2-p65-HSF1 induced to dCas9 by RNA aptamer synergistically activate transcription of the target gene.
  • SAM synergistic activation mediator
  • Non-Patent Documents 6, Patents Patents
  • Document 2 SunTag is a repeating peptide tag (GCN4) array into which multiple anti-GCN4 peptide antibody (scFv) fusion factors can be introduced (Non-Patent Document 4).
  • GCN4 repeating peptide tag
  • scFv anti-GCN4 peptide antibody
  • a method of introducing a plurality of demethylation-promoting domains (proteins that promote demethylation, etc.) such as GAADD45A and NEIL2 bound to the PUF domain together with the PUF domain-binding TET via a Pumilio homolog domain binding sequence into the guide RNA Is disclosed (Patent Document 3). This document shows that the transcriptional activation of p65-HSF1 is superior to that of VP64, and that TET1 is activated by the combined use of Growth Arrest and DNA Damage-inducible Alpha (GADD45A).
  • MDC1A Congenital muscular dystrophy type 1A
  • suppression of the expression of endogenous genes has been mainly targeted at expressed proteins and mRNA, but more efficient suppression is expected by suppressing the expression itself.
  • suppression of expression by siRNA or antisense DNA is effective only for a short period of time because its action does not continue after these reagents are degraded in vivo.
  • expression is suppressed via the epigenome or chromatin structure, the effect is memorized in cells as the epigenome or chromatin structure, and the effect lasts for a long period of time.
  • the present inventors have diligently studied means for achieving enhancement of target gene expression and suppression of expression using dCas9.
  • the modified SunTag system that induces both transcription-related factor or chromatin-related factor and demethylase into the target gene using dCas9-SunTag, the transcription-related factor or chromatin-related factor alone or demethylase enzyme alone
  • gene expression can be significantly activated as compared to induction.
  • the introduction of a combination of a transcriptional activator and a demethylase by dCas9-SunTag is considered to be applicable to a wider range of targets because it can promote a wide range of gene expression.
  • the modified SunTag system which uses dCas9-SunTag to induce both transcriptional repressors and methylation factors into target genes, significantly increases gene expression compared to induction of transcriptional repressors alone or methylation factors alone. It was found that it can be suppressed.
  • the introduction of a combination of a transcriptional repressor and a methylating factor by dCas9-SunTag is considered to be applicable to a wider range of targets because it can suppress a wide range of gene expression.
  • the modified SunTag system shows excellent activity when compared with direct fusion systems (eg, dCas9-TET1CD and dCas9-VP64) using the same sgRNA.
  • the direct fusion system has a low degree of activation with a single sgRNA and requires multiple sgRNAs to reliably activate transcription (Bamann, V. et al., Supra).
  • the modified SunTag system of the present invention can reliably activate or suppress the expression of the target gene with only one type of sgRNA. Therefore, the modified SunTag system has a very simple configuration and can be used for various purposes such as therapeutic applications. Another advantage of the modified SunTag system is the length of each component.
  • both dCas9 and the factor to be introduced are genes with a long sequence length, the packaging ability is limited. It cannot be used in a direct fusion system with viral vectors that are usually used in gene therapy.
  • the modified SunTag system can also be used in viral vectors because the total length of dCas9 and SunTag is very short.
  • a modified SunTag system eg, a modified SunTag system that employs TET1 and VP64 or p65-HSF1 as a transcriptional activator
  • WO2018 / 053037 which disclosed a method for introducing a plurality of TET1CD and other factors into a guide RNA
  • GADD45A and TET1CD which are demethylation promoting domains
  • the modified SunTag system of the present invention differs from the technique described in the document in that a plurality of factors are introduced into dCas9, and as a result, results different from those in the document are obtained.
  • the GADD45A adopted in WO2018 / 053037 can also be activated in the system of the present invention, but the transcriptional activators (VP64 and p65-HSF1) give better results than the GADD45A in the system of the present invention. Indicated.
  • dCas9-SunTag It is a schematic diagram of the modified dCas9-SunTag for recruiting TET1 and another factor X at the same time.
  • dCas9-SunTag dCas9 is fused with multiple GCN4 peptide tag tandem sequences that are separated and bound by an amino acid linker.
  • Modified dCas9-SunTag can recruit multiple anti-GCN4 peptide antibody (scFv) fusion TET1 (scFv-TET1) and scFv fusion factor X (scFv-X), synergistically activating target genes by them. Can bring. It is a graph which shows the expression level of each target gene whose expression was enhanced by dCas9-Suntag.
  • the target gene names (CARD9, KDM2B, RAB19, and CNKSR1) are listed at the top of each graph. The explanation of the graph below is the same in FIGS. 2B and 2C.
  • the target gene expression levels in A549 cells transfected with dCas9-Suntag and scFv-TET1 are listed on the far left of each graph (TET1).
  • Each factor X (VP64, p65-HSF1, p300, SS18, GADD45A, FOXA1, and PU.1) whose combined effect with TET1 was examined is shown on the horizontal axis.
  • the left side indicates the target gene expression level in A549 cells transfected with dCas9-SunTag and scFv-X
  • the right side indicates the TET1 column is "+”
  • the expression level values on the vertical axis are the values obtained by normalizing the expression level of the target gene analyzed by RT-PCR for each test cell with respect to the expression level of actin, and the cells transfected with GFP, which is a negative control.
  • the expression of the target gene (listed at the top) that intersects in the cell has a significant synergistic effect by using TET1 and the factor that intersects in the cell (listed in the leftmost column) in combination. Means to indicate (P ⁇ 0.05).
  • Each column shows the factors tested (VP64, p65-HSF1, p300, SS18, GADD45A, FOXA1, and PU.1 in order from the top), and each column shows the target genes (CARD9, KDM2B, RAB19 in order from the left). , CNKSR1, SBNO2, SPARC, CLEC11A, HGF, TCF21, and TINAGL1).
  • Target gene names (CARD9, KDM2B, RAB19, CNKSR1, SBNO2, and SPARC) are listed at the top of each graph.
  • the left bar represents the expression level of the target gene in cells transfected with dCas9-SunTag, scFv-TET1, and scFv-VP64
  • the right bar represents the expression level of the target gene in cells transfected with dCas9-TET1 and dCas9-VP64.
  • the expression level values on the vertical axis are the values obtained by normalizing the expression level of the target gene analyzed by RT-PCR for each test cell with respect to the expression level of actin, and the cells transfected with GFP, which is a negative control. Shown as a multiple of the corresponding value of.
  • the SunTag system showed better transcriptional activation at p ⁇ 0.05
  • KDM2B, CNKSR1, SBNO2, and SPARC the SunTag system showed better transcriptional activation at p ⁇ 0.01. showed that.
  • the horizontal axis shows the results of fusing 1: TET1 alone, 2: VP64 alone, 3: TET1 and VP64 with scFv, and 4: 5: fusion protein of TET1 and VP64 with scFv.
  • the vertical axis represents the target gene expression level. (Right) The structure of the scFv fusion protein used in each experiment is shown. Both when the independent TET1 and VP64 were used together (3) and when TET1 and VP64 were fused (4,5), the transcriptional activation was improved as compared with TET1 alone (1) and VP64 alone (2). It was seen. When TET1 and VP64 were fused, the effect was superior when TET1 was fused at the N-terminal of VP64.
  • scFv-GCN4-X X is a methylation factor or a transcription repressor
  • the upper figure shows the results on the 5th day, and the lower figure shows the results on the 10th day.
  • the horizontal axis is 1: DNMT3A alone, 2: DNMT3B alone, 3: DNMT3A, and KRAB fused with scFv, 4: DNMT3B, and KRAB fused with scFv, 5: DNMT3A, KRAB, and DNMT3L, respectively.
  • the vertical axis represents the target gene expression level. * Represents PV ⁇ 0.05 and ** represents PV ⁇ 0.01.
  • the expression level on the vertical axis indicates a value normalized to the value when the control is 1. Expression suppression was stronger in combination with KRAB (3,4) and in combination with KRAB and DNmt3L (5,6) than in combination with DNmt3a alone (1) and DNmt3b alone (2). In addition, the results on the 10th day after transfection showed that the presence of DNmt3L strongly maintained the suppression of expression.
  • a plurality of peptide tags are bound to dCas9 induced in the vicinity of the transcriptional regulatory region of a gene whose transcription is to be promoted by sgRNA or a gene whose transcription is to be suppressed (referred to as "target gene” in the present specification).
  • DCas9-Tag a fusion in which a demethylase is fused to a peptide tag binding site that can bind to the peptide tag, and a transcription-related factor or chromatin-related factor at the peptide tag binding site that can bind to the peptide tag.
  • a fusion of a demethylase and a transcription-related factor or a chromatin-related factor at a peptide tag binding site capable of binding to the peptide tag can induce demethylases and transcription-related factors and / or chromatin-related factors in the sgRNA-binding region.
  • dCas9-Tag a fusion in which a methylating factor was fused to a peptide tag binding site capable of binding to the peptide tag, and a transcription inhibitor fused to a peptide tag binding site capable of binding to the peptide tag.
  • Methylation to the sgRNA binding region by use in combination with a fusion or (ii) using a fusion of a methylating factor and a transcriptional repressor at a peptide tag binding site capable of binding to the peptide tag.
  • Factors and transcriptional repressors can be induced.
  • dCas9-SunTag system in addition to sgRNA, dCas9, peptide tag, and peptide tag binding site, (a) demethylase and transcription-related factor and / or chromatin-related factor, ( b) Containing a complex of a demethylase and a transcription-related factor and / or a chromatin-related factor, (c) a methylating factor and a transcriptional repressor, and (d) a complex of a methylating factor and a transcriptional repressor.
  • the complex binds to the transcriptional regulatory region of the target gene via sgRNA.
  • An example of the above (a) is shown in FIG.
  • demethylase and transcription-related factors and / or chromatin-related factors induced in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene by the formation of this complex cause the expression of the target gene by demethylation and transcription activation, respectively.
  • methylation factors and transcriptional repressors induced in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene by the formation of this complex suppress the expression of the target gene by methylation and transcriptional repression, respectively.
  • factors introduced into the target sequence as a fusion with a peptide tag binding site namely demethylase, transcription-related factor, chromatin-related factor, methylation factor, and transcriptional repressor (in the present specification).
  • Factors introduced into the target sequence may be independently fused to the peptide tag binding site, or two or more of them may be fused to the same peptide tag binding site as a fusion protein. May be.
  • the types of "factors introduced into the target sequence” include at least two or more types including either a demethylase or a methylating factor.
  • demethylase and transcription-related factor may be used, and three or more types (for example, demethylase and 2) may be used.
  • three or more types for example, demethylase and 2
  • Two types of transcription-related factors, demethylase and transcription-related factor and chromatin-related factor, two types of demethylase and transcription-related factor, or two types of methylation factor and transcriptional repressor) are used. May be good.
  • There is one type of "fusion of peptide tag binding site and factor introduced into the target sequence" used in the modified dCas9-SunTag system of the present invention for example, peptide tag binding site, demethylase and transcription-related).
  • two or more combinations (a fusion of a peptide tag binding site and a demethylase, a fusion of a peptide tag binding site and a transcription-related factor, a peptide tag binding site and a demethylase)
  • the "transcription-related factor and / or chromatin-related factor” is either a transcription-related factor fused to a peptide tag binding site or a chromatin-related factor fused to a peptide tag binding site.
  • One type may be used, or two or more types including either two or more types or both may be used.
  • the term "one or more fusions containing a peptide tag binding site and a transcription-related factor or a chromatin-related factor” means that there is one or more types of fusion, and the peptide tag binding site.
  • One or more fusions of and transcription-related factors; one or more fusions of peptide tag binding sites and chromatin-related factors; and fusions of peptide tag binding sites and transcription-related factors and peptide tag binding sites Each contains one or more fusions with chromatin-related factors. That is, when two or more types are used, two or more types may be used as the transcription-related factor fused to the peptide tag binding site, or two or more types may be used as the chromatin-related factor fused to the peptide tag binding site. , Two or more types including both transcription-related factors fused to the peptide tag binding site and chromatin-related factors fused to the peptide tag binding site may be used. It should be noted that the fact that the peptide tag binding site and the transcription-related factor or chromatin-related factor are specified as "one or more fusions" is not described with the intention of limiting the other factors to one type. No.
  • one or more types mean one type or two or more types, and two or more types are, for example, two types, three types, four types, five types, or six types, or more. You may.
  • the invention relates to a kit for a modified dCas9-SunTag system. Specifically, it is a kit for activating target gene expression.
  • a kit for activating target gene expression (1) A fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker, or a nucleic acid molecule encoding the same.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • the present invention relates to a kit containing a guide RNA (gRNA) containing a sequence complementary to a DNA sequence near the transcriptional regulatory region of a target gene, or a nucleic acid molecule expressing the guide RNA.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention is a kit for suppressing target gene expression.
  • the present invention relates to a kit containing a guide RNA (sgRNA) containing a sequence complementary to a DNA sequence near the transcriptional regulatory region of a target gene, or a nucleic acid molecule expressing the guide RNA.
  • sgRNA guide RNA
  • the invention in another aspect, relates to a complex that constitutes a modified dCas9-SunTag system. Specifically, it is a complex for activating target gene expression.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • the present invention relates to a complex containing a guide RNA (gRNA) containing a sequence complementary to a DNA sequence near the transcriptional regulatory region of a target gene.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention is a complex for suppressing target gene expression.
  • the present invention relates to a complex containing a guide RNA (sgRNA) containing a sequence complementary to a DNA sequence near the transcriptional regulatory region of a target gene.
  • sgRNA guide RNA
  • the invention relates to a method of activating gene expression utilizing a modified dCas9-SunTag system.
  • the present invention relates to a method for activating the expression of a target gene, which comprises introducing the following (1) to (3) into cells containing the target gene: (1) A fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker, or a nucleic acid molecule encoding the same.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • the present invention relates to a guide RNA (gRNA) containing a sequence complementary to a DNA sequence near the transcriptional regulatory region of a target gene, or a nucleic acid molecule expressing the guide RNA.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention is a method for activating the expression of a target gene, in which the following components (1) to (3) are brought into contact with the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the following components (1) to (3) are brought into contact with the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the following components (1) to (3) are brought into contact with the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the following components (1) to (3) are brought into contact with the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • gRNA guide RNA
  • the present invention relates to a method for suppressing gene expression using a modified dCas9-SunTag system.
  • the present invention relates to a method for suppressing the expression of a target gene, which comprises introducing the following (1) to (3) into cells containing the target gene: (1) A fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker, or a nucleic acid molecule encoding the same; (2) (i) A fusion containing a peptide tag binding site and a methylating factor, or a nucleic acid molecule encoding the same, and a fusion containing a peptide tag binding site and a transcriptional repressor, or a nucleic acid encoding the same.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • Nucleic acid or (Ii) A fusion containing a peptide tag binding site, a methylating factor, and a transcriptional repressor, or a nucleic acid molecule encoding the same; (3) Guide RNA (sgRNA) containing a sequence complementary to the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene, or a nucleic acid molecule expressing it.
  • sgRNA Guide RNA
  • the present invention is a method of suppressing the expression of a target gene, in which the following components (1) to (3) are brought into contact with a DNA sequence in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • sgRNA guide RNA
  • dCas9 having no nuclease activity
  • Cas9 null mutant a variant of Cas9 into which an amino acid mutation that deletes nuclease activity has been introduced, and is also called a Cas9 null mutant.
  • Cas9 into which the D10A mutation in the RuvC nuclease domain and the H840A mutation in the HNH nuclease domain have been introduced is used.
  • the N863A mutation can also result in deficiency of nuclease activity.
  • the nucleic acid molecule expressing dCas9 can be obtained from a commercially available plasmid (Addgene; plasmid # 1000091) or the like.
  • a “peptide tag array” is a combination of multiple peptide tags linked via a linker.
  • “Peptide tag” means a peptide consisting of an amino acid sequence that can specifically bind to a specific structure.
  • the “peptide tag binding site” means a site having the specific structure capable of specifically binding to the peptide tag. Any combination of the peptide tag and the peptide tag binding site can be used as long as it is a combination that specifically binds to each other.
  • the binding of the peptide tag to the peptide tag binding site is biologically orthogonal to the intracellular reaction that contains the target gene.
  • Examples of the combination of the peptide tag and the peptide tag binding site include a combination of a peptide epitope and an antibody that recognizes the peptide epitope, and a combination of a small fragment and a large fragment of a split protein having a self-assembling ability.
  • GCN4 General Control Non-depressible 4
  • GCN4 peptide epitope and anti-GCN4 peptide epitope antibody His tag and anti-His tag antibody
  • EE hexapeptide and anti-EE hexapeptide antibody c. -Myc tag and anti-c-Myc tag antibody
  • HA tag and anti-HA tag antibody S tag and anti-S tag antibody
  • FLAG tag and anti-FLAG tag antibody etc.
  • GCN4 peptide can be used without limitation as long as it is an epitope contained in GCN4, but the amino acid sequence represented by EELLSKNYHLENEVARLKK (SEQ ID NO: 1) is preferable.
  • the peptide tag binding site is an antibody that recognizes a peptide epitope
  • the antibody may be a substance containing an antibody fragment or an antibody fragment as long as it has specific binding property to the peptide tag, in addition to a complete antibody. ..
  • the variable regions (particularly CDRs) of an antibody impart binding properties to an antibody, for example, F (ab') 2 , Fab', Fab, Fab 3 , one.
  • scFv Chain Fv
  • Single chain triple body Nanobody, diverent VHH, pentavalent VHH, minibody, (double chain) diabody, tandem diabody, triabody (or tribody), tetrabody (Or [sc (Fv) 2 ] 2 ), or (scFv-SA) 4 ) disulfide-bound Fv (hereinafter referred to as "dsFv”), heavy chain antibodies, or polymers thereof can also be used (Nature Biotechnology, 29 (1): 5-6 (2011); Manesh Jean et al., TRENDS in Biotechnology, 25 (7) (2007): 307-316; and Christoph Stein et al., Antibodies (1): 88-123 (2012). )reference).
  • a split protein with self-assembling ability is a pair of proteins that can reorganize two separated protein fragments to form the same structure as the original when a certain protein is divided into two.
  • a short peptide (small fragment) obtained by dividing the original protein into two parts can be used as a peptide tag, and a long peptide (large fragment) can be used as a peptide tag binding site (Curent Opinion in Chemical Biology (2011) 15: See 789-797 and WO2005 / 074436).
  • a split protein having such self-assembling ability a small fragment of GFP (Green Fluorescent Protein) can be used as a peptide tag, and a large fragment of GFP can be used as a peptide tag binding site.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the binding between the peptide and the protein domain is stored in a database.
  • the peptide tag and the peptide tag can be referred to by referring to Peptide Binding Proteins Database (http://pepbind.bicpu.edu.in/home.php). You can find a combination of joints.
  • GVKESLV SEQ ID NO: 2
  • PDZAlpha-Sytrophin PDZ protein interaction domain can be used as a peptide tag binding portion.
  • the binding force of the peptide-peptide bond site pair can be strengthened by binding another inactive domain using a linker and improving it by evolutionary engineering (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008). ) Vol. 105 (18): 6578-6583).
  • the "peptide tag binding site" to be fused with the factor introduced into each target sequence may be the same or different.
  • a peptide tag binding site that fuses with a demethylase and a peptide tag binding site that fuses with a transcription-related factor or chromatin-related factor may be the same or different.
  • the peptide tag binding site to be fused with the methylating factor and the peptide tag binding site to be fused with the transcriptional repressor may be the same or different.
  • peptide tag binding sites are the same, demethylase and both transcription-related factors or chromatin-related factors can be bound to a peptide tag array containing one type of peptide tag, or , Both methylating factors and transcriptional repressors can be bound.
  • the peptide tag binding site to be fused with the demethylase and the peptide tag binding site to be fused with the transcription-related factor or chromatin-related factor are different, or the peptide tag binding site to be fused with the methylating factor is fused with the transcription inhibitor.
  • a peptide tag array containing the peptide tags corresponding to each peptide tag binding site is used.
  • the position and number of the corresponding peptide tags it is possible to regulate the number and position of the demethylase to be bound and the transcription-related factor or chromatin-related factor, or the methylation factor and the transcriptional repressor. can.
  • a demethylase and a transcription-related factor or a chromatin-related factor as a fusion or when using a methylation factor and a transcriptional repressor as a fusion, two or more kinds of fusions are used. In some cases, the same or different peptide tag binding sites can be used as well.
  • the "linker” contained in the peptide tag array can be any sequence as long as it does not interfere with the binding between the peptide tag and the peptide tag binding site and does not interfere with the desired effect in the present invention. It is preferable that it does not affect the intracellular reaction containing the target gene. All the linkers contained in the peptide tag array may have the same length or sequence, or linkers of two or more kinds of lengths or sequences may be used in combination. As the linker, a repeating sequence of glycine and serin is typically used. The length of the linker can be 5 to 100 amino acids, 5 to 50 amino acids, 10 to 50 amino acids, 15 to 50 amino acids, 15 to 40 amino acids, 17 to 30 amino acids, or 22 amino acids.
  • linker sequences include, for example, GSGSG (SEQ ID NO: 3), GSGGS (SEQ ID NO: 4), SGSGS (SEQ ID NO: 5), GGGGS (SEQ ID NO: 6), or a sequence thereof that is repeated 2-3 times, or GSGSGGSGSGSGGSGSGGSGSG (SEQ ID NO: 7), or the like JiesujiesujijiesujiesujijiesujiesujijiesujiSGGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 8).
  • a linker is inserted between a plurality of peptide tags to be bound.
  • the number of peptide tags contained in the peptide tag array can be increased or decreased as appropriate depending on the distance from the target site to the transcriptional regulatory region, the type of demethylase and transcription-related factor or chromatin-related factor, the length of the linker, etc. For example, it may be 2 to 30, 3 to 15, 3 to 10, or 3 to 5.
  • any enzyme that catalyzes a series of reactions leading to demethylation of the methylation site can be used without limitation, and Ten-eleven translocation 1 (TET1), Ten. -Eleven translocation 2 (TET2), Ten-eleven translocation 3 (TET3), Thymine-DNA glycosylase (TDG) are included.
  • the demethylating enzyme may be all of the amino acids constituting the enzyme protein or a part thereof (for example, an enzyme catalyst site) as long as the enzyme activity is retained.
  • the catalyst site (TET1CD) of Ten-eleven translocation 1 can be used as the demethylase.
  • transcription-related factor means a factor involved in the regulation of DNA transcription, and is a transcriptional activator such as VP64, p65-HSF1, VPR, and Rta; p300 (EP300), ARA54, ATXN7L3, Coactivators (mediators, transcriptional regulators) such as BCL3, CBP, CDC25B, COPS5, DDC, KAT5, KDM1A; and FOXA1, PU. Includes pioneer factors such as 1, and Ascl1. Of these, “transcriptional activator” means a protein that binds to a specific base sequence on genomic DNA and promotes transcription by RNA polymerase.
  • an appropriate factor may be selected based on the gene sequence of the transcriptional regulatory region of a known target gene, or a transcriptional activator involved in the regulation of the target gene is already known.
  • a transcriptional activator may be adopted, and for example, it can be investigated using a database such as JASPAR (http://jaspar.genereg.net/).
  • chromatin-related factor means a factor involved in the regulation of chromatin in transcription, and includes a chromatin remodeling factor such as SS18; and a heterochromatin relaxer such as GADD45A.
  • methylation factor can be used without limitation as long as it is an enzyme that catalyzes a series of reactions leading to methylation of a methylation site or a factor that assists it. And / its cofactors can be mentioned.
  • Specific methylating factors include DNA methyltransferases (DNMT) 3A, DNMT3B, and DNMT3L.
  • DNMT3A or DNMT3B and DNMT3L are used in combination as a methylation factor.
  • transcription-suppressing factor means a factor that suppresses transcription, and examples thereof include Kruppel-associated box (KRAB).
  • a fusion containing dCas9 and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker is expressed as one molecule by, for example, binding a DNA encoding dCas9 and a DNA encoding a peptide tag array.
  • a fusion containing a peptide tag binding site and a factor introduced into the target sequence can be obtained by binding the DNA encoding the peptide tag binding site with the DNA encoding the factor introduced into the target sequence. It can be produced by expressing it as a molecule.
  • the guide RNA (gRNA) in the present specification is an artificially linked tracrRNA and crRNA in the CRISPR / Cas method.
  • a plasmid capable of expressing a desired gRNA by inserting a DNA sequence corresponding to an arbitrary crRNA is commercially available (Addgene plasmid 41824, etc.).
  • the crRNA a sequence complementary to the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene is used.
  • the gRNA may be one type, or a plurality of gRNAs containing different crRNAs for a single target gene may be used.
  • a nucleic acid molecule means a polynucleotide encoding a desired protein or peptide, such as deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), fragments produced by polymerase chain reaction (PCR), and linkages. , Cleavage, endonuclease action and exonuclease action may be any of the fragments produced.
  • the monomer constituting the nucleic acid molecule may be an artificially modified nucleotide as well as a naturally occurring nucleotide.
  • the fusions of (1) and (2) described herein may contain marker molecules in whole or in part.
  • the marker molecule may be, for example, a selection marker for selecting the cell into which the gene has been introduced, or a marker for visualizing the cell into which the gene has been introduced.
  • a "selectable marker” is a genetic element that provides a selectable phenotype for cells into which a selectable marker has been introduced, and generally refers to the resistance of a gene product to a drug that inhibits cell growth or kills the cell. It is a gene to give. Specifically, for example, Neo gene, Hyg gene, hisD gene, Gpt gene and Bl gene can be mentioned.
  • the "label marker” is a protein whose presence can be detected by luminescence, color development, etc., for example, green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), GFP, Discosoma red fluorescent protein (Ds-Red), TagRFP. , TurboRFP, tdTomato, mCherry, mKate, mRubi, mBana, mOrange, mPlum, mStrawbury, and Vimentin.
  • the marker molecule may be expressed in an expression cassette different from the fusion described herein, or may be described herein via an IRES (Internal Ribo-somal Entry Systems) sequence, 2A sequence, or the like. It may be expressed by one type of expression cassette by binding to the fusion.
  • IRES Internal Ribo-somal Entry Systems
  • sequence information of the protein, fusion, or nucleic acid molecule for example, DNA or RNA
  • sequence information of the protein, fusion, or nucleic acid molecule is available from Protein Data Bank, GenBank, and the like.
  • RNA sequences corresponding to the DNA sequence information can also be obtained by using sequence conversion software or the like as appropriate.
  • the proteins or fusions described herein can be obtained by known molecular biology techniques using the DNA encoding them, eg, the DNA encoding the protein or fusion of interest is suitable. It can be obtained by inserting it into an expression vector and expressing it.
  • kits herein may be further included with an outer box, container, diluent, turbid agent, and / or instructions for preparation and use.
  • the components (1) to (3) are stored and provided in different containers, but a plurality of components may be contained in one container.
  • the target gene expression activation complex or the target gene expression suppression complex is preferably formed in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene, but this is not necessarily for target gene expression activation. It does not mean that all the formation of the complex or the complex for suppressing the expression of the target gene is performed in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene, and as long as the object of the present invention is achieved, the complex is formed outside the region.
  • a complex may be formed in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene by binding the complex or a part thereof in the vicinity of the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • near the transcriptional regulatory region of the target gene includes the transcriptional regulatory region of the target gene and is for the target gene expression activation complex or target gene expression suppression described in the present specification. It contains a region in which transcription of the target gene can be activated or suppressed by binding of the complex.
  • examples of such a region include a transcriptional regulation region and a region included within 1 kb from both ends of the transcriptional regulatory region.
  • the nucleic acid molecule when a nucleic acid molecule is introduced into a cell containing a target gene, the nucleic acid molecule is introduced as an expression cassette capable of expressing the nucleic acid molecule.
  • the expression cassette contains the sequences required for expression of the nucleic acid molecule, such as promoters, terminators, operators, and / or enhancers.
  • the expression cassette is usually introduced in a state of being inserted into a vector.
  • vectors examples include vectors that can replicate in eukaryotic cells, as well as vectors that maintain episomes or integrate into the host cell genome, such as plasmid vectors or viral vectors (adenovirus vectors, lentivirus vectors and Adeno-associated viral vectors, etc.) are included.
  • the nucleic acid molecules (1) to (3) described in the present specification may be expressed by different expression cassettes, or two or more types of nucleic acid molecules may be expressed in an IRES (Internal Ribo-somal Entry Systems) sequence or It may be expressed by one type of expression cassette via a 2A sequence or the like.
  • IRES Internal Ribo-somal Entry Systems
  • the nucleic acid molecules (1) to (3) described in the present specification may be introduced by different vectors, or two or more kinds of nucleic acid molecules are loaded and introduced into one kind of vector. You may.
  • the nucleic acid molecules (1) to (3) are activated promoters (CMV promoter, EF1 promoter, CAG promoter, etc.) having high ubiquitous activity in a wide range of cells, and specific cells (for example, specific cells). Introduced into cells by linking under expression control by promoters (SV40 promoter, Nanog promoter, tert promoter, etc.) known to be specifically activated in tissue cells and diseased cells such as cancer cells).
  • the nucleic acid molecules of (1) to (3) may be expressed only by the above-mentioned, or the expression may be promoted in response to a specific stimulus.
  • a structure in which expression is promoted in response to a specific stimulus a structure in which nucleic acid molecules (1) to (3) are linked under the control of a promoter, enhancer, operator, etc. that promotes expression in response to a specific stimulus.
  • the nucleic acid molecules of (1) to (3) may be expressed by being included and giving the stimulus at an arbitrary timing. Examples of such a structure include a tet operator, a LexA binding region, and a GAL4 binding region.
  • the nucleic acid molecules or proteins (1) to (3) can be introduced into cells by using any known means, and for example, commercially available transfection reagents may be used.
  • transfection reagents for DNA or RNA transfection, electroporation, Lipofectamine 2000 or 3000 (Invitrogen), jetPRIME Kit (Polyplus transfection), DreamFect (Ozbioscience), GenePorter3000 (Ozbioscience), Calcium Phosphate Transfection. Oz bioscience), RNAi Max (Invitrogen), MessengerMAX (Invitrogen), microinjection and the like can be used.
  • it may be introduced using the above-mentioned vector such as a viral vector, liposomes, or the like.
  • Lipofectamine CRISPRMAX Invitrogen
  • PULSin Polyplus transfection
  • Pro-DeliverIN Ozbioscience
  • BioPORTER Protein Delivery Reagent Genelantis
  • microinjection etc.
  • it may be introduced using liposomes or the like.
  • transfecting a protein into cells a complex of any number of combinations (1) to (3) (however, (1) is always included) is formed in advance, and the complex is transfected into cells. You may.
  • the method for activating the expression of the target gene of the present invention can be carried out, for example, by introducing the following components (1) to (3) into cells containing the target gene: (1) A fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • gRNA guide RNA
  • the method for suppressing the expression of the target gene of the present invention can be carried out, for example, by introducing the following components (1) to (3) into cells containing the target gene: (1) A fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • gRNA guide RNA
  • the method of activating the expression of the target gene of the present invention is (1) A nucleic acid molecule encoding a fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker. (2) (i) A nucleic acid molecule encoding a fusion containing a peptide tag binding site and a demethylase, and one or more fusions containing a peptide tag binding site and a transcription-related factor or a chromatin-related factor.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • Nucleic acid molecule or (Ii) A nucleic acid molecule encoding one or more fusions comprising a peptide tag binding site, a demethylase, and a transcription-related factor or chromatin-related factor; (4) Expression of the nucleic acid molecules of (1) to (3) in cells into which a nucleic acid molecule expressing a guide RNA (gRNA) containing a sequence complementary to the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene has been introduced. It can be done by promoting it.
  • gRNA guide RNA
  • the method for suppressing the expression of the target gene of the present invention is (1) A nucleic acid molecule encoding a fusion containing an inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9 (dCas9) having no nuclease activity and a peptide tag array in which a plurality of peptide tags are bound via a linker. (2) (i) A nucleic acid molecule encoding a fusion containing a peptide tag binding site and a methylating factor, and a nucleic acid molecule encoding one or more fusions containing a peptide tag binding site and a transcriptional repressor.
  • dCas9 inactivated CRISPR-associated endonucleose Cas9
  • nucleic acid molecule encoding one or more fusions comprising a peptide tag binding site, a methylating factor, and a transcriptional repressor; (4) Expression of the nucleic acid molecules of (1) to (3) in cells into which a nucleic acid molecule expressing a guide RNA (gRNA) containing a sequence complementary to the DNA sequence near the transcriptional regulatory region of the target gene has been introduced. It can be done by suppressing it.
  • gRNA guide RNA
  • the method of activating or suppressing the expression of the target gene by promoting the expression of the nucleic acid molecules of (1) to (3) is to introduce the nucleic acid molecules before the method. It may include the introduction. Further, when a cell into which a nucleic acid molecule has been introduced is used, the transcriptional regulatory region of the nucleic acid molecule of (1) to (3) has a structure in which expression is promoted in response to a specific stimulus, and by applying the stimulus, the expression is promoted. It may have a promoter or the like in which the expression of the nucleic acid molecules (1) to (3) is promoted or the expression is activated in a specific cell.
  • the target gene expression of the present invention can be activated in vivo, in vitro, or ex vivo.
  • A549 (RIKEN BRC) cells were cultured in minimum essential medium (MEM) (M4655-500ML, sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and non-essential amino acids at 37 ° C. under 5% CO 2.
  • MEM minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • A549 cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. Forty-eight hours after transfection, Blasticidin-S (Invitrogen, CA, USA) was added to the medium at a final concentration of 2 ⁇ g / ml. Three days after the selection, cells were harvested and used for analysis.
  • Example 1 Modified dCas9-SunTag for simultaneously recruiting TET1 and different factors.
  • a GCN4 peptide tag EELLSKNYHLENEVARLK: sequence 1 consisting of dCas9 and 19 amino acids (aa) in which multiple copies are linked at intervals via a 22 amino acid linker (GSGSGGGSGSGSGGSGSGGSGSG: SEQ ID NO: 7). Fused with a tandem sequence.
  • Modified dCas9-SunTag can induce multiple copies of the anti-GCN4 peptide antibody (scFv) fusion TET1 (scFv-TET1) to the target promoter, resulting in gene demethylation and activation.
  • TET1 and X The synergistic effect of TET1 and X was determined as follows.
  • the expression level of the target gene in cells transfected with dCas9-SunTag and scFv-X (Fig. 2, TET1 (-)) was adjusted to the expression level of the target gene in cells transfected with dCas9-SunTag and scFv-TET1 (Fig. 2, TET1). Cells showing high expression levels were selected as compared to the expression level of.
  • the expression level of the target gene was compared with the expression level of the target gene in cells transfected with dCas9-SunTag, scFv-TET1, and scFv-X (Fig. 2 TET1 (+)).
  • sgRNA sgRNA corresponding to CARD9, KDM2B, RAB19, CNKSR1, SBNO2, SPARC, CLEC11A, HGF, TCF21, and TINAGL1 was used.
  • Example 2 Comparison between modified SunTag and direct fusion of dCas9
  • sgRNAs single guide RNAs
  • Activation by dCas9-VP64 is ameliorated by use with dCas9 fused with TET1 involved in the first enzymatic step of DNA demethylation (see Baumann, V. et al. Nature communications 2019, 10, 2119.).
  • the activation by the direct fusion system and the activation by the modified SunTag system were compared.
  • the expression levels of the target genes in cells transfected with dCas9-SunTag, scFv-TET1 and scFv-VP64 were transfected with dCas9-TET1 and dCas9-VP64. It was compared with the expression level of the target gene in the cell.
  • the sgRNAs corresponding to CARD9, KDM2B, RAB19, CNKSR1, SBNO2, SPARC, CLEC11A, HGF, and TINAGL1 were used. As a result, in the investigated genes, the system using SunTag showed significantly better activation (FIGS. 4A and 4B).
  • the modified dCas9-SunTag By using the modified dCas9-SunTag, multiple factors could be induced to the target gene, and transcription could be activated synergistically. As a result of searching for a factor capable of exerting a synergistic effect with TET1 by using the modified dCas9-SunTag, p65-HSF1, p300, SS18, GADD45A, FOXA1, or PU. 1 showed a synergistic effect with TET1 for the expression of at least one gene. Among them, VP64 showed the best results because it showed a synergistic effect on a wide range of genes.
  • Example 2 Modified dCas9-SunTag for simultaneously recruiting TET1 and a fusion of different factors.
  • sgRNA A 20 bp sequence unique to the CARD9 gene was selected around the transcription initiation site. The selected gRNA was cloned under the control of the human U6 promoter (gRNA_Cloning Vector BbsI, Addgene 128433). The target sequence was TGGGAGCAGCTTTTCCTTGG (SEQ ID NO: 10).
  • A549 cells (RIKEN BRC, Tsukuba, Japan) contain 10% fetal bovine serum (FBS) and non-essential amino acids in the minimum essential medium (MEM) (M4655-500ML, Sigma-Aldrich,). In St. Louis, Missouri, USA), the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2. A549 cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Blasticidin S (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added to the medium 48 hours after transfection at a final concentration of 2 ⁇ g / mL. Three days after selection, cells were harvested and analyzed.
  • FBS fetal bovine serum
  • MEM minimum essential medium
  • the molar ratio of the dCas9-SunTag vector: scFv-TET1 vector: scFv-VP64 vector: sgRNA vector used for transfection was 1: 1: 1: 1.5.
  • the molar ratio of the dCas9-SunTag vector: scFv-TET1-VP64 (or scFv-VP64-TET1) fusion vector: sgRNA vector used for transfection was 1: 1: 1.5. bottom. All constructs except the sgRNA vector were expressed under the control of the CAG promoter.
  • As the primer sequences CAGGCTCCTGGTGTGTTCTG (SEQ ID NO: 20) and CTCCAGCACTCGTCATCGT (SEQ ID NO: 21) were used.
  • Example 3 Modified dCas9-SunTag for simultaneous recruitment of TET1 and transcriptional repressors
  • Construction of sgRNA A 22 bp sequence unique to the Lect2 gene was selected around the transcription initiation site. The selected gRNA was cloned under the control of the human U6 promoter. The target sequence was CAAGAGCAGCATACACTTAGG (SEQ ID NO: 40).
  • TLR3 Cell culture and transfection TLR3 (JCRB, Ibaraki, Japan) cells are 2% fetal bovine serum (FBS), 10 ng / ml EGF, 5 ⁇ g / L monoethanolamine, 10 ⁇ g / ml transferrin, and 1 ⁇ g / ml insulin.
  • FBS fetal bovine serum
  • EGF EGF
  • 5 ⁇ g / L monoethanolamine EGF
  • 10 ⁇ g / ml transferrin 10 ⁇ g / ml transferrin
  • 1 ⁇ g / ml insulin was obtained from fetal bovine serum (FBS), 10 ng / ml EGF, 5 ⁇ g / L monoethanolamine, 10 ⁇ g / ml transferrin, and 1 ⁇ g / ml insulin.
  • DMEM Dalvecco Modified Eagle's Medium
  • TLR3 cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • Blasticidin S (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added to the medium 48 hours after transfection to a final concentration of 2 ⁇ g / mL. Three days after selection, a portion of the cells was collected (day 5) and analyzed. The remaining cells were cultured for another 5 days and recovered (day 10). Transfection was performed using equimolar dCas9-SunTag vector, scFv vector, and sgRNA vector. All constructs except the sgRNA vector were expressed under the control of the CAG promoter.
  • the primer sequences were GTGCCAGCAAAATTTCCAAC (SEQ ID NO: 41) and TTCCCAGTGAATTGGTGCATA (SEQ ID NO: 42).

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Abstract

内因性遺伝子の過剰発現を利用した治療の重要性が高まっており，強力な遺伝子を活性化でき，かつ，ウイルスベクターにクローニング可能な小さいサイズのシステムが，新たな遺伝子治療のツールとして求められている。本発明は，内因性遺伝子を過剰発現可能なシステムを提供する。具体的には，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを利用して転写関連因子またはクロマチン関連因子と脱メチル化酵素の両方を標的遺伝子に誘導する改変ＳｕｎＴａｇシステムにより，転写関連因子またはクロマチン関連因子単独又は脱メチル化酵素単独の誘導と比較して，遺伝子発現を有意に活性化可能なシステムが提供される。ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇによる転写関連因子またはクロマチン関連因子と脱メチル化酵素の組み合わせの導入は，幅広い遺伝子発現を促進させることができることから，より広範な標的に対して適用可能である。

Description

脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子を用いた特定遺伝子の相乗的発現誘導法 関連出願の相互参照
　本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また，本願は日本国において２０２０年２月２１日に出願された，日本国特許出願第２０２０－０２８６９４号の優先権を主張する。本願が優先権を主張する特許出願記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。
　本発明は，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを用いる特定の内因性遺伝子の発現を増強させる方法に関するものである。
　標的遺伝子の過剰発現は，基礎研究だけでなく治療にも利用されており，従来は外因性遺伝子の導入により行われてきた。ｃＤＮＡの外因性発現は，遺伝子機能の解明のために一般的に使用される機能解明手法である。また，分化細胞におけるいくつかの重要な転写活性化因子の外因性発現は，細胞状態の遷移をもたらし，人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによる機能的遺伝子の外因性発現は，遺伝子治療として変異遺伝子を置き換えることにより，ハプロ不全によりもたらされる疾患の治療法となる。
　しかし，このような外因性遺伝子の導入にはいくつかの制限がある。例えば，ｃＤＮＡライブラリが様々なアイソフォームを含むゲノム全体をカバーすることは困難であり，また，配列長が長いｃＤＮＡ配列は，挿入できるサイズに制限があるウイルスベクターにクローニングできないなどの問題がある。
　人工転写活性化因子による内因性遺伝子の活性化は，遺伝子の過剰発現の代替アプローチとして利用されてきた。ＤＮＡ結合タンパク質とエフェクタードメインで構成される人工転写活性化因子は，ＤＮＡ結合タンパク質の働きにより標的遺伝子のプロモーター領域と結合して発現を活性化する。ＤＮＡ結合タンパク質として，ジンクフィンガータンパク質，転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ），及び触媒的に非活性化されているＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の３種類が知られており，これらのＤＮＡ結合タンパク質の中で，ｄＣａｓ９のシンプルさと汎用性が注目されている。
　ｄＣａｓ９－ＶＰ６４などのｄＣａｓ９と転写活性化ドメインの融合タンパク質は，内因性遺伝子のプロモーター領域を標的とすることにより内因性遺伝子を活性化する。この融合タンパク質の標的となる内因性遺伝子へのターゲティングは，シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって行われている。しかし，単一のｓｇＲＮＡを使用した場合には，活性化の程度が低く，通常，確実に転写を活性化させるためには何種類かのｓｇＲＮＡを併用して目的のプロモーター領域に複数の融合タンパク質を誘導する必要があった（非特許文献１～３）。このため，ｄＣａｓ９と転写活性化ドメインの融合タンパク質を利用してゲノム全体にわたって機能獲得スクリーニングを行ったり，遺伝子治療を行ったりできないという問題があった。また，ｄＣａｓ９に複数のＶＰ６４を結合させる方法も提案されている（非特許文献４，特許文献１）。
　この問題を解決するために，ｄＣａｓ９に複数の因子を誘導して活性化の強度を改善する方法が開発されている（非特許文献５）。相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）システムは，ｄＣａｓ９－ＶＰ６４，ＲＮＡアプタマーを含む修飾ｓｇＲＮＡ，および転写活性化ドメインｐ６５－ＨＳＦ１に融合したＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質で構成されている。ｄＣａｓ９と融合したＶＰ６４，及び，ＲＮＡアプタマーによってｄＣａｓ９に誘導されたＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１は，相乗的に標的遺伝子の転写を活性化する。
　本発明者は，以前に，単一のｓｇＲＮＡを使用した特定のＤＮＡ遺伝子の効率的かつ標的化された脱メチル化および活性化のためのｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ法を報告した（非特許文献６，特許文献２）。ＳｕｎＴａｇは，複数の抗ＧＣＮ４ペプチド抗体（ｓｃＦｖ）融合因子を導入可能な繰り返しペプチドタグ（ＧＣＮ４）アレイである（非特許文献４）。これまで，タグ間のリンカー長を最適化することにより，ＤＮＡ脱メチル化中の最初の酵素ステップに関与するＴＥＴ１の効果が最大化されることを報告している。
　また，ガイドＲＮＡにＰｕｍｉｌｉｏ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｄｏｍａｉｎ結合配列を介して，ＰＵＦドメイン結合ＴＥＴと共にＰＵＦドメインに結合させたＧＡＡＤＤ４５ＡやＮＥＩＬ２などの脱メチル化促進ドメイン（脱メチル化を促進させるタンパク質等）を複数導入する方法が開示されている（特許文献３）。本文献には，ＶＰ６４よりもｐ６５－ＨＳＦ１の転写活性化が優れていること，及びＴＥＴ１とＧｒｏｗｔｈ　Ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ＤＮＡ　Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）との併用による活性化が示されている。
国際公開ＷＯ２０１６／０１１０８０号 国際公開ＷＯ２０１７／０９０７２４号 国際公開ＷＯ２０１８／０５３０３７号
Ｍａｅｄｅｒ，　Ｍ．Ｌ．ら，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３，　１０，　９７７－９７９． Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，　Ｐ．ら，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３，　１０，　９７３－９７６． Ｍａｌｉ，　Ｐ．ら，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０１３，　３１，　８３３－８３８． Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，　Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｅｌｌ　２０１４，　１５９，　６３５－６４６． Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，　Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ　２０１５，　５１７，　５８３－５８８． Ｍｏｒｉｔａ，　Ｓ．ら，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０１６，　３４，　１０６０－１０６５．
　内因性遺伝子の過剰発現又は発現抑制を利用した治療の重要性が高まっている。たとえば，機能的な内因性遺伝子の過剰発現により，ハプロ不全に起因する疾患を治療する可能性が期待されている。また，突然変異遺伝子の機能を代償するファミリー遺伝子など別の正常遺伝子の過剰発現により，劣性突然変異に起因する疾患を治療する可能性もある。先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）は，非機能性ラミニンα２につながるＬＡＭＡ２の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患である。ウイルスベクターを使用したＭＤＣ１ＡのマウスモデルにおけるＬａｍａ１の過剰発現は，疾患の進行を改善することが報告されている。したがって，強力に遺伝子を活性化でき，かつ，ウイルスベクターにクローニング可能な小さいサイズのシステムが，新たな遺伝子治療のツールとして求められている。
　また，内因性遺伝子の発現抑制は，これまでは主に発現タンパク質やｍＲＮＡを標的として行われてきたが，発現そのものを抑制することでより効率的な抑制が見込まれる。例えばｓｉＲＮＡやアンチセンスＤＮＡによる発現抑制は，これらの試薬が生体内で分解された後はその作用は続かないため短期間しか効果がない。それに対してエピゲノムやクロマチン構造などを介して発現抑制をおこなえば，その効果はエピゲノムやクロマチン構造として細胞に記憶され効果は長期間持続する。
　本発明者らは，上記課題を解決すべく，ｄＣａｓ９を利用した標的遺伝子発現の活性化増強及び発現抑制を達成する手段について鋭意検討を行った。その結果，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを利用して転写関連因子またはクロマチン関連因子と脱メチル化酵素の両方を標的遺伝子に誘導する改変ＳｕｎＴａｇシステムにより，転写関連因子またはクロマチン関連因子単独又は脱メチル化酵素単独の誘導と比較して，遺伝子発現を有意に活性化可能であることを見出した。特に，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇによる転写活性化因子と脱メチル化酵素の組み合わせの導入は，幅広い遺伝子発現を促進させることができることから，より広範な標的に対して適用可能であると考えられる。また，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを利用して転写抑制因子とメチル化因子の両方を標的遺伝子に誘導する改変ＳｕｎＴａｇシステムにより，転写抑制因子単独又はメチル化因子単独の誘導と比較して，遺伝子発現を有意に抑制可能であることを見出した。特に，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇによる転写抑制因子とメチル化因子の組み合わせの導入は，幅広い遺伝子発現を抑制させることができることから，より広範な標的に対して適用可能であると考えられる。
　改変ＳｕｎＴａｇシステムは，同じｓｇＲＮＡを使用して直接融合システム（例えば，ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１ＣＤおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４）と比較した結果，優れた活性を示す。直接融合システムは，単一のｓｇＲＮＡではその活性化の程度は低く，確実に転写を活性化するためには複数のｓｇＲＮＡが必要である（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｖ．ら，上掲）。一方で，本発明の改変ＳｕｎＴａｇシステムは，１種類のｓｇＲＮＡのみで確実に標的遺伝子の発現を活性化又は抑制することができる。よって，改変ＳｕｎＴａｇシステムは非常にシンプルな構成で，治療用途などの多用途に利用可能である。改変ＳｕｎＴａｇシステムのもう１つの利点は，各構成成分の長さにある。直接融合システムでは，ｄＣａｓ９と導入しようとする因子の両方を足した長さが必要となるところ，ｄＣａｓ９及び導入しようとする因子は共に配列長が長い遺伝子であるため，パッケージング能力が制限されている遺伝子治療で通常用いられるウイルスベクターなどでは直接融合システムでは利用できない。一方，改変ＳｕｎＴａｇシステムは，ｄＣａｓ９とＳｕｎＴａｇの合計長が非常に短いため，ウイルスベクターにおいても利用可能である。また，改変ＳｕｎＴａｇシステム（例えば，ＴＥＴ１及び転写活性化因子としてＶＰ６４やｐ６５－ＨＳＦ１を採用した改変ＳｕｎＴａｇシステム）は，幅広い標的遺伝子に対してその発現を促進可能である。
　また，ガイドＲＮＡにＴＥＴ１ＣＤと他の因子とを複数導入する方法を開示したＷＯ２０１８／０５３０３７においては，脱メチル化促進ドメインであるＧＡＤＤ４５ＡとＴＥＴ１ＣＤをガイドＲＮＡに導入して転写促進効果を示したことを報告している（ＷＯ２０１８／０５３０３７，０３５７段落参照）。本発明の改変ＳｕｎＴａｇシステムにおいては，ｄＣａｓ９に複数の因子を導入している点において，当該文献に記載の技術とは異なり，これにより当該文献とは異なる結果が得られている。例えば，ＷＯ２０１８／０５３０３７において採用されたＧＡＤＤ４５Ａは，本発明のシステムにおいても活性化可能であるが，転写活性化因子（ＶＰ６４及びｐ６５－ＨＳＦ１）は，本発明のシステムにおいてはＧＡＤＤ４５Ａより優れた結果を示した。
ＴＥＴ１と別の因子Ｘとを同時にリクルートするための改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇの模式図である。改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇでは，ｄＣａｓ９はアミノ酸リンカーで区切られて結合する複数のＧＣＮ４ペプチドタグタンデム配列と融合している。改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇは，抗ＧＣＮ４ペプチド抗体（ｓｃＦｖ）融合ＴＥＴ１（ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１）及びｓｃＦｖ融合因子Ｘ（ｓｃＦｖ－Ｘ）の複数をリクルートすることができ，それらによる標的遺伝子の相乗的な活性化をもたらすことができる。 ｄＣａｓ９－Ｓｕｎｔａｇにより発現を増強した各標的遺伝子の発現レベルを示すグラフである。各グラフの上部に標的遺伝子名（ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，およびＣＮＫＳＲ１）が記載されている。以下のグラフの説明は、図２Ｂ及び図２Ｃにおいても同様である。ｄＣａｓ９－ＳｕｎｔａｇおよびｓｃＦｖ－ＴＥＴ１をトランスフェクトしたＡ５４９細胞における標的遺伝子発現レベルが各グラフの一番左に記載されている（ＴＥＴ１）。ＴＥＴ１との併用効果を調べた各因子Ｘ（左から順に，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ｐ３００，ＳＳ１８，ＧＡＤＤ４５Ａ，ＦＯＸＡ１，およびＰＵ．１）を横軸に示す。それぞれの因子Ｘのグラフにおいて，左側（ＴＥＴ１の欄が「－」）は，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇおよびｓｃＦｖ－ＸをトランスフェクトしたＡ５４９細胞における標的遺伝子発現レベルを示し，右側（ＴＥＴ１の欄が「＋」）は，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１およびｓｃＦｖ－ＸをトランスフェクトしたＡ５４９細胞における標的遺伝子発現レベルを示す。縦軸の発現レベルの値は，各被検細胞についてＲＴ－ＰＣＲによって分析された標的遺伝子の発現量をアクチンの発現量に対して正規化した値を，陰性コントロールであるＧＦＰをトランスフェクトした細胞の対応する値に対する倍数として示した。 ｄＣａｓ９－Ｓｕｎｔａｇにより発現を増強した各標的遺伝子の発現レベルを示すグラフである。各グラフの上部に標的遺伝子名（ＳＢＮＯ２，ＳＰＡＲＣ，ＣＬＥＣ１１Ａ，およびＨＧＦ）が記載されている。 ｄＣａｓ９－Ｓｕｎｔａｇにより発現を増強した各標的遺伝子の発現レベルを示すグラフである。各グラフの上部に標的遺伝子名（ＴＣＦ２１，およびＴＩＮＡＧＬ１）が記載されている。 改変ＳｕｎＴａｇにおける，ＴＥＴ１との別の因子との相乗効果を示す図である。塗りつぶされたマスは，当該マスにおいて交差する標的遺伝子（最上段に記載）の発現が，ＴＥＴ１と当該マスにおいて交差する因子（一番左列に記載）とを併用することにより有意な相乗効果を示すことを意味する（Ｐ＜０．０５）。各列は試験された因子（上から順番に，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ｐ３００，ＳＳ１８，ＧＡＤＤ４５Ａ，ＦＯＸＡ１，およびＰＵ．１）を示し，各列は標的遺伝子（左から順に，ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，ＳＰＡＲＣ，ＣＬＥＣ１１Ａ，ＨＧＦ，ＴＣＦ２１，およびＴＩＮＡＧＬ１）を示す。 改変ＳｕｎＴａｇとｄＣａｓ９直接融合を比較した結果を示すグラフである。各グラフの上部に標的遺伝子名（ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，及びＳＰＡＲＣ）が記載されている。各グラフにおいて，左のバーはｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１，およびｓｃＦｖ－ＶＰ６４をトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現レベルを表し，右のバーはｄＣａｓ９－ＴＥＴ１およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４をトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現レベルを表す。縦軸の発現レベルの値は，各被検細胞についてＲＴ－ＰＣＲによって分析された標的遺伝子の発現量をアクチンの発現量に対して正規化した値を，陰性コントロールであるＧＦＰをトランスフェクトした細胞の対応する値に対する倍数として示した。＊はｐ＜０．０５を表し，＊＊はｐ＜０．０１を表す（以上のグラフの説明は図４Ｂにおいて同様）。ＣＡＲＤ９及びＲＡＢ１９において，ｐ＜０．０５でＳｕｎＴａｇシステムの方が優れた転写活性化を示し，ＫＤＭ２Ｂ，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，及びＳＰＡＲＣにおいて，ｐ＜０．０１でＳｕｎＴａｇシステムの方が優れた転写活性化を示した。 改変ＳｕｎＴａｇとｄＣａｓ９直接融合を比較した結果を示すグラフである。各グラフの上部に標的遺伝子名（ＣＬＥＣ１１Ａ，ＨＧＦ，及びＴＩＮＡＧＬ１）が記載されている。ＣＬＥＣ１１Ａにおいて，ｐ＜０．０５でＳｕｎＴａｇシステムの方が優れた転写活性化を示し，ＨＧＦ及びＴＩＮＡＧＬ１において，ｐ＜０．０１でＳｕｎＴａｇシステムの方が優れた転写活性化を示した。 （左）ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｇＲＮＡ，及びＧＣＮ４に対するｓｃＦｖ融合タンパク質ベクターを細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした結果を表すグラフである。横軸は，１：ＴＥＴ１単独，２：ＶＰ６４単独，３：ＴＥＴ１，及びＶＰ６４のそれぞれをｓｃＦｖと融合，４及び５：ＴＥＴ１とＶＰ６４の融合タンパク質をｓｃＦｖに融合した結果を示す。縦軸は標的遺伝子発現量を表す。（右）各実験に使用したｓｃＦｖ融合タンパク質の構造を示す。独立したＴＥＴ１，ＶＰ６４を併用した場合（３），及びＴＥＴ１とＶＰ６４を融合した場合（４，５）共に，ＴＥＴ１単独（１）及びＶＰ６４単独（２）と比較して転写の活性化の改善がみられた。ＴＥＴ１とＶＰ６４を融合した場合には，ＴＥＴ１がＶＰ６４のＮ末に融合しているときの方が効果が優れていた。 ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｇＲＮＡ，及びＧＣＮ４に対するｓｃＦｖ融合タンパク質質ベクター（ｓｃＦｖ－ＧＣＮ４－Ｘ：Ｘはメチル化因子又は転写抑制因子）を細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした結果を表すグラフである。上図は５日目，下図は１０日目の結果を示す。横軸は，１：ＤＮＭＴ３Ａ単独，２：ＤＮＭＴ３Ｂ単独，３：ＤＮＭＴ３Ａ，及びＫＲＡＢのそれぞれをｓｃＦｖと融合，４：ＤＮＭＴ３Ｂ，及びＫＲＡＢのそれぞれをｓｃＦｖと融合，５：ＤＮＭＴ３Ａ，ＫＲＡＢ，及びＤＮＭＴ３ＬのそれぞれをｓｃＦｖと融合，６：ＤＮＭＴ３Ｂ，ＫＲＡＢ，及びＤＮＭＴ３ＬのそれぞれをｓｃＦｖと融合した結果を示す。縦軸は標的遺伝子発現量を表す。＊はＰＶ＜０．０５，＊＊はＰＶ＜０．０１を表す。縦軸の発現量はコントロールを１とした時の数値に正規化した値を示す。発現抑制はＤｎｍｔ３ａ単独（１），Ｄｎｍｔ３ｂ単独（２）に比べ，ＫＲＡＢとの併用（３，４）及び，ＫＲＡＢ及びＤｎｍｔ３Ｌとの併用（５，６）の方が強かった。またｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後，１０日目の結果から，Ｄｎｍｔ３Ｌが存在することにより発現抑制が強く維持されることが示された。
　本発明においては，ｓｇＲＮＡにより転写を促進させたい遺伝子又は転写を抑制したい遺伝子（本明細書において「標的遺伝子」という）の転写調節領域近傍に誘導されるｄＣａｓ９に複数のペプチドタグが結合している（ｄＣａｓ９－Ｔａｇ）。ｄＣａｓ９－Ｔａｇと共に，（ｉ）当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位に脱メチル化酵素が融合した融合物と，当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位に転写関連因子またはクロマチン関連因子が融合した融合物とを併用するか，あるいは，（ｉｉ）当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位に脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子とが融合した融合物を使用することにより，ｓｇＲＮＡ結合領域に脱メチル化酵素及び転写関連因子及び／またはクロマチン関連因子を誘導することができる。また，ｄＣａｓ９－Ｔａｇと共に，（ｉ）当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位にメチル化因子が融合した融合物と，当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位に転写抑制因子が融合した融合物とを併用するか，あるいは，（ｉｉ）当該ペプチドタグに結合可能なペプチドタグ結合部位にメチル化因子と転写抑制因子とが融合した融合物を使用することにより，ｓｇＲＮＡ結合領域にメチル化因子及び転写抑制因子を誘導することができる。すなわち，本発明の改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムにおいては，ｓｇＲＮＡ，ｄＣａｓ９，ペプチドタグ，及びペプチドタグ結合部位に加えて，（ａ）脱メチル化酵素，及び，転写関連因子及び／またはクロマチン関連因子，（ｂ）脱メチル化酵素と転写関連因子及び／またはクロマチン関連因子との複合体，（ｃ）メチル化因子，及び，転写抑制因子，（ｄ）メチル化因子と転写抑制因子の複合体，を含む複合体が標的遺伝子の転写調節領域にｓｇＲＮＡを介して結合する。上記（ａ）の例を，図１に示す。この複合体の形成により標的遺伝子の転写調節領域近傍に誘導された脱メチル化酵素及び転写関連因子及び／またはクロマチン関連因子は，それぞれ，脱メチル化及び転写活性化等により，標的遺伝子の発現を促進させる。また，この複合体の形成により標的遺伝子の転写調節領域近傍に誘導されたメチル化因子及び転写抑制因子は，それぞれ，メチル化及び転写抑制等により，標的遺伝子の発現を抑制する。
　本明細書において，ペプチドタグ結合部位との融合物として標的配列に導入される因子，すなわち，脱メチル化酵素，転写関連因子，クロマチン関連因子，メチル化因子，及び転写抑制因子（本明細書において，「標的配列に導入される因子」という）は，各々が独立してペプチドタグ結合部位と融合していてもよいし，または，２種類以上が融合タンパクとして同一のペプチドタグ結合部位と融合していてもよい。また，本明細書に記載のキット，複合体，及び方法において，「標的配列に導入される因子」の種類としては，少なくとも脱メチル化酵素又はメチル化因子のいずれかを含む２種類又はそれ以上（例えば，脱メチル化酵素と転写関連因子，脱メチル化酵素とクロマチン関連因子，若しくは，メチル化因子と転写抑制因子）であればよく，３種類またはそれ以上（例えば，脱メチル化酵素と２種類の転写関連因子，脱メチル化酵素と転写関連因子とクロマチン関連因子，２種類の脱メチル化酵素と転写関連因子，若しくは，２種類のメチル化因子と転写抑制因子）の因子が用いられてもよい。本発明の改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムにおいて用いられる「ペプチドタグ結合部位と標的配列に導入される因子との融合物」の種類は，１種類（例えば，ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素と転写関連因子との融合物，ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とクロマチン関連因子との融合物，若しくは，ペプチドタグ結合部位とメチル化因子と転写抑制因子との融合物）又はそれ以上であってもよいし，２種類又はそれ以上の組み合わせ（ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素との融合物及びペプチドタグ結合部位と転写関連因子との融合物の組み合わせ，ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素との融合物及びペプチドタグ結合部位とクロマチン関連因子との融合物の組み合わせ，若しくは，ペプチドタグ結合部位とメチル化因子の融合物及びペプチドタグ結合部位と転写抑制因子との融合物の組み合わせ）であってもよい。
　例えば，本発明の改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムにおいて「転写関連因子及び／またはクロマチン関連因子」としては，ペプチドタグ結合部位に融合した，転写関連因子またはペプチドタグ結合部位に融合したクロマチン関連因子のいずれか１種類を使用してもよいし，いずれかを２種類以上又は両方を含む２種類以上を使用してもよい。本明細書において，「ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物」とは，融合物の種類が１種類以上であることを意味し，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子との融合物の１種類以上；ペプチドタグ結合部位とクロマチン関連因子との融合物の１種類以上；並びに，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子との融合物及びペプチドタグ結合部位とクロマチン関連因子との融合物のそれぞれ１種類以上を含む。すなわち，２種類以上使用する場合，ペプチドタグ結合部位に融合した転写関連因子として２種類以上使用してもよいし，ペプチドタグ結合部位に融合したクロマチン関連因子として２種類以上使用してもよいし，ペプチドタグ結合部位に融合した転写関連因子とペプチドタグ結合部位に融合したクロマチン関連因子の両方を含む２種類以上を使用してもよい。なお，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子について「１種類以上の融合物」と明記されていることは，他の因子が１種類であることを限定する意図で記載された物ではない。
　本明細書において，１種類以上とは，１種類又は２種類以上を意味し，２種類以上とは，例えば，２種類，３種類，４種類，５種類，もしくは６種類，又はそれ以上であってもよい。
　よって，一態様において，本発明は，改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムのためのキットに関する。具体的には，標的遺伝子発現活性化用キットであって，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子を含む，キットに関する。
　また，本発明は，標的遺伝子発現抑制用キットであって，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子を含む，キットに関する。
　別の態様において，本発明は，改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムを構成する複合体に関する。具体的には，標的遺伝子発現活性化用複合体であって，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む，複合体に関する。
　また，本発明は，標的遺伝子発現抑制用複合体であって，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む，複合体に関する。
　別の態様において，本発明は，改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムを利用した遺伝子発現の活性化方法に関する。具体的には，標的遺伝子の発現を活性化させる方法であって，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）を導入することを含む方法に関する：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子，に関する。
　更に別の態様において，本発明は，標的遺伝子の発現を活性化させる方法であって，該標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列に以下の（１）～（３）の成分を接触させることを含む方法に関する：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
　別の態様において，本発明は，改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇシステムを利用した遺伝子発現の抑制方法に関する。具体的には，本発明は，標的遺伝子の発現を抑制する方法であって，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）を導入することを含む方法に関する：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子。
　更に別の態様において，本発明は，標的遺伝子の発現を抑制させる方法であって，該標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列に以下の（１）～（３）の成分を接触させることを含む方法に関する：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
　「ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」は，ヌクレアーゼ活性を欠失させるアミノ酸変異が導入されたＣａｓ９の変異体であり，Ｃａｓ９ヌル変異体とも呼ばれる。典型的には，ＲｕｖＣヌクレアーゼ・ドメインにおけるＤ１０Ａ変異，及びＨＮＨヌクレアーゼ・ドメインにおけるＨ８４０Ａ変異が導入されたＣａｓ９が使用される。また，Ｎ８６３Ａ変異もヌクレアーゼ活性を欠損させることができる。ｄＣａｓ９を発現する核酸分子は，市販のプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｐｌａｓｍｉｄ＃１０００９１）などから入手することができる。
　「ペプチドタグアレイ」は，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したものである。「ペプチドタグ」とは，特定の構造と特異的に結合可能なアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。また，「ペプチドタグ結合部位」は，ペプチドタグと特異的に結合可能な前記特定の構造を有する部位を意味する。ペプチドタグとペプチドタグ結合部位とは，互いに特異的に結合する組み合わせであれば任意の組み合わせを利用することができる。好ましくは，ペプチドタグとペプチドタグ結合部位との結合は，標的遺伝子を含有する細胞内が内因性で有する反応と生物学的に直交（ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）である。ペプチドタグとペプチドタグ結合部位の組み合わせとしては，例えば，ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせ，自己組織化能を有するスプリットタンパク質のスモールフラグメントとラージフラグメントの組み合わせが挙げられる。
　ペプチドエピトープとそれを認識する抗体の組み合わせとしては，Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｎｏｎ－ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　４（ＧＣＮ４）ペプチドエピトープと抗ＧＣＮ４ペプチドエピトープ抗体，Ｈｉｓタグと抗Ｈｉｓタグ抗体，ＥＥヘキサペプチドと抗ＥＥヘキサペプチド抗体，ｃ－Ｍｙｃタグと抗ｃ－Ｍｙｃタグ抗体，ＨＡタグと抗ＨＡタグ抗体，Ｓタグと抗Ｓタグ抗体，ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧタグ抗体などが例示される（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｄｅｓｉｇｎ　＆　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ｖｏｌ．２４（５）：ｐｐ．４１９－４２８（２０１１）参照）。例えば，ＧＣＮ４ペプチドは，ＧＣＮ４に含まれるエピトープであれば制限なく使用できるが，ＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列が好ましい。
　ペプチドタグ結合部位がペプチドエピトープを認識する抗体である場合，完全抗体の他，当該抗体はペプチドタグとの特異的な結合性を有する限り，抗体断片や抗体断片を含有する物質であってもよい。具体的には，抗体はその可変領域（特には，ＣＤＲｓ）が結合特性を付与していることが知られており，例えば，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’，Ｆａｂ，Ｆａｂ３，一本鎖Ｆｖ（以下，「ｓｃＦｖ」という），一本鎖トリプルボディ，ナノボディ，ダイバレントＶＨＨ，ペンタバレントＶＨＨ，ミニボディ，（二本鎖）ダイアボディ，タンデムダイアボディ，トリアボディ（又はトリボディ），テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２），若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下，「ｄｓＦｖ」という），重鎖抗体，又はそれらの重合体を用いることもできる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２９（１）：５－６　（２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ　Ｊａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２５（７）（２００７）：３０７－３１６；及び，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ　ｓｔｅｉｎら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８－１２３（２０１２）参照）。
　自己組織化能を有するスプリットタンパク質は，あるタンパク質を２分したときに，分れた２つのタンパク質断片が再組織化して元と同じ構造をつくることができるタンパク質のペアのことをいう。元のタンパク質を２分して得られる短いペプチド（スモールフラグメント）をペプチドタグとして使用し，長いペプチド（ラージフラグメント）をペプチドタグ結合部位として用いることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）１５：７８９－７９７及びＷＯ２００５／０７４４３６参照）。このような自己組織化能を有するスプリットタンパク質として，ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）のスモールフラグメントをペプチドタグとして使用し，かつ，ＧＦＰのラージフラグメントをペプチドタグ結合部位として使用することができる。
　さらに，ペプチドとタンパク質のドメインとの結合はデータベース化されており，例えばＰｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｄａｔａｂａｓｅ　（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｐｂｉｎｄ．ｂｉｃｐｕ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ）を参照することにより，ペプチドタグとペプチドタグ結合部分の組み合わせを見出すことができる。例えば，ＧＶＫＥＳＬＶ（配列番号２）をペプチドタグと使用し，ＰＤＺＡｌｐｈａ－Ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ　ＰＤＺ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎをペプチドタグ結合部分として使用することができる。また，ペプチドとペプチド結合部位のペアの結合力は別の不活性なドメインをリンカーを用いて結合させ進化工学で改良することにより強くすることができる（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（２００８）ｖｏｌ．１０５（１８）：６５７８－６５８３）。
　各標的配列に導入される因子と融合させる「ペプチドタグ結合部位」は同一であってもよいし，異なっていてもよい。例えば，脱メチル化酵素と融合させるペプチドタグ結合部位と，転写関連因子またはクロマチン関連因子と融合させるペプチドタグ結合部位とは，同一であってもよいし異なっていてもよい。同様に，メチル化因子と融合させるペプチドタグ結合部位と，転写抑制因子と融合させるペプチドタグ結合部位とは，同一であってもよいし異なっていてもよい。これらのペプチドタグ結合部位が同一である場合には，１種類のペプチドタグを含むペプチドタグアレイに対して，脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子の両方を結合させることができ，あるいは，メチル化因子と転写抑制因子の両方を結合させることができる。脱メチル化酵素と融合させるペプチドタグ結合部位と，転写関連因子またはクロマチン関連因子と融合させるペプチドタグ結合部位が異なる場合，あるいは，メチル化因子と融合させるペプチドタグ結合部位と，転写抑制因子と融合させるペプチドタグ結合部位が異なる場合には，それぞれのペプチドタグ結合部位に対応したペプチドタグを含むペプチドタグアレイを用いる。この場合，対応するペプチドタグの位置や数をコントロールすることにより，結合させる脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子，あるいは，メチル化因子と転写抑制因子の数や位置を調節することができる。脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを融合物として使用する場合，及び，メチル化因子と転写抑制因子とを融合物として使用する場合においても，２種類以上の融合物を使用する場合には同様に同一又は異なるペプチドタグ結合部位を使用することができる。
　ペプチドタグアレイに含まれる「リンカー」は，ペプチドタグとペプチドタグ結合部位との結合を妨げず，本発明における所望の効果を妨げないものであれば，任意の配列を選択することができるが，標的遺伝子を含有する細胞内の内因性の反応には影響しないことが好ましい。ペプチドタグアレイに含まれる全てのリンカーが同じ長さ又は配列であってもよいし，２種類以上の長さ又は配列のリンカーを組み合わせて使用してもよい。リンカーとしては，典型的には，グリシンとセリンの繰り返し配列が用いられる。また，リンカーの長さは，５～１００アミノ酸，５～５０アミノ酸，１０～５０アミノ酸，１５～５０アミノ酸，１５～４０アミノ酸，１７～３０アミノ酸，又は２２アミノ酸とすることができる。具体的なリンカー配列としては，例えば，ＧＳＧＳＧ（配列番号３），ＧＳＧＧＳ（配列番号４），ＳＧＳＧＳ（配列番号５），もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号６）またはそれらの２～３回繰り返し配列，又は，ＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号７），もしくはＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号８）が挙げられる。
　本発明におけるペプチドタグアレイは，結合する複数のペプチドタグ間にリンカーが挿入されている。ペプチドタグアレイに含まれるペプチドタグの数は，ターゲット部位から転写調節領域までの距離や，脱メチル化酵素及び転写関連因子またはクロマチン関連因子の種類，リンカーの長さ等に応じて，適宜増減可能であり，たとえば２～３０個，３～１５個，３～１０個，３～５個であってよい。
　本明細書における「脱メチル化酵素」としては，メチル化部位の脱メチル化にいたる一連の反応を触媒する酵素であれば制限なく使用することができ，Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　１（ＴＥＴ１），Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　２（ＴＥＴ２），Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　３（ＴＥＴ３），Ｔｈｙｍｉｎｅ－ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＴＤＧ）が含まれる。脱メチル化酵素は，その酵素活性が保持されている限り，酵素タンパク質を構成するアミノ酸の全部であってもよいしその一部分（例えば，酵素触媒部位）であってもよい。例えば，脱メチル化酵素としては，Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　１の触媒部位（ＴＥＴ１ＣＤ）を使用することができる。
　本明細書における「転写関連因子」は，ＤＮＡの転写の制御に関与する因子を意味し，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，及びＲｔａなどの転写活性化因子；ｐ３００（ＥＰ３００），ＡＲＡ５４，ＡＴＸＮ７Ｌ３，ＢＣＬ３，ＣＢＰ，ＣＤＣ２５Ｂ，ＣＯＰＳ５，ＤＤＣ，ＫＡＴ５，ＫＤＭ１Ａなどのコアクチベーター（メディエーター，転写制御因子）；及びＦＯＸＡ１，ＰＵ．１，及びＡｓｃｌ１などのパイオニア因子を含む。このうち「転写活性化因子」は，ゲノムＤＮＡ上の特定の塩基配列に結合し，ＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進するタンパク質を意味する。転写活性化因子は，既知の標的遺伝子の転写調節領域の遺伝子配列に基づいて適切な因子を選択してもよいし，標的遺伝子の調節に関与している転写活性化因子が既に知られている場合にはそのような転写活性化因子を採用してもよく，例えば，ＪＡＳＰＡＲ（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）などのデータベースを利用して調べることもできる。
　本明細書における「クロマチン関連因子」とは，転写においてクロマチンの制御に関与する因子を意味し，ＳＳ１８などのクロマチンリモデリング因子；並びに，ＧＡＤＤ４５Ａなどのｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｒｅｌａｘｅｒを含む。
　本明細書における「メチル化因子」とは，メチル化部位のメチル化にいたる一連の反応を触媒する酵素又はそれを補助する因子であれば制限なく使用することができ，ＤＮＡメチル基転移酵素，及び／その補因子を挙げることができる。具体的なメチル化因子としては，ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）３Ａ，ＤＮＭＴ３Ｂ，及びＤＮＭＴ３Ｌを挙げることができる。好ましくはメチル化因子として，ＤＮＭＴ３Ａ又はＤＮＭＴ３Ｂと，ＤＮＭＴ３Ｌとが組み合わせて使用される。
　本明細書における「転写抑制因子」とは，転写を抑制する因子を意味し，Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）を挙げることができる。
　ｄＣａｓ９と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物は，例えば，ｄＣａｓ９をコードするＤＮＡとペプチドタグアレイをコードするＤＮＡとを結合させることにより１分子として発現させて作製することができる。同様に，ペプチドタグ結合部位と標的配列に導入される因子とを含む融合物は，ペプチドタグ結合部位をコードするＤＮＡと標的配列に導入される因子をコードするＤＮＡとを結合させることにより，１分子として発現させて作製することができる。
　本明細書におけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法におけるｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを人工的に連結させたものである。任意のｃｒＲＮＡに対応するＤＮＡ配列を挿入することにより所望のｇＲＮＡを発現させることができるプラスミドが市販されている（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４１８２４等）。ｃｒＲＮＡとしては，標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を使用する。ｇＲＮＡは，１種類であってもよいし，単一の標的遺伝子に対して異なるｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡを複数使用してもよい。
　本明細書において，核酸分子は，所望のタンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味し，例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ），ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるフラグメント，及び連結，切断，エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントであってもよい。核酸分子を構成するモノマーは，天然に存在するヌクレオチドの他，人工的に修飾されたヌクレオチドであってもよい。
　本明細書に記載された（１）及び（２）の融合物は，その全て又は一部がマーカー分子を含んでいてもよい。マーカー分子は，例えば，遺伝子が導入された細胞を選択するための選択マーカーであってもよいし，遺伝子が導入された細胞を可視化するための標識マーカーであってもよい。「選択マーカー」とは，選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントをいい，一般には，遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える遺伝子である。具体的には，例えば，Ｎｅｏ遺伝子，Ｈｙｇ遺伝子，ｈｉｓＤ遺伝子，Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子が挙げられる。「標識マーカー」は，発光や発色などによりその存在を検出可能なタンパク質であり，例えば，緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ），赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ），ＧＦＰ，Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光タンパク質（Ｄｓ－Ｒｅｄ），ＴａｇＲＦＰ，ＴｕｒｂｏＲＦＰ，ｔｄＴｏｍａｔｏ，ｍＣｈｅｒｒｙ，ｍＫａｔｅ，ｍＲｕｂｙ，ｍＢａｎａｎａ，ｍＯｒａｎｇｅ，ｍＰｌｕｍ，ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ，及びビメンチン等を挙げることができる。マーカー分子は，本明細書に記載の融合物とは異なる発現カセットにより発現されてもよいし，あるいは，ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｉｂｏ－ｓｏｍａｌ　Ｅｎｔｒｙ　Ｓｉｔｅｓ）配列や２Ａ配列などを介して本明細書に記載の融合物と結合させることにより，１種類の発現カセットにより発現されてもよい。
　本明細書に記載のタンパク質，融合物，またはそれをコードする核酸分子（例えば，ＤＮＡ又はＲＮＡ）の配列情報は，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　ＢａｎｋやＧｅｎＢａｎｋ等から入手可能である。また，適宜配列変換ソフト等を用い，当該ＤＮＡ配列情報に対応するＲＮＡ配列も入手可能である。本明細書に記載のタンパク質又は融合物は，それをコードするＤＮＡを使用して公知の分子生物学的手法により入手することができ，たとえば，目的のタンパク質又は融合物をコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入して発現させることにより，得ることができる。
　本明細書におけるキットは，さらに，外箱，容器，希釈剤，濁液剤，及び／又は調製方法・使用方法に関する説明書と共に含めることができる。通常は（１）～（３）の成分は異なる容器に格納されて提供されるが，複数の成分が一つの容器に含まれていてもよい。
　本明細書における，標的遺伝子発現活性化用複合体又は標的遺伝子発現抑制用複合体は，好ましくは標的遺伝子の転写調節領域近傍において形成されているが，このことは，必ずしも標的遺伝子発現活性化用複合体又は標的遺伝子発現抑制用複合体の形成の全てが標的遺伝子の転写調節領域近傍で行われることを意味するものではなく，本発明の目的が達成される限り，当該領域以外で形成された複合体又はその一部分が標的遺伝子の転写調節領域近傍に結合することにより，標的遺伝子の転写調節領域近傍に複合体が形成されてもよい。本明細書において，「標的遺伝子の転写調節領域近傍」とは，該標的遺伝子の転写調節領域を含み，かつ，本明細書に記載された標的遺伝子発現活性化用複合体又は標的遺伝子発現抑制用複合体が結合することにより該標的遺伝子の転写を活性化又は抑制可能な領域を含む。例えば，このような領域として，転写調節領域及び転写調節領域の両端からそれぞれ１ｋｂ以内に含まれる領域が挙げられる。
　本発明の方法において，核酸分子が標的遺伝子を含む細胞に導入される場合，当該核酸分子は，当該核酸分子を発現可能な発現カセットとして導入される。発現カセットは，当該核酸分子の発現に必要な配列（例えば，プロモーター，ターミネーター，オペレーター，及び／又はエンハンサーなど）を含む。また，当該発現カセットは，通常はベクターに挿入された状態に導入される。ベクターの例としては，真核生物細胞において複製可能なベクター，ならびにエピソームを維持するベクターあるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが挙げられ，例えば，プラスミドベクター又はウイルスベクター（アデノウイルスベクター，レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなど）が含まれる。本明細書に記載の（１）～（３）の核酸分子は，それぞれ異なる発現カセットにより発現されてもよいし，あるいは，２種類以上の核酸分子がＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｉｂｏ－ｓｏｍａｌ　Ｅｎｔｒｙ　Ｓｉｔｅｓ）配列や２Ａ配列などを介して１種類の発現カセットにより発現されてもよい。また，本明細書に記載の（１）～（３）の核酸分子は，それぞれ異なるベクターにより導入されてもよいし，あるいは，２種類以上の核酸分子が１種類のベクターに搭載されて導入されてもよい。当該発現カセットにおいて（１）～（３）の核酸分子は，幅広い細胞においてユビキタスに活性の高い活性化されるプロモーター（ＣＭＶプロモーター，ＥＦ１プロモーター，ＣＡＧプロモーターなど）や，特定の細胞（例えば，特定の組織の細胞や癌細胞などの疾患細胞）において特異的に活性化されることが知られているプロモーター（ＳＶ４０プロモーター，Ｎａｎｏｇプロモーター，ｔｅｒｔプロモーターなど）による発現制御下に連結させることにより，細胞に導入するのみで（１）～（３）の核酸分子を発現させるようにしていても良いし，あるいは，特定の刺激に応じて発現が促進される構造を有していてもよい。特定の刺激に応じて発現が促進される構造としては，特定の刺激に応じて発現を促進させるプロモーター，エンハンサー，オペレーターなどの制御下に（１）～（３）の核酸分子を連結した構造が含まれ，任意のタイミングで当該刺激を与えることにより（１）～（３）の核酸分子を発現させてもよい。このような構造としては，例えば，ｔｅｔオペレーター，ＬｅｘＡ結合領域，ＧＡＬ４結合領域などを挙げることができる。
　細胞への（１）～（３）の核酸分子又はタンパク質の導入は，公知の任意の手段を使用することにより可能であり，例えば，市販のトランスフェクション用試薬を使用してもよい。たとえば，ＤＮＡ又はＲＮＡのトランスフェクションには，エレクトロポレーション，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又は３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｊｅｔＰＲＩＭＥ　Ｋｉｔ（ポリプラストランスフェクション），ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（オズバイオサイエンス），ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ３０００（オズバイオサイエンス），Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（オズバイオサイエンス），ＲＮＡｉ　Ｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），マイクロインジェクション等を使用可能である。あるいは，ウイルスベクターなどの上述のベクターや，リポソーム等を用いて導入してもよい。
　タンパク質のトランスフェクションには，エレクトロポレーション，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＰＵＬＳｉｎ（ポリプラストランスフェクション），Ｐｒｏ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ（オズバイオサイエンス），ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ），マイクロインジェクション等を使用可能である。あるいは，リポソーム等を用いて導入してもよい。タンパク質を細胞へのトランスフェクションする場合，（１）～（３）の任意の数の組み合わせ（ただし，（１）は必ず含む）の複合体を予め形成させ，当該複合体を細胞にトランスフェクションしてもよい。
　（１）～（３）の核酸分子を別々のベクターに搭載してトランスフェクションする場合，トランスフェクション時における，各ベクターのモル比は，例えば，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇベクター：ｓｃＦｖ－脱メチル化酵素ベクター：ｓｃＦｖ－転写関連因子またはクロマチン関連因子ベクター：ｓｇＲＮＡベクター＝１：１：１：１～３又は１：１：１：１～２又は１：１：１：１．５とすることができる。
　本発明の標的遺伝子の発現を活性化させる方法は，例えば，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）の成分を導入することにより行うことができる：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
　本発明の標的遺伝子の発現を抑制する方法は，例えば，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）の成分を導入することにより行うことができる：
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物；並びに，
（３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
　あるいは，本発明の標的遺伝子の発現を活性化させる方法は，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物をコードする核酸分子，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物をコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物をコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物をコードする核酸分子；並びに，
（４）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現する核酸分子
が導入された細胞において，（１）～（３）の核酸分子の発現を促進させることにより行うことができる。
　あるいは，本発明の標的遺伝子の発現を抑制する方法は，
（１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物をコードする核酸分子，
（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物をコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む１種類以上の融合物をコードする核酸分子，あるいは，
（ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む１種類以上の融合物をコードする核酸分子；並びに，
（４）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現する核酸分子
が導入された細胞において，（１）～（３）の核酸分子の発現を抑制させることにより行うことができる。
　核酸分子が導入された細胞において，（１）～（３）の核酸分子の発現を促進させることにより標的遺伝子の発現を活性化させ又は抑制する方法は，当該方法の前にそれらの核酸分子を導入することを含んでいてもよい。また，核酸分子が導入された細胞を用いる場合，（１）～（３）の核酸分子の転写調節領域は特定の刺激に応じて発現が促進される構造を有し，当該刺激を加えることにより（１）～（３）の核酸分子の発現が促進されるか，特定の細胞において発現が活性化されるプロモーターなどを有していてもよい。
　本発明の標的遺伝子発現の活性化は，ｉｎ　ｖｉｖｏ，ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，又はｅｘ　ｖｉｖｏで行うことができる。
　以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが，これは本発明の範囲を限定するものではない。
（ｓｇＲＮＡの構築）
　各標的遺伝子について，転写開始部位周辺のユニークな２０ｂｐの配列を選択した（表１）。選択されたｓｇＲＮＡは，ヒトＵ６プロモーター（配列番号９）の制御下でクローン化した。
（細胞培養）
　Ａ５４９（理研ＢＲＣ）細胞を，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および非必須アミノ酸を添加したミニマムエッセンシャルメディウム（ＭＥＭ）（Ｍ４６５５－５００ＭＬ，シグマ）中，５％ＣＯ２下，３７℃で培養した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造元のプロトコルに従い，Ａ５４９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に，ブラストサイジン－Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を最終濃度２μｇ／ｍｌで培地に添加した。セレクションの３日後，細胞を回収して分析に使用した。トランスフェクションにおける，各ベクターのモル比は，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇベクター：ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１ベクター：ｓｃＦｖ－Ｘベクター：ｓｇＲＮＡベクター＝１：１：１：１．５とした。ｓｇＲＮＡベクターを除くすべての構築物は，ＣＡＧプロモーターの制御下で発現させた。
（定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析）
　Ａｌｌｐｒｅｐ　ＤＮＡ　／　ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して，細胞から総ＲＮＡを分離した。遺伝子発現は，ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　９８（Ｒｏｃｈｅ）で製造元のプロトコルに従って測定した。発現レベルはアクチンレベルに対して正規化し，ＧＦＰをトランスフェクトした実験コントロールと比較した倍数の変化として示した。プライマー配列は表１に記載の配列を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例１）ＴＥＴ１及び異なる因子を同時にリクルートするための改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ
　改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇでは，ｄＣａｓ９と，２２アミノ酸リンカー（ＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ：配列番号７）を介して間隔をあけて複数コピーが連結された１９アミノ酸（ａａ）からなるＧＣＮ４ペプチドタグ（ＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ：配列番号１）のタンデム配列とを融合した。改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇは，抗ＧＣＮ４ペプチド抗体（ｓｃＦｖ）融合ＴＥＴ１（ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１）の複数のコピーを標的のプロモーターに誘導し，遺伝子の脱メチル化と活性化をもたらすことができる。また，抗ＧＣＮ４ペプチド抗体（ｓｃＦｖ）が別の因子と融合したもの（ｓｃＦｖ－別の因子Ｘ）をｓｃＦｖ－ＴＥＴ１と共に使用することにより，単一のｓｇＲＮＡにＴＥＴ１と別の因子の両方を標的にリクルートすることで（図１），標的遺伝子を相乗的に活性化することができる。したがって，改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを使用することにより，ＴＥＴ１との併用で遺伝子発現を相乗的に活性化させる別の要因を探索した。
（１）改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇによりＴＥＴ１と相乗的に遺伝子発現を活性化する因子の探索
　転写活性化因子（ＶＰ６４およびｐ６５－ＨＳＦ１），コアクチベーター（ｐ３００），推定ＳＷＩ／ＳＮＦサブユニット（ＳＳ１８），ヘテロクロマインリラクサー（ＧＡＤＤ４５Ａ），および先駆因子（ＦＯＸＡ１およびＰＵ．１）について，ＴＥＴ１との相乗効果を調べた。前記因子のそれぞれを利用した場合の１０種類の遺伝子（ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，ＳＰＡＲＣ，ＣＬＥＣ１１Ａ，ＨＧＦ，ＴＣＦ２１，およびＴＩＮＡＧＬ１）の発現を解析した。ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇおよび１種類のｓｃＦｖ－Ｘ（Ｘ＝ＴＥＴ１，ｐ６５－ＨＳＦ１，ｐ３００，ＳＳ１８，ＧＡＤＤ４５Ａ，ＦＯＸＡ１，またはＰＵ．１）をトランスフェクションした。また，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１，およびｓｃＦｖ－Ｘのトランスフェクションも行った。
　ＴＥＴ１とＸの相乗効果は次のように判定した。ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇおよびｓｃＦｖ－Ｘをトランスフェクトした細胞（図２，ＴＥＴ１（－））の標的遺伝子の発現レベルを，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇおよびｓｃＦｖ－ＴＥＴ１をトランスフェクトした細胞（図２，ＴＥＴ１）の標的遺伝子の発現レベルと比較して，高い発現レベルを示す細胞を選択した。次に，標的遺伝子の発現レベルを，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１，およびｓｃＦｖ－Ｘ（図２ＴＥＴ１（＋））でトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現レベルと比較した。ｓｇＲＮＡは，ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，ＳＰＡＲＣ，ＣＬＥＣ１１Ａ，ＨＧＦ，ＴＣＦ２１，およびＴＩＮＡＧＬ１に対応するｓｇＲＮＡを使用した。
（２）結果
　結果を図３に要約した。転写活性化因子ＶＰ６４は，１０種類の標的遺伝子のうち８種類においてＴＥＴ１との相乗効果を示した。転写活性化因子ｐ６５－ＨＳＦ１は，１０種類の遺伝子のうち５種類でＴＥＴ１との相乗効果を示した。他の因子は，３種類程度の遺伝子においてＴＥＴ１との相乗効果を示した。よって，選択されたこれらの因子は，ＴＥＴ１と相乗的に遺伝子発現を促進させることが示された。
（実施例２）改変ＳｕｎＴａｇとｄＣａｓ９直接融合との比較
　ｄＣａｓ９－ＶＰ６４などの，ｄＣａｓ９と転写活性化ドメインの直接融合タンパク質は，内因性遺伝子の活性化に広く使用されている（Ｍａｅｄｅｒ，　Ｍ．Ｌ．ら，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３，　１０，　９７７－９７９．；Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，　Ｐ．ら，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３，　１０，　９７３－９７６．；及びＭａｌｉ，　Ｐ．らＮａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０１３，　３１，　８３３－８３８．参照）。しかし，個々のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と使用した場合には活性化できる程度が低いという問題がある。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４による活性化は，ＤＮＡ脱メチル化の最初の酵素ステップに関与するＴＥＴ１と融合したｄＣａｓ９と共に使用することにより改善される（Ｂａｕｍａｎｎ，　Ｖ．らＮａｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２０１９，　１０，　２１１９．参照）。
　よって，直接融合システムによる活性化と改変ＳｕｎＴａｇシステムによる活性化とを比較した。各標的遺伝子に同じ単一のｓｇＲＮＡを使用して，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ，ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１およびｓｃＦｖ－ＶＰ６４をトランスフェクトした細胞にける標的遺伝子の発現レベルを，ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１及びｄＣａｓ９－ＶＰ６４をトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現レベルと比較した。ＣＡＲＤ９，ＫＤＭ２Ｂ，ＲＡＢ１９，ＣＮＫＳＲ１，ＳＢＮＯ２，ＳＰＡＲＣ，ＣＬＥＣ１１Ａ，ＨＧＦ，及びＴＩＮＡＧＬ１に対応するｓｇＲＮＡを使用した。その結果，調べた遺伝子においては，ＳｕｎＴａｇを使用したシステムの方が，大幅に優れた活性化を示した（図４Ａ及びＢ）。
　改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを用いることにより，複数の因子を標的遺伝子に誘導することができ，相乗的に転写を活性化することができた。改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇを用いることにより，ＴＥＴ１との相乗効果を発揮することができる因子について探索した結果，ｐ６５－ＨＳＦ１，ｐ３００，ＳＳ１８，ＧＡＤＤ４５Ａ，ＦＯＸＡ１，またはＰＵ．１が，少なくとも１種類の遺伝子の発現についてＴＥＴ１と相乗作用を示した。それらの中でも，ＶＰ６４は幅広い遺伝子で相乗効果を示すことから最良の結果を示した。
（実施例２）ＴＥＴ１及び異なる因子の融合体を同時にリクルートするための改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ
（１）ｓｇＲＮＡの構築
　ＣＡＲＤ９遺伝子にユニークな２０ｂｐ配列を転写開始部位の周辺で選択した。選択されたｇＲＮＡは，ヒトＵ６プロモーター（ｇＲＮＡ＿Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＢｂｓＩ，Ａｄｄｇｅｎｅ　１２８４３３）の制御下でクローン化した。標的配列はＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧ（配列番号１０）であった。
（２）細胞培養とトランスフェクション
　Ａ５４９細胞（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ，つくば，日本）は，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および非必須アミノ酸を含む，最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｍ４６５５－５００ＭＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州，米国）中，５％ＣＯ２下，３７℃で培養した。Ａ５４９細胞は，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でトランスフェクトした。ブラストサイジンＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を，トランスフェクションの４８時間後に最終濃度２μｇ／ｍＬで培地に添加した。選択の３日後，細胞を回収して分析した。トランスフェクションに使用した，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇベクター：ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１ベクター：ｓｃＦｖ－ＶＰ６４ベクター：ｓｇＲＮＡベクターのモル比は，１：１：１：１．５とした。ＴＥＴ１－ＶＰ６４融合システムにおいては，トランスフェクションに使用した，ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇベクター：ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１－ＶＰ６４（またはｓｃＦｖ－ＶＰ６４－ＴＥＴ１）融合ベクター：ｓｇＲＮＡベクターのモル比は，１：１：１．５とした。ｓｇＲＮＡベクターを除くすべてのコンストラクトは，ＣＡＧプロモーターの制御下で発現させた。
（３）定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析
　ＡｌｌＰｒｅｐ　ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を使用して，細胞からトータルＲＮＡを単離した。遺伝子発現は，ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラ，草津，日本）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　９８（ロシュ，バーゼル，スイス）で測定した。発現レベルは，アクチンｍＲＮＡの対応するレベルに対して正規化され，ＧＦＰをトランスフェクトしたコントロールと比較した変化倍率として表した。プライマー配列は，ＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧ（配列番号２０）およびＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴ（配列番号２１）を用いた。
（実施例３）ＴＥＴ１及び転写抑制因子を同時にリクルートするための改変ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ
（１）ｓｇＲＮＡの構築
　Ｌｅｃｔ２遺伝子にユニークな２２ｂｐ配列を転写開始部位の周辺で選択した。選択されたｇＲＮＡは，ヒトＵ６プロモーターの制御下でクローン化した。標的配列は，ＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＴＣＴＴＡＧＧ（配列番号４０）とした。
（２）細胞培養とトランスフェクション
　ＴＬＲ３（ＪＣＲＢ，茨城，日本）細胞は，２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），１０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ，５μｇ／Ｌ　モノエタノールアミン，１０μｇ／ｍｌトランスフェリン，及び１μｇ／ｍｌインスリンを添加した，ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｄ５７９６－５００ＭＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州，米国）中，５％ＣＯ２，３３℃で培養した。ＴＬＲ３細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でトランスフェクトした。ブラストサイジンＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア州，米国）を，トランスフェクションの４８時間後に最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。選択の３日後，細胞の一部を収集し（５日目），分析した。残りの細胞をさらに５日間培養し，回収した（１０日目）。トランスフェクションは，等モルのｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇベクター，ｓｃＦｖベクター，およびｓｇＲＮＡベクターを使用して行った。ｓｇＲＮＡベクターを除くすべてのコンストラクトは，ＣＡＧプロモーターの制御下で発現させた。
（３）定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析
　ＡｌｌＰｒｅｐ　ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を使用して，細胞からトータルＲＮＡを単離した。遺伝子発現は，ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラ，草津，日本）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　９８（ロシュ，バーゼル，スイス）で測定した。発現レベルは，Ｇａｐｄｈ　ｍＲＮＡの対応するレベルに対して正規化され，ＧＦＰをトランスフェクトしたコントロールと比較した変化倍率として表した。プライマー配列は，ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＣ（配列番号４１）およびＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＴＡ（配列番号４２）とした。

Claims (36)

  1. 　標的遺伝子発現活性化用キットであって，
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子を含む，キット。
  2. 　標的遺伝子発現活性化用複合体であって，
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む，複合体。
  3. 　前記脱メチル化酵素が，Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　１の触媒部位（ＴＥＴ１ＣＤ）である，請求項１に記載のキット又は請求項２に記載の複合体。
  4. 　前記転写関連因子またはクロマチン関連因子が，転写関連因子である，請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のキット又は複合体。
  5. 　前記転写関連因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，Ｒｔａ，ｐ３００，ＦＯＸＡ１，及びＰＵ．１からなる群より選択される，請求項４に記載のキット又は複合体。
  6. 　前記転写関連因子が，転写活性化因子である，請求項４に記載のキット又は複合体。
  7. 　前記転写活性化因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，及びＲｔａからなる群より選択される，請求項６に記載のキット又は複合体。
  8. 　前記転写活性化因子が，ＶＰ６４及び／又はｐ６５－ＨＳＦ１である，請求項７に記載のキット又は複合体。
  9. 　前記転写関連因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，Ｒｔａ，ｐ３００，ＦＯＸＡ１，及びＰＵ．１から選択され，かつ，前期クロマチン関連因子がＳＳ１８及び／又はＧＡＤＤ４５Ａである，請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のキット又は複合体。
  10. 　標的遺伝子発現抑制用キットであって，
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及びペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子を含む，キット。
  11. 　標的遺伝子発現抑制用複合体であって，
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む，複合体。
  12. 　前記メチル化因子が，ＤＮＡメチル基転移酵素，及び／又はその補因子である，請求項１０に記載のキット又は請求項１１に記載の複合体。
  13. 　前記メチル化因子が，ＤＮＭＴ３Ａ，ＤＮＭＴ３Ｂ，及びＤＮＭＴ３Ｌから選択される１種類以上である，請求項１２に記載のキット又は複合体。
  14. 　前記転写抑制因子が，ＫＲＡＢである，請求項１０～請求項１３のいずれか１項に記載のキット又は複合体。
  15. 　前記ペプチドタグがペプチドエピトープであり，かつ，前記ペプチドタグ結合部位が抗ペプチドエピトープ抗体であるか，あるいは，
    　前記ペプチドタグがスプリットタンパク質のスモールフラグメントであり，前記ペプチドタグ結合部位がスプリットタンパク質のラージフラグメントである，請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載のキット又は複合体。
  16. 　前記ペプチドタグがＧｅｎｅｒａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｎｏｎ－ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　４（ＧＣＮ４）ペプチドエピトープであり，かつ，前記ペプチドタグ結合部位が抗ＧＣＮ４ペプチドエピトープ抗体であるか，あるいは，
    　前記ペプチドタグがＨｉｓタグまたはＥＥタグであり，かつ，前記ペプチドタグ結合部位が抗Ｈｉｓタグ抗体または抗ＥＥタグ抗体である，
    請求項１５に記載のキット又は複合体。
  17. 　前記抗体が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である，請求項１５又は請求項１６に記載のキット又は複合体。
  18. 　前記ペプチドタグがＧＦＰのスモールフラグメントであり，かつ，前記ペプチドタグ結合部位がＧＦＰのラージフラグメントであるか，あるいは，
    　前記ペプチドタグがＧＶＫＥＳＬＶ（配列番号２）であり，かつ，前記ペプチドタグ結合部位がＰＤＺ　ｐｒｏｔｅｉｎである，請求項１５に記載のキット又は複合体。
  19. 　前記リンカーが１５～５０アミノ酸からなるペプチドである，請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載のキット又は複合体。
  20. 　前記（１）及び（２）のうち任意の融合物が，さらにマーカー分子を含む，請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の標的遺伝子発現活性化用キット又は複合体。
  21. 　標的遺伝子の発現を活性化させる方法であって，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）を導入することを含む方法：
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子。
  22. 　標的遺伝子の発現を活性化させる方法であって，該標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列に以下の（１）～（３）の成分を接触させることを含む方法：
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む１種類以上の融合物，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
  23. 　前記脱メチル化酵素が，Ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　１の触媒部位（ＴＥＴ１ＣＤ）である，請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
  24. 　前記転写関連因子またはクロマチン関連因子が，転写関連因子である，請求項２１～請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　前記転写関連因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，Ｒｔａ，ｐ３００，ＦＯＸＡ１，及びＰＵ．１からなる群より選択される，請求項２４に記載の方法。
  26. 　前記転写関連因子が，転写活性化因子である，請求項２４に記載の方法。
  27. 　前記転写活性化因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，及びＲｔａからなる群より選択される，請求項２６に記載の方法。
  28. 　前記転写活性化因子が，ＶＰ６４及び／又はｐ６５－ＨＳＦ１である，請求項２７に記載の方法。
  29. 　前記転写関連因子が，ＶＰ６４，ｐ６５－ＨＳＦ１，ＶＰＲ，Ｒｔａ，ｐ３００，ＦＯＸＡ１，及びＰＵ．１から選択され，かつ，前期クロマチン関連因子がＳＳ１８及び／又はＧＡＤＤ４５Ａである，請求項２１～請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  30. （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物をコードする核酸分子，
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位と脱メチル化酵素とを含む融合物をコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物をコードする１種類以上の核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，脱メチル化酵素と，転写関連因子またはクロマチン関連因子とを含む融合物をコードする核酸分子；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する核酸分子を含む，ベクター。
  31. 　標的遺伝子の発現を抑制する方法であって，該標的遺伝子を含む細胞に以下の（１）～（３）を導入することを含む方法：
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；（２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ），またはそれを発現する核酸分子。
  32. 　標的遺伝子の発現を抑制する方法であって，該標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列に以下の（１）～（３）の成分を接触させることを含む方法：
    （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物；
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
  33. 　前記メチル化因子が，ＤＮＡメチル基転移酵素，及び／又はその補因子である，請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
  34. 　前記メチル化因子が，ＤＮＭＴ３Ａ，ＤＮＭＴ３Ｂ，及びＤＮＭＴ３Ｌから選択される，請求項３３に記載の方法。
  35. 　前記転写抑制因子が，ＫＲＡＢである，請求項３１～請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. （１）ヌクレアーゼ活性を有しない不活性化型ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と，複数のペプチドタグがリンカーを介して結合したペプチドタグアレイとを含む融合物をコードする核酸分子，
    （２）（ｉ）ペプチドタグ結合部位とメチル化因子とを含む融合物，またはそれをコードする核酸分子，及び，ペプチドタグ結合部位と転写抑制因子とを含む融合物をコードする核酸分子，あるいは，
    （ｉｉ）ペプチドタグ結合部位と，メチル化因子と，転写抑制因子とを含む融合物をコードする核酸分子；並びに，
    （３）標的遺伝子の転写調節領域近傍のＤＮＡ配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する核酸分子を含む，ベクター。
     
     
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PCT/JP2021/006498 WO2021167101A1 (ja) 2020-02-21 2021-02-19 脱メチル化酵素と転写関連因子またはクロマチン関連因子を用いた特定遺伝子の相乗的発現誘導法

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