JP2019531072A - 核酸サンプル調製の方法 - Google Patents
核酸サンプル調製の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019531072A JP2019531072A JP2019514776A JP2019514776A JP2019531072A JP 2019531072 A JP2019531072 A JP 2019531072A JP 2019514776 A JP2019514776 A JP 2019514776A JP 2019514776 A JP2019514776 A JP 2019514776A JP 2019531072 A JP2019531072 A JP 2019531072A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- adapter
- target
- primer
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
- C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
- C12Q2549/119—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals using nested primers
Abstract
Description
本願は、2016年9月15日に出願された米国仮特許出願第62/395,339号の米国特許法第119条(e)項に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
本明細書で記載される技術は、分析用の核酸分子の調製において有用な方法および組成物に関する。
次世代シーケンシングする前の標的富化は、全ゲノム、全エキソーム、および全トランスクリプトームシーケンシングより費用効果が高く、従って、広い実行に関して;研究発見および臨床適用の両方に関してより実践的である。例えば、標的富化アプローチによって与えられる高カバレッジ深度(high coverage depth)は、アレル計数のより広いダイナミックレンジ(遺伝子発現およびコピー数評価において)および低頻度変異の検出を可能にし、これは、がんにおける体細胞変異を評価するために有利である。次世代シーケンシングの現在の富化プロトコルの例としては、ハイブリダイゼーションベースの捕捉アッセイ(TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースのアッセイ(HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina; エマルジョン/デジタルPCR、Raindance)が挙げられる。ハイブリダイゼーションベースのアプローチは、捕捉プローブによって網羅される標的化された配列のみならず、シーケンシング能力を消耗する近くのオフターゲット塩基をも捕捉する。さらに、これらの方法は、比較的時間浪費型、労働集約的であり、特異性が比較的低レベルであるという欠点をもつ。
本明細書で開示される技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。いくつかの実施形態において、配列分析用の核酸サンプルの調製において(例えば、次世代シーケンシング(next−generating sequencing)を使用して)有用な方法および組成物は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸配列を決定するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、シーケンシング前に1またはこれより多くの標的ヌクレオチド配列を含む核酸を富化することに関する。いくつかの局面において、本開示は、1またはこれより多くの捕捉部分改変ヌクレオチドを核酸に付加する工程を包含する、核酸を調製するための(例えば、シーケンシング分析において使用するための)方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、アダプター核酸を、上記捕捉部分改変ヌクレオチドが付加された核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライゲーション生成物と上記捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ライゲーション生成物を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または別の適切な増幅アプローチによって増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸(例えば、2本鎖核酸)の3’末端に付加する工程を包含する核酸を調製するための方法が提供され、ここで上記1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分改変ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記核酸の3’末端に上記捕捉部分改変ヌクレオチドが存在すると、上記核酸全体に改変されたヌクレオチドが(例えば、ランダムに)組み込まれることを回避しながら、上記核酸の単離、精製および/または洗浄が促進される。いくつかの実施形態において、1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸(例えば、2本鎖核酸)へと組み込む工程を包含する核酸を調製するための方法が提供され、ここで上記1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分改変ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、プライマー(例えば、逆転写プライマー)を使用して組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、上記核酸を調製する先の工程の間に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、上記1またはこれより多くのヌクレオチドは、フラグメント化、ランダムプライミング、第1鎖合成、第2鎖合成、および/または末端修復の間に組み込まれる。
他の局面の中でも、本開示は、分析用の核酸サンプルライブラリーの調製に関する改善された技術を提供する。本明細書で記載されるように、アダプター核酸は、標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る。アダプター核酸の使用は、ライブラリー調製およびシーケンシング分析の間に、例えば、プライマー結合部位および分子バーコードまたはインデックス配列を提供することによって、有用であり得る。いくつかの局面において、本開示は、アダプターライゲーションに関するプロセスにおける改善および分子バーコードフィデリティーを実質的に改善するアダプターをライゲーションしたサンプル単離に関する。
本明細書で記載される技術の局面は、目的の分子(例えば、核酸、ライゲーション生成物など)を単離するための捕捉部分の使用に関する。本明細書で使用される場合、「捕捉部分(capture moiety)」とは、その目的の分子を捕捉する(例えば、単離する/精製する)目的で、結合パートナーと選択的に相互作用するように構成される部分をいう。
本開示の局面は、既知の標的ヌクレオチド配列に連続したヌクレオチド配列を決定する改善された方法を提供する。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に(例えば、「ショットガン(shotgun)」シーケンシング)、またはプライマーをデザインするために使用される2つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの1つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する(例えば、シーケンシングする)ことを可能にする。
いくつかの実施形態において、標的核酸および/またはその増幅生成物は、1つの方法のうちの任意の適切な工程の前および/または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法(Solid Phase Reversible Immobilization(SPRI))クリーンアップを含み得る。SPRIクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である(例えば、Agencourt AMPure XP − PCR Purification(カタログ番号A63880、Beckman Coulter; Brea, CA))。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。いくつかの実施形態において、非標識dNTPは、酵素処理によって除去される。
本明細書で使用される場合、用語「核酸アダプター(nucleic acid adapter)」または「アダプター(adapter)」とは、標的ヌクレオチド配列の増幅および/またはシーケンシングの間に有用な1またはこれより多くの要素を提供する、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る核酸分子をいう。いくつかの実施形態において、アダプターは、1本鎖である。いくつかの実施形態において、アダプターは、2本鎖である。いくつかの実施形態において、2本鎖アダプターは、第1のライゲーション可能な二重鎖末端および第2の不対末端を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、増幅鎖およびブロッキング鎖を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、5’不対部分および3’二重鎖部分を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、3’オーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態において、その3’オーバーハングは、3’Tオーバーハングである。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、第1のおよび第2のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、5’二重鎖部分および伸長不能な3’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、3’不対部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖およびそのブロッキング鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、そしてその二重鎖部分は、ライゲーション温度においてにおいて二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
本開示の局面は、1またはこれより多くの増幅ラウンドを含み得る技術に関する。いくつかの実施形態において、第1の増幅ラウンドは、第1の標的特異的プライマーおよび第1のアダプタープライマーを使用して行われる。
いくつかの実施形態において、プライマー(例えば、第1のおよび第2の標的特異的プライマー、ならびに第1のおよび第2のアダプタープライマー)を、これらが、約61〜72℃、例えば、約61〜69℃、約63〜69℃、約63〜67℃、約64〜66℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが72℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが70℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが68℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが約65℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を(例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって)変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、1つまたはこれより多くのハイブリダイズしたランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、1つまたはこれより多くのランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸(target nucleic acid)」および「標的ヌクレオチド配列を含む核酸(nucleic acid comprising a target nucleotide sequence)」とは、目的の核酸分子(例えば、分析されるべき核酸)をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列(例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列)および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列(これは、未知の配列といわれ得る)の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、2本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、DNAである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムDNAまたは染色体DNA(gDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的DNA(cDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、1本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、RNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA、cfDNA、cfRNA、長い非コードRNA、マイクロRNA)を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーおよび/またはアダプターは、識別子配列(例えば、バーコード、インデックス)、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列(例えば、Rd1)、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Illuminaベースのシーケンシング技術のためのP5およびP7配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ion Torrentシーケンシング技術と適合性のP1およびAである。
本明細書で記載される核酸分子は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る(例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得るか、ネブライザーにより剪断され得る)。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびCovaris(Woburn, MA)から市販されるAFATM剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物(例えば、伸長生成物、増幅生成物)は、剪断も酵素消化もされない。
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング(next−generation sequencing)」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法(例えば、サンガーシーケンシング法)で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法/プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる:大規模並行シグネチャーシーケンシング(Massively Parallel Signature Sequencing)(Lynx Therapeutics);454パイロシーケンシング(454 Life Sciences/ Roche Diagnostics);固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング(solid−phase, reversible dye−terminator sequencing)(Solexa/Illumina);SOLiD技術(Applied Biosystems);イオン半導体シーケンシング(Ion semiconductor sequencing)(ION Torrent);DNAナノボールシーケンシング(Complete Genomics);ならびにPacific Biosciences、Intelligen Bio−systems、およびOxford Nanopore Technologiesから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である(例えば、Shendureら,「Next−generation DNA sequencing」, Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135−1145;Mardis, 「The impact of next−generation sequencing technology on genetics」, Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133−141; Suら, 「Next−generation sequencing and its applications in molecular diagnostics」 Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333−43;Zhangら, 「The impact of next−generation sequencing on genomics」, J Genet Genomics, 2011, 38(3):95−109;(Nyren, P.ら Anal Biochem 208: 17175(1993); Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545−52(2006); Strausberg, R. L.ら, Drug Disc Today 13:569−77(2008);米国特許第7,282,337号;米国特許第7,279,563号;米国特許第7,226,720号;米国特許第7,220,549号;米国特許第7,169,560号;米国特許第6,818,395号;米国特許第6,911,345号;米国公開番号2006/0252077;同2007/0070349;および同20070070349を参照のこと;これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、核酸(例えば、標的核酸、標的ヌクレオチド配列を含む核酸)は、適切なサンプル(例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど)中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および/または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
本明細書で記載される技術のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および/またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常(例えば、SNP、挿入、欠失、および/または遺伝子再編成)を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および/または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、1つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅(multiplex amplification)」とは、1つまたはこれより多くの反応容器において1より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの1つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約2〜1,000個の間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを指し得る。しかし、いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約1,000〜10,000の間の異なる標的配列の検出に指し得る。いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約10,000〜100,000の間の異なる標的配列の検出を指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、2〜1,000の間の任意の範囲、例えば、5〜500個、25〜1,000個、または10〜100個などの間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを言う。PCRに当てはまる場合の用語「多重(multiplex)」とは、同じPCR反応において少なくとも2個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
種々の次世代シーケンシング技術における使用に適したアダプター核酸および相当するアダプタープライマーを、デザインし生成した。
Illumina特異的適用において使用され得るアダプター核酸およびアダプタープライマーの例は、以下に示される:
Illumina特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ(増幅)鎖(5’→3’):
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCCGTACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACCGCCAGGAG*T(配列番号1)(ここで「N」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「*T」は、ホスホチオエート結合を有するTを表す)
ボトム(ブロッキング)鎖(5’→3’):
5phosCTCCTGGCGGTTt(配列番号2)(ここで「t」は、改変チミン核塩基(例えば、逆方向チミン(inverted thymine)を表す)
第1のアダプタープライマー(5’→3’):
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA(配列番号3)
第2のアダプタープライマー(5’→3’):
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(配列番号4)
イオン特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ(増幅)鎖(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACNNNNNNNNGCTCTTCCGATC*T(配列番号5)(ここで「N」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「*T」は、ホスホチオエート結合を有するTを表す)
ボトム(ブロッキング)鎖(5’→3’):
5phosGATCGGAAGAGCt(配列番号6)(ここで「t」は、改変チミン核塩基(例えば、逆方向チミン)を表す)
第1のアダプタープライマー(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTC(配列番号7)
第2のアダプタープライマー(5’→3’):
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(配列番号8)
分析用の核酸サンプルを調製するための方法を図示する作業フローの例は、図5に示される。RNA分子のサンプルを、ランダムプライマーとアニールする。このアニーリングは、例えば、ランダムヘキサマーをそのサンプルに添加し、続いて、65℃において5分間加熱することによって達成され得る。アニーリング後に、第1鎖cDNA合成を、プライマー伸長によって(例えば、室温において)逆転写酵素を使用して達成して、DNA/RNAハイブリッドを生成する。
いくつかの発明の実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに/または結果および/もしくは本明細書で記載される利点のうちの1つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および/または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび/または改変の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および/または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法に関する。さらに、2つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
Claims (38)
- 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)1またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む2本鎖核酸の3’末端に付加する工程であって、ここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分改変ヌクレオチドである工程;
(b)アダプター核酸を、該捕捉部分改変ヌクレオチドが付加された該2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程(a)における該2本鎖核酸の3’末端に付加された該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;
(c)該ライゲーション生成物と該捕捉部分改変ヌクレオチドの結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程;ならびに
(d)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、
を包含する方法。 - 工程(b)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、工程(a)における前記2本鎖核酸の3’末端に付加された前記1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的な、該アダプター核酸の前記3’末端における1またはこれより多くのヌクレオチドの配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、1本鎖である、請求項1に記載の方法。
- (e)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって工程(d)の増幅生成物を増幅する工程、
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 前記第2の標的特異的プライマーは、前記第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される、請求項4に記載の方法。
- 前記第2の標的特異的プライマーは、前記標的ヌクレオチド配列にアニールしない5’テールを含む、請求項4または5に記載の方法。
- 前記第2の標的特異的プライマーの5’テールと同一である3’部分を含むさらなるプライマーを添加する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、ビオチン部分である、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記ビオチン部分は、ビオチン−トリエチレングリコール、ビス−ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン−トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、5位、6位、7位または8位において、前記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、請求項11に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、7位において前記アデニン核塩基に共有結合的に連結される、請求項12に記載の方法。
- 前記アデニン核塩基の7位は、炭素原子である、請求項13に記載の方法。
- 前記ビオチン部分は、長さが5〜20個の原子のリンカーを介して前記核塩基に共有結合的に連結される、請求項10に記載の方法。
- 前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、ビオチン−n−dNTPであり、ここでnは、該ビオチン部分のカルボニル基と該NTPの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す5〜20の整数である、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、請求項17に記載の方法。
- 工程(a)において、1個のヌクレオチドが、前記標的ヌクレオチド配列を含む前記2本鎖核酸の前記3’末端に付加される、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)の後でかつ工程(c)の前に洗浄工程をさらに包含する、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 工程(c)の後でかつ工程(d)の前に:
i)前記捕捉部分改変ヌクレオチドを含む前記2本鎖核酸を、常磁性基材または表面上に固定化する工程;および
ii)該固定化された2本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 工程(ii)の後に:
iii)前記洗浄した固定化2本鎖核酸を前記常磁性基材または表面から放出する工程、
をさらに包含する、請求項21に記載の方法。 - 工程(a)の前に、前記2本鎖核酸を5’リン酸化する工程をさらに包含する、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)の前に:
i)テンプレートとしてRNA調製物を使用するランダムにプライムした第1鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第1鎖合成反応の生成物を使用する第2鎖合成反応を行うことによって、cDNAを調製する工程;ならびに
ii)該cDNAを末端修復して、平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程、
をさらに包含する、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 工程ii)の後に:
iii)前記捕捉部分改変ヌクレオチドを含む前記2本鎖核酸を、常磁性基材または表面上に固定化する工程;
iv)該固定化した2本鎖核酸を洗浄する工程;および
v)該洗浄した固定化した2本鎖核酸を該常磁性基材または表面から放出する工程
をさらに包含する、請求項24に記載の方法。 - 工程(ii)の後でかつ工程(iii)の前に洗浄工程をさらに包含する、請求項25に記載の方法。
- (f)工程(e)の前記増幅生成物を常磁性基材または表面上に固定化する工程;
(g)該固定化した増幅生成物を洗浄する工程;および
(h)該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材または表面から放出する工程、
をさらに包含する、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 工程(e)の後でかつ工程(f)の前に洗浄工程をさらに包含する、請求項27に記載の方法。
- 工程(b)において、前記2本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記クラウディング剤は、ライゲーション混合物の5%〜50%に相当する量のポリエチレングリコールである、請求項29に記載の方法。
- 前記2本鎖核酸は、平滑末端化される、前述の請求項のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)テンプレートとしてRNA調製物を使用するランダムにプライムした第1鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第1鎖合成反応の生成物を使用する第2鎖合成反応を行うことによって、cDNAを調製する工程であって、ここで該RNA調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程;
(b)該cDNAを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;
(c)該平滑末端化した2本鎖核酸を常磁性基材または表面上に固定化する工程;
(d)該固定化した平滑末端化2本鎖核酸を洗浄する工程;
(e)該洗浄した固定化平滑末端化2本鎖核酸を該常磁性基材または表面から放出する工程;
(f)1またはこれより多くのヌクレオチドを該放出した平滑末端化2本鎖核酸の3’末端に付加する工程;
(g)ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプターを、工程(f)において生成した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;
(h)該ライゲーション生成物を洗浄することなく、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程;
(i)工程(h)の増幅生成物を、第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程;
(j)工程(i)の該増幅生成物を常磁性基材または表面に固定化する工程;
(k)該固定化した増幅生成物を洗浄する工程;ならびに
(l)該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材または表面から放出する工程、
を包含する方法。 - 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)テンプレートとして核酸調製物を使用するランダムにプライムした第1鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第1鎖合成反応の生成物を使用する第2鎖合成反応を行うことによって、cDNAを調製する工程であって、ここで該核酸調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程;
(b)該cDNAを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;
(c)該平滑末端化した2本鎖核酸を洗浄する工程;
(d)1またはこれより多くのヌクレオチドを工程(c)において洗浄した該核酸の3’末端に付加する工程であって、必要に応じてここで該1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、捕捉部分改変ヌクレオチドである工程;
(e)工程(d)において生成した該核酸を洗浄する工程;
(f)ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程(e)において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該1またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程;
(g)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程;
(h)第2のアダプタープライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(g)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該第1の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程;ならびに
(j)該工程(h)の増幅生成物を洗浄する工程、
を包含する方法。 - 前記洗浄する工程は、可逆的固相固定化技術を使用して行われる、請求項33に記載の方法。
- 前記1またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、捕捉部分改変ヌクレオチドであり、前記方法は、工程(f)の後でかつ工程(g)の前に、該捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分の固定化した結合パートナーを使用して前記ライゲーション生成物を捕捉する工程;および該捕捉したライゲーション生成物を清浄にする工程をさらに包含する、請求項34に記載の方法。
- 前記捕捉部分は、ビオチン部分を含み、前記結合パートナーは、ストレプトアビジンを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記第2のアダプタープライマーは、前記第1のアダプタープライマーに対してネスト化される、請求項33に記載の方法。
- 前記第2のアダプタープライマーは、前記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする、請求項33に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662395339P | 2016-09-15 | 2016-09-15 | |
US62/395,339 | 2016-09-15 | ||
PCT/US2017/051924 WO2018053362A1 (en) | 2016-09-15 | 2017-09-15 | Methods of nucleic acid sample preparation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019531072A true JP2019531072A (ja) | 2019-10-31 |
JP2019531072A5 JP2019531072A5 (ja) | 2021-11-11 |
JP6997772B2 JP6997772B2 (ja) | 2022-01-18 |
Family
ID=61619260
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019514776A Active JP6997772B2 (ja) | 2016-09-15 | 2017-09-15 | 核酸サンプル調製の方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10704082B2 (ja) |
EP (2) | EP3933039A1 (ja) |
JP (1) | JP6997772B2 (ja) |
CN (1) | CN109937254B (ja) |
AU (1) | AU2017328950B2 (ja) |
CA (1) | CA3037185A1 (ja) |
ES (1) | ES2903357T3 (ja) |
WO (1) | WO2018053362A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013169339A1 (en) | 2012-05-10 | 2013-11-14 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence |
AU2015209079B2 (en) | 2014-01-27 | 2021-07-15 | Archerdx, Llc | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
JP6997773B2 (ja) | 2016-09-15 | 2022-01-18 | アーチャーディーエックス, エルエルシー | 無細胞dnaの分析用の核酸サンプル調製の方法 |
US10704082B2 (en) | 2016-09-15 | 2020-07-07 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation |
JP7161991B2 (ja) | 2016-11-02 | 2022-10-27 | アーチャーディーエックス, エルエルシー | 免疫レパートリーシーケンシングのための核酸サンプル調製の方法 |
WO2020237010A1 (en) * | 2019-05-21 | 2020-11-26 | Academia Sinica | Method for amplifying and detecting ribonucleic acid (rna) fragments |
WO2021027706A1 (zh) * | 2019-08-09 | 2021-02-18 | 深圳市真迈生物科技有限公司 | 捕获核酸分子的方法、核酸文库的制备方法及测序方法 |
US20210171940A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Becton, Dickinson And Company | Magnetic capture bead mediated molecular barcoding of nucleic acid targets in single particles and compositions for use in the same |
WO2022146773A1 (en) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Nuprobe Usa, Inc. | Methods and compositions for sequencing and fusion detection using ligation tail adapters (lta) |
CA3218561A1 (en) | 2021-05-19 | 2022-11-24 | Seqstant Gmbh | Method for parallel real-time sequence analysis |
WO2024055320A1 (zh) * | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种基因测序方法、装置、设备和介质 |
CN115612722A (zh) * | 2022-09-16 | 2023-01-17 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种基因测序方法、装置、设备和介质 |
Family Cites Families (127)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5157032A (en) | 1985-01-18 | 1992-10-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Mixed ligand complexes and uses thereof as binding agents and probes to DNA |
US4868104A (en) | 1985-09-06 | 1989-09-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous assay for specific polynucleotides |
US6027913A (en) | 1988-01-28 | 2000-02-22 | Sommer; Steven S. | Nucleic acid amplification with direct sequencing |
US5374524A (en) | 1988-05-10 | 1994-12-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Solution sandwich hybridization, capture and detection of amplified nucleic acids |
EP0731175A3 (en) | 1989-07-11 | 2004-05-26 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for HIV nucleic acid |
CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
US6087101A (en) | 1990-05-18 | 2000-07-11 | Gruelich; Karl Otto | Optical characterization of nucleic acids and oligonucleotides |
DE69233750D1 (de) | 1991-04-10 | 2009-01-02 | Scripps Research Inst | Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden |
US5604098A (en) | 1993-03-24 | 1997-02-18 | Molecular Biology Resources, Inc. | Methods and materials for restriction endonuclease applications |
US6063566A (en) | 1994-05-13 | 2000-05-16 | The Scripps Research Institute | Catalytic RNA molecules |
US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
US5565340A (en) | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
US5556771A (en) | 1995-02-10 | 1996-09-17 | Gen-Probe Incorporated | Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification |
DE69633941T2 (de) | 1995-12-22 | 2005-11-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Nachweis von unterschieden in nukleinsäuren |
JP2001517925A (ja) | 1995-12-22 | 2001-10-09 | ベーリングウエルケ、アクティエンゲゼルシャフト | 核酸の均質増幅および検出 |
US5827658A (en) * | 1996-08-09 | 1998-10-27 | The United States Of America As Reprsented By The Department Of Health And Human Services | Isolation of amplified genes via cDNA subtractive hybridization |
US5861251A (en) | 1996-10-15 | 1999-01-19 | Bioneer Corporation | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction |
AU4938497A (en) | 1996-11-12 | 1998-06-03 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for direct isothermal sequencing of nucleic acids |
US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
US20020061532A1 (en) | 1997-02-14 | 2002-05-23 | Mosaic Technologies, Inc. | Method and apparatus for performing amplification of nucleic acids on supports |
US6365346B1 (en) | 1998-02-18 | 2002-04-02 | Dade Behring Inc. | Quantitative determination of nucleic acid amplification products |
US6235502B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-05-22 | Molecular Staging Inc. | Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification |
US6197554B1 (en) | 1998-11-20 | 2001-03-06 | Shi-Lung Lin | Method for generating full-length cDNA library from single cells |
US6200757B1 (en) | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
US7074556B2 (en) | 1999-03-02 | 2006-07-11 | Invitrogen Corporation | cDNA synthesis improvements |
WO2000070095A2 (en) | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Dade Behring Inc. | Homogeneous isothermal amplification and detection of nucleic acids using a template switch oligonucleotide |
US6818395B1 (en) | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
US6232104B1 (en) | 1999-08-17 | 2001-05-15 | Dade Behring Inc. | Detection of differences in nucleic acids by inhibition of spontaneous DNA branch migration |
CN102586228A (zh) | 1999-09-13 | 2012-07-18 | 纽亘技术公司 | 用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物 |
US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US6309836B1 (en) | 1999-10-05 | 2001-10-30 | Marek Kwiatkowski | Compounds for protecting hydroxyls and methods for their use |
US20030022318A1 (en) | 2000-01-25 | 2003-01-30 | Epiclone, Inc. | Method for thermocycling amplification of nucleic acid sequences and the generation of related peptides thereof |
AU5741101A (en) | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Digital Gene Technologies, Inc. | Methods for rapid isolation and sequence determination of gene-specific sequences |
JP2001333800A (ja) | 2000-05-30 | 2001-12-04 | Unitech Kk | Rna量およびdna量の比較検出方法 |
DE60141087D1 (de) | 2000-06-26 | 2010-03-04 | Nugen Technologies Inc | Methoden und zusammensetzungen zur auf transkription basierenden vervielfältigung von nukleinsäuren |
EP1356104A2 (en) | 2000-10-06 | 2003-10-29 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences |
AR031640A1 (es) | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
US6858413B2 (en) | 2000-12-13 | 2005-02-22 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
US20040058373A1 (en) | 2001-01-31 | 2004-03-25 | Winkler Matthew M. | Competitive amplification of fractionated targets from multiple nucleic acid samples |
BR0205268A (pt) | 2001-03-09 | 2004-11-30 | Nugen Technologies Inc | Processos e composições para a mplificação de sequências de rna |
US6632611B2 (en) | 2001-07-20 | 2003-10-14 | Affymetrix, Inc. | Method of target enrichment and amplification |
US20030104432A1 (en) | 2001-07-27 | 2003-06-05 | The Regents Of The University Of California | Methods of amplifying sense strand RNA |
EP1488001B1 (en) | 2002-03-11 | 2008-08-20 | Nugen Technologies, Inc. | Methods for generating double stranded dna comprising a 3' single stranded portion and uses of these complexes for recombination |
EP1490514A4 (en) | 2002-03-29 | 2008-12-17 | Nugen Technologies Inc | THROUGH ISOTHERME SINGLE PRIMER NUCLEIC ACID AMPLIFICATION IMPROVED DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANALYTES |
EP1573056A4 (en) | 2002-05-17 | 2007-11-28 | Nugen Technologies Inc | METHODS FOR FRAGMENTATION, LABELING AND IMMOBILIZATION OF NUCLEIC ACIDS |
US7273730B2 (en) | 2002-05-24 | 2007-09-25 | Invitrogen Corporation | Nested PCR employing degradable primers |
US6852494B2 (en) | 2003-01-10 | 2005-02-08 | Linden Technologies, Inc. | Nucleic acid amplification |
DK1454992T3 (da) | 2003-03-07 | 2006-10-02 | Ist Naz Stud Cura Dei Tumori | Anaplastisk lymfomakinaseassay, reagenser og sammensætninger deraf |
CA2521084A1 (en) | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Nugen Technologies, Inc. | Global amplification using a randomly primed composite primer |
EP1668158B1 (en) | 2003-08-11 | 2010-10-20 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Rna detection and quantitation |
US7226720B2 (en) | 2003-09-08 | 2007-06-05 | General Electric Company | Limited play data storage media and method for limiting access to data thereon |
US7824856B2 (en) | 2003-09-10 | 2010-11-02 | Althea Technologies, Inc. | Expression profiling using microarrays |
US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
US20080021205A1 (en) | 2003-12-11 | 2008-01-24 | Helen Blau | Methods and Compositions for Use in Preparing Hairpin Rnas |
EP1696920B8 (en) | 2003-12-19 | 2015-05-06 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for development of ret modulators |
CA2552007A1 (en) | 2003-12-29 | 2005-07-21 | Nugen Technologies, Inc. | Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids |
GB0421525D0 (en) | 2004-09-28 | 2004-10-27 | Novartis Ag | Inhibitors of protein kineses |
US20070070349A1 (en) | 2005-09-23 | 2007-03-29 | Helicos Biosciences Corporation | Optical train and method for TIRF single molecule detection and analysis |
US7220549B2 (en) | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
WO2006119280A2 (en) | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Handylab, Inc. | Lyophilized pellets |
WO2007030759A2 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Nugen Technologies, Inc. | Improved nucleic acid amplification procedure |
WO2007057652A1 (en) | 2005-11-15 | 2007-05-24 | Solexa Limited | Method of target enrichment |
US7282337B1 (en) | 2006-04-14 | 2007-10-16 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing |
US20090275486A1 (en) | 2006-05-16 | 2009-11-05 | Nurith Kurn | Nucleic acid separation and purification method based on reversible charge interactions |
US20100022403A1 (en) | 2006-06-30 | 2010-01-28 | Nurith Kurn | Methods for fragmentation and labeling of nucleic acids |
WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
US8685899B2 (en) | 2007-02-14 | 2014-04-01 | Genisphere Inc. | Methods, reagents and kits for detection of nucleic acid molecules |
WO2009032167A1 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Illumina Cambridge | Method for sequencing a polynucleotide template |
US20100248310A1 (en) | 2007-10-22 | 2010-09-30 | Monoquant Pty Ltd. | Method of dna amplification |
AU2009205523A1 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | Applied Biosystems, Llc | Compositions, methods, and kits for detecting ribonucleic acid |
WO2009102896A2 (en) | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Nugen Technologies, Inc. | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions |
WO2009117698A2 (en) | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Nugen Technologies, Inc. | Methods of rna amplification in the presence of dna |
WO2009133466A2 (en) | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Population Genetics Technologies Ltd. | Asymmetric adapter library construction |
CN101270395A (zh) | 2008-05-08 | 2008-09-24 | 重庆大学 | 柑桔衰退病毒一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法 |
WO2009148617A2 (en) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | The Salk Institute For Biological Studies | Grepseq: an almost inexhaustible, cost-effective, high-throughput protocol for the generation of selector sequences |
CA2730190A1 (en) | 2008-07-14 | 2010-01-21 | Queen's University At Kingston | Pharmaceutical compositions comprising ret inhibitors and methods for the treatment of cancer |
WO2010077288A2 (en) | 2008-12-09 | 2010-07-08 | The Salk Institute For Biological Studies | Methods for identifying differences in alternative splicing between two rna samples |
JP2010143860A (ja) | 2008-12-19 | 2010-07-01 | Chisso Corp | タンパク質の安定化剤 |
WO2010083046A2 (en) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | The Salk Institute For Biological Studies | Methods for using next generation sequencing to identify 5-methyl cytosines in the genome |
US20100286143A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-11-11 | Dora Dias-Santagata | Methods and materials for genetic analysis of tumors |
WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
WO2011019964A1 (en) | 2009-08-12 | 2011-02-17 | Nugen Technologies, Inc. | Methods, compositions, and kits for generating nucleic acid products substantially free of template nucleic acid |
WO2011032053A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for whole transcriptome analysis |
WO2011053987A1 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence selection and amplification |
CA2786473A1 (en) | 2010-01-08 | 2011-07-14 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for isothermal nucleic acid amplification |
EP2366031B1 (en) | 2010-01-19 | 2015-01-21 | Verinata Health, Inc | Sequencing methods in prenatal diagnoses |
GB201008125D0 (en) | 2010-05-14 | 2010-06-30 | Biofortuna Ltd | Tissue typing assays and kits |
US20110319290A1 (en) | 2010-06-08 | 2011-12-29 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and Compositions for Multiplex Sequencing |
US20120003657A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Samuel Myllykangas | Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization |
WO2012024658A2 (en) * | 2010-08-20 | 2012-02-23 | IntegenX, Inc. | Integrated analysis system |
EP3572528A1 (en) | 2010-09-24 | 2019-11-27 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers |
WO2012044956A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted genome amplification methods |
JP6328934B2 (ja) | 2010-12-22 | 2018-05-23 | ナテラ, インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
WO2012103154A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-08-02 | Nugen Technologies, Inc. | Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations |
US8722585B2 (en) | 2011-05-08 | 2014-05-13 | Yan Wang | Methods of making di-tagged DNA libraries from DNA or RNA using double-tagged oligonucleotides |
CA2835942C (en) * | 2011-05-19 | 2019-01-22 | Sequenom, Inc. | Products and processes for multiplex nucleic acid identification |
GB2497838A (en) | 2011-10-19 | 2013-06-26 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
US20130123117A1 (en) | 2011-11-16 | 2013-05-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Capture probe and assay for analysis of fragmented nucleic acids |
CN105861487B (zh) | 2012-01-26 | 2020-05-05 | 纽亘技术公司 | 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法 |
WO2013169339A1 (en) | 2012-05-10 | 2013-11-14 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence |
CN104619894B (zh) | 2012-06-18 | 2017-06-06 | 纽亘技术公司 | 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法 |
AU2013286635B2 (en) * | 2012-07-03 | 2018-11-08 | Foundation Medicine, Inc. | Tm-enhanced blocking oligonucleotides and baits for improved target enrichment and reduced off-target selection |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
WO2014047678A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Method of producing a normalised nucleic acid library using solid state capture material |
US20150291953A1 (en) | 2012-11-02 | 2015-10-15 | Enzymatics Inc. | Methods and kits for nucleic acid sample preparation for sequencing |
EP2959016A4 (en) | 2013-02-21 | 2016-10-12 | Toma Biosciences Inc | METHOD, COMPOSITIONS AND NUCLEIC ACID ANALYSIS KITS |
WO2014138385A1 (en) | 2013-03-06 | 2014-09-12 | Ohio State Innovation Foundation | Isothermal amplification of nuleic acid, and library preparation and clone generation in sequencing |
GB2584364A (en) | 2013-03-15 | 2020-12-02 | Abvitro Llc | Single cell bar-coding for antibody discovery |
US20140274729A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nugen Technologies, Inc. | Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries |
EP2971130A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-05 | Nugen Technologies Inc | SEQUENTIAL SEQUENCING |
CN105189748B (zh) | 2013-03-15 | 2021-06-08 | 血统生物科学公司 | 测序免疫组库的方法 |
WO2015073711A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
US9689027B2 (en) | 2013-11-15 | 2017-06-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | High efficiency multiplexed nucleic acid capture in a structured microenvironment |
CN109706222A (zh) | 2013-12-11 | 2019-05-03 | 安可济控股有限公司 | 用于检测罕见序列变体的组合物和方法 |
US10407720B2 (en) | 2013-12-15 | 2019-09-10 | Academia Sinica | Methods for full-length amplification of double-stranded linear nucleic acids of unknown sequences |
EP3099819A4 (en) | 2014-01-27 | 2018-01-10 | Archerdx, Inc. | Isothermal methods and related compositions for preparing nucleic acids |
WO2015112948A2 (en) | 2014-01-27 | 2015-07-30 | Iafrate Anthony John | Methods for determining a nucleotide sequence |
AU2015209079B2 (en) | 2014-01-27 | 2021-07-15 | Archerdx, Llc | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
SI3354732T1 (sl) | 2014-06-23 | 2020-07-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Z nukleazo posredovan DNA sklop |
SG11201702060VA (en) | 2014-09-15 | 2017-04-27 | Abvitro Inc | High-throughput nucleotide library sequencing |
CN107208157B (zh) | 2015-02-27 | 2022-04-05 | 贝克顿迪金森公司 | 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物 |
EP3332024B1 (en) | 2015-08-06 | 2020-10-28 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Target enrichment by single probe primer extension |
WO2017177308A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | University Health Network (Uhn) | Hybrid-capture sequencing for determining immune cell clonality |
US10704082B2 (en) | 2016-09-15 | 2020-07-07 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation |
JP6997773B2 (ja) | 2016-09-15 | 2022-01-18 | アーチャーディーエックス, エルエルシー | 無細胞dnaの分析用の核酸サンプル調製の方法 |
US20220282305A1 (en) | 2016-09-15 | 2022-09-08 | Archerdx, Llc | Methods of nucleic acid sample preparation |
JP7161991B2 (ja) | 2016-11-02 | 2022-10-27 | アーチャーディーエックス, エルエルシー | 免疫レパートリーシーケンシングのための核酸サンプル調製の方法 |
-
2017
- 2017-09-15 US US15/706,642 patent/US10704082B2/en active Active
- 2017-09-15 AU AU2017328950A patent/AU2017328950B2/en active Active
- 2017-09-15 WO PCT/US2017/051924 patent/WO2018053362A1/en unknown
- 2017-09-15 ES ES17851671T patent/ES2903357T3/es active Active
- 2017-09-15 EP EP21193343.7A patent/EP3933039A1/en not_active Withdrawn
- 2017-09-15 EP EP17851671.2A patent/EP3512947B1/en active Active
- 2017-09-15 CN CN201780070128.7A patent/CN109937254B/zh active Active
- 2017-09-15 CA CA3037185A patent/CA3037185A1/en active Pending
- 2017-09-15 JP JP2019514776A patent/JP6997772B2/ja active Active
-
2020
- 2020-07-02 US US16/919,238 patent/US11795492B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3512947A4 (en) | 2020-05-06 |
US10704082B2 (en) | 2020-07-07 |
ES2903357T3 (es) | 2022-04-01 |
CA3037185A1 (en) | 2018-03-22 |
AU2017328950B2 (en) | 2023-09-14 |
WO2018053362A1 (en) | 2018-03-22 |
US11795492B2 (en) | 2023-10-24 |
US20180127806A1 (en) | 2018-05-10 |
EP3512947B1 (en) | 2021-10-20 |
CN109937254B (zh) | 2023-05-30 |
AU2017328950A1 (en) | 2019-05-02 |
JP6997772B2 (ja) | 2022-01-18 |
CN109937254A (zh) | 2019-06-25 |
EP3933039A1 (en) | 2022-01-05 |
US20210054435A1 (en) | 2021-02-25 |
EP3512947A1 (en) | 2019-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11795492B2 (en) | Methods of nucleic acid sample preparation | |
AU2017355460B2 (en) | Methods of nucleic acid sample preparation for immune repertoire sequencing | |
US11390905B2 (en) | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of DNA | |
JP7467118B2 (ja) | 核酸分子を同定するための組成物と方法 | |
JP2019531072A5 (ja) | ||
AU2011305445B2 (en) | Direct capture, amplification and sequencing of target DNA using immobilized primers | |
JP2019532629A5 (ja) | ||
US20120252686A1 (en) | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction | |
JP2017537657A (ja) | 標的配列の濃縮 | |
US20220282305A1 (en) | Methods of nucleic acid sample preparation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200915 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200915 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201209 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20201209 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20210121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210506 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20210506 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210712 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20210922 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211012 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211110 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211125 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6997772 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |