JP6997772B2 - 核酸サンプル調製の方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年9月15日に出願された米国仮特許出願第62/395,339号の米国特許法第119条(e)項に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
本明細書で記載される技術は、分析用の核酸分子の調製において有用な方法および組成物に関する。
次世代シーケンシングする前の標的富化は、全ゲノム、全エキソーム、および全トランスクリプトームシーケンシングより費用効果が高く、従って、広い実行に関して;研究発見および臨床適用の両方に関してより実践的である。例えば、標的富化アプローチによって与えられる高カバレッジ深度(high coverage depth)は、アレル計数のより広いダイナミックレンジ(遺伝子発現およびコピー数評価において)および低頻度変異の検出を可能にし、これは、がんにおける体細胞変異を評価するために有利であ
る。次世代シーケンシングの現在の富化プロトコルの例としては、ハイブリダイゼーションベースの捕捉アッセイ(TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースのアッセイ(HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina; エマルジョン/デジタルPCR、Raindance)が挙げられる。ハイブリダイゼーションベースのアプローチは、捕捉プローブによって網羅される標的化された配列のみならず、シーケンシング能力を消耗する近くのオフターゲット塩基をも捕捉する。さらに、これらの方法は、比較的時間浪費型、労働集約的であり、特異性が比較的低レベルであるという欠点をもつ。
本明細書で開示される技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。いくつかの実施形態において、配列分析用の核酸サンプルの調製において(例えば、次世代シーケンシング(next-generating sequencing)を使用して)有用な方法および組成物は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸配列を決定するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、シーケンシング前に1またはこれより多くの標的ヌクレオチド配列を含む核酸を富化することに関する。いくつかの局面において、本開示は、1またはこれより多くの捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを核酸に付加する工程を包含する、核酸を調製するための(例えば、シーケンシング分析において使用するための)方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、アダプター核酸を、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライゲーション生成物と上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ライゲーション生成物を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または別の適切な増幅アプローチによって増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸(例えば、2本鎖核酸)の3’末端に付加する工程を包含する核酸を調製するための方法が提供され、ここで上記1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記核酸の3’末端に上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが存在すると、上記核酸全体に修飾されたヌクレオチドが(例えば、ランダムに)組み込まれることを回避しながら、上記核酸の単離、精製および/または洗浄が促進される。いくつかの実施形態において、1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸(例えば、2本鎖核酸)へと組み込む工程を包含する核酸を調製するための方法が提供され、ここで上記1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、プライマー(例えば、逆転写プライマー)を使用して組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、上記核酸を調製する先の工程の間に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、フラグメント化、ランダムプライミング、第1鎖合成、第2鎖合成、および/または末端修復の間に組み込まれる。
酸の3’末端に付加する工程であって、ここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程;(b)アダプター核酸を、該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された該2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程(a)における該2本鎖核酸の3’末端に付加された該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;(c)該ライゲーション生成物と該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程;ならびに(d)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、を包含する。
して、上記核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記ビオチン部分は、例えば、長さが5~20個の原子(例えば、長さが5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個の原子)のリンカーを介して、上記核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、ビオチン-n-dNTPであり、ここでnは、該ビオチン部分のカルボニル基と該NTPの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す5~20の整数である。いくつかの実施形態において、
る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程(b)の後でかつ工程(c)の前に反応クリーンアップまたは洗浄工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程(c)の後でかつ工程(d)の前に:i)上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを含む上記2本鎖核酸を、常磁性基材または表面(例えば、ポリスチレン常磁性ビーズ)上に固定化する工程;およびii)上記固定化した2本鎖核酸を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程(ii)の後に:iii)上記洗浄した固定化2本鎖核酸を上記常磁性基材または表面から放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化2本鎖核酸は、化学的試薬と接触させることおよび/または熱を適用することによって、上記常磁性基材または表面から放出される。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、塩基または塩基性溶液である。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、水酸化ナトリウム(NaOH)を含む。いくつかの実施形態において、接触させることが2種の溶液(例えば、塩基を含む溶液および洗浄した固定化核酸を含む溶液)を混合する工程、固体を溶液に添加する工程、または溶液を固体に添加する工程を包含し得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化2本鎖核酸は、NaOHと接触させることおよび加熱すること(例えば、室温より高く(例えば、25~90℃、25~70℃、25~50℃、35~65℃、35~45℃、30~40℃、40~50℃の範囲の温度)加熱すること)によって、上記常磁性基材または表面から放出される。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化2本鎖核酸は、例えば、分析用のさらなる調製のために、上記常磁性基材または表面上に残存する。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化2本鎖核酸は、分析用のさらなる調製の前に、上記常磁性基材または表面から放出される。
核酸を該常磁性基材または表面から放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記常磁性基材または表面は、被覆(例えば、ポリスチレン被覆)を含む。いくつかの実施形態において、cDNAは、遺伝子特異的にプライムされた第1鎖合成を行うことによって分析のために調製される。いくつかの実施形態において、末端修復する工程は、DNA末端を平滑化および/またはリン酸化する工程を包含する。
核酸調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程;(b)該cDNAを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;(c)該平滑末端化した2本鎖核酸を洗浄する工程;(d)1またはこれより多くのヌクレオチドを工程(c)において洗浄した該核酸の3’末端に付加する工程であって、必要に応じてここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程;(e)工程(d)において生成した該核酸を洗浄する工程;(f)ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程(e)において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;(g)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程;(h)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(g)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程;ならびに(j)該工程(h)の増幅生成物を洗浄する工程、を包含する。
他の局面の中でも、本開示は、分析用の核酸サンプルライブラリーの調製に関する改善された技術を提供する。本明細書で記載されるように、アダプター核酸は、標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る。アダプター核酸の使用は、ライブラリー調製およびシーケンシング分析の間に、例えば、プライマー結合部位および分子バーコードまたはインデックス配列を提供することによって、有用であり得る。いくつかの局面において、本開示は、アダプターライゲーションに関するプロセスにおける改善および分子バーコードフィデリティーを実質的に改善するアダプターをライゲーションしたサンプル単離に関する。
ゲーションした核酸を、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの結合パートナーで捕捉する工程を包含する。
本明細書で記載される技術の局面は、目的の分子(例えば、核酸、ライゲーション生成物など)を単離するための捕捉部分の使用に関する。本明細書で使用される場合、「捕捉部分(capture moiety)」とは、その目的の分子を捕捉する(例えば、単離する/精製する)目的で、結合パートナーと選択的に相互作用するように構成される部分をいう。
エチレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリプロピレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2CH2O)n-を含み、ここでnは、1~20の整数(両端の値を含む)である。いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2CH2O)n-を含み、ここでnは、1~10の整数(両端の値を含む)である。ある種の実施形態において、リンカーは、1またはこれより多くのアリーレンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、1またはこれより多くのフェニレン(例えば、パラ置換されたフェニレン)を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、キラル中心を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、1またはこれより多くのホスフェート、脂肪族鎖、ヘテロ脂肪族鎖、および1またはこれより多くのアミド(例えば、-C(=O)NH-)を含む。
とによって、不溶性支持体上に固定化され得る。従って、いくつかの実施形態において、その目的の分子は、その目的の分子に付着した捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとの間で形成される複合体を通じて単離され得る。
本開示の局面は、既知の標的ヌクレオチド配列に連続したヌクレオチド配列を決定する改善された方法を提供する。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に(例えば、「ショットガン(shotgun)」シーケンシング)、またはプライマーをデザインするために使用される2つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの1つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する(例えば、シーケンシングする)ことを可能にする。
た2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここでそのアダプター核酸の3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程(a)において2本鎖核酸の3’末端に付加された1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;(c)そのライゲーション生成物とその捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、そのライゲーション生成物を捕捉する工程;および(d)その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、そのライゲーション生成物を増幅する工程を包含する。
ートから調製されるプロセス300を概して記載する。
るように)アダプターをライゲーションした核酸は、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の遺伝子特異的プライマー(「GSP1」)およびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマー(「P5_1」)を使用する第1のPCRラウンド324に供される。このようにして、P5_1は、GSP1によって生成される鎖をプライムオフする。示されるように、いくつかの実施形態において、GSP1(例えば、第1の標的特異的プライマー)は、その標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない5’領域でテール付加される。いくつかの実施形態において、5’テール領域は、例えば、プライマーダイマーの発生を最小化する配列内容物を有することによって、プライマーダイマーを防止し得る。いくつかの実施形態において、GSP1は、その5’テール付加領域でテール付加されない。図3にさらに示されるように、第2のPCRラウンド326は、第2の遺伝子特異的プライマー(「GSP2」)および第2のアダプタープライマー(「P5_2」)を使用して行われる。示されるように、GSP2は、GSP1に対してネスト化される。また示されるように、GSP2は、その標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない5’領域でテール付加される。第1のPCRラウンドに類似の様式で、P5_2は、GSP2によって生成される鎖をプライムオフする。この第2のPCRラウンドでは、さらなるプライマー(「SINGLE PRIMER」)が含まれ、このプライマーは、(i)GSP2のテール付加された5’領域のうちの少なくとも一部と同一の3’領域、および(ii)シーケンシングに有用なさらなる要素(例えば、シーケンシングプライマー結合部位およびサンプルインデックス)を含む5’領域を含む。P5_2がGSP2によって生成される相補鎖からセンス鎖を生成した後に、そのさらなるプライマーは、次いで、シーケンシングの準備ができた生成物328を生成するために、GSP2テール付加された領域の目下の相補的配列をプライムオフする。
いくつかの実施形態において、標的核酸および/またはその増幅生成物は、1つの方法のうちの任意の適切な工程の前および/または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法(Solid Phase Reversible Immobilization(SPRI))クリーンアップを含み得る。SPRIクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である(例えば、Agencourt AMPure XP - PCR Purification(カタログ番号A63880、Beckman Coulter; Brea, CA))。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。いくつかの実施形態において、非標識dNTPは、酵素処理によって除去される。
RNA調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程;(b)そのcDNAを末端修復して、その標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;(c)その平滑末端化した2本鎖核酸を常磁性基材または表面上に固定化する工程;(d)その固定化した平滑末端化2本鎖核酸を洗浄する工程;(e)その洗浄した固定化平滑末端化2本鎖核酸をその常磁性基材または表面から放出する工程;(f)1またはこれより多くのヌクレオチドを、その放出した平滑末端化2本鎖核酸の3’末端に付加する工程;(g)ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプターを工程(f)において生成した核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここでそのオーバーハング配列は、その1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;(h)そのライゲーション生成物を洗浄することなしに、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、そのライゲーション生成物を増幅する工程;(i)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(h)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここでその第2の標的特異的プライマーは、その第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程;(j)工程(i)の増幅生成物を常磁性基材または表面に固定化する工程;(k)その固定化した増幅生成物を洗浄する工程;ならびに(l)その洗浄した固定化増幅生成物をその常磁性基材または表面から放出する工程を包含し得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸アダプター(nucleic acid adapter)」または「アダプター(adapter)」とは、標的ヌクレオチド配列の増幅および/またはシーケンシングの間に有用な1またはこれより多くの要素を提供する
、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る核酸分子をいう。いくつかの実施形態において、アダプターは、1本鎖である。いくつかの実施形態において、アダプターは、2本鎖である。いくつかの実施形態において、2本鎖アダプターは、第1のライゲーション可能な二重鎖末端および第2の不対末端を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、増幅鎖およびブロッキング鎖を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、5’不対部分および3’二重鎖部分を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、3’オーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態において、その3’オーバーハングは、3’Tオーバーハングである。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、第1のおよび第2のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、5’二重鎖部分および伸長不能な3’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、3’不対部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖およびそのブロッキング鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、そしてその二重鎖部分は、ライゲーション温度においてにおいて二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
本開示の局面は、1またはこれより多くの増幅ラウンドを含み得る技術に関する。いくつかの実施形態において、第1の増幅ラウンドは、第1の標的特異的プライマーおよび第1のアダプタープライマーを使用して行われる。
ライマーの使用を包含し得る。いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用すると、予測外のプライマー結合部位の増幅に起因して、PCR生成物における非特異的に結合が低減し得る。本明細書で使用される場合、用語「ネスト化される(nested)」は、1つのプライマー対の1つのプライマーのアニーリング部位と別のプライマー対の別のプライマーのアニーリング部位との間の位置的関係性を記載するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、第2のプライマーは、1個、2個、3個またはこれより多くのヌクレオチドが第1のプライマーに対してネスト化され、このことは、1個、2個、3個またはこれより多くのヌクレオチドがフレームシフトされるそのテンプレート鎖上の部位にその第2のプライマーが結合することを意味する。
GC含量、少なくとも60% GC含量、少なくとも65% GC含量、少なくとも70% GC含量、少なくとも75% GC含量、少なくとも80% GC含量、またはより高いGC含量を含み得る。いくつかの実施形態において、5’テール配列は、少なくとも60% GC含量を含み得る。いくつかの実施形態において、5’テール配列は、少なくとも65% GC含量を含み得る。
。
いくつかの実施形態において、プライマー(例えば、第1のおよび第2の標的特異的プライマー、ならびに第1のおよび第2のアダプタープライマー)を、これらが、約61~72℃、例えば、約61~69℃、約63~69℃、約63~67℃、約64~66℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが72℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが70℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが68℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが約65℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を(例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって)変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、1つまたはこれより多くのハイブリダイズしたランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、1つまたはこれより多くのランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
的の核酸を特異的に増幅する(その存在量を増大させる)プロセスをいう。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、以前のポリメラーゼ伸長の生成物が連続する伸長ラウンドにわたってテンプレートとして働く場合に起こる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うPCR増幅レジメンは、少なくとも1回、およびいくつかの場合には、少なくとも5回またはこれより多くの反復サイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、各反復サイクルは、1)鎖分離(例えば、熱変性);2)テンプレート分子へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング;および3)そのアニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長という工程を含み得る。これらの工程の各々に関与する任意の適切な条件および時間が使用され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、選択される条件および時間は、長さ、配列の内容、融解温度、二次構造特徴、または反応において使用される核酸テンプレートおよび/もしくはプライマーに関する他の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラー(そのうちの多くは市販されている)で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、線形的増幅を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用して行われる増幅工程は、線形的増幅を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅は、核酸配列ベースの増幅(NASBA)を使用して行われ得る。例えば、いくつかの実施形態において、増幅は、T7媒介性NASBA反応を含む。
作用する。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、RNAテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、伸長反応は、相補的なDNA分子を生成するために、RNAに対して行われる逆転写を包含する(RNA依存性DNAポリメラーゼ活性)。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、マウスのモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)ポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、RSV逆転写酵素、HIV-1逆転写酵素、HIV-2逆転写酵素、または別の適切な逆転写酵素である。
BSAを含む。適切な緩衝液のさらなる非限定的な例は、50mM KCl、10mM
Tris-HCl(25℃においてpH8.8)、0.5~5mM(例えば、およそ0.5mM、およそ1mM、およそ2mM、およそ3mM、およそ4mM、およそ5mM)
MgCl2、および0.1% BSAを含む。
施形態において、プライマーのTmは、以下の式を使用して計算され得る(これは、NetPrimerソフトウェアによって使用され、Frieir,ら PNAS 1986
83:9373-9377(これは、その全体において本明細書に参考として援用される)により詳細に記載される)。
イクル~20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、各増幅工程は、長さが12サイクル~16サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、70℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、72℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約65℃であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約61~約72℃であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸(target nucleic acid)」および「標的ヌクレオチド配列を含む核酸(nucleic acid comprising a target nucleotide sequence)」とは、目的の核酸分子(例えば、分析されるべき核酸)をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列(例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列)および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列(これは、未知の配列といわれ得る)の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、2本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、DNAである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムDNAまたは染色体DNA(gDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的DNA(cDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、1本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、RNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA、cfDNA、cfRNA、長い非コードRNA、マイクロRNA)を含む。
を生成し得る)。例えば、ゲノムDNAまたはmRNAによって含まれる標的核酸は、この至適リード長より実質的に長い核酸分子によって含まれ得る。第2の増幅工程から生じる増幅された核酸部分が特定のシーケンシング技術における使用のための適切な長さ(例えば、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1kb、2kb)のものであるために、その既知の標的ヌクレオチド配列とアダプターがライゲーションされ得る標的核酸の末端との間の平均距離は、選択された技術の至適リード長に可能な限り近くであるべきである。例えば、所定のシーケンシング技術の至適リード長が200bpである場合、本明細書で記載される方法に従って増幅される核酸分子は、約400bpまたはこれより短い平均長を有するべきである。しかし、いくつかの実施形態において、核酸分子が長さ400bpを超える場合に本明細書で記載される技術が実行され得ることは、認識されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、核酸フラグメントは、およそ400個またはこれより多くのヌクレオチド、500個またはこれより多くのヌクレオチド、600個またはこれより多くのヌクレオチド、700個またはこれより多くのヌクレオチド、800個またはこれより多くのヌクレオチド、900個またはこれより多くのヌクレオチド、1000個またはこれより多くのヌクレオチド、1500個またはこれより多くのヌクレオチド、2000個またはこれより多くのヌクレオチド、2500個またはこれより多くのヌクレオチド、3000個またはこれより多くのヌクレオチド、4000個またはこれより多くのヌクレオチド、5000個またはこれより多くのヌクレオチド、10000個またはこれより多くのヌクレオチドであり得る。
to)」とは、別のヌクレオチド配列(例えば、既知のヌクレオチド配列)の直ぐ上流または下流にある核酸分子(例えば、標的核酸)のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、1kbまたはこれより短いヌクレオチド配列、例えば、1kbまたはこれより短いヌクレオチド配列、750bpまたはこれより短いヌクレオチド配列、500bpまたはこれより短いヌクレオチド配列、400bpまたはこれより短いヌクレオチド配列、300bpまたはこれより短いヌクレオチド配列、200bpまたはこれより短いヌクレオチド配列、100bpまたはこれより短いヌクレオチド配列を含む。サンプルが既知の標的ヌクレオチド配列を含む種々の標的核酸(例えば、既知の標的ヌクレオチド配列が、そのゲノムに、または別個の同一でない染色体上に何度も出現する細胞)を含むいくつかの実施形態において、その既知の標的ヌクレオチド配列「に連続するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列(またはそのヌクレオチド配列)を決定する(determining a(or the) nucleotide sequence)」とは、核酸のヌクレオチド塩基が何であるかおよびその相対的位置を決定することを指す。
含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および/または何であるかを決定するために適している。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成の1つの部分が何であるかは、先に既知であり(例えば、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の一部)、他の部分の配列は、本明細書で開示される方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子を要し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
いくつかの実施形態において、プライマーおよび/またはアダプターは、識別子配列(例えば、バーコード、インデックス)、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列(例えば、Rd1)、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Illuminaベースのシーケンシング技術のためのP5およびP7配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ion Torrentシーケンシング技術と適合性のP1およびAである。
ンデックス配列は、核酸が得られる患者を同定するように働き得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、1つの反応(例えば、1つのフローセルで行われる)での多数の異なるサンプルのシーケンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、個々のシーケンシング反応を検出する目的で配列イメージャーを配向するために使用され得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、長さが2~25ヌクレオチド、長さが2~15ヌクレオチド、長さが2~10ヌクレオチド、長さが2~6ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、または少なくとも25個のヌクレオチドを含む。
本明細書で記載される核酸分子は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る(例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得るか、ネブライザーにより剪断され得る)。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびCovaris(Woburn, MA)から市販されるAFATM剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物(例えば、伸長生成物、増幅生成物)は、剪断も酵素消化もされない。
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング(next-generation sequencing)」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法(例えば、サンガーシーケンシング法)で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法/プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる:大規模並行シグネチャーシーケンシング(Massively Parallel Signature Sequencing)(Lynx Therapeutics);454パイロシーケンシング(454 Life Sciences/ Roche Diagnostics);固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング(solid-phase, reversible dye-terminator sequencing)(Solexa/Illumina);SOLiD技術(Applied Biosystems);イオン半導体シーケンシング(Ion semiconductor sequencing)(ION Torrent);DNAナノボールシーケンシング(Complete Genomics);ならびにPacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、およびOxford Nanopore Technologiesから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である(例えば、Shendureら,「Next-generation
DNA sequencing」, Nature, 2008, vol. 26,
No. 10, 1135-1145;Mardis, 「The impact of next-generation sequencing technology on genetics」, Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141; Suら, 「Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics」 Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333-43;Zhangら, 「The impact of next-generation sequencing on genomics」, J Genet Genomics, 2011, 38(3):95-109;(Nyren, P.ら Anal Biochem 208:
17175(1993); Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545-52(2006); Strausberg, R.
L.ら, Drug Disc Today 13:569-77(2008);米国特許第7,282,337号;米国特許第7,279,563号;米国特許第7,226,720号;米国特許第7,220,549号;米国特許第7,169,560号;米国特許第6,818,395号;米国特許第6,911,345号;米国公開番号2006/0252077;同2007/0070349;および同20070070349を参照のこと;これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、核酸(例えば、標的核酸、標的ヌクレオチド配列を含む核酸)は、適切なサンプル(例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど)中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および/または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
ーション、加熱、凍結および融解、保存剤(例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター)との接触、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、化学的および/または生物学的試薬で処理され得る。化学的および/または生物学的試薬は、処理および/または貯蔵の間に、サンプルの安定性またはそのサンプルによって含まれる核酸を保護および/または維持するために使用され得る。さらに、または代わりに、化学的および/または生物学的試薬は、そのサンプルの他の構成要素から核酸を放出するために使用され得る。非限定的な例によれば、血液サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に、抗凝固剤で処理され得る。核酸分析のためのサンプルの処理、保存、または処理に適切な方法およびプロセスは、本明細書で開示される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄にした流体サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、その清澄にされる流体サンプルを含む上清の低速遠心分離(例えば、3,000×gまたはこれより小さい)および収集によって清澄にされ得る。
本明細書で記載される技術のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および/またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常(例えば、SNP、挿入、欠失、および/または遺伝子再編成)を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および/または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
既知ではない既知の遺伝子(例えば、発がん遺伝子)を要する遺伝子再編成の存在および何であるかを決定し得る。
Takouchiら Nature Medicine 2012 18:378-81;これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。しかし、再編成に関与する第2の遺伝子の遺伝子再編成の精密な位置および何であるかが予め既知でなくてもよいことは、認識されるべきである。よって、本明細書で記載される方法において、このような再編成の存在および何であるかは、遺伝子再編成に関与する第2の遺伝子の再編成の位置または何であるかを知る必要なしに検出され得る。
2011 3:21; Sakamotoら, Cancer Cell 2011 19:679-690;およびWO 04/079326で開示される分子を参照のこと)。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ALKインヒビターは、ALKまたはその一部の発現および/またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤(ALKまたはその一部の発現および/または活性を低減する例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および/またはペプチドを含む)を含み得る。本明細書で使用される場合「未分化リンパ腫キナーゼ(anaplastic lymphoma kinase)」または「ALK」とは、代表的には野生型形態におけるニューロン調節に関与する膜貫通チロシンキナーゼ(tyROS1ine kinase)をいう。ALK遺伝子およびmRNAのヌクレオチド配列は、多くの種(ヒトを含む)に関して公知である(例えば、NCBI Gene ID:238の下で註釈されるとおり)。
はペプチドを含む)を含み得る。本明細書で使用される場合「c-ros発癌遺伝子1(c-ros oncogene 1)」または「ROS1」(当該分野ではros-1ともいわれる)とは、sevenlessサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼを指し、これは、PTPN6と相互作用する。ROS1遺伝子およびmRNAのヌクレオチド配列は、多くの種(ヒトを含む)に関して公知である(例えば、NCBI Gene ID:6098の下で註釈されるとおり)。
する被験体は、がんを診断するための現在の方法を使用して医師によって同定され得る。例えば、肺がんの状態を特徴付けかつ診断を補助する、肺がんの症状および/または合併症は、当該分野で周知であり、呼吸の虚弱(weak breathing)、鎖骨上リンパ節腫脹、肺の異常音、胸部を軽くたたいた場合の濁音(dullness)および胸痛が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、肺がんの診断を補助し得る検査としては、x線、高レベルのある種の物質(例えば、カルシウム)に関する血液検査、CTスキャン、および腫瘍生検が挙げられるが、これらに限定されない。肺がんの家族歴、または肺がんのリスク因子への曝露(例えば、喫煙または煙および/もしくは空気汚染への曝露)はまた、被験体が肺がんを有するようであるか否かを決定するか、または肺がんの診断を行うことを補助し得る。
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、1つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅(multiplex amplification)」とは、1つまたはこれより多くの反応容器において1より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの1つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約2~1,000個の間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを指し得る。しかし、いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約1,000~10,000の間の異なる標的配列の検出に指し得る。いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約10,000~100,000の間の異なる標的配列の検出を指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、2~1,000の間の任意の範囲、例えば、5~500個、25~1,000個、または10~100個などの間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを言う。PCRに当てはまる場合の用語「多重(multiplex)」とは、同じPCR反応において少なくとも2個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
種々の次世代シーケンシング技術における使用に適したアダプター核酸および相当するアダプタープライマーを、デザインし生成した。
Illumina特異的適用において使用され得るアダプター核酸およびアダプタープライマーの例は、以下に示される:
Illumina特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ(増幅)鎖(5’→3’):
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCCGTACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACCGCCAGGAG*T(配列番号1)(ここで「N」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「*T」は、ホスホチオエート結合を有するTを表す)
ボトム(ブロッキング)鎖(5’→3’):
5phosCTCCTGGCGGTTt(配列番号2)(ここで「t」は、改変チミン核塩基(例えば、逆方向チミン(inverted thymine)を表す)
第1のアダプタープライマー(5’→3’):
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA(配列番号3)
第2のアダプタープライマー(5’→3’):
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(配列番号4)
イオン特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ(増幅)鎖(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACNNNNNNNNGCTCTTCCGATC*T(配列番号5)(ここで「N」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「*T」は、ホスホチオエート結合を有するTを表す)
ボトム(ブロッキング)鎖(5’→3’):
5phosGATCGGAAGAGCt(配列番号6)(ここで「t」は、改変チミン核塩基(例えば、逆方向チミン)を表す)
第1のアダプタープライマー(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTC(配列番号7)
第2のアダプタープライマー(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(配列番号8)
分析用の核酸サンプルを調製するための方法を図示する作業フローの例は、図5に示される。RNA分子のサンプルを、ランダムプライマーとアニールする。このアニーリングは、例えば、ランダムヘキサマーをそのサンプルに添加し、続いて、65℃において5分間加熱することによって達成され得る。アニーリング後に、第1鎖cDNA合成を、プライマー伸長によって(例えば、室温において)逆転写酵素を使用して達成して、DNA/RNAハイブリッドを生成する。
ることによってDNA/RNAハイブリッドのRNAを切断する。そのDNAにハイブリダイズしたままのRNAの得られたフラグメントは、第2鎖cDNA合成のプライマーとして働く。これは、DNA PolIを使用し、そのサンプルを例えば、16℃で60分間インキュベートして達成される。この期間の後に、DNA PolIを熱によって(例えば、そのサンプルを75℃で20分間インキュベートすることによって)不活性化する。DNA PolIの熱不活性化は、その後のサンプル調製工程においてサンプル完全性を大きく増大させることが見出された。
端、およびその鎖の伸長を防止する逆方向dT塩基を含む。
いくつかの発明の実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに/または結果および/もしくは本明細書で記載される利点のうちの1つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および/または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび/または改変の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および/または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法に関する。さらに、2つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法が相互に矛盾しなけ
れば、本開示の発明の範囲内に含まれる。
ではなく、要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、要素のリスト(これに対して文言「少なくとも1」が指す)内で具体的に識別される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「AおよびBのうちの少なくとも一方(at least one of A and B)」(または、等しくは、「AまたはBのうちの少なくとも一方(at least one of A or B)」、または、等しくは、「Aおよび/またはBのうちの少なくとも一方(at least one of A and/or B)」は、一実施形態において、少なくとも1つの(必要に応じて、1つより多くのを含む)AであってBは存在しない(および必要に応じて、B以外の要素を含む)に;別の実施形態において、少なくとも1つの(必要に応じて、1つより多くのを含む)Bであって、Aは存在しない(および必要に応じて、A以外の要素を含む);さらに別の実施形態において、少なくとも1つの(必要に応じて、1つより多くのを含む)A、および少なくとも1つの(必要に応じて、1つより多くのを含む)B(および必要に応じて、他の要素を含む);などを指し得る。
essentially of)」の特徴としても企図されることは、認識されるべきである。例えば、本開示が「AおよびBを含む組成物(composition comprising A and B)」を記載する場合、本開示はまた、代替の実施形態、「AおよびBからなる組成物(composition consisting of A and B)」および「AおよびBから本質的になる組成物(composition consisting essentially of A and B)」を企図する。
Claims (35)
- 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む2本鎖核酸の3’末端に付加する工程であって、ここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドであり、該捕捉部分は、該捕捉部分の結合パートナーと選択的に相互作用する部分である、工程;
(b)アダプター核酸を、該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された該2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程(a)における該2本鎖核酸の3’末端に付加された該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;
(c)該ライゲーション生成物と該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの該結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程;ならびに
(d)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、
を包含する方法。 - 工程(b)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、工程(a)における前記2本鎖核酸の3’末端に付加された前記1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的な、該アダプター核酸の前記3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、1本鎖である、請求項1に記載の方法。
- (e)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって工程(d)の増幅生成物を増幅する工程、
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 前記第2の標的特異的プライマーは、前記第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される、請求項4に記載の方法。
- 前記第2の標的特異的プライマーは、前記標的ヌクレオチド配列にアニールしない5’テールを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第2の標的特異的プライマーの5’テールと同一である3’部分を含むさらなるプライマーを添加する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、ビオチン部分である、請求項1に記載の方法。
- 前記ビオチン部分は、長さが5~20個の原子のリンカーを介して前記ヌクレオチドに共有結合的に連結されている、請求項8に記載の方法。
- 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、5位、6位、7位または8位において、前記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、請求項11に記載の方法。
- 前記アデニン核塩基またはその誘導体の7位は、炭素原子である、請求項12に記載の方法。
- 前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項1に記載の方法。
- 前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、請求項14に記載の方法。
- 工程(a)において、1個のヌクレオチドが、前記標的ヌクレオチド配列を含む前記2本鎖核酸の前記3’末端に付加される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の後でかつ工程(b)の前に洗浄工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の前に、前記2本鎖核酸を5’リン酸化する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の前に:
i)テンプレートとしてRNA調製物を使用するランダムにプライムした第1鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第1鎖合成反応の生成物を使用する第2鎖合成反応を行うことによって、cDNAを調製する工程;ならびに
ii)該cDNAを末端修復して、平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程、
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 工程(b)において、前記2本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、請求項1に記載の方法。
- 前記クラウディング剤は、(b)におけるライゲーション混合物の5%~50%に相当する量のポリエチレングリコールである、請求項20に記載の方法。
- 前記2本鎖核酸は、平滑末端化される、請求項1に記載の方法。
- 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)テンプレートとしてRNAを含む核酸調製物を使用するランダムにプライムした第1鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第1鎖合成反応の生成物を使用する第2鎖合成反応を行うことによって、cDNAを調製する工程であって、ここで該RNAは、標的ヌクレオチド配列を含む工程;
(b)該cDNAを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;
(c)該平滑末端化した2本鎖核酸を洗浄する工程;
(d)1またはこれより多くのヌクレオチドを工程(c)において洗浄した該核酸の3’末端に付加する工程であって、ここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドであり、該捕捉部分は、該捕捉部分の結合パートナーと選択的に相互作用する部分である、工程;
(e)工程(d)において生成した該核酸を洗浄する工程;
(f)ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程(e)において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、工程(d)において付加された該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;
(g)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程;
(h)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(g)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程;ならびに
(i)該工程(h)の増幅生成物を洗浄する工程、
を包含する方法。 - 前記方法は、工程(f)の後でかつ工程(g)の前に、前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの固定化した前記結合パートナーを使用して前記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、請求項23に記載の方法。
- 前記捕捉したライゲーション生成物を精製する工程をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項24に記載の方法。
- 前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、請求項26に記載の方法。
- 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、5位、6位、7位または8位において、前記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、請求項29に記載の方法。
- 前記アデニン核塩基またはその誘導体の7位は、炭素原子である、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、ビオチン部分である、請求項23に記載の方法。
- 前記ビオチン部分は、長さが5~20個の原子のリンカーを介して前記ヌクレオチドに共有結合的に連結されている、請求項32に記載の方法。
- 前記洗浄する工程は、可逆的固相固定化技術を使用して行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記第2のアダプタープライマーは、前記第1のアダプタープライマーに対してネスト化される、請求項23に記載の方法。
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