ES2914396T3 - Medios y métodos de amplificación de secuencias de nucleótidos - Google Patents

Abstract

Un método de amplificación de ADN fragmentado con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas: a. obtener una muestra biológica que comprende ADN fragmentado, b. desfosforilar el ADN fragmentado en la muestra, y c. digerir el ADN resultante usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y d. ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y e. retirar los productos incompletamente ligados, y f. amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con los adaptadores.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y métodos de amplificación de secuencias de nucleótidos

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo del análisis de ácidos nucleicos. En particular, la invención proporciona métodos de preparación de un conjunto de fragmentos de ADN degradados aislados de una muestra de líquido corporal de un individuo. El conjunto preparado de secuencias del ácido nucleico se puede usar en un método de diagnóstico, tal como, por ejemplo, la detección y/o el pronóstico del cáncer.

Antecedentes de la invención

En 2016, el cáncer afectará a más de 2 millones de individuos ese año en solo los Estados Unidos, pero un biomarcador en circulación clínicamente probado que se puede usar para ayudar a orientar en el tratamiento del paciente estará disponible solo para una minoría de ellos, incluso en el ámbito de las metástasis generalizadas. Los biomarcadores de proteína basados en suero, tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno prostático específico (PSA), se usan comúnmente para este fin, pero estas proteínas también se encuentran en el suero de individuos sin cáncer. Además, no se encuentra que estos marcadores estén elevados en una porción sustancial de pacientes con cánceres avanzados. Durante muchos años, los científicos han buscado un biomarcador universal para detectar tumores en una fase precoz. Recientemente, una nueva generación de biomarcadores ha estado disponible con el descubrimiento de las alteraciones genéticas que son responsables del inicio y la progresión de los cánceres humanos. De hecho, con la información genómica cada vez mayor de los estudios de secuenciación del genoma del cáncer, ahora se sabe que prácticamente todos los cánceres de cada tipo albergan alteraciones genéticas somáticas. Estas alteraciones incluyen sustituciones de una sola base, inserciones, deleciones, translocaciones (incluyendo estas últimas las asociadas con la creación de fusiones génicas, amplificaciones génicas o pérdidas de heterocigosidad) y también regiones de ADN diferencialmente metiladas. Mutaciones somáticas comparables ocurren a frecuencias despreciables en poblaciones de células normales y, por lo tanto, proporcionan biomarcadores exquisitamente específicos desde una perspectiva biológica. Una fuente importante de ADN de tumor que puede ser evaluada de forma no invasiva en la circulación es el ADN de tumor circulante (ADNtc) libre. Este ADNtc está compuesto por pequeños fragmentos de ácido nucleico. Muchos estudios han mostrado que el ADNtc está presente en pacientes que tienen tumores, incluso en tumores en la fase precoz (o no detectables). Los métodos de diagnóstico de primera línea detectaron mutaciones en oncogenes o genes supresores de tumor individuales bien conocidos. Los métodos de diagnóstico posteriores investigaron múltiples de estos genes bien conocidos por PCR múltiple o métodos basados en matriz. A pesar de que estos métodos pueden detectar una cantidad significativa de tumores, sería beneficioso tener una visión más imparcial de todo el genoma en el perfil mutacional de un tumor. La secuenciación del genoma completo de la muestra de ADN libre circulante es todavía muy compleja y el análisis de datos también es exhaustivo, por lo que existe una necesidad de enriquecer las secuencias que tienen la mutación. Existen varias técnicas de enriquecimiento de ADN mutado y usan las diferencias cinéticas de rehibridación (análisis de Cot) entre secuencias no mutantes y secuencias que tienen mutación en combinación con una nucleasa detectora de mutaciones, enzimas reparadoras de ADN que detectan una secuencia con emparejamiento erróneo o nucleasa específica de dúplex que detecta una secuencia completamente emparejada. Todas estas técnicas se diferencian en la preparación del ácido nucleico antes de la desnaturalización-renaturalización. Por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. 20030022215 usa digestión por endonucleasa de restricción en combinación con autocircularización de moléculas correctamente rehibridadas para seleccionar en contra de la rehibridación con emparejamiento erróneo artificial no deseado. La solicitud de patente de EE.UU. 20150133316 usa PCR con cebadores degenerados para amplificar una fracción del genoma y la solicitud de patente de EE.UU. 20150232924 usa la técnica de AFLP para amplificar una fracción del genoma digerida con endonucleasa de restricción. Además, el documento de patente WO2009082488, que pertenece al campo de la interferencia por ARN, desvela una ADN fosfatasa, una enzima de restricción, exonucleasas I, III y VII, enzima de Klenow, Klenow (exo-menos), bases de desoxinucleótidos, adaptadores con bucle en horquilla, cebadores específicos de los adaptadores con bucle en horquilla, una ADN polimerasa y un tampón que se pueden combinar en un sistema; sin embargo, la presente solicitud no desvela la presencia de una ADN fosfatasa termosensible ni una enzima de restricción insensible a la metilación. Los documentos de patente WO2012092265, WO2012012037 y Travers Kevin J et al (2010) Nucleic Acids Research, vol. 38, N.° 15, páginas E159-1, desvelan un método de amplificación de fragmentos fragmentados en el intervalo de 100-800 pb, que se ligan con adaptadores de horquilla, pero una etapa de fosfatasa en el ADN diana no se desvela en estas referencias. Además de la necesidad de reducir la complejidad de la muestra antes de la secuenciación, existe una necesidad igualmente importante de amplificación fiable de secuencias del ácido nucleico fragmentadas por nucleasa, tales como el ADNtc presente en una muestra de sangre. La presente invención cumple esta necesidad y proporciona métodos y kits para una amplificación fiable de ácidos nucleicos fragmentados por nucleasa que están presentes en una muestra biológica. Por consiguiente, la invención proporciona una tecnología de amplificación que se puede llevar a cabo en un único receptor y con un único sistema amortiguador.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de amplificación de ADN fragmentado con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica que comprende ADN fragmentado,

b) desfosforilar el ADN fragmentado en la muestra, y

c) digerir el ADN resultante usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y d) ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y

e) retirar los productos incompletamente ligados, y

f) amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con los adaptadores. En una realización específica, dicho ADN fragmentado es ADNc degradado, ADN genómico degradado, es ADN fragmentado con nucleasa, es ADN de tumor circulante (ADNtc), es ADN libre circulante (ADNlc), es ADN purificado de tejido fijado en formol-incorporado en parafina o es ADN metilado.

Una etapa de realización adicional d) de dicho método va precedida de un tratamiento del ADN digerido con polimerasa de Klenow y polimerasa de Klenow exo-menos o con polimerasa de Klenow exo-menos en presencia de bases de desoxinucleótidos.

En una realización específica, los productos incompletamente ligados en la etapa e) de dicho método se retiran añadiendo exonucleasa I, III y VII a la muestra.

En una realización particular de dicho método, los adaptadores con bucle en horquilla presentes en los productos ligados se abren enzimáticamente antes de la etapa de amplificación.

En una realización específica, la digestión en la etapa c) de dicho método se lleva a cabo con una enzima de restricción insensible a la metilación.

En una realización particular de dicho método, la muestra que comprende ADN fragmentado es una muestra de sangre, suero o plasma del paciente.

En una realización adicional, se proporciona un método de diagnóstico para la detección o el pronóstico de cáncer que comprende cualquiera de dichos métodos, seguido de la aplicación de una etapa de normalización para enriquecer en secuencias de nucleótidos de variante, determinación de secuencias de dichas secuencias de nucleótidos de variante y correlación de las variaciones de secuencia con una detección o un pronóstico del cáncer.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Distribución de tamaños y representación en color de ADN mecánicamente fragmentado por un ultrasonicador enfocado M220 (Covaris).

Figura 2: Electroferograma (Femto Pulse™) de 2 pl de ADNlc (±245 pg/pl) de plasma sanguíneo de paciente con HCC uzg002. En total se extrajeron ± 428,75 ng de ADNlc de 5 ml de plasma sanguíneo, a partir de 10 ml de sangre completa extraída en un tubo de ADNlc de sangre PAXgene (PreAnalytiX). 163 pb - 312 pb - 545 pb = patrón apoptósico de ADNlc. MI = marcador inferior, MS = marcador superior

Figura 3: Condiciones enzimáticas para desfosforilar el extremo 5'P de las secuencias del ácido nucleico. Se muestra una representación en color de los productos de ADN generados.

Figura 4: Digesto de restricción con Mspl. Representación en color de todos los productos de ADN generados: no digeridos, digeridos solo en un lado, digeridos en ambos lados.

Figura 5: Se digirió el fragmento desfosforilado de ADN de prueba (10 ng) con la endonucleasa de restricción Mspl, generando tres fragmentos, dos fragmentos que contienen solo un extremo Mspl, 40(44) pb y 56(66) pb, y un fragmento que contiene dos extremos Mspl, 84(91) pb. La detección se lleva a cabo con electroforesis capilar. La longitud de la longitud del fragmento observado se indica entre paréntesis. Por ejemplo 84(91) pb significa que la longitud real es 84 pb, pero se observa en el método de electroforesis como un fragmento de 91 pb. Figura 6: Etapa de llenado con Klenow (exo-) y desoxiadenilación.

Figura 7: Reacción de ligamiento con el adaptador comercial NEBNext (que no contiene enlaces 3' fosforotioato) con ADN ligasa T4

Figura 8: Los tres fragmentos se ligaron por ADN ligasa T4 con un adaptador con bucle en horquilla (distribuido por New England Biolabs, pero pedido en DNA Technologies sin enlace 3' fosforotioato ya que éste bloquea la actividad de exonucleasa). Los fragmentos indicados son el adaptador en 36 pb, el fragmento de 56 pb ligado a 1x36 pb en 103 pb, el fragmento de 40 pb ligado a 2x36 pb en 118 pb, el fragmento de 84 pb ligado a 1x36 pb en 128 pb, el fragmento de 56 pb ligado a 2x36 pb en 133 pb, el fragmento de 84 pb ligado a 2x36 pb en 156 pb.

Figura 9: La mezcla de fragmentos no ligados, incompletamente ligados y completamente ligados tratados con una combinación de exonucleasa I, exonucleasa III y exonucleasa VII. El fragmento de 156(160) pb se deja sin tocar (no se degrada) debido a que se genera un círculo de ADN completo, sin mellas.

Figura 10: A partir de 10 ng del fragmento de ADN de prueba y realizando todas las etapas en el método de preparación, este es el producto final de amplificación, que es el fragmento de 84 pb con una secuencia de adaptador de 60 pb en ambos extremos, que genera un fragmento de 204(211) pb.

Figura 11: Protocolo completo de la divulgación con conversión de bisulfito (kit EZ DNA Methylation-Lightning™ (Zymo Research)) y después de la amplificación por PCR añadiendo secuencias de Illumina (NEBNext comercial)

Figura 12: Protocolo completo de la divulgación (sin conversión con bisulfito) realizada en > 3 ng de ADNg de HEK293S fragmentado antiguo de 200 pb. El pico en 191 pb puede ser un trozo muy repetitivo de la secuencia de AluY o AluS.

Figura 13: Electroferograma (Fragment analyser™) de la biblioteca de secuenciación preparada por el protocolo de amplificación de RRBS en 10 ng de ADNlc del paciente con HCC uzg002. MI = marcador inferior, MS = marcador superior. La anotación de 101 pb y 208 pb se hace por el software ProSize, pero es irrelevante.

Figura 14: SEQ ID NO 11 preparada usando el protocolo de amplificación de RRBS y amplificado con cebadores de normalización (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5). El producto de amplificación se incubó con Antarctic UDG, endonucleasa VIII y T7 endonucleasa I en CutSmart. El producto de 201 pb es la longitud completa, 172 pb con un adaptador cortado, 131 pb con ambos adaptadores cortados y 47 pb los trozos del adaptador.

Figura 15: La mezcla cortada con adaptador (Figura 13) se purificó usando estreptavidina unida a perlas magnéticas Dynabeads™ Mione™ usando el protocolo usado para la purificación de proteínas. 138 pb con ambos adaptadores cortados más cortos y 52 pb algo de adaptador restante.

Figura 16: Se reamplificó 100 ng de mezcla purificada (Figura 14) usando cebadores NEBNext comerciales con 2x polimerasa KAPA HiFi U+

Figura 17: SEQ ID NO 11 preparada usando el protocolo de amplificación de RRBS y amplificado con cebadores de ADN conductor (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7). El producto de amplificación se incubó con Antarctic UDG, endonucleasa VIII y T7 endonucleasa I en CutSmart. El producto de 200 pb es la longitud completa, 143 pb con un adaptador cortado, 78 pb con ambos adaptadores cortados.

Figura 18: La mezcla cortada con adaptador (Figura 16) se purificó usando estreptavidina unida a perlas magnéticas Dynabeads™ Mione™ usando el protocolo usado para la purificación de proteínas. 85 pb es el inserto y 49 pb probablemente algo de adaptador restante.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado a él en esta sección. Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. "Aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible, tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende englobar variaciones de ±20 % o ±10 %, más preferentemente ±5 %, incluso más preferentemente ±1 %, y todavía más preferentemente ±0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos desvelados. El término "anormal", cuando se usa en el contexto de organismos, tejidos, células o componentes de los mismos, se refiere a los organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que se diferencian en al menos una característica observable o detectable (por ejemplo, edad, tratamiento, momento del día, etc.) de los organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que muestran la característica respectiva "normal" (esperada). Las características que son normales o esperadas para un tipo de célula o tejido podrían ser anormales para un tipo diferente de célula o tejido. Los dibujos descritos son solo esquemáticos y no son limitantes. En los dibujos, el tamaño de algunos de los elementos puede estar exagerado y no dibujado a escala para fines ilustrativos. Donde el término "que comprende" se usa en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos o etapas. Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Se debe entender que los términos así usados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en el presente documento son capaces de funcionar en otras secuencias distintas de las descritas o ilustradas en el presente documento. A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos usados en el presente documento tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Los profesionales son particularmente dirigidos a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (2012); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento 100), John Wiley & Sons, Nueva York (2012), para definiciones y términos de la técnica. No se debe interpretar que las definiciones proporcionadas en el presente documento tengan un alcance inferior al entendido por un experto habitual en la técnica.

La detección precoz es el santo grial de la investigación del cáncer y cualquier esfuerzo para potenciar la detección del cáncer en cualquier fase precoz es más que bienvenida. Se puede usar posiblemente ciertos fragmentos de ADN diseminados por los tumores en la circulación sanguínea para el cribado no invasivo de cánceres en fase precoz, la monitorización de respuestas al tratamiento y ayudar a explicar por qué algunos cánceres son resistentes a las terapias. Para la mayoría de los tumores, una biopsia de tejido es bastante compleja porque es cara, dolorosa o potencialmente arriesgada para el paciente. Todas estas son buenas razones para conocer el cáncer a través de la sangre y entusiasmarse con la posibilidad de hacer biopsias de líquidos. El desarrollo de métodos no invasivos para detectar y monitorizar tumores sigue siendo un reto importante en la oncología. El ADN de tumor circulante (ADNtc) libre y las células de tumor circulante (CTC) son fuentes de plasma de ADN de tumor que habían sido investigadas para la detección no invasiva y la monitorización de tumores de pacientes, pero no habían sido analizados o comparados directamente en múltiples tipos de tumor. Por favor, un término más general usado en la técnica es ADN libre circulante (ADNlc), que es un término más amplio que el ADNtc puesto que también incluye ADN flotante libre de células no tumorales. Aunque la actual biopsia de líquidos aprobada por la Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) de los EE. UU. mide CTC intactas dando un pronóstico de supervivencia global, el posible valor predictivo del ADNtc es mucho más excitante. La biopsia de líquido de ADNtc nos permite entender específicamente qué tipo de cambios moleculares están ocurriendo en el tumor en tiempo real, que es un paso muy grande más allá de lo que las CTC son hoy en día en términos clínicos.

Hasta la fecha, las biopsias de líquidos han generado mucho entusiasmo, puesto que pueden proporcionar un cuadro en curso y no invasivo del cáncer de un paciente, ofreciendo una valiosa percepción sobre cuál es la mejor forma de combatirlo. Además de ofrecer pistas sobre la fase y la diseminación, las biopsias de líquidos se pueden usar para monitorizar los efectos del tratamiento del cáncer, dar una alerta temprana sobre la posible reaparición y ofrecer pistas sobre las razones para la resistencia al tratamiento. Cada vez se están realizando más investigaciones de ADNtc en pacientes con cáncer, lo que respalda las posibles y diferentes aplicaciones de este enfoque. El análisis sucesivo de ADNtc durante el tratamiento puede proporcionar un cuadro dinámico de los cambios en la enfermedad molecular, lo que sugiere que este enfoque no invasivo también podría ser usado para monitorizar el desarrollo de resistencia secundaria e identificar poblaciones subclonales heterogéneas de células tumorales que se desarrollan durante el curso del tratamiento. En el futuro, en lugar de las amplias técnicas de obtención de imágenes y biopsias de tejido invasivas, las biopsias de líquidos se podrían usar para orientar en las decisiones de tratamiento del cáncer e incluso quizás para el cribado de tumores que todavía no son visibles con las técnicas de obtención de imágenes.

El problema de amplificar cantidades mínimas de ADN fragmentado presentes en muestras humanas se ha resuelto en la presente invención. Por consiguiente, la invención proporciona una tecnología de amplificación que se puede llevar a cabo en un único recipiente y con un único sistema amortiguador. Además, el método de la invención genera un conjunto de fragmentos de ADN digeridos con una herramienta de corte de ADN específica de secuencia a partir de una muestra de ácido nucleico que se degrada a tal grado que el ADN degradado y dicho ADN degradado digerido con la herramienta de corte de ADN específica de secuencia no se pueden resolver por medios físicos.

Por consiguiente, en una primera realización, la invención proporciona un método de amplificación de ADN fragmentado presente en una muestra con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas:

a) Obtener una muestra biológica que comprende ADN fragmentado,

b) desfosforilar el ADN fragmentado en la muestra, y

c) digerir el ADN resultante usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y

d) ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y

e) retirar los productos incompletamente ligados, y

f) amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con los adaptadores.

En un aspecto particular de la divulgación, el ácido nucleico se fragmenta debido a la manipulación física de la muestra. En otro aspecto particular de la divulgación, el ácido nucleico se fragmenta debido a las nucleasas presentes en la muestra. En una realización particular, el ácido nucleico fragmentado es ácido nucleico fragmentado por nucleasa.

En la presente divulgación, un ácido nucleico puede ser ARN o ADN, o una mezcla de ARN y ADN. En otro aspecto de la divulgación, el ácido nucleico está metilado. En un aspecto particular de la divulgación, cuando el ácido nucleico es ARN, necesita ser modificado dando ADN copia (ADNc).

En otro aspecto particular de la divulgación, la muestra biológica deriva de un mamífero, tal como un ser humano. Una muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre, plasma o de suero.

En un aspecto particular de la divulgación, el ADN fragmentado (o en una realización particular el ADN fragmentado con nucleasa) se desfosforila con una enzima. Un ejemplo de una enzima de desfosforilación es un ácido nucleico fosfatasa. Existen para el experto muchos ejemplos de ácido nucleico fosfatasas. Los ácidos nucleicos fosfatasas liberan los grupos 5'- y 3'-fosfato de ADN, ARN y nucleótidos.

Un ácido nucleico fosfatasa preferida es un ácido nucleico fosfatasa termosensible. Por lo tanto, en un aspecto particular de la divulgación, EL ácido nucleico fosfatasa usada es una fosfatasa lábil al calor, pero necesita la adición de un cofactor para ser activa (por ejemplo, fosfatasa Antarctic), por lo que no se necesita purificación para reducir la enzima. En otro aspecto más particular de la divulgación, el ácido nucleico fosfatasa es una fosfatasa lábil al calor y no necesita la adición de un cofactor para ser activa (por ejemplo, fosfatasa alcalina de gamba recombinante). En otro aspecto más específico de la divulgación, se usa fosfatasa intestinal de ternero, pero la purificación es necesaria para reducir la enzima.

En un aspecto particular de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción. En otro aspecto particular de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de tetranucleótidos específica (un tetranucleótido que reconoce enzima o una enzima tetracortadora). En otro aspecto específico de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de penta-nucleótidos específica (un pentanucleótido que reconoce enzima o una enzima pentacortadora). En otro aspecto específico de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de hexanucleótidos específica (un hexa-nucleótido que reconoce enzima o una enzima hexacortadora). En otro aspecto específico de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de 7-nucleótidos específica (un 7-nucleótido que reconoce enzima o una enzima 7-cortadora). En otro aspecto específico de la divulgación, los ácidos nucleicos desfosforilados se digieren con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de 8-nucleótidos específica (un 8-nucleótido que reconoce enzima o una enzima 8-cortadora). En otro aspecto más específico de la divulgación, la al menos una enzima de restricción es una mezcla de dos o más enzimas de restricción (por ejemplo, una enzima 4-cortadora y una enzima 5-cortadora, o una 4-cortadora y una 6-cortadora). En otro aspecto más específico de la divulgación, la enzima de restricción es una enzima insensible a la metilación. De hecho, muchas enzimas de restricción son sensibles a los estados de metilación del ADN y la escisión se puede bloquear, o alterar, cuando se metila una base particular en el sitio de reconocimiento de la enzima.

En un aspecto particular de la divulgación, los ácidos nucleicos fragmentados con al menos una enzima de restricción se ligan con secuencias adaptadoras. En otra realización preferida, dichas secuencias adaptadoras son adaptadores con bucle en horquilla. Una horquilla (o bucle en horquilla o una estructura de tallo-bucle) es un patrón que ocurre cuando dos regiones de la misma cadena, normalmente complementaria en secuencia de nucleótidos cuando se lee en direcciones opuestas, forma partes de bases para formar una hélice doble que termina en un bucle no apareado. En otro aspecto particular de la divulgación, el adaptador con bucle en forma de horquilla se une por una sustancia química, proteína, conector de ácido nucleico, pero puede no interferir con la posterior actividad de exonucleasa. Un ejemplo de una secuencia adaptadora se representa a continuación en la SEQ ID NO: 1. Contiene un grupo 5'-fosfato, un nucleótido interno de desoxiUracilo y un extremo protuberante de T en 3'. El adaptador es una estructura en bucle debido a los 12 pb de complementariedad entre 5' y 3'.

SEQ ID NO: 1: 5'P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/desoxiU/ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'

SEQ ID NO: 2 y 3 representan cebadores de amplificación, complementarios a las dos partes del adaptador. Aquí, los cebadores contienen un enlace fosforotioato (marcado por *) en el extremo 3’ para evitar la hidrólisis de la base en 3', pero los cebadores sin un enlace fosforotioato también funcionan. Los cebadores se usan para prolongar los fragmentos de la biblioteca con las características de secuenciación apropiadas, características distales para unirse al chip de Illumina, índice-secuencia (subrayado) para el multiplexado y características próximas al inserto para fines de secuenciación.

SEQ ID NO: 2: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3' SEQ ID NO: 3: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATC*T-3'

Esta biblioteca contiene secuencias adaptadoras largas, esto puede ser problemático durante la normalización, ya que estas secuencias de alta abundancia dominarán el proceso de normalización. Esto es por lo que las secuencias adaptadoras más cortas son recomendables. La idea era cortar un trozo del adaptador comercial para truncar éste con una longitud compatible con la normalización.

Por PCR se incorpora un uracilo en el centro del adaptador en ambas cadenas usando los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Usando una mezcla de tres enzimas: UDG termolábil Antarctic, endonucleasa VIII y T7 endonucleasa I se genera una rotura bicatenaria en el sitio en el que se incorporó el uracilo (Figura 14). Debido a que la T7 endonucleasa I no es desnaturalizable por calor, se añadió una proteinasa K y después de la incubación se destruyó la proteinasa K por calor. Los trozos terminales de los adaptadores se retiraron usando perlas magnéticas Dynabeads™ Mione™ e inmovilizando en PBS. Como resultado se obtiene una biblioteca de ADN con adaptador truncado en una mezcla de enzimas troceadas y desnaturalizadas por calor disueltas en PBS/CutSmart (Figura 15). Esta mezcla se puede usar en la reacción de nucleasa específica de dúplex. Después de DSN, la biblioteca es monocatenaria y se tiene que amplificar, esto se hace usando los cebadores NEBNext comerciales (Figura 16).

SEQ ID NO: 4: 5'-Biotina-

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC/idesoxiU/CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGA

TCT-3’

SEQ ID NO: 5: 5'-Biotina-

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGAT GTGAC/idesoxi U/GG AGTT CAGACGT GTGCT

CTTCCGATCT-3’

El fundamento de uso del ADN conductor es hacer que la eficiencia del proceso de normalización sea menos dependiente de la cantidad de ADNlc derivado de tumor. La adición de un exceso de estirpe germinal de ADN del paciente a la reacción de DSN podría impulsar la reacción de normalización hacia el enriquecimiento de ADN raro y no de la estirpe germinal. El ADN conductor se debe tratar de la misma forma que se trata el ADNlc, pero por el mismo motivo que antes, ahora es recomendable no tener secuencias adaptadoras presentes ya que los presentes inventores no quieren amplificar su ADN conductor al final de la reacción de normalización.

SEQ ID: 6: 5'-Biotina-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACTÚAN CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG A*/idesoxiU/*C*/3idesoxiU/-3'

SEQ ID: 7: Biotina Índice 1 de NEBNext 3U*: 5'-Biotina- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGT GAT GTG ACTÚAN GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG A*/idesoxiU/*C*/3idesoxiU/-3'

Por PCR se incorporaron dos uracilos y tres enlaces fosforotioato en el extremo 3’ debido a que la actividad de corrección de errores de la KAPA puede cortar las bases de uracilo. Usando una mezcla de tres enzimas: UDG termolábil Antarctic, endonucleasa VIII y T7 endonucleasa I se genera una rotura bicatenaria en el sitio en el que se incorporaron los uracilos (Figura 17). Debido a que la T7 endonucleasa I no es desnaturalizable por calor, se añadió una proteinasa K y después de la incubación se destruyó la proteinasa K por calor. Los trozos terminales de los adaptadores se retiraron usando perlas magnéticas Dynabeads™ Mione™ e inmovilizando en PBS. Como resultado se obtiene una biblioteca de ADN con adaptador truncado en una mezcla de enzimas troceadas y desnaturalizadas por calor disueltas en PBS/CutSmart (Figura 18). Esta mezcla se puede usar en la reacción de nucleasa específica de Duplex.

En otra realización la invención proporciona un método de amplificación de ADN fragmentado presente en una muestra con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica que comprende ADN fragmentado,

b) desfosforilar el ADN fragmentado en la muestra, y

c) digerir el ADN resultante usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y

d) ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y

e) retirar los productos incompletamente ligados, y

f) abrir los adaptadores con bucle en horquilla presentes en los productos ligados, y

g) amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con adaptadores abiertos.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona un método de amplificación de ácidos nucleicos fragmentados presentes en una muestra con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas: a) desfosforilar dichos ácidos nucleicos fragmentados, y

b) digerir los ácidos nucleicos resultantes usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y

c) añadir una polimerasa de desoxiadenilación,

d) ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y

e) retirar los productos incompletamente ligados, y

f) abrir los adaptadores con bucle en horquilla presente en los productos ligados, y

g) amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con adaptadores abiertos.

En una realización particular, la al menos una enzima de restricción usada en los métodos genera extremos protuberantes en 3' después de la escisión de los ácidos nucleicos en la muestra. En este caso se usa la combinación de enzima de Klenow seguida de la adición de Klenow (exo-menos). El fragmento de Klenow sirve para proporcionar la reparación de extremos del extremo protuberante en 3' generado. El fragmento de Klenow es un gran fragmento de proteína producido cuando la ADN polimerasa I de E. ^coIí se escinde enzimáticamente por la proteasa subtilisina. El fragmento de Klenow retiene la actividad de polimerasa de 5' ^ 3' y la actividad de exonucleasa de 3' ^ 5' para la retirada de nucleótidos de precodificación y la corrección de errores, pero pierde su actividad de exonucleasa 5' ^ 3'. Antes de añadir Klenow (exo-menos), el gran fragmento de Klenow tiene que ser retirado por purificación o añadiendo una proteasa termolábil (por ejemplo, proteinasa K). En una siguiente etapa se usa Klenow (exo-menos) que genera la desoxiadenilación de los fragmentos.

En otro aspecto más de la divulgación, la al menos una enzima de restricción usada en los métodos genera extremos protuberantes de 5'. En este caso, una polimerasa de desoxiadenilación conveniente es la enzima de Klenow (exomenos o exo-) que proporciona el llenado en los extremos protuberantes de 5', seguido de desoxiadenilación de los fragmentos. La ADN polimerasa de Klenow exo-menos es una polimerasa dependiente de ADN que carece de tanto las actividades de exonucleasa 5 '^ 3 ' como 3 '^ 5 ' de ADN polimerasa I, de la que deriva. Esta truncación aminoterminal de ADN polimerasa I tiene dos mutaciones (D355A y E357A).

En otro aspecto más de la divulgación, los productos incompletamente ligados (es decir, las secuencias de nucleótidos digeridas ligadas con los adaptadores con bucle en horquilla) se retiran por al menos una exonucleasa, exonucleasa que degrada las cadenas de ADN a partir de una mella en el ADN bicatenario. En otro aspecto particular de la divulgación, los productos incompletamente ligados (es decir, las secuencias de nucleótidos digeridas ligadas con los adaptadores con bucle en horquilla) se retiran por una mezcla de exonucleasas. En una realización particular, dicha mezcla de exonucleasas comprende exonucleasa I, III y VII.

La exonucleasa I cataliza la retirada de nucleótidos de ADN monocatenario en la dirección de 3' a 5'. La exonucleasa III cataliza la retirada escalonada de mononucleótidos de los extremos hidroxilo 3' del ADN dúplex. Los sustratos preferidos son extremos 3' romos o entrantes, aunque la enzima también actúa en mellas en el ADN de dúplex para producir huecos monocatenarios. La enzima no es activa en ADNmc, y así los extremos protuberantes de 3' son resistentes a la escisión. La exonucleasa VII (Exo VII) derivada de E. ^coIí escinde el ADN monocatenario (ADNmc) de tanto la dirección 5 '^ 3 ' como 3 '^5 '. Esta enzima no es activa en ADNbc lineal o circular. Es, por ejemplo, útil para la retirada de cebadores de oligonucleótidos monocatenarios de una reacción de PCR completada cuando se requieren diferentes cebadores para las posteriores reacciones de PCR.

En otra realización más, las secuencias de nucleótidos digeridas ligadas obtenidas con los adaptadores con bucle en horquilla se abren enzimáticamente antes de la etapa de amplificación.

Se recomienda la abertura de los fragmentos de adaptador ligados puesto que potencia la eficiencia de conversión con bisulfito opcional. Además, la abertura del adaptador aumenta la eficiencia de amplificación. En un aspecto particular de la divulgación, cuando los adaptadores de horquilla no están abiertos, se pueden usar cebadores que se unen a la región de bucle del adaptador en combinación con una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. En un aspecto particular de la divulgación, la abertura de los adaptadores se lleva a cabo con una enzima uracil-ADN glicosilasa. Esta enzima cataliza la liberación de uracilo libre del ADN monocatenario o bicatenario que contiene uracilo. Los sitios abásicos resultantes son susceptibles a la escisión hidrolítica a temperatura elevada y pH elevado. En un aspecto preferido de la divulgación, la uracil-ADN glicosilasa es termolábil. En un aspecto específico de la divulgación, la UDG termolábil es la uracil-ADN glicosilasa termolábil Antarctic . En un aspecto particular de la divulgación, la abertura de los adaptadores por una uracil ADN-glicosilasa va seguida de un tratamiento con ^{endonucleasa VIII. Una fuente conveniente es la endonucleasa VIII de} E. ^coIí que actúa tanto de N-glicosilasa como de AP-liasa. La actividad de N-glicosilada libera las pirimidinas dañadas del ADN bicatenario, generando un sitio apurínico (AP). La actividad de AP-liasa escinde 3' y 5' con respecto al sitio AP dejando un 5' fosfato y un 3' fosfato.

En otro aspecto más de la divulgación, antes de la etapa de amplificación, se aplica un tratamiento con bisulfito de sodio.

La metilación del ADN, que ocurre lo más comúnmente en la posición C5 de las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG, desempeña una función clave en muchos procedimientos biológicos, tales como la expresión génica, el desarrollo embrionario, la proliferación celular, la diferenciación y la estabilidad de cromosomas. La metilación de ADN aberrante se asocia frecuentemente con una pérdida de homeostasis de ADN e inestabilidad genómica, que conducen al desarrollo de enfermedades humanas, tales como el cáncer. La importancia de la metilación del ADN crea una necesidad urgente de métodos eficaces altamente sensibles y fiables para explorar las innovadoras estrategias de diagnóstico y terapéuticas. La secuenciación genómica con bisulfito desarrollada por Frommer y colaboradores fue reconocida como una revolución en los análisis de metilación del ADN basándose en la conversión de ADN genómico usando bisulfito de sodio. Además de diversos méritos del método de secuenciación genómica con bisulfito, tales como ser altamente cualitativo y cuantitativo, sirve de principio fundamental para muchos métodos derivados para interpretar mejor el misterio de la metilación del ADN. Aquí, los presentes inventores presentarán un protocolo actualmente frecuentemente usado en su laboratorio que ha demostrado que da resultados óptimos. Están disponibles en la técnica varios métodos, que se pueden usar para el tratamiento con bisulfito. Un protocolo de detección de la metilación de ADN está publicado por Li Y. y Toffefsbol T.O. (2011) Methods Mol. Biol. 791: 11-21. Además, están disponibles varios kits comerciales para el tratamiento con bisulfito de sodio, tales como, por ejemplo, los kits distribuidos por Qiagen y Zymo Research.

En otro aspecto más de la divulgación, la etapa de tratamiento con bisulfito opcional va seguida de una etapa de amplificación. En un aspecto específico de la divulgación se pueden usar polimerasas de alta fidelidad, donde no ocurrió tratamiento con bisulfito (por ejemplo, polimerasa Phusion, Q5-polimerasa, polimerasa KAPA HiFi). En otro aspecto particular de la divulgación donde se realiza la conversión con bisulfito, se tienen que usar otras polimerasas que pueden incorporar fácilmente nucleótidos opuestos a las bases de uracilo (por ejemplo, polimerasa Kapa HiFi uracil ).

La divulgación se refiere a un método de producción de un conjunto de secuencias de nucleótidos de secuencias de nucleótidos fragmentadas por nucleasa presentes en una muestra de líquido corporal de un organismo que comprende las siguientes etapas:

a) Desfosforilar las secuencias de nucleótidos en los extremos 5'

b) fragmentar las secuencias de nucleótidos desfosforilados en sus extremos usando una enzima dejando un grupo 5'-fosfato

c) ligar los extremos fosforilados de las secuencias de nucleótidos digeridas con un adaptador con bucle en horquilla

d) retirar enzimáticamente los productos incompletamente ligados

e) abrir enzimáticamente el adaptador con bucle en horquilla

f) amplificar las secuencias de nucleótidos restantes.

En otro aspecto más de la divulgación, una normalización o un protocolo derivado de Cot que comprenda una etapa de desnaturalización, una etapa de renaturalización, y que usa cualquier agente que reconozca el sitio del emparejamiento erróneo, se aplica en las secuencias de nucleótidos amplificadas. Un protocolo de normalización reduce realmente el coste de la secuenciación y el análisis de datos debido a que las secuencias de nucleótidos están enriquecidas en las secuencias de nucleótidos que llevan la mutación.

Un enfoque importante, el análisis de Cot alta (donde "Co" es la concentración de ADN a tiempo cero y "t" es el tiempo de reasociación), se basa en la cinética de renaturalización del ADN. Debido a que las secuencias de bajas copias de ADN que albergan mutaciones, no presentes en la estirpe germinal, se renaturalizan más lentamente que las secuencias más abundantes, se puede obtener una fracción de ADNmc de ADN de Cot alta enriquecido en mutaciones de tumor en condiciones adecuadas. En esta técnica, el ADN amplificado obtenido por el método de la divulgación es desnaturalizado por calor, y se rehibrida lentamente. Entonces, el ADN somático bicatenario (más abundante) se puede separar del ADN monocatenario (bajas copias) de tumores por cromatografía en hidroxiapatita (HAP). El análisis de Cot alta se puede aplicar a cualquier muestra; sin embargo, los profesionales necesitan, en general, un firme entendimiento de la cinética de reasociación del ADN y experiencia relativamente avanzada en espectrofotometría. Mientras que los presentes inventores no excluyen la posibilidad del método previo en la presente divulgación, los presentes inventores recomiendan la aplicación de la tecnología de normalización de nucleasa específica de dúplex (DSN) para ADN genómico eucariota. El método se basa en las propiedades de un DSN aislada del cangrejo de Kamchatka. La DSN es termostable y específica del ADNbc. Al igual que el fraccionamiento de ADN de Cot alta, la normalización de DSN se basa en la cinética de hibridación, pero no implica la separación física de fracciones de ADNmc y ADNbc. Después de la reasociación de ADN desnaturalizado, el ADNbc que comprende secuencias somáticas se hidroliza por DSN y la fracción de ADNmc que contiene moléculas de bajas copias, que alberga mutaciones de tumor, se amplifica por PCR.

En un aspecto particular, en lugar de usar normalización de DSN para reducir las secuencias altamente repetitivas y para evitar secuenciar estas regiones, también están disponibles enfoques más dirigidos. La retirada de secuencias repetitivas se puede hacer añadiendo oligonucleótidos a la muestra que son complementarios a los fragmentos de ADN más abundantes. Después de la desnaturalización y la hibridación de dichos oligonucleótidos con el ADN presente en la muestra, se forman dúplex de ADN-oligonucleótido. Estos dúplex de ADN-oligonucleótido se pueden cortar por DSN. Alternativamente, los oligonucleótidos se pueden marcar con una característica (por ejemplo, biotina) que puede extraerse para reducir el dúplex de ADN-oligonucleótido.

En otro aspecto también se puede usar CRISPR-cas9 en combinación con ARNgu complementario con fragmentos de ADN repetitivos para reducir específicamente estas secuencias. Un requisito absoluto en este sistema de CRISPR-cas9 es la disponibilidad de una secuencia de PAM (véase Gu W. et al (2016) Genome Biology 17:41). Como ejemplo no limitante en el caso de que se use Mspl como enzima de restricción, es posible incluir la secuencia de PAM en el adaptador y usar cada secuencia cerca de un sitio de Mspl como secuencia guía, que haría que el método de los presentes inventores fuera menos dependiente de las secuencias de PAM disponibles en el genoma humano para reducir los fragmentos de ADN específicos.

En otro aspecto más para hacer que la eficiencia del procedimiento de normalización sea menos dependiente del porcentaje de ADN de tumor circulante en ADN libre circulante total, también se pueden añadir un exceso de ADN conductor de la estirpe germinal a la muestra. El ADN conductor se puede generar a partir de ADN genómico de glóbulos sanguíneos. El ADN conductor se procesa completamente de la misma forma que la muestra de ADNc, excepto que se amplifica con cebadores que contienen la secuencia A*U*C*U en el extremo 3’ de los cebadores de amplificación. Esta secuencia puede ser rota en ambos extremos usando la mezcla enzimática: UDG termolábil Antarctic, endonucleasa VIII y endonucleasa T7. Debido a que la T7 endonucleasa I no es desnaturalizable por calor, se añadió la proteinasa K y después de la incubación la proteinasa K se destruyó por calor. Los trozos terminales de los adaptadores se retiraron usando perlas magnéticas Dynabeads™ Mione™ e inmovilizando en PBS. Como resultado se obtiene una biblioteca de ADN sin adaptador en una mezcla de enzimas troceadas y desnaturalizadas disueltas en PBS/CutSmart. Esta mezcla se puede usar en la reacción de nucleasa específica de dúplex, por lo tanto las secuencias adaptadoras se pueden retirar después de la conversión con bisulfito y posterior amplificación sin degradar la muestra de ADN del paciente. Se deben retirar las secuencias adaptadoras para evitar que dominen el procedimiento de normalización y para evitar que el ADN conductor se secuencie. Una etapa adicional para retirar el ADN conductor después de la normalización es el uso de cebadores 5' fosforilados para la amplificación de ADN conductor y el uso de cebadores que contienen 5' fosforotioato para la amplificación de ADNlc. La combinación de estos dos tipos de cebadores hace posible degradar específicamente el ADN conector y no el ADNlc por exonucleasa lambda. La exonucleasa lambda elimina los mononucleótidos del ADN bicatenario en una dirección de 5' a 3'. El sustrato preferido es ADN bicatenario 5' fosforilado, aunque también degradará sustratos monocatenarios y no fosforilados a una tasa reducida. La exonucleasa lambda no tiene actividad significativa para los enlaces fosforotioato.

En otro aspecto más la divulgación proporciona un método de diagnóstico del cáncer produciendo un conjunto de secuencias de nucleótidos de secuencias de nucleótidos fragmentadas por nucleasa presentes en una muestra de líquido corporal de un organismo, en donde dichas secuencias de nucleótidos varían de las secuencias de nucleótidos presentes en la estirpe germinal de dicho organismo, comprendiendo el método las siguientes etapas:

a) Desfosforilación del lado 5' de las secuencias de nucleótidos

b) fragmentación enzimática de las secuencias de nucleótidos desfosforiladas en sus extremos

c) ligamiento de extremos no desfosforilados de las secuencias de nucleótidos digeridas con un adaptador con bucle en horquilla

d) retirada enzimática de secuencias de nucleótidos no ligadas o incompletamente ligadas

e) abertura enzimática del adaptador con bucle en horquilla

f) amplificación de las secuencias de nucleótidos obtenidas

g) selección de las secuencias de nucleótidos con emparejamientos erróneos usando una etapa de desnaturalización y renaturalización

h) secuenciación de las secuencias de nucleótidos obtenidas e identificación de qué mutaciones génicas están presentes

El experto en la técnica conoce una variedad de métodos de secuenciación. Una tecnología de secuenciación preferida es la tecnología de secuenciación Ilumina.

En otra realización más, la invención proporciona un método de diagnóstico para la detección o el pronóstico de cáncer que comprende cualquiera de los métodos previos descritos anteriormente en el presente documento, seguido de la aplicación de una etapa de normalización para enriquecer en secuencias de nucleótidos de variante, determinación de secuencias de dichas secuencias de nucleótidos de variante y correlación de las variaciones de secuencia con una detección o un pronóstico de cáncer.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona un kit para amplificar ADN fragmentado con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende una ADN fosfatasa, al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, exonucleasas I, III y VII, enzima Klenow y enzima Klenow (exo-menos), bases de desoxinucleótidos, adaptadores con bucle en horquilla, cebadores específicos para los adaptadores con bucle en horquilla, una ADN polimerasa y un sistema amortiguador.

Ejemplos

1. Descripción general de la tecnología de amplificación

1.1 Aislamiento de los ácidos nucleicos de una muestra de líquido corporal

En cualquier momento dado, las células están muriendo en el cuerpo por diversos motivos. En un individuo sano, la mayor parte de la muerte celular ocurre debido a que estas células son viejas y tienen que ser sustituidas por células nuevas. Estas células desprenden su ADN genómico en la circulación sanguínea como ADN libre circulante. Este ADN libre circulante está altamente fragmentado debido al proceso de apoptosis y actividad de endo- y exonucleasas adicional. Se sabe que cuando se desarrolla un tumor en el cuerpo, se desprende una cantidad más alta de ADN libre circulante en la circulación sanguínea, esto es debido a que ocurre más muerte celular en el tejido tumoral debido a una mutagénesis letal y al crecimiento celular incontrolado. También se desprende este ADN de tumor en la circulación sanguínea, lo que hace que este conjunto de fragmentos de ADN libre circulante sea una valiosa muestra biológica para biopsia no invasiva del cuerpo total. En primer lugar, un médico recoge una cantidad suficiente de sangre de un individuo. Como la cantidad de ADN libre circulante es baja, se necesita la recogida de algunos mililitros (por ejemplo, un volumen ampliamente usado es 10 ml) de sangre. Recientemente se reivindica que se podrían extraer 100-200x más de ADNlc de plasma sanguíneo, lo que hace posible extraer ADNlc suficiente de una gota de sangre (Circulogene). La sangre se tiene que recoger en un recipiente a vacío con un agente estabilizante de células y anticoagulante, tal como EDTA, para evitar la fuga de ADN genómico de los glóbulos sanguíneos. Actualmente, los recipientes a vacío más óptimos son distribuidos por STRECK o PreAnalytiX, que contienen conservantes sin formaldehído. En la realización óptima, el método se realiza con material esterilizado por UV para evitar la contaminación con ADN exógeno. También se prefiere el uso de tubos LoBind. En recipientes a vacío alternativos, otros métodos de recogida de plasma sanguíneo y otras formas de extracción del ADNlc pueden conducir a un resultado similar. El líquido corporal más optimo es el plasma sanguíneo, debido a la baja contaminación del ADN selectivo por los glóbulos sanguíneos moribundos. La Red de Investigación para la Detección Precoz, parte del Instituto Nacional del Cáncer de EE. UU., publicó un procedimiento normalizado de trabajo para la recogida de plasma sanguíneo y se puede encontrar aquí: https://edrn.nci.nih.gov/resources/standard-operating-procedures/standardoperating-procedures/plasma-sop.pdf. En una siguiente etapa, el ADN libre circulante necesita ser purificado de la muestra de sangre. Actualmente, están disponibles algunos kits para purificar este ADNlc, pero dos kits pueden manejar una entrada de alto volumen (>1 ml). El kit de ácido nucleico circulante de QIAamp (Qiagen) puede purificar fragmentos más cortos (>75 pb) en comparación con el kit Quick-cfDNA™ Serum & Plasm (Zymo Research) (>100 pb), pero el rendimiento del kit de Zymo Research será probablemente más alto debido al diseño de la columna.

1.2 Desfosforilación del lado 5' del conjunto de ácidos nucleicos con una fosfatasa

Como este método se puede usar como parte de un método de diagnóstico, se evitan preferentemente las etapas de purificación o de intercambio de tampón. La fosfatasa alcalina de gamba recombinante es una fosfatasa lábil al calor, distribuida por NEB y funciona en el tampón semiuniversal CutSmart™.

1.3 Fragmentación del ADN desfosforilado con una herramienta de corte de ADN específica de secuencia

Es necesario que la herramienta de corte de ADN específica de secuencia deje un 5' fosfato. Las herramientas de corte más comunes son enzimas de restricción, pero también se podría usar un sistema que hiciera uso de la cas9-nucleasa y un ARN guía o similar. En la realización óptima, la herramienta de corte funciona al 100 % en el tampón CutSmart™ y deja un único extremo protuberante 3'-dA, pero también es fácil trabajar con extremos romos o extremos protuberantes de 5'.

1.4 Reparación de extremos y desoxiadenilación de los fragmentos de ADN desfosforilados

Si en la etapa previa se genera un único extremo de 3'-dA, se puede saltar esta etapa. Si se genera un extremo romo o extremo protuberante de 5', la adición de Klenow (exonucleasa menos) en presencia de todos los dNTP (preparados tan frescos como sea posible), es suficiente para llenar los extremos y la desoxiadenilación en una única etapa. Si se genera un extremo protuberante de 3', distinto de 3'-dA, se necesita un proceso de dos etapas. El primer fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) en combinación con todos los dNTP se usa para generar un extremo romo. Después de retirar (por purificación o proteólisis con proteinasa K) el fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow), se hace la desoxiadenilación mediante la adición de Klenow (exonucleasa menos) en presencia de dATP. Es importante cuando se trabaja en el mismo recipiente de reacción sin purificación la adición de dNTP suficientes, especialmente dATP, de forma que el fragmento de Klenow (exo-) pueda trabajar (Km = 1 -2 pM), pero no demasiado, debido a que el dATP inhibe la ADN ligasa T4 (Ki = 35 pM).

1.5 Ligamiento de secuencias adaptadoras con los fragmentos obtenidos de dicho ADN desfosforilado

Es necesario que el adaptador consista en dos secuencias del ácido nucleico que se unen juntas dando una forma cerrada con una característica degradable de exonucleasa (por ejemplo, que contiene una base de uracilo). En un modo de trabajo óptimo, el adaptador con bucle en forma de horquilla es un adaptador compatible con una plataforma de secuenciación de nueva generación ampliamente usada, por ejemplo Illumina, y el adaptador puede ser abierto para potenciar la amplificación adicional. Un adaptador óptimo es el adaptador comercializado por New England Biolabs, el adaptador NEBNext (pero sin el enlace 3' fosforotioato). Si la muestra se trata posteriormente con bisulfito, todas las citosinas tienen que estar metiladas. La ligasa óptima en la preparación de biblioteca es la ADN ligasa T4 y funciona en el tampón CutSmart™ cuando se añade ATP 10 mM (preparado tan fresco como sea posible). Se aconseja añadir un exceso (100:1) de adaptador (hibridado en CutSmart™, tan fresco como sea posible) para conservar la diversidad de la biblioteca.

1.6 Retirada de fragmentos no ligados o parcialmente ligados por uso de exonucleasas

Se necesita una exonucleasa que pueda degradar ADN mono- y bicatenario a partir de una mella monocatenaria en el ADN bicatenario de 3'>5' o 5'>3'. En la práctica, dicha exonucleasa sin actividad de endonucleasa no está disponible, lo que hace necesario combinar varias exonucleasas. La combinación mínima es la exonucleasa III y la exonucleasa VII, pero los presentes inventores observaron que la adición de exonucleasa I a la reacción puede impulsar a la finalización.

1.7 Abertura del adaptador con bucle en forma de horquilla

Se usa una combinación de dos enzimas, una uracil-ADN glicosilasa (UDG) y endonucleasa VIII, para la abertura del adaptador con bucle en forma de horquilla. Ambas enzimas tienen que ser lábiles al calor, que es por lo que se usa la UDG Antarctic. La abertura del adaptador también es beneficiosa para la conversión con bisulfito de sodio y amplificación.

1.8 Tratamiento con bisulfito de sodio opcional

Cuando se trata ADN con bisulfito de sodio, todas las citosinas no metiladas se convierten en uracilo. De esta forma, se puede investigar la metilación de ADN. Es más común usar uno de los kits de metilación de ADN EZ distribuidos por Zymo Research, debido a que generan altos rendimientos.

1.9 Amplificación de la biblioteca

En un aspecto óptimo de la divulgación se usa polimerasa de alta fidelidad imparcial (por ejemplo, la polimerasa KAPA Hifi) y si se realizó la conversión con bisulfito, se tiene que usar una polimerasa que pueda incorporar fácilmente nucleótidos opuestos a las bases de uracilo (por ejemplo, polimerasa KAPA Hifi Uracil+). Los cebadores contienen óptimamente 3'T en un enlace fosforotioato para disminuir la amplificación adaptador-dímero.

SEQ ID NO: 8 representa la secuencia del adaptador NEBNext comercialmente disponible sin enlace 3' fosforotioato: 5’P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC GATCT-3’

SEQ ID NO: 9 y 10 representan cebadores de amplificación NEBnext comercialmente disponibles con características necesarias para unirse a un chip de Illumina, índice para el multiplexado y características para la secuenciación SEQ ID NO: 9:

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’

SEQ ID NO: 10:

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCG7GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC

GATC*T-3’

1.10 Normalización de Cot, secuenciación de nueva generación y análisis de datos

La normalización de Cot, la secuenciación y el análisis de datos se realizan como en los protocolos descritos en la técnica.

2. Protocolo completo de la divulgación

En el presente ejemplo, los presentes inventores aplicaron el método de la divulgación con las secuencias del ácido nucleico de entrada de prueba que se parecen a las secuencias del ácido nucleico fragmentadas presentes en una muestra biológica (véase la Figura 1). Puesto que las secuencias del ácido nucleico derivadas de una muestra biológica consisten en ADN apoptósico y necrótico muy degradado, fragmentado por nucleasas en la muestra biológica, tal como sangre (véase la Figura 2), los presentes inventores usaron fragmentos artificiales de ADN, que contienen dos sitios de restricción Mspl para los que se representa la secuencia en SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 11 representa el ADN de prueba que se usa para la amplificación. Los dos sitios de Mspl están subrayados.

SEQ ID NO: 11:

5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTACCCGACCACACGGCGTTGATCGCCGAGGACCGG CGTTTCACGTCGACCGAGCTGCGCGACGCGGTCTACGGCGCCGCGGCGGCGCTGATCG CCCTCGGTGTCGAACCCGCAGACCGGGTGGCCATCTGGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC GCT-3’

Etapa 1:

Se retiran los grupos 5' fosfato presentes en los 10 ng de la secuencia del ácido nucleico de prueba (SEQ ID NO: 11) por una ADN fosfatasa adecuada. Se usó la fosfatasa alcalina de gamba recombinante (rSAP) (fuente: New England Biolabs). Después de la etapa de desfosforilación, la enzima se desnaturalizó por calor (o se destruyó con calor) (75 °C durante 30 minutos). La Figura 3 representa la reacción de desfosforilación.

Etapa 2:

En una siguiente etapa, las secuencias del ácido nucleico desfosforiladas se escinden con una enzima de restricción adecuada. En el presente ejemplo, los presentes inventores usaron la enzima Mspl. Mspl es una enzima insensible a la metilación que se usa frecuentemente en la tecnología de secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) (Gu, H. et al. (2011) Nat. Protoc. 6, 468-481). Esta tecnología se puede usar específicamente para enriquecer partes del genoma ricas en CG, por lo que se reduce la cantidad de lecturas de secuenciación requeridas para capturar la mayor parte del metiloma. Se observan cambios del estado de metilación, especialmente la hipometilación, en muchos tipos de cáncer, por lo que centrándose en este trozo relevante conocido del genoma ya se podría detectar el cáncer de forma más sensible. Los fragmentos de ADN pueden estar no digeridos, digeridos en un lado o digeridos en ambos lados. Los últimos fragmentos son los trozos más informativos y los presentes inventores intentarán seguir usando solo estos. La Figura 4 representa una representación en color del resultado obtenido después de la escisión con Mspl de las secuencias del ácido nucleico. La Figura 5 representa el material de entrada digerido con Mspl. Etapa 3: Llenado y desoxiadenilación con polimerasa de Klenow (exo-)

Los extremos 3'OH que no se generan por digestión con Mspl no son inactivados (que significa que estos extremos pueden todavía participar en la posterior reacción de ligamiento de adaptadores, pero contendrán una mella) y también participarán en el llenado en la etapa y posterior desoxiadenilación usando Klenow (exo-) en combinación con todos los dNTP (Km = 1 -2 pM). Un fragmento desoxiadenilado tiene la ventaja de que es compatible con los adaptadores de tipo Illumina comercialmente usados. La Figura 6 representa una representación en color de la reacción de Klenow (exo-).

Etapa 4: Ligamiento de adaptadores

Se liga posteriormente un adaptador a los fragmentos (aquí se usa un adaptador comercialmente disponible de NEB), pero sin enlaces fosforotioato (necesarios para la siguiente etapa usando exonucleasas). Debido a que los extremos 3'OH, no generados por la digestión con Mspl, no están inactivados y también llegan a desoxiadenilarse, se puede ligar un adaptador para este fin, que con el tiempo generaría secuencias no bloqueadas no deseadas. La alta concentración de adaptador puede causar más ruido de fondo, pero puede mejorar la diversidad de la biblioteca, especialmente cuando existe una baja cantidad de ADN de entrada. La Figura 7 representa una representación en color del ligamiento de adaptadores. La Figura 8 representa los productos de ligamiento del adaptador.

Etapa 5: Retirada de productos de ligamiento mellados por exonucleasas I, III y VII

Solo los fragmentos de ADN que se digirieron en ambos lados por Mspl se ligarán completamente con los adaptadores. Los fragmentos de ADN que no se digirieron o solo se digirieron en un lado solo se ligarán parcialmente con los adaptadores. Esto es debido a que con el tratamiento con fosfatasa en la etapa 1 existe una mella entre el adaptador y el fragmento de ácido nucleico ligado en estos sitios. Esta mella podrá ser reconocida por la exonucleasa III y se extenderá hasta un hueco hasta que se forme un trozo de ADNmc. Este trozo es reconocido por la segunda exonucleasa, exoVII, que lo degradará. A continuación de estas 2 exonucleasas, se usa una tercera exonucleasa, exol, para también degradar el ADNmc. Las tres enzimas pueden ser desnaturalizadas por calor. La Figura 9 representa los fragmentos de ligamiento obtenidos después de la etapa de digestión con exonucleasa.

Etapa 6: Abertura del adaptador con bucle cortado por el adaptador con bucle por una UDG y endo VIII

En una siguiente etapa, los productos de ligamiento de adaptador con bucle - ácido nucleico (adaptador con bucle -ácido nucleico) son abiertos por la enzima uracil-ADN glicosilasa (UDG), seguido por la retirada de los fragmentos de ácido nucleico que tienen un extremo 3' y 5' libre disponible por la exonucleasa VIII. En el ámbito experimental de los presentes inventores, usaron la UDG termolábil Antarctic (AnUDG) en la mezcla USER comercial de NEB. La mezcla de AnUDG y endoVIII puede ser desnaturalizada por calor y las enzimas son activas en el tampón KAPA.

Etapa 7: Amplificación por PCR

Antes que llevar a cabo la amplificación por PCR, se usan perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) para reducir los adaptadores restantes y la sal. Opcionalmente se usa un kit de conversión con bisulfito antes de la amplificación por reacción de PCR. Están comercialmente disponibles varios kits, tales como el kit de bisulfito EpiTect Fast de Qiagen o los kits de bisulfito de Zymo Research. La amplificación por PCR se lleva a cabo por la polimerasa Kapa HiFi (U+) debido a que es la polimerasa más imparcial ahora disponible.

La Figura 10 representa los productos amplificados por PCR. La Figura 11 representa los productos amplificados por PCR después de la conversión con bisulfito. La Figura 12 representa una biblioteca de secuenciación amplificada por PCR obtenida del ADN de entrada artificial. La Figura 13 representa la biblioteca de secuenciación amplificada por PCR obtenida de la amplificación en 10 ng de ADNlc del paciente con HCC uzg002 según las etapas 1 -7 del protocolo.

5. Todas las etapas de amplificación se pueden llevar a cabo en un tubo

Se saca sangre en recipientes a vacío de STRECK o PreAnalytiX. Se prepara plasma sanguíneo según la SOP de EDRN (NIH). Se aísla ADN libre circulante usando el kit Quick-cfDNA™ Serum & Plasma según las instrucciones dadas por Zymo Research. Entre 1-10 ng de ADN de entrada, es decir, 0,1 % (de la concentración de ADN de entrada) de lambda-ADN no metilado (como patrón interno para probar la eficiencia de conversión con bisulfito)

1 pl de rSAP (NEB) (1 u)

1 pl de CutSmart™ (NEB) (10x)

8 pl de H2O sin nucleasa

10 pl de reacción

60' 37 °C

30' 75 °C

0,5 pl de Mspl (NEB) (10 u)

0,5 pl de CutSmart™ (NEB) (10x)

4 pl de H2O sin nucleasa

15 pl de reacción

30' 37 °C

0,5 pl de Klenow (exo-) (NEB) (5 u)

1 pl de CutSmart™ (NEB) (10x)

0,25 pl de dNTP (dCTP, dGTP, dTTP 0,4 mM y dATP 4 mM) (Promega)

8,25 pl de H2O sin nucleasa

25 pl de reacción

20' 30 °C

20' 37 °C

30' 75 °C

1 de adaptador (10 pM) (IDT)

1 pi de CutSmart™ (NEB) (10x)

4 pi de ATP (10 mM)

4 pi de H2O sin nucieasa

35 pi de reacción

0,5 pi de ADN iigasa T4 (NEB) (1 u)

0,5 pi de CutSmart™ (NEB) (10x)

4 pi de H2O sin nucieasa

40 pi de reacción

16h16 °C

20' 65 °C

0,5 pi de exoI (NEB) (20 u)

0,5 pi de exolII (NEB) (50 u)

0,5 pi de exoVII (NEB) (10 u)

0,5 pi de CutSmart™ (NEB) (10x)

3 pi de H2O sin nucieasa

45 pi de reacción

2 h 37 °C

20' 95 °C

1 pi de AnUDG (NEB) (1 u)

0,5 pi de endoVIII (NEB) (5 u)

0,5 pi de CutSmart™ (NEB) (10x)

3 pi de H2O sin nucieasa

50 pi de reacción

1 h 37 °C

20' 75 °C

Opcionaimente, usar 20 pi (40 % de ia muestra) como entrada para ei tratamiento con bisuifito de sodio (seguir ei kit EZ DNA Methyiation-Lightning como se enseña por ia empresa Zymo Research), usar 20 pi (40 % de ia muestra) sin tratamiento con bisuifito de sodio.

15 pi de 2x mezcia KAPA Hifi (uracii+) (KAPA Biosystems)

0,9 pi de cebador universai 10 pM (IDT)

0,9 pi de cebador indexado 10 pM (IDT)

13,2 pi de ADN

30 pi de reacción

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método de amplificación de ADN fragmentado con una longitud promedio inferior a 200 nucleótidos que comprende las siguientes etapas:

a. obtener una muestra biológica que comprende ADN fragmentado,

b. desfosforilar el ADN fragmentado en la muestra, y

c. digerir el ADN resultante usando al menos una herramienta de corte de ADN específica de secuencia, y d. ligar las secuencias de nucleótidos digeridas con adaptadores con bucle en horquilla, y

e. retirar los productos incompletamente ligados, y

f. amplificar las secuencias de nucleótidos resultantes usando cebadores que se hibridan con los adaptadores.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el ADN fragmentado es ADNc degradado, ADN genómico degradado, es ADN fragmentado con nucleasa, es ADN de tumor circulante (ADNtc), es ADN libre circulante (ADNlc), es ADN purificado de tejido fijado en formol-incorporado en parafina o es ADN metilado.

3. Un método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la etapa d) va precedida de un tratamiento del ADN digerido con polimerasa de Klenow y polimerasa de Klenow exo-menos o con polimerasa de Klenow exo-menos en presencia de bases de desoxinucleótidos.

4. Un método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde los productos incompletamente ligados en la etapa e) se retiran añadiendo exonucleasa I, III y VII a la muestra.

5. Un método según las reivindicaciones 1,2, 3 o 4, en donde los adaptadores con bucle en horquilla presentes en los productos ligados se abren enzimáticamente antes de la etapa de amplificación.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la digestión en la etapa c) se lleva a cabo con una enzima de restricción insensible a la metilación.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la muestra que comprende ADN fragmentado es una muestra de sangre, suero o plasma de un paciente.

8. Un método de diagnóstico para la detección o el pronóstico de cáncer que comprende cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 7, seguido de la aplicación de una etapa de normalización para enriquecer en las secuencias de nucleótidos de variante, determinación de secuencias de dichas secuencias de nucleótidos de variante y correlación de las variaciones de secuencia con una detección o un pronóstico de cáncer.