JP2021503947A - 二本鎖dnaを増幅するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
なし。
本出願は、2017年11月21日に出願された米国仮特許出願第62/589,074号に関連する。
なし。
本明細書に添付する。
過去10年の間に、がん疾患の理解ならびに標的療法の開発において非常に大きな進歩が見られた。かつてないほどの数の新薬が、過去10年にわたりFDAおよびEMAによってがん治療用に承認された1。いくつかの最もよく知られた薬物としては、EGFR(HER2)受容体を標的とする、乳がん治療のためのトラスツズマブ(Herceptin)、EGFR(HER1)受容体を標的とする、結腸直腸腺癌治療のためのセツキシマブ(Erbitux)、Bcr-Abl融合タンパク質を標的とする、骨髄増殖性障害およびCMLのためのイマチニブ(Gleevec)、いくつかのチロシンタンパク質キナーゼを標的とする、肝臓および腎臓がんのためのソラフェニブ(Nexavar)、ALK-EML融合タンパク質の阻害を介した非小細胞肺癌治療のためのクリゾチニブ(Xalkori)、またはBraf V600E変異キナーゼの阻害を介した黒色腫治療のためのベムラフェニブ(Zelboraf)が挙げられる。多くの一連の標的療法が利用可能になったことにより、患者の効率的な分子プロファイリングの必要性が生じている。
腫瘍学および他の分野における無細胞DNAの分析は、患者の診断および治療を改善する大きな機会をもたらす。主な問題は、無細胞DNAの含有量が非常に少ない生物学的流体、例えば血漿、尿、またはCSF試料から結果を得ることが困難であるということである。本明細書に開示される方法は、二本鎖DNAを含む短い二本鎖ポリヌクレオチド断片を増幅することによって、この問題点の解決策を提供する。これには、無細胞DNAにおいて見出されるそれらの分子が非限定的に含まれる。増幅は、ローリングサークルDNA増幅などの後続の工程による試料の効率的な増幅を可能にする試料の前処理の新規なセットと組み合わせた、「プライマーゼ開始型多置換増幅(primase-initiated multiple displacement amplification)」(「PI-MDA」、別称「TruePrime」)と呼ばれる増幅技術に基づく。本明細書において使用する「プライマーゼ開始型多置換増幅」または「TruePrime」とは、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長のためのプライマーを提供するためにプライマーゼ/ポリメラーゼを使用する、多置換増幅(「MDA」)の一形態を指す。一般的に、ポリメラーゼは、非常に高い置換能力、およびプロセス中の配列変更を防ぐための良好な合成忠実度を有する。そのようなポリメラーゼの一つはPhi29 DNAポリメラーゼである。現在のゴールドスタンダードのMDAは、増幅を始めるために短いDNA片(「オリゴヌクレオチド」)を必要とするが、一方、プライマーゼ開始型多置換増幅は、いかなる合成ランダムプライマーも必要としない。
I. 序説
PrimPolは、好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスから得られた酵素である。PrimPolは、1つの耐熱性タンパク質に、プライマーゼおよびポリメラーゼという2つの別個の補完的な活性を併せ持つ。従来のポリメラーゼは、相補配列を合成するためにテンプレート分子にアニールした短い一続きのヌクレオチド(プライマー)を必要とする。一方、PrimPolは、それ自身のプライマー配列を生成し、それによって全く新しい用途を提供する。
本明細書においては、とりわけ、線状二本鎖ポリヌクレオチド(例えばDNA分子)、特にアポトーシス(モノヌクレオソーム)性無細胞DNAを増幅する方法を提供する。線状二本鎖DNAを増幅する方法は、一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するようにDNA分子の両端に一本鎖ヘアピンアダプターを付着させる工程、ならびに、ローリングサークル増幅および多置換増幅、例えばプライマーゼ開始型多置換増幅によって共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程を含む。
本明細書に記載の増幅方法において使用するための線状二本鎖DNAは、任意の供給源から提供され得る。これには、例えば、真核生物、真正細菌、古細菌、およびウイルスからのDNAが含まれる。DNAの真核生物供給源には、植物、動物、脊椎動物、哺乳動物、およびヒトが含まれ得る。DNAの微生物供給源には、個体のマイクロバイオームからまたは環境から供給される微生物が含まれ得る。
本明細書に開示される方法において使用する線状二本鎖DNAは、無細胞DNA(「cfDNA」)を含み得る。無細胞DNAとは、細胞内部に封入されていないDNAを指す。無細胞DNAはアポトーシス性無細胞DNAであり得る。(図1、「アポトーシス性無細胞DNA」。)アポトーシス性cfDNAとは、例えばアポトーシス細胞死機構により死んだ細胞または死にかかっている細胞から放出されたDNAを指し、アポトーシス細胞死機構では、DNAはヌクレオソーム間で切断されて、160〜170bpのDNA断片、またはすべてのヌクレオソーム間でDNAの切断が生じるわけではない場合はその倍数のDNA断片が産生される。これには、正常細胞、例えば生殖細胞系列ゲノムを有する正常細胞から放出されたDNAが含まれる。また、これには、循環腫瘍DNAまたは「ctDNA」とも称される、がん細胞(例えば悪性細胞)から放出されたDNAも含まれる。このDNAは一般的に、例えば癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に、がんに関連する体細胞突然変異を保有する。また、アポトーシス性cfDNAには、母体循環血中の胎児DNAも含まれる。無細胞DNAは、血液、血漿、血清、CSF、尿、唾液、涙、乳汁、精液、および滑液を非限定的に含むいくつかの異なる体液のうち任意のものから供給され得る。アポトーシス性cfDNAは一般的に、約110〜約230ヌクレオチドの間の第一のモノヌクレオソームピーク(最頻値は約168ヌクレオチド)と、約240〜440ヌクレオチドの間の第二の、より小さいジヌクレオソームピークという、2つのピークを伴うサイズ分布を有する。
他の態様において、二本鎖DNA分子は、断片化ゲノムDNA、例えば細胞から単離した断片化ゲノムDNA、または、mRNA、rRNAもしくはtRNA分子などのRNA分子の逆転写により産生された二本鎖cDNA分子を含む。
末端修復とは、3’および/または5’一本鎖オーバーハングを有する二本鎖DNA分子に、粘着末端または平滑末端のいずれかを提供するプロセスを指す。末端修復によって、二本鎖DNA分子はポリヌクレオチドアダプターとの付着に一層適したものになる。付着は、粘着末端ライゲーションまたは平滑末端ライゲーションのいずれかによるものであり得る。「粘着末端ライゲーション」とは、各々がもう一方の3’オーバーハングに相補的な3’オーバーハングを有する2つの二本鎖ポリヌクレオチドのライゲーションを指す。粘着末端は、例えば、3’dAおよび3’dTなどの1ヌクレオチドオーバーハング、または、制限酵素の消化によって産生されたオーバーハングなどのより長い粘着末端であり得る。「平滑末端ライゲーション」とは、ある二本鎖ポリヌクレオチドの、別の二本鎖ポリヌクレオチドの平滑末端とのライゲーションを指す。
末端修復され、任意でdAテーリングされたポリヌクレオチドを、アダプターとライゲーションすることができる。アダプターは、標的分子との付着のために適合されたポリヌクレオチド分子である。一般的に、アダプターには、DNA鎖の伸長をプライミングするためのヌクレオチド配列が含まれる。本開示の特定の方法において、アダプターはヘアピンアダプターである。本明細書において使用する「ヘアピンアダプター」なる用語は、第一および第三の領域に隣接した第二の領域を含む一本鎖核酸分子(例えばDNA)を指す。第一および第三の領域は、互いとハイブリダイズするのに十分な相補性を有する(例えば95%、99%、または100%相補的)。第二の領域は、第一の領域と第三の領域のどちらとも相補的でない。アダプターは、25〜100ヌクレオチド長の長さを有し得る。第二の領域は、例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15ヌクレオチド長であり得るか、または25ヌクレオチド長未満であり得る。結果として、ヘアピンアダプター分子は自分自身の上に折り返されて、二本鎖の末端と、ハイブリダイズされていない一本鎖の内部セグメントとを含むステムループ構造を形成することができる。ヘアピンアダプターは、用途に応じて、3’dAオーバーハングを含み得るかまたは平滑末端であり得る。例えば図7および図8を参照されたい。
特定の態様において、一本鎖共有結合性閉鎖ポリヌクレオチドの増幅は、TthPrimPolなどのDNA指向性プライマーゼ/ポリメラーゼと、Phi29などの鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、修飾または非修飾デオキシリボヌクレオチドとを使用することを伴う。これらの試薬は、併用すると、プライマーゼ/ポリメラーゼによってプライミングされDNAポリメラーゼによって伸長されるローリングサークル増幅をもたらす。さらに、プライマーゼ/ポリメラーゼとDNAポリメラーゼの併用は、プライマーゼ/ポリメラーゼおよび/またはランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅分子のプライミングとDNAポリメラーゼによるプライマー伸長とによる多鎖置換増幅をもたらし得る。増幅分子における多数の位置からDNA合成がプライミングされ伸長されるため、多鎖置換増幅により分岐構造が生じる。
本明細書において使用する「プライミング」なる用語は、ポリヌクレオチドテンプレート上でのオリゴヌクレオチドプライマーの生成を指す。
増幅法では、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、例えば、(例えば二本鎖DNAよりはむしろ)一本鎖DNAに対する強い結合性を有するポリメラーゼを利用することができる。鎖置換活性は、例えばヘアピン構造のループ区域において、プライマー位置を伸長しながらDNA分子のハイブリダイズした鎖を置換するのに有用であり得る。
プライマー生成およびプライマー伸長は、プライマーゼ/ポリメラーゼ酵素およびDNAポリメラーゼに、デオキシリボヌクレオチド基質、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸を供給することによって達成することができる。一般的に、これらには4種の標準塩基であるA、T、GおよびCが含まれる。しかしながら、特定の態様においては、イノシンなどの非天然ヌクレオチドが含まれ得る。特定の態様において、ヌクレオチドは、それらが組み込まれたポリヌクレオチドの検出または捕捉のための標識を有してもよい。
ローリングサークル増幅とは、共有結合性閉鎖DNA分子、例えば一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する方法である。テンプレートDNA分子は、プライマー、例えばプライマーゼ/ポリメラーゼによって提供されたプライマーを用いてプライミングされる。DNAポリメラーゼは、このプライマーに対するプライマー伸長を閉鎖DNA分子の周囲で行う。ポリメラーゼはハイブリダイズしたコピーを置換して、テンプレートの周囲でポリヌクレオチド伸長を続け、連鎖状の増幅産物を産生する。
多置換増幅とは、テンプレート分子からのプライマー伸長によって分子が産生され、これらの分子自体がプライミングされプライマー伸長により複製されて分岐状の構造が生じる、PCRに基づかない等温DNA増幅法である。各プライマーが1つのDNA分子テンプレートから分枝区域内へと伸長されるにつれて、各分枝は互いに置換される。特定の態様において、MDAでは、プライマーとしてランダムヘキサマーを利用して、元のテンプレート上およびその増幅コピー上の複数部位での増幅をプライミングする。多鎖増幅は、例えば2011年4月21日に公開された国際公開公報第2011/047307A1号(「Multiple Displacement Amplification」)にさらに記載されている。複数プライミング部位のプライマーを伸長する重合。
一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する他の方法が本明細書において企図される。
である。この縮重領域は4種のDNAヌクレオチドのいずれかで構成されたランダム配列である。DOP-PCR手順の最初の5工程は、非特異的増幅工程である。縮重プライマーは低いアニーリング温度とともに、ゲノム全体にわたる場所でのランダムなアニーリングを生じる。PCRの間、これらのプライマーから伸長が起こり、長い断片が生成される。
本明細書において使用する「ハイスループットシーケンシング」なる用語は、何千もの核酸分子の同時またはほぼ同時のシーケンシングを指す。ハイスループットシーケンシングは「次世代シーケンシング」または「超並列シーケンシング」と称される場合もある。ハイスループットシーケンシングのためのプラットフォームには、非限定的に、超並列シグネチャシーケンシング(MPSS)、ポロニー(Polony)シーケンシング、454パイロシーケンシング、Illumina(Solexa)シーケンシング、SOLiDシーケンシング、Ion Torrent半導体シーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Heliscope 1分子シーケンシング、1分子リアルタイム(SMRT)シーケンシング(PacBio)、およびナノポアDNAシーケンシング(例えばOxford Nanopore)が含まれる。
本明細書に開示される方法を行う際に使用するためのキットもまた本明細書において提供される。本明細書において使用する「キット」なる用語は、一緒に使用するよう意図された品物の集合体を指す。
図3に、PCR増幅によって得られた短鎖DNA分子(200bp)の増幅を示す。末端修復およびdAテーリング反応、ならびにヘアピンアダプターの付加は、TruePrimeによる短鎖DNAインプットの効率的な増幅を可能にする。
図5に、PCR増幅によって得られ、本開示の手順である末端修復、dAテーリング、ヘアピンアダプターのライゲーション、およびローリングサークル増幅に供された、短鎖DNA分子(200bp)の増幅を示す。ローリングサークル増幅は、2つの独立に調製されたDNA試料を基質として使用して(調製物1および調製物2)、増幅を誘発するためにTthPrimPol(TruePrime)またはランダム合成プライマー(RP)のいずれかを用いて実行することができる。増幅収量は、ランダムプライマーを使用した場合にはるかに多い(図5の上部を参照されたい)。しかしながら、制限酵素の消化による同量の増幅DNA(500ng)の分析は、恐らくはランダム合成プライマーに基づくMDA法の周知の欠点であるプライマーダイマーの増幅に起因して、TruePrime(TthPrimPolに基づく)がランダムプライマーよりも多くの標的分子(236bp)を産生することを明らかにしている。
図6に、PCR増幅によって得られた50bpから1250bpまでの範囲(50、100、150、200、400、500、600、700、800および1250bp)のDNA分子の増幅を示す。末端修復およびdAテーリング反応、ならびにヘアピンアダプターの付加は、TruePrimeによるさまざまなDNA分子の効率的な増幅を可能にする。
図7に、試験した異なるヘアピンアダプターを示す。アダプターはすべて、ヘアピンを形成する分子の自己ハイブリダイゼーションを可能にする自己相補的配列を有する。ヘアピン配列および長さはそれぞれの場合で異なる。
48人のがん患者をインフォームド・コンセントのもとで本研究に採用した。StreckのCell-free DNA BCT(登録商標)管を使用して血液10mlを抽出した。有核血液細胞からのゲノムDNAの混入を避けるためにダブルスピン遠心分離プロトコルにより血漿3mlを直ちに単離した。ゴールドスタンダードのcfDNA精製キット(QiagenのQIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)を使用して血漿試料1mlから無細胞DNAを精製した。Qubitによって定量化した各ケースにおいて、さまざまな収量が得られた(0.12〜21.6ng/μlの範囲)。無細胞DNAのサイズプロファイルを、バイオアナライザHSキットを使用して分析し、関心対象のアポトーシス性無細胞DNA分子(約160〜170bpのサイズ)の存在、および他のより長いDNA分子の非存在を確認した。
図10に、ピコグラムの無細胞DNAから出発してマイクログラムの範囲のDNA増幅収量を実現する、本開示のワークフローの優れた感度および効率を示す。インプット量と観察された増幅収量との間の比例関係が顕著である。
結腸がん患者(T3N1aM0)由来の無細胞DNA 4ngを、cfDNA増幅のための本開示のワークフローに二つ組で供した。
3人の異なる結腸がん患者(T3/4)由来の無細胞DNA 26.7ng、84ng、および150ngを、cfDNA増幅のための開示のワークフローに供し、それぞれ15μg、17μg、および20μgを得た。Ion Proton(商標)シーケンシングシステムにおいて多重化のためのタグ分子バーコードとともにOncomine(商標)Colon cfDNA Assayを使用し、Ion Proton(商標)チップを使用して、各患者由来の増幅なしのcfDNA 20ngおよび増幅ありのcfDNA 50ngをシーケンシングした。ライブラリはIon Chef(商標)システムを使用して調製した。Torrent Suiteソフトウェアを使用してリードアライメントを実行し、CLCソフトウェアを以下の設定で使用してバリアントコールを行った:倍数性=2。この値を超える被覆度を有する位置の無視=1000000。標的領域に対するコールの制限=Oncomine_Colon_cfDNA.03062017.Designed_BED。壊れたペアの無視=なし。非特異的なマッチの無視=リード。最小被覆度=10。最小カウント=2。最小頻度(%)=1.0〜35.0。塩基の質のフィルター=なし。リードの方向のフィルター=なし。相対的なリードの方向のフィルター=なし。リードの位置のフィルター=なし。パイロエラーバリアントの除去=なし。トラックの作成=あり。注釈付きの表の作成=なし。
本発明の例示的態様は以下を含む。
1. (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;ならびに
(c)(i)ローリングサークル増幅および
(ii)多置換増幅
による単一操作において、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。
2. 線状二本鎖DNA分子が、例えば480bp未満、320bp未満、または約140bp〜180bp(例えば平均約160bp)のサイズを有する、アポトーシス性無細胞DNA分子を含む、態様1の方法。
3. 線状二本鎖DNAを提供する工程が、染色体DNAを断片化することを含む、態様1の方法。
4. 線状二本鎖DNAが、例えばCSF、血液、血漿、血清、腹水、尿、唾液、涙、乳汁、精液、および滑液から選択される、哺乳動物からの1種または複数種の体液に由来する、前記態様のいずれかの方法。
5. 線状二本鎖DNAを提供する工程が、該線状二本鎖DNAを生物学的試料中の他の細胞成分から単離することを含む、前記態様のいずれかの方法。
6. 線状二本鎖DNAを提供する工程が、末端修復および/またはdAテーリングを含む、前記態様のいずれかの方法。
7. 末端修復が、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)、T4 DNAポリメラーゼクレノウ断片、およびT4 DNAポリメラーゼ大型断片のうちの1つまたは複数を使用して行われる、態様5の方法。
8. Taqポリメラーゼを使用してdAテーリングを行う工程を含む、態様5の方法。
9. アダプターが一本鎖DNA分子を含む、前記態様のいずれかの方法。
10. アダプターがヘアピン構造を有する、前記態様のいずれかの方法。
11. 以下の配列:
を有するアダプターを付着させる工程を含む、前記態様のいずれかの方法。
12. アダプターがプライマーゼ/ポリメラーゼ認識配列を含む、前記態様のいずれかの方法。
13. アダプターを付着させる工程が、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションを含む、前記態様のいずれかの方法。
14. アポトーシス性無細胞DNA分子を提供する工程;
該無細胞DNA分子の末端修復およびdAテーリングを行う工程;ならびに
末端修復されdAテーリングされた該無細胞DNA分子に、dTオーバーハングを含むヘアピンアダプターをライゲーションする工程
を含む、前記態様のいずれかの方法。
15. プライマーゼ/ポリメラーゼによって増幅をプライミングする、前記態様のいずれかの方法。
16. サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)プライマーゼ/ポリメラーゼ(TthPrimPol)によって増幅をプライミングする、前記態様のいずれかの方法。
17. SEQ ID NO: 10の配列を有するTthPrimPolによって増幅をプライミングする、前記態様のいずれかの方法。
18. ヒトプライマーゼ/ポリメラーゼ(HsPrimPol)によって増幅をプライミングする、前記態様のいずれかの方法。
19. ランダム合成プライマー(例えば、一般的には3〜8ヌクレオチド長のランダム配列、例えばヘキサマー)を用いて増幅をプライミングする、前記態様のいずれかの方法。
20. 増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用した鎖伸長を含む、前記態様のいずれかの方法。
21. 増幅が、Phi29ポリメラーゼを使用した鎖伸長を含む、前記態様のいずれかの方法。
22. 増幅が、プライマーゼ開始型多置換増幅(primase-initiated multiple displacement amplification)を含む、前記態様のいずれかの方法。
23. プライマーゼ/ポリメラーゼを使用して前記DNA上でプライマーを生成する工程、および鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して該プライマーを伸長する工程を含む、前記態様のいずれかの方法。
24. プライマーゼ/ポリメラーゼがTthPrimPolを含み、ポリメラーゼがPhi29ポリメラーゼを含む、態様23の方法。
25. (d)増幅されたDNAをシーケンシングする工程
をさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
26. シーケンシングする工程が、増幅されたDNAを断片化すること、および断片化された該DNAにシーケンシングプラットフォーム特有のアダプターを付着させることを含む、態様25の方法。
27. シーケンシングが、選択された配列(アンプリコン)、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムに対して行われる、態様25の方法。
28. (e)シーケンシングされた増幅DNAにおける1つまたは複数の遺伝的バリアントを検出する工程
をさらに含む、態様25の方法。
29. 増幅されたDNAを定量化する工程をさらに含む、前記態様のいずれかの方法。
30. (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)該DNA分子に対して末端修復およびdAテーリングを行う工程;
(c)アダプターでタグ付けされたDNA分子を産生するように、末端修復されdAテーリングされた該DNA分子にヘアピンアダプターをライゲーションする工程;ならびに
(d)アダプターでタグ付けされた該DNA分子を、(i)ローリングサークル増幅および(ii)多置換増幅(「MDA」)によって増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。
31. 増幅が、Phi29 DNAポリメラーゼおよびランダム合成プライマーを使用したランダムプライムドMDA(random-primed MDA)を含む、態様30の方法。
32. 増幅が、プライマーゼ/ポリメラーゼ(例えばTthPrimPol)を用いてプライミングすることを含む、態様30の方法。
33. (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;および
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼと、ランダムプライマーまたは縮重プライマーと、任意選択的なリガーゼとの任意の組み合わせによって、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。
34. 増幅が、縮重オリゴヌクレオチドプライムドPCR(Degenerate oligonucleotide-primed PCR)(DOP-PCR)、リンカー-アダプターPCR(linker-adaptor PCR)(LA-PCR)、プライマー伸長事前増幅PCR(Primer Extension Preamplification PCR)(PEP-PCR-/I-PEP-PCR)、およびそれらの変形形態を含む、態様33の方法。
35. (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;および
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ(例えばTaqポリメラーゼ)と、非常にプロセッシブな鎖置換DNAポリメラーゼ(例えばPhi29ポリメラーゼまたはバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)(Bst)ポリメラーゼ)との任意の組み合わせを使用して、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。
36. 増幅が、多重アニーリングおよびループ化に基づく増幅サイクル(multiple annealing and looping-based amplification cycles)(MALBAC)を含む、態様35の方法。
37. (a)プライマーゼ/ポリメラーゼ;
(b)鎖置換活性を有するポリメラーゼ;
(c)デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および
(d)一本鎖ヘアピンアダプター
を含むキット。
38. プライマーゼ/ポリメラーゼがTthPrimPolである、態様37のキット。
39. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、態様37のキット。
40. 一本鎖アダプターが、配列:
を有する、態様37のキット。
41. (d)以下:
(i)dsDNA末端修復のための1つもしくは複数の酵素(例えばT4 DNAポリメラーゼ、クレノウ断片、および/またはTaqポリメラーゼ);
(ii)DNAライゲーションのための1つもしくは複数の酵素;
(iii)任意で、DNAライゲーション効率を高めるための試薬;
(iv)反応緩衝液;ならびに
(v)前述の任意の要素とともに使用するための緩衝液
から選択される1、2、または3個の要素
をさらに含む、態様37のキット。
42. (a)アポトーシス性無細胞DNAの単離のための試薬
をさらに含む、前記態様のいずれかのキット。
43. アダプターでタグ付けされた一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子の集団を含むDNAライブラリであって、各DNA分子は第一、第二、第三、および第四の領域を含み、該第二および第四の領域は互いに対して相補的であり、該第一および第三の領域は互いに対して相補的ではない、DNAライブラリ。
44. 第一および第三の領域が同一の配列を有する、態様43のDNAライブラリ。
45. 第二および第四の領域がゲノムDNAのセグメント、例えばアポトーシス性cfDNAを含む、態様43または態様44のDNAライブラリ。
Claims (45)
- (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;ならびに
(c)(i)ローリングサークル増幅および
(ii)多置換増幅
による単一操作において、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。 - 線状二本鎖DNA分子が、例えば480bp未満、320bp未満、または約140bp〜180bp(例えば平均約160bp)のサイズを有する、アポトーシス性無細胞DNA分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 線状二本鎖DNAを提供する工程が、染色体DNAを断片化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 線状二本鎖DNAが、例えばCSF、血液、血漿、血清、腹水、尿、唾液、涙、乳汁、精液、および滑液から選択される、哺乳動物からの1種または複数種の体液に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 線状二本鎖DNAを提供する工程が、該線状二本鎖DNAを生物学的試料中の他の細胞成分から単離することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 線状二本鎖DNAを提供する工程が、末端修復および/またはdAテーリングを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 末端修復が、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)、T4 DNAポリメラーゼクレノウ断片、およびT4 DNAポリメラーゼ大型断片のうちの1つまたは複数を使用して行われる、請求項5に記載の方法。
- Taqポリメラーゼを使用してdAテーリングを行う工程を含む、請求項5に記載の方法。
- アダプターが一本鎖DNA分子を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターがヘアピン構造を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターがプライマーゼ/ポリメラーゼ認識配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターを付着させる工程が、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- アポトーシス性無細胞DNA分子を提供する工程;
該無細胞DNA分子の末端修復およびdAテーリングを行う工程;ならびに
末端修復されdAテーリングされた該無細胞DNA分子に、dTオーバーハングを含むヘアピンアダプターをライゲーションする工程
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - プライマーゼ/ポリメラーゼによって増幅をプライミングする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)プライマーゼ/ポリメラーゼ(TthPrimPol)によって増幅をプライミングする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- SEQ ID NO: 10の配列を有するTthPrimPolによって増幅をプライミングする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトプライマーゼ/ポリメラーゼ(HsPrimPol)によって増幅をプライミングする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ランダム合成プライマー(例えばランダムヘキサマー配列)を用いて増幅をプライミングする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用した鎖伸長を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、Phi29ポリメラーゼを使用した鎖伸長を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、プライマーゼ開始型多置換増幅(primase-initiated multiple displacement amplification)を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーゼ/ポリメラーゼを使用して前記DNA上でプライマーを生成する工程、および鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して該プライマーを伸長する工程を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーゼ/ポリメラーゼがTthPrimPolを含み、ポリメラーゼがPhi29ポリメラーゼを含む、請求項23に記載の方法。
- (d)増幅されたDNAをシーケンシングする工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - シーケンシングする工程が、増幅されたDNAを断片化すること、および断片化された該DNAにシーケンシングプラットフォーム特有のアダプターを付着させることを含む、請求項25に記載の方法。
- シーケンシングが、選択された配列(アンプリコン)、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムに対して行われる、請求項25に記載の方法。
- (e)シーケンシングされた増幅DNAにおける1つまたは複数の遺伝的バリアントを検出する工程
をさらに含む、請求項25に記載の方法。 - 増幅されたDNAを定量化する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)該DNA分子に対して末端修復およびdAテーリングを行う工程;
(c)アダプターでタグ付けされたDNA分子を産生するように、末端修復されdAテーリングされた該DNA分子にヘアピンアダプターをライゲーションする工程;ならびに
(d)アダプターでタグ付けされた該DNA分子を、(i)ローリングサークル増幅および(ii)多置換増幅(「MDA」)によって増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。 - 増幅が、Phi29 DNAポリメラーゼおよびランダム合成プライマーを使用したランダムプライムドMDA(random-primed MDA)を含む、請求項30に記載の方法。
- 増幅が、プライマーゼ/ポリメラーゼ(例えばTthPrimPol)を用いてプライミングすることを含む、請求項30に記載の方法。
- (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;および
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼと、ランダムプライマーまたは縮重プライマーと、任意選択的なリガーゼとの任意の組み合わせによって、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。 - 増幅が、縮重オリゴヌクレオチドプライムドPCR(Degenerate oligonucleotide-primed PCR)(DOP-PCR)、リンカー-アダプターPCR(linker-adaptor PCR)(LA-PCR)、プライマー伸長事前増幅PCR(Primer Extension Preamplification PCR)(PEP-PCR-/I-PEP-PCR)、およびそれらの変形形態を含む、請求項33に記載の方法。
- (a)線状二本鎖DNA分子を提供する工程;
(b)一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を産生するように、該線状二本鎖DNA分子の両端に一本鎖アダプターを付着させる工程;および
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ(例えばTaqポリメラーゼ)と、非常にプロセッシブな鎖置換DNAポリメラーゼ(例えばPhi29ポリメラーゼまたはバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)(Bst)ポリメラーゼ)との任意の組み合わせを使用して、該一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子を増幅する工程
を含む、DNAを増幅する方法。 - 増幅が、多重アニーリングおよびループ化に基づく増幅サイクル(multiple annealing and looping-based amplification cycles)(MALBAC)を含む、請求項35に記載の方法。
- (a)プライマーゼ/ポリメラーゼ;
(b)鎖置換活性を有するポリメラーゼ;
(c)デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および
(d)一本鎖ヘアピンアダプター
を含むキット。 - プライマーゼ/ポリメラーゼがTthPrimPolである、請求項37に記載のキット。
- ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、請求項37に記載のキット。
- (d)以下:
(i)dsDNA末端修復のための1つもしくは複数の酵素(例えばT4 DNAポリメラーゼ、クレノウ断片、および/またはTaqポリメラーゼ);
(ii)DNAライゲーションのための1つもしくは複数の酵素;
(iii)任意で、DNAライゲーション効率を高めるための試薬;
(iv)反応緩衝液;ならびに
(v)前述の任意の要素とともに使用するための緩衝液
から選択される1、2、または3個の要素
をさらに含む、請求項37に記載のキット。 - (a)アポトーシス性無細胞DNAの単離のための試薬
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のキット。 - アダプターでタグ付けされた一本鎖共有結合性閉鎖DNA分子の集団を含むDNAライブラリであって、各DNA分子は第一、第二、第三、および第四の領域を含み、該第二および第四の領域は互いに対して相補的であり、該第一および第三の領域は互いに対して相補的ではない、DNAライブラリ。
- 第一および第三の領域が同一の配列を有する、請求項43に記載のDNAライブラリ。
- 第二および第四の領域がゲノムDNAのセグメント、例えばアポトーシス性cfDNAを含む、請求項43または請求項44に記載のDNAライブラリ。
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