CN114381501A - 一种简便的高通量dna甲基化检测方法 - Google Patents

一种简便的高通量dna甲基化检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114381501A
CN114381501A CN202111683728.5A CN202111683728A CN114381501A CN 114381501 A CN114381501 A CN 114381501A CN 202111683728 A CN202111683728 A CN 202111683728A CN 114381501 A CN114381501 A CN 114381501A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
methylation detection
detection method
dna methylation
throughput
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111683728.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈晶晶
江翱
卢瑶
侯策
王嫚
曹振
宋东亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority to CN202111683728.5A priority Critical patent/CN114381501A/zh
Publication of CN114381501A publication Critical patent/CN114381501A/zh
Priority to PCT/CN2022/140475 priority patent/WO2023125170A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种简便的高通量DNA甲基化检测方法，其步骤包括：(1)用强碱对DNA样本进行氧化处理，使DNA样本中的胞嘧啶氧化成尿嘧啶，甲基化胞嘧啶氧化成胸腺嘧啶；(2)加入酸中和强碱，使反应体系的pH值控制在6‑8以内；(3)采用不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶，进行文库扩增及测序。本发明开发了一种简便的高通量DNA胞嘧啶甲基化检测技术，并命名为DMA‑seq。相比于现有的DNA甲基化检测试剂盒，DMA‑seq具有操作简单、耗时短、DNA损伤小、数据质量好、对甲基化位点靶向性高等优点，适用于高丰度的DNA甲基化位点检测，尤其是肿瘤早期筛查方向。

Description

一种简便的高通量DNA甲基化检测方法
技术领域
本发明专利涉及一种简便的高通量DNA甲基化检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学领域的重要研究方向。胞嘧啶甲基化(5mC)是DNA上最常见的修饰碱基，占所有胞嘧啶的1％-8％，有些特定的胞嘧啶位点如细菌的Dam甲基化位点或真核生物的CpG岛中的胞嘧啶位点发生甲基化修饰的比例可高达近100％，因此5mC也被称为“第五种碱基”。DNA甲基化是细菌识别区分内外源DNA的主要方式，是细菌识别自身的身份标记。近年来，大量研究表明DNA甲基化水平异常与肿瘤发生、恶化和细胞癌变进程有着密切的联系。因此，血液的cfDNA甲基化检测是临床上进行肿瘤早筛的重要手段，具有很高的灵敏度和特异性。
目前市面上用于检测胞嘧啶甲基化位点和水平的产品主要分为两种：一种是重亚硫酸盐转化试剂盒，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶通过脱氨反应转变成尿嘧啶，再使用耐尿嘧啶的DNA聚合酶通过PCR扩增将尿嘧啶转变成胸腺嘧啶。最终达到将未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶的效果，而发生甲基化的胞嘧啶位点不会发生改变。但这种方法会导致严重的DNA损伤(约90％的DNA会发生断裂)，且具有较高的假阴性，影响了甲基化检测的灵敏度和准确性。第二种是酶转化法试剂盒(EM-seq)，其原理是先利用TET酶将5mC通过三步氧化反应(5mC-5hmC-5fC-5caC)转变成5caC，再利用APOBEC脱氨酶将未甲基化的C通过脱氨反应转变成U，最后通过PCR转变成T。这种方法对DNA的损伤小，能够检测低至10ng的DNA样本中的甲基化位点和水平。但是这种方法具有较高的假阳性和假阴性，且操作较为复杂。此外，DNA甲基化检测方法需要将所有的未甲基化胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，这影响了测序数据的质量和比对准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便的高通量DNA甲基化检测方法，具有耗时短、对甲基化位点靶向性高的优点。
本发明采取的技术方案为：一种简便的高通量DNA甲基化检测方法，其步骤包括：
(1)用强碱对DNA样本进行氧化处理，使DNA样本中的胞嘧啶氧化成尿嘧啶，甲基化胞嘧啶氧化成胸腺嘧啶；
(2)加入酸中和强碱，使反应体系的pH值控制在6-8以内，以便于后续文库扩增程序的进行；
(3)采用不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶，进行文库扩增及测序。
优选的，步骤(1)中的强碱为NaOH或者KOH。
优选的，步骤(1)强碱处理浓度为0.05M-0.4M。
优选的，步骤(1)中氧化处理的温度为50-80℃。
优选的，步骤(1)中氧化处理的时间为0.5-2h。
优选的，步骤(1)中的DNA样本在氧化处理前先进行片段化以及末端修复和接头连接处理。
优选的，采用超声法打断或者酶切法打断的方式使DNA片段化。
优选的，步骤(2)中的酸为盐酸、硫酸或者乙酸。
优选的，所述步骤(3)中不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶为2×Hieff
Figure BDA0003448059610000021
PCRMaster Mix、
Figure BDA0003448059610000022
UltraTM II
Figure BDA0003448059610000023
Master Mix或Phusion Flash高保真PCR预混液。
本发明的反应原理(见图3)为：用强碱处理DNA样本，对甲基化5mC和未甲基化C进行氧化脱氨，甲基化的5mC经氧化脱氨反应后变成胸腺嘧啶(T)，未甲基化C经氧化脱氨反应后变成尿嘧啶(dU)，再使用对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶进行扩增，含T的模板可以被扩增，而含dU的模板无法被扩增，从而达到特异性扩增甲基化DNA的目的。
本发明开发了一种简便的高通量DNA胞嘧啶甲基化检测技术，并命名为DMA-seq(Deamination and Methyl-C Amplification sequencing)。相比于现有的DNA甲基化检测试剂盒，DMA-seq具有操作简单(一步操作)、耗时短、DNA损伤小、数据质量好、对甲基化位点靶向性高等优点，适用于高丰度的DNA甲基化位点检测，尤其是肿瘤早期筛查方向。
附图说明
图1DMA-seq流程示意图。
图2 5mC甲基化标准品序列。
图3热碱脱氨反应示意图。
图4酸碱组合对DMA-seq转化率的影响。
图5热碱脱氨反应温度对DMA-seq转化率的影响。
图6热碱脱氨反应中氢氧化钠浓度对DMA-seq转化率的影响。
图7热碱脱氨反应时间对DMA-seq转化率的影响。
图8不同尿嘧啶敏感的高保真DNA聚合酶对DMA-seq转化率的影响。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示。
表1探针及引物序列
Figure BDA0003448059610000031
实施例1：5mC DNA标准品的制备
在本实施例中，我们利用PCR技术构建了DNA甲基化标准品(5mC DNA标准品序列如图2及SEQ ID No.1所示)，具体反应体系如下：
表2
Figure BDA0003448059610000032
混匀后按照以下程序进行反应：
表3
Figure BDA0003448059610000033
PCR结束后，加入40μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清，加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；再次加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇，室温静置晾干3min。加入20μL ddH2O悬浮磁珠后，室温静置5min。将将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，取上清，Nanodrop测定回收的PCR产物浓度，Qsep测定PCR产物纯度，一代测序测定PCR产物序列。
实施例2：DMA-seq对DNA甲基化检测的效果。
在本实施例中，我们使用翌圣生物的Hieff
Figure BDA0003448059610000042
Ultima DNA Library PrepKit for Illumina建立了DMA-seq对5mC DNA标准品的转化流程以及检测方式(示意图见图1和图3)，具体流程如下：
1)DNA末端修复和接头连接
表4
组分 用量
5mC DNA标准品 10ng
Endprep Mix 10μL
补ddH2O至 60μL
30℃10min，72℃20min，4℃保存。
表5
组分 用量
上述反应体系 60μL
Ligation Enhancer 30
Fast T4 DNA Ligase 5
DNA Adapter 5
Total 100μL
20℃反应15min。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后加入11ul 1M NaOH或KOH，60℃反应60min。
反应结束后加入11ul 1M盐酸或乙酸或者0.5M硫酸。
反应结束后加入60μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清，加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；再次加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇，室温静置晾干3min。加入21μL ddH2O悬浮磁珠后，室温静置5min。将将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，取上清。
3)文库扩增及测序
表6
Figure BDA0003448059610000041
Figure BDA0003448059610000051
混匀后按照以下程序进行反应：
表7
Figure BDA0003448059610000052
PCR结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。按照上述DNA回收方法进行文库回收。Qubit进行文库浓度测定后，在NovaSeq 6000平台上进行文库测序并分析。测序数据分析结果见图4，不同酸碱组合均具有较好的转化率，且假阳性较低。
实施例3：热碱脱氨反应中NaOH处理温度对DMA-seq数据的影响。
在本实施例中，我们验证了热碱脱氨反应中不同NaOH处理温度对DMA-seq数据的影响，具体流程如下：
1)DNA末端修复和接头连接：与实施例2相同。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后加入11ul 1M NaOH，50-80℃反应60min。
反应结束后加入11ul 1M盐酸。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
3)文库扩增及测序：与实施例2相同。
测序数据分析结果见图5，随着反应温度升高，阳性率和假阳性率均有升高，其中60-70℃效果最好。
实施例4：热碱脱氨反应中NaOH处理浓度对DMA-seq数据的影响。
在本实施例中，我们验证了热碱脱氨反应中不同NaOH处理浓度对DMA-seq数据的影响，具体流程如下：
1)DNA末端修复和接头连接：与实施例2相同。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后分别加入11ul 0.5、1、2、4M NaOH，70℃反应60min。
反应结束后加入相对应的盐酸进行中和。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
测序数据分析结果见图6，随着NaOH处理浓度升高，阳性率和假阳性率均有升高，其中200-400mM效果最好。
实施例5：热碱脱氨反应中NaOH处理时间对DMA-seq数据的影响。
在本实施例中，我们验证了热碱脱氨反应中不同NaOH处理时间对DMA-seq数据的影响，具体流程如下：
1)DNA末端修复和接头连接：与实施例2相同。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后分别加入11ul 4M NaOH，70℃反应30、60、90、120min。
反应结束后加入22ul 2M盐酸进行中和。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
3)文库扩增及测序：与实施例2相同。
测序数据分析结果见图7，随着反应时间延长，阳性率和假阳性率均有升高，其中30-60min效果最好。
实施例6：不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶对DMA-seq数据的影响。
在本实施例中，我们验证了耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶对DMA-seq数据的影响，具体流程如下：
1)DNA末端修复和接头连接：与实施例2相同。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后分别加入11ul 4M NaOH，70℃反应30min。
反应结束后加入22ul 2M盐酸进行中和。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
3)文库扩增及测序：分别使用翌圣生物的2×Super
Figure BDA0003448059610000061
II High-FidelityMix、NEB的
Figure BDA0003448059610000062
UltraTM II
Figure BDA0003448059610000063
Master Mix和ThermoFisher的Phusion Flash高保真PCR预混液对文库进行扩增。按照上述DNA回收方法进行文库回收。Qubit进行文库浓度测定后，在NovaSeq 6000平台上进行文库测序并分析。
测序数据分析结果见图8，相较于耐尿嘧啶的DNA聚合酶，不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶在DMA-seq中能够有效对m5C转化后的DNA序列进行特异性富集扩增，其中2×Super
Figure BDA0003448059610000071
II High-Fidelity Mix的扩增富集效果最明显。
实施例7：DMA-seq对不同DNA投入量的甲基化检测效果。
在本实施例中，我们验证了DMA-seq对不同DNA投入量的甲基化检测效果，具体实施方式如下：
1)DNA末端修复和接头连接
表8
组分 用量
5mC DNA标准品 100pg-100ng
Endprep Mix 10μL
补ddH2O至 60μL
30℃10min，72℃20min，4℃保存。
表9
组分 用量
上述反应体系 60μL
Ligation Enhancer 30
Fast T4 DNA Ligase 5
DNA Adapter 5
Total 100μL
20℃反应15min。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后分别加入11ul 4M NaOH，70℃反应30min。
反应结束后加入22ul 2M盐酸进行中和。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
3)文库扩增及测序
表9
Figure BDA0003448059610000072
混匀后按照以下程序进行反应：
表10
Figure BDA0003448059610000081
PCR结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。按照上述DNA回收方法进行文库回收。Qubit进行文库浓度测定后，在NovaSeq 6000平台上进行文库测序并分析。
测序数据分析结果如表11，DMA-seq对不同投入量的5mC标准品均具有很好的建库效果和阳性转换率，且具有很好的数据质量(Q30)和比对率。
表11
Figure BDA0003448059610000082
实施例8：DMA-seq对Control DNA CpG methylated pUC19的甲基化检测。
在本实施例中，我们使用DMA-seq对Control DNA CpG methylated pUC19的甲基化位点进行检测，具体流程如下：
DNA片段化、末端修复和接头连接
表12
Figure BDA0003448059610000083
30℃10min，72℃20min，4℃保存。
表13
Figure BDA0003448059610000084
Figure BDA0003448059610000091
20℃反应15min。
2)强碱高温处理及酸中和
反应结束后分别加入11ul 4M NaOH，70℃反应30min。
反应结束后加入22ul 2M盐酸进行中和。
反应结束后使用磁珠回收DNA。
3)文库扩增及测序
表14
Figure BDA0003448059610000092
混匀后按照以下程序进行反应：
表15
Figure BDA0003448059610000093
PCR结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。按照上述DNA回收方法进行文库回收。Qubit进行文库浓度测定后，在NovaSeq 6000平台上进行文库测序并分析。
测序数据分析结果如表16，DMA-seq对不同投入量的Control DNA CpGmethylated pUC19标准品均具有很好的建库效果和阳性转换率，且具有很好的数据质量(Q30)和比对率。
表16
Figure BDA0003448059610000101
本发明开发了一种简便的高通量DNA胞嘧啶甲基化检测技术，并命名为DMA-seq(Deamination and Methyl-C Amplification sequencing)。相比于现有的DNA甲基化检测试剂盒，DMA-seq具有操作简单(一步操作)、耗时短、DNA损伤小、数据质量好、对甲基化位点靶向性高等优点，适用于高丰度的DNA甲基化位点检测，尤其是肿瘤早期筛查方向。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 一种简便的高通量DNA甲基化检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggtctg tactgatcga 60
ccgtgcaaca gcagtctcga tcagctgctc cgcatgcaag tagcggtact aacgtacagt 120
acgatgctag ctagtgctta ggatcgagat cgcagaaggt ggacgtaccg tgacgatgat 180
cgatcggatg ctagctagta gtgctcgatc gatagctaat gcttgc 226
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggtctg tactgatcga 60
ccgtgcaaca gcagtctcga tcagctgctc 90
<210> 3
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagtctcga tcagctgctc cgcatgcaag tagcggtact aacgtacagt acgatgctag 60
ctagtgctta ggatcgagat cgcagaagg 89
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggacgtacc gtgacgatga tcgatcggat gctagctagt agtgctcgat cgatagctaa 60
tgcttgccct tctgcgatct cgatcct 87

Claims (9)

1.一种简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于其步骤包括：
(1)用强碱对DNA样本进行氧化处理，使DNA样本中的胞嘧啶氧化成尿嘧啶，甲基化胞嘧啶氧化成胸腺嘧啶；
(2)加入酸中和强碱，使反应体系的pH值控制在6-8以内；
(3)采用不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶，进行文库扩增及测序。
2.根据权利要求1所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(1)中的强碱为NaOH或者KOH。
3.根据权利要求2所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(1)强碱处理浓度为0.05M-0.4M。
4.根据权利要求3所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(1)中氧化处理的温度为50-80℃。
5.根据权利要求4所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(1)中氧化处理的时间为0.5-2h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(1)中的DNA样本在氧化处理前先进行片段化以及末端修复和接头连接处理。
7.根据权利要求6所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：采用超声法打断或者酶切法打断的方式使DNA片段化。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：步骤(2)中的酸为盐酸、硫酸或者乙酸。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的简便的高通量DNA甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中不耐尿嘧啶的高保真DNA聚合酶为2×Hieff
Figure FDA0003448059600000011
PCR Master Mix、
Figure FDA0003448059600000012
UltraTMII
Figure FDA0003448059600000013
Master Mix或Phusion Flash高保真PCR预混液。
CN202111683728.5A 2021-12-30 2021-12-30 一种简便的高通量dna甲基化检测方法 Pending CN114381501A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111683728.5A CN114381501A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 一种简便的高通量dna甲基化检测方法
PCT/CN2022/140475 WO2023125170A1 (zh) 2021-12-30 2022-12-20 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111683728.5A CN114381501A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114381501A true CN114381501A (zh) 2022-04-22

Family

ID=81199305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111683728.5A Pending CN114381501A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114381501A (zh)
WO (1) WO2023125170A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023125170A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409042A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种高通量基因组甲基化dna富集方法及其所使用标签和标签接头
WO2014019595A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Universität Konstanz Method for the detection of dna methylation and hydroxymethylation
WO2023125170A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8440404B2 (en) * 2004-03-08 2013-05-14 Rubicon Genomics Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation
US20150011396A1 (en) * 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
CN111183145B (zh) * 2017-03-08 2024-01-09 芝加哥大学 高灵敏度dna甲基化分析方法
CN110305946A (zh) * 2019-07-18 2019-10-08 重庆大学附属肿瘤医院 基于高通量测序的dna甲基化检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409042A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种高通量基因组甲基化dna富集方法及其所使用标签和标签接头
WO2014019595A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Universität Konstanz Method for the detection of dna methylation and hydroxymethylation
WO2023125170A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHLOE BAUM: "Rapid identification of methylase specificity (RIMS-seq) jointly identifies methylated motifs and generates shotgun sequencing of bacterial genomes", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 49, no. 19, pages 2 *
RICHARD Y, -H. WANG: "HEAT- AND ALKALI-INDUCED DEAMINATION OF 5-METHYLCYTOSINE AND CYTOSINE RESIDUES IN DNA", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 697, pages 371 - 377, XP023467912, DOI: 10.1016/0167-4781(82)90101-4 *
赵贵森;郑海燕;莫耀南;冯文芳;杨渝珍;: "一种用于DNA甲基化分析的改进型亚硫酸氢盐转化法", 中国生物化学与分子生物学报, no. 10, pages 876 - 880 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023125170A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种简便的高通量dna甲基化检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023125170A1 (zh) 2023-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vaisvila et al. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA
EP2737085B1 (en) Methods for detection of nucleotide modification
CN113930516B (zh) 宫颈癌相关基因甲基化的引物、试剂盒、模型及构建方法
Ličytė et al. A bisulfite-free approach for base-resolution analysis of genomic 5-carboxylcytosine
CN114381501A (zh) 一种简便的高通量dna甲基化检测方法
Zhou et al. A novel methyl-dependent DNA endonuclease GlaI coupling with double cascaded strand displacement amplification and CRISPR/Cas12a for ultra-sensitive detection of DNA methylation
CN113881739B (zh) 氧化含锯齿末端核酸分子的方法及还原方法与文库构建法
CN113943763B (zh) 一种还原核酸的方法及其检测方法
CN107488721A (zh) 消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用
US20220251640A1 (en) Methods of determination of genome architecture and epigenetic profile
CN113862333B (zh) 一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法
WO2022257354A1 (zh) 检测核酸分子中n6-甲基腺嘌呤的方法及试剂盒
CN114032293A (zh) 一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用
CN114085894A (zh) 核酸甲基化胞嘧啶转化方法
CN113846160A (zh) 正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法及过氧钨酸盐在将5hmC氧化为thT中的应用
CN114134205A (zh) 脱氨酶介导的dna中n4-甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法
Sun et al. Non-destructive enzymatic deamination enables single molecule long read sequencing for the determination of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single base resolution
WO2019233450A1 (zh) Dna甲基化的检测方法
WO2019233451A1 (zh) Dna甲基化检测探针
CN110541040B (zh) 一种利用arms-pcr技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒
CN116926167A (zh) 一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用
CN115725703A (zh) 一种特异性酶切结合qPCR单碱基分辨定量检测DNA中尿嘧啶的方法
WO2018129988A1 (zh) 用于检测肠癌的基因标志物的方法、用该方法筛选的基因标志物及其用途
CN114657248A (zh) 用于检测早期结直肠癌的血浆游离dna甲基化生物标记物或其组合物、应用及试剂盒
CN117625745A (zh) Dna甲基化转化方法、甲基化酶转化试剂盒及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination