ES2903357T3 - Métodos de preparación de muestras de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de ácidos nucleicos para análisis, comprendiendo el método: (a) añadir uno o más nucleótidos a un extremo 3' de un ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en donde al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura; (b) ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario al que se ha añadido el nucleótido modificado por resto de captura para producir un producto de ligación, en donde una secuencia de uno o más nucleótidos en un extremo 3' del ácido nucleico adaptador es complementaria al uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a); (c) capturar el producto de ligación poniendo en contacto el producto de ligación con un componente de unión del nucleótido modificado por resto de captura; y (d) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de preparación de muestras de ácido nucleico

CAMPO TÉCNICO

La tecnología descrita en el presente documento se refiere a métodos y composiciones útiles en la preparación de moléculas de ácidos nucleicos para análisis.

ANTECEDENTES

El enriquecimiento de dianas antes de la secuenciación de nueva generación es más rentable que la secuenciación de genoma completo, exoma completo y transcriptoma completo y, por lo tanto, más práctico para una amplia implementación; tanto para aplicaciones de descubrimiento de la investigación como clínicas. Por ejemplo, la elevada profundidad de cobertura proporcionada por los enfoques de enriquecimiento de dianas permite un intervalo dinámico más amplio para el recuento de alelos (en la expresión génica y la evaluación del número de copias) y la detección de mutaciones de baja frecuencia, que es ventajoso para evaluar mutaciones somáticas en el cáncer. Los ejemplos de los actuales protocolos de enriquecimiento para la secuenciación de nueva generación incluyen ensayos de captura basados en hibridación (TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent) y ensayos basados en reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina; PCR en emulsión/digital, Raindance). Los enfoques basados en hibridación no solo capturan las secuencias elegidas cubiertas por las sondas de captura, sino también bases inespecíficas cercanas que consumen la capacidad de secuenciación. Además, estos métodos requieren relativamente mucho tiempo, son labo riosos y permiten un nivel de especificidad relativamente bajo.

El documento de patente WO 2012/024658 A2 (Integenx Inc.; Jovanovich Stevan B et al.) (2012) desvela un sistema de análisis integrado de "muestra a secuencia" para su uso en la preparación de bibliotecas de ADN.

El documento de patente US 2012/283145 A1 (Wang Yan) (2012) desvela métodos de preparación de bibliotecas de ADN de marcado doble a partir de ADN o ARN, usando oligonucleótidos de marcado doble.

SUMARIO

La invención en el presente documento es como se define por las reivindicaciones.

Los aspectos de la tecnología desvelada en el presente documento se refieren a métodos de preparación y a análisis de ácidos nucleicos. En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones útiles en la preparación de muestras de ácido nucleico para el análisis de secuencias (por ejemplo, usando secuenciación de nueva generación). Las técnicas descritas en el presente documento están relacionadas con los métodos de determinación de una secuencia de ácido nucleico. Los métodos y las composiciones descritas en el presente documento se refieren al enriquecimiento de ácidos nucleicos que comprenden una o más secuencias de nucleótidos diana antes de la secuenciación. En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de preparación de ácidos nucleicos (por ejemplo, para su uso en un análisis de secuenciación) que implican añadir uno o más nucleótidos modificados por restos de captura a un ácido nucleico. En algunas realizaciones, los métodos implican además ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico al que se ha añadido el nucleótido modificado por resto de captura para producir un producto de ligación. En algunas realizaciones, los métodos implican además capturar el producto de ligación poniendo en contacto el producto de ligación con un componente de unión de un resto de captura del nucleótido modificado por resto de captura. En algunas realizaciones, los métodos implican además amplificar el producto de ligación, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa u otro enfoque de amplificación adecuado. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de preparación de ácidos nucleicos que implican añadir uno o más nucleótidos a un extremo 3' de un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario) que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en el que al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura. La presencia del nucleótido modificado por resto de captura en el extremo 3' del ácido nucleico facilita el aislamiento, la purificación y/o el lavado del ácido nucleico, mientras que se evita la incorporación de nucleótidos modificados (por ejemplo, aleatoriamente) en todo el ácido nucleico. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para preparar ácidos nucleicos que implican la incorporación de uno o más nucleótidos en un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario) que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en la que al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura. El uno o más nucleótidos se puede incorporar usando un cebador (por ejemplo, un cebador de transcripción inversa). El uno o más nucleótidos se puede incorporar durante una etapa temprana de preparación de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, el uno o más nucleótidos se pueden incorporar durante la fragmentación, el cebado aleatorio, la síntesis de primera cadena, la síntesis de segunda cadena y/o la reparación de extremos.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de preparación de ácidos nucleicos para análisis, en los que los métodos implican: (a) añadir uno o más nucleótidos a un extremo 3' de un ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en donde al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura; (b) ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario al que se ha añadido el nucleótido modificado por resto de captura para producir un producto de ligación, en donde una secuencia de uno o más nucleótidos en un extremo 3' del ácido nucleico adaptador es complementaria al uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a); (c) capturar el producto de ligación poniendo en contacto el producto de ligación con un componente de unión de un resto de captura del nucleótido modificado por resto de captura; y (d) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador.

En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende combinar el ácido nucleico adaptador, el ácido nucleico bicatenario y una ligasa en condiciones en las que la ligasa liga el ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario. En algunas realizaciones, el ácido nucleico adaptador que se combina con el ácido nucleico bicatenario comprende una porción de dúplex y una secuencia protuberante. En algunas realizaciones, la secuencia protuberante comprende la secuencia de uno o más nucleótidos en el extremo 3' del ácido nucleico adaptador que es complementaria con el uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a).

En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende combinar el ácido nucleico adaptador, el ácido nucleico bicatenario y una ligasa en condiciones en las que la ligasa liga el ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario, en donde el ácido nucleico adaptador que se combina con el ácido nucleico bicatenario es monocatenario.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden además: (e) amplificar un producto de amplificación de la etapa (d) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana. En algunas realizaciones, el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana. En algunas realizaciones, el segundo cebador específico de diana comprende una cola en 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana. En algunas realizaciones, el método comprende además añadir un cebador adicional que comprende una porción en 3' que es idéntica a la cola en 5' del segundo cebador específico de diana.

En algunas realizaciones, el resto de captura es un resto de biotina. El resto de biotina puede comprender biotinatrietilenglicol, bis-biotina, biotina fotoescindible, destiobiotina, destiobiotina-trietilenglicol o azida de biotina.

En algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo y citosina, o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase de adenina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el resto de captura se liga covalentemente a la nucleobase de adenina o derivado de la misma en la posición 5, 6, 7 u 8. En algunas realizaciones, el resto de captura se liga covalentemente a la nucleobase de adenina en la posición 7. La posición 7 de la nucleobase de adenina puede ser un átomo de carbono.

El resto de biotina puede ligarse covalentemente a la nucleobase por un conector de cualquier longitud apropiada. En algunas realizaciones, el resto de biotina se liga covalentemente a la nucleobase, por ejemplo, por un conector de 5 a 20 átomos de longitud (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 átomos de longitud). En algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura es biotina-n-dNTP, en donde n es un número entero desde 5 hasta 20 que representa el número de átomos conectores entre un grupo carbonilo del resto de biotina y la posición de ligación en una nucleobase de NTP.

En algunas realizaciones, el componente de unión es estreptavidina. En algunas realizaciones, la estreptavidina está ligada a una perla paramagnética.

En algunas realizaciones, en la etapa (a), un nucleótido se añade al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario que comprende la secuencia de nucleótidos diana.

Los métodos pueden comprender además una purificación de ácidos nucleicos no específicos. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender además una purificación de la reacción o una etapa de lavado después de la etapa (b) y antes de la etapa (c). En algunas realizaciones, el método comprende además, después de la etapa (c) y antes de la etapa (d): i) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario, que comprende el nucleótido modificado por resto de captura, sobre un sustrato o superficie paramagnético (por ejemplo, una perla paramagnética de poliestireno); y ii) lavar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado. En algunas realizaciones, el método comprende además, después de la etapa (ii): iii) liberar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético. El ácido nucleico bicatenario inmovilizado puede ser liberado del sustrato o superficie paramagnético siendo puesto en contacto con un reactivo químico y/o aplicando calor. El reactivo químico puede ser una base o disolución básica. El reactivo químico puede comprender hidróxido sódico (NaOH). Se debe apreciar que, en algunos métodos desvelados en el presente documento, la puesta en contacto puede implicar mezclar dos disoluciones (por ejemplo, una disolución que comprende una base y una disolución que comprende un ácido nucleico inmovilizado lavado), añadir un sólido a una disolución, o añadir una disolución a un sólido. El ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado puede ser liberado del sustrato o superficie paramagnético poniendo en contacto con NaOH y calentando (por ejemplo, calentando hasta por encima de la temperatura ambiente, tal como una temperatura en un intervalo de 25 a 90 °C, 25 a 70 °C, 25 a 50 °C, 35 a 65 °C, 35 a 45 °C, 30 a 40 °C, 40 a 50 °C). En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado queda sobre el sustrato o superficie paramagnético, por ejemplo, para la posterior preparación para el análisis. En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado se libera del sustrato o superficie paramagnético antes de la posterior preparación para el análisis.

Los métodos desvelados en el presente documento pueden comprender además, antes de la etapa (a), 5' fosforilar el ácido nucleico bicatenario.

En algunas realizaciones, el método proporcionado en el presente documento comprenden además, antes de la etapa (a): i) preparar ADNc realizando una reacción de síntesis de primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ARN como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primear cadena aleatoriamente cebada como plantilla; y ii) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos. En algunas realizaciones, el método comprende además, después de la etapa ii): iii) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario, que comprende el nucleótido modificado por resto de captura, sobre un sustrato o superficie paramagnético; iv) lavar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado; y v) liberar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético. El sustrato o superficie paramagnético puede comprender un recubrimiento (por ejemplo, un recubrimiento de poliestireno). El ADNc también se puede preparar para análisis realizando síntesis de la primera cadena específicamente cebada del gen. La reparación de los extremos puede implicar hacer romos y/o fosforilar los extremos de ADN.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además, después de la etapa (e), (f) inmovilizar el producto de amplificación de la etapa (e) sobre un sustrato o superficie paramagnético; (g) lavar el producto de amplificación inmovilizado; y (h) liberar el producto de amplificación inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético. El método puede comprender además una o más etapas de lavado intermedias (por ejemplo, lavado de productos de amplificación entre cualquier etapa de los métodos descritos en el presente documento). Por ejemplo, el método puede comprender además una etapa de lavado después de la etapa (e) y antes de la etapa (f).

En algunas realizaciones, en la etapa (b), el ácido nucleico bicatenario se liga al ácido nucleico adaptador en presencia de un agente de amontonamiento. En algunas realizaciones, el agente de amontonamiento es polietilenglicol en una cantidad que representa del 5 % al 50 % de una mezcla de ligación. El ácido nucleico bicatenario puede ser de extremos romos. El ácido nucleico bicatenario puede comprender extremos protuberantes.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de preparación de ácidos nucleicos para su análisis, en los que los métodos implican: (a) preparar un ADNc realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ARN como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla, en donde la preparación de ARN comprende una secuencia de nucleótidos diana; (b) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos que comprende la secuencia de nucleótidos diana; (c) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos sobre un sustrato o superficie paramagnético; (d) lavar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos inmovilizado; (e) liberar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético; (f) añadir uno o más nucleótidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario de extremos romos liberado; (g) ligar un adaptador que comprende una porción de dúplex ligable y una secuencia protuberante al ácido nucleico producido en la etapa (f) para producir un producto de ligación, en donde la secuencia protuberante es complementaria al uno o más nucleótidos; (h) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador; (i) amplificar un producto de amplificación de la etapa (h) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana, en donde el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana; (j) inmovilizar el producto de amplificación de la etapa (i) en un sustrato o superficie paramagnético; (k) lavar el producto de amplificación inmovilizado; y (l) liberar el producto de amplificación inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético. En algunas realizaciones, la etapa (h) se realiza sin lavar el producto de ligación.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de preparación de ácidos nucleicos para análisis, en los que los métodos implican: (a) preparar un ADNc realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ácido nucleico como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla, en donde la preparación de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos diana; (b) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos que comprende la secuencia de nucleótidos diana; (c) lavar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos; (d) añadir uno o más nucleótidos al extremo 3' del ácido nucleico lavado en la etapa (c), opcionalmente en donde al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura; (e) lavar el ácido nucleico producido en la etapa (d); (f) ligar un ácido nucleico adaptador que comprende una porción de dúplex ligable y una secuencia protuberante al ácido nucleico lavado en la etapa (e) para producir un producto de ligación, en donde la secuencia protuberante es complementaria al uno o más nucleótidos; (g) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador; (h) amplificar un producto de amplificación de la etapa (g) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana, en donde el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana; y (j) lavar el producto de amplificación de la etapa (h).

Las etapas de lavado se pueden realizar usando una técnica de inmovilización reversible de fase sólida.

En algunos métodos desvelados en el presente documento, al menos uno del uno o más nucleótidos puede ser un nucleótido modificado por resto de captura, y el método comprende además, la siguiente etapa (f) y antes de la etapa (g), capturar el producto de ligación usando un componente de unión inmovilizado del resto de captura del nucleótido modificado por resto de captura; y limpiar el producto de ligación capturado. El resto de captura puede comprender un resto de biotina y el componente de unión puede comprender estreptavidina.

En algunas realizaciones, el segundo cebador adaptador está anidado con respecto al primer cebador adaptador. El segundo cebador adaptador se puede hibridar específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador.

Otras ventajas y características novedosas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de diversas realizaciones no limitantes de la invención cuando se consideran junto con las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las realizaciones no limitantes de la presente invención se describirán a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas, que son esquemáticas y no pretenden estar dibujadas a escala. En las figuras, cada componente idéntico o casi idéntico ilustrado se representa normalmente por un único número. Para fines de claridad, no todos los componentes están marcados en cada figura, ni cada componente de cada realización de la invención se muestra donde la ilustración no sea necesaria para permitir a los expertos habituales en la técnica entender la invención. En las figuras:

La FIG. 1 es una ilustración de un proceso que permite la captura de una biblioteca de ácidos nucleicos ligada por adaptador.

La FIG. 2 es una ilustración de un método de preparación de una muestra de ácido nucleico de alta fidelidad para análisis.

La FIG. 3 representa un proceso de generación de una muestra de ADNc bicatenario usando una cadena de ARN mensajero.

La FIG. 4 representa un proceso de generación de una muestra de ADNc bicatenario usando una cadena de ARN mensajero, donde el producto de ligación capturado se eluye de perlas magnéticas antes de la amplificación.

La FIG. 5 es una representación de una secuencia de trabajo para un método de preparación de una muestra de ácido nucleico de alta fidelidad para análisis.

La FIG. 6 es una representación por imagen de un gel que representa una muestra de biblioteca que se ha reparado en los extremos sin inactivación por polimerasa y una muestra de biblioteca que se ha reparado en los extremos tras la inactivación por calor de polimerasa.

La FIG. 7 es una representación por imagen de un gel que representa las eficiencias de ligación de adaptadores de muestras ligadas en ausencia o presencia de un agente de amontonamiento.

La FIG. 8A es un diagrama que ilustra los componentes que pueden comprender un ácido nucleico adaptador.

La FIG. 8B es un diagrama que ilustra los componentes que pueden comprender un segundo cebador específico de diana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Entre otros aspectos, la presente divulgación proporciona técnicas mejoradas relacionadas con la preparación de bibliotecas de muestras de ácidos nucleicos para análisis. Como se describe en el presente documento, un ácido nucleico adaptador se puede ligar a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diana. El uso de ácidos nucleicos adaptadores puede ser útil durante la preparación de bibliotecas y el análisis de secuenciación, por ejemplo, proporcionando sitios de unión del cebador y secuencias de códigos de barras moleculares o de índice. En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a mejoras en los procesos relacionados con la ligación del adaptador y el aislamiento de muestras ligadas al adaptador que mejoran sustancialmente la fidelidad del código de barras molecular.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere al reconocimiento de que, tras la ligación del adaptador, el remanente de adaptadores no ligados en las reacciones de PCR posteriores podría producir una superabundancia de códigos de barras moleculares. Esta superabundancia, o inflación, de códigos de barras moleculares puede producir positivos falsos, ya que una molécula solo debería contener un código de barras. Se aprecia que un adaptador no ligado puede, en algunos casos, cebar una región común en los fragmentos existentes durante la PCR. Durante múltiples ciclos de reacción, se pueden integrar copias adicionales de un código de barras u otra secuencia artificial en una única molécula. Por consiguiente, los inventores han reconocido y apreciado la necesidad de procesos mejorados referentes a la ligación de adaptadores y al aislamiento de fragmentos de bibliotecas ligados por adaptador.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de preparación de ácidos nucleicos para análisis, que comprende (a) añadir un nucleótido modificado por resto de captura a un extremo 3' de un ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, ADNc, ADNg), ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario que tiene el nucleótido modificado por resto de captura, y capturar el ácido nucleico ligado por adaptador con un componente de unión del nucleótido modificado por resto de captura.

En algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura es un nucleótido modificado por resto de biotina. Una representación general de este método se muestra en la FIG. 1, que proporciona un ejemplo no limitante de un método que implica un nucleótido modificado por resto de biotina. En este ejemplo, se proporciona una biblioteca de ácidos nucleicos bicatenarios fosforilados en 5' de extremos romos 102. Se añade ATP marcada con biotina 104 a los extremos 3' de los ácidos nucleicos bicatenarios para producir una biblioteca 106 que comprende nucleótidos modificados por resto de captura en los extremos 3' de los fragmentos. Los fragmentos de biblioteca se ligan con un adaptador 108 para producir una muestra 110 que tiene un adaptador no ligado junto con fragmentos de biblioteca ligados por adaptador. Los fragmentos de biblioteca ligados se capturan, o aíslan, de adaptadores no ligados usando una superficie recubierta con estreptavidina para generar una biblioteca 112 que minimiza o elimina la aparición de remanente de adaptador no ligado. Aunque este ejemplo utiliza un resto de biotina de captura, cualquier resto que sea capaz de ser específicamente elegido para el aislamiento (por ejemplo, por una interacción con un componente de unión) puede ser adecuado en las técnicas descritas en el presente documento.

Resto de captura

Los aspectos de las técnicas descritas en el presente documento se refieren al uso de un resto de captura para aislar una molécula de interés (por ejemplo, un ácido nucleico, un producto de ligación, etc.). Como se usa en el presente documento, un "resto de captura" se refiere a un resto que está configurado para interactuar selectivamente con un componente de unión con el fin de capturar (por ejemplo, aislar/purificar) la molécula de interés.

Un resto de captura y un componente de unión del resto de captura pueden comprender cualquier par de unión adecuado. Un par de unión puede interactuar selectivamente mediante enlace covalente o no covalente. Un par de unión puede interactuar selectivamente por hibridación, enlace iónico, enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals, o cualquier combinación de estas fuerzas. Un resto de captura y/o componente de unión puede comprender, por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, inosina, avidina, secuencias de GST, secuencias de GST modificadas, secuencias de reconocimiento de biotina ligasa (BiTag), marcas S, marcas de SNAP, sitios de enterocinasa, sitios de trombina, anticuerpos o dominios de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, antígenos, receptores, dominios de receptor, fragmentos de receptor, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, un resto de captura comprende un resto de biotina. En algunas realizaciones, las técnicas descritas en el presente documento son útiles en la preparación de muestras de ácido nucleico para análisis. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico puede comprender un resto de captura biotinilado. La molécula de ácido nucleico puede comprender al menos un nucleótido modificado por resto de captura que comprende un resto de biotina. El nucleótido modificado por resto de captura puede comprender la estructura general de la fórmula (I):

Como se muestra en la fórmula (I), un nucleótido modificado por resto de captura puede comprender un resto de biotina unido a una nucleobase de un nucleótido. Por ejemplo, el resto de biotina puede comprender biotinatrietilenglicol, bis-biotina, biotina fotoescindible, destiobiotina, destiobiotina-trietilenglicol o biotina-azida. Los ejemplos no limitantes de nucleótidos modificados por resto de captura se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Estructuras de ejemplo de nucleótidos modificados por resto de captura

Biotina-11-dGTP

Timidina Espaciador Biotina

En algunas realizaciones, un nucleótido modificado por resto de captura comprende un conector entre el resto de captura y una nucleobase del nucleótido. En algunas realizaciones, el resto de captura está ligado covalentemente a la nucleobase por un conector de cualquier longitud adecuada. En algunas realizaciones, el resto de captura está ligado covalentemente a la nucleobase por un conector de 5 a 20 átomos de longitud. El conector puede comprender una cadena alifática. Un conector puede comprender —(CH2)n—, en donde n es un número entero desde 1 hasta 20, ambos incluidos, o en donde n es un número entero desde 1 hasta 10, ambos incluidos. Un conector puede comprender una cadena heteroalifática. Un conector puede comprender un resto de polietilenglicol. Un conector puede comprender un resto de polipropilenglicol. Un conector puede comprender —(CH2CH2O)n—, en donde n es un número entero desde 1 hasta 20, ambos incluidos. Un conector puede comprender —(CH2CH2O)n—, en donde n es un número entero desde 1 hasta 10, ambos incluidos. Un conector puede comprender uno o más arilenos. Un conector puede comprender uno o más fenilenos (por ejemplo, fenileno sustituido en para). Un conector puede comprender un centro quiral. Un conector puede comprender uno o más fosfatos, una cadena alifática, una cadena heteroalifática y una o más amidas (por ejemplo, —C(=O)NH—).

En algunas realizaciones, un nucleótido modificado por resto de captura es biotina-n-dNTP, en donde n es un número entero desde 5 hasta 20 que representa el número de átomos conectores entre un grupo carbonilo del resto de biotina y la posición de ligación en una nucleobase de NTP.

En algunas realizaciones, un componente de unión está ligado a un soporte insoluble. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la molécula de interés se puede inmovilizar sobre un soporte insoluble mediante una interacción de unión selectiva formada entre un resto de captura y un componente de unión del resto de captura unido al soporte insoluble.

En algunas realizaciones, el soporte insoluble comprende una perla u otra superficie sólida. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la perla es una perla paramagnética. El uso de perlas para el aislamiento se conoce bien en la técnica, y se puede usar cualquier método de aislamiento por perlas adecuado con las técnicas descritas en el presente documento. Las perlas pueden ser útiles para el aislamiento en que las moléculas de interés se pueden ligar a las perlas, y las perlas se pueden lavar para retirar componentes de disolución no ligados a las perlas, lo que permite la purificación y el aislamiento. Las perlas se pueden separar de otros componentes en la disolución basándose en propiedades tales como el tamaño, la densidad, o propiedades dieléctricas, iónicas y magnéticas.

El soporte insoluble puede ser una perla magnética. El uso de perlas permite que el resto de captura de ácido nucleico derivatizado se separe de una mezcla de reacción por centrifugación o filtración, o, en el caso de perlas magnéticas, por aplicación de un campo magnético. Las perlas magnéticas se pueden introducir, mezclar, retirar y liberar en disolución usando campos magnéticos. Los procesos que utilizan perlas magnéticas pueden ser automatizados. Las perlas se pueden funcionalizar usando química bien conocida para proporcionar una superficie que tiene funcionalización adecuada para la unión de un componente de unión de un resto de captura. La derivatización de superficies para permitir la unión del resto de captura es convencional en la técnica. Por ejemplo, el recubrimiento de superficies con estreptavidina permite la unión de un resto de captura biotinilado. El recubrimiento de superficies con estreptavidina se ha descrito en, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5.374.524 de Miller. En algunas realizaciones, se pueden usar superficies sólidas distintas de perlas. Las superficies sólidas pueden ser superficies planas, tales como las usadas para las micromatrices de hibridación, o las superficies sólidas pueden ser el relleno de una columna de separación.

En algunas realizaciones, un componente de unión de un resto de captura se puede ligar a un soporte insoluble antes, simultáneamente con o después de la unión del resto de captura. Puede ser preferible poner en contacto un resto de captura con un componente de unión del resto de captura mientras que ambos estén en disolución. En dichos métodos, el complejo de resto de captura:componente de unión se puede inmovilizar a continuación sobre un soporte insoluble poniendo en contacto el complejo con una superficie apropiadamente derivatizada. Por lo tanto, la molécula de interés se puede aislar mediante un complejo formado entre un resto de captura ligado a la molécula de interés y un componente de unión del resto de captura.

En algunas realizaciones, se puede desear ligar el resto de captura a una nucleobase de un nucleótido. De este modo, el extremo 3' sigue libre para ser opcionalmente ligado a un ácido nucleico adaptador mientras que el resto de captura está disponible para ser capturado por un componente de unión. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo y citosina, o un derivado de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase de adenina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el resto de captura está ligado covalentemente a la nucleobase de adenina o derivado de la misma en la posición 5, 6, 7 u 8. En algunas realizaciones, el resto de captura está ligado covalentemente a la nucleobase de adenina en la posición 7. Un esquema de numeración para un anillo de adenina se representa en la fórmula (II):

Se puede desear modificar una o más posiciones en una nucleobase que está ligada a un resto de captura. Por ejemplo, la posición 7 de la nucleobase de adenina es un átomo de carbono. Sin embargo, se debe apreciar que cualquier átomo capaz de formar un enlace covalente adicional (por ejemplo, C, O, N, S, etc.) se pueden sustituir en una posición en una nucleobase adecuada para la ligación de un resto de captura. Tras la captura de los fragmentos ligados por adaptador, la biblioteca se puede someter a amplificación para enriquecer las secuencias de nucleótidos diana.

Preparación de ácidos nucleicos para análisis

Los aspectos de la divulgación proporcionan métodos mejorados de determinación de la secuencia de nucleótidos contigua a una secuencia de nucleótidos diana conocida. Los métodos de secuenciación tradicionales generan información de secuencia aleatoriamente (por ejemplo, secuenciación "aleatoria") o entre dos secuencias conocidas que se usan para diseñar cebadores. A diferencia, ciertos de los métodos descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, permiten la determinación de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, secuenciación) en la dirección 5' o en la dirección 3' de una única región de secuencia conocida con un elevado nivel de especificidad y sensibilidad.

La divulgación proporciona un método de enriquecimiento de secuencias de nucleótidos específicas antes de determinar la secuencia de nucleótidos usando una tecnología de secuenciación de nueva generación. Los métodos proporcionados en el presente documento se pueden referir a enriquecer muestras que comprenden ácido desoxirribonucleico (ADN). En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden: (a) añadir uno o más nucleótidos a un extremo 3' de un ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en donde al menos uno (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o más) de los uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura; (b) ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario al que se ha añadido el nucleótido modificado por resto de captura para producir un producto de ligación, en donde una secuencia de uno o más nucleótidos en un extremo 3' del ácido nucleico adaptador es complementaria al uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a); (c) capturar el producto de ligación poniendo en contacto el producto de ligación con un componente de unión de un resto de captura del nucleótido modificado por resto de captura; y (d) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador.

En algunas realizaciones, el método comprende además: (e) amplificar un producto de amplificación de la etapa (d) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana. Por ejemplo, la FIG. 2 representa un proceso no limitante 200 por el que puede proceder esta realización. El ácido nucleico bicatenario 202 que comprende una secuencia de nucleótidos diana se elonga añadiendo uno o más nucleótidos modificados por resto de captura 204 a los extremos 3' (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos modificados por resto de captura). El ácido nucleico marcado por resto de captura se liga con un adaptador 206 para generar un fragmento de biblioteca ligado por adaptador 208. El fragmento ligado por adaptador se aísla introduciendo un componente de unión del resto de captura, el primero de los cuales está ligado a un soporte magnético 210. La aplicación de un campo magnético 212 aisló ácidos nucleicos ligados por adaptador de adaptadores no ligados. El producto de ligación capturado se somete a una primera ronda de PCR usando un primer cebador específico de diana 214 que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador 216 que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador. De esta forma, el primer cebador adaptador 216 ceba la cadena generada por el primer cebador específico de diana 214. Se realiza una segunda ronda de PCR usando un segundo cebador específico de diana 218 y un segundo cebador adaptador 220. Como se muestra, el segundo cebador específico de diana 218 está anidado con respecto al primer cebador específico de diana 214. Como también se muestra, el segundo cebador específico de diana se elonga con una región 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana. De un modo similar a la primera ronda de PCR, el segundo cebador adaptador 220 ceba la cadena generada por el segundo cebador específico de diana 218. En esta segunda ronda de PCR, se incluye un cebador 222 adicional que contiene (i) una región 3' que es idéntica a al menos una porción de la región 5' elongada del segundo cebador específico de diana 218 y (ii) una región 5' que puede contener elementos útiles para la secuenciación, tales como secuencias de índice o de códigos de barras y sitios de unión del cebador. Después de que el segundo cebador adaptador 220 genere una hebra codificante a partir de la hebra complementaria generada por el segundo cebador específico de diana 218, el cebador 222 adicional ceba a continuación la secuencia ahora complementaria de la región elongada para generar el producto listo para secuenciación 224.

Las técnicas descritas en el presente documento permiten el enriquecimiento de secuencias de nucleótidos diana de una muestra de ácido nucleico. La muestra de ácido nucleico puede comprender ADN genómico. La muestra de ácido nucleico puede comprender ADNc. El ADNc se puede preparar realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla, en donde la preparación de ARN comprende una secuencia de nucleótidos diana. Se puede preparar una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos a partir de una preparación de ARN. Por ejemplo, la FIG.

3 representa genéricamente un proceso 300 por el que se prepara un fragmento de biblioteca de ácido nucleico bicatenario a partir de un ARN mensajero.

Como se muestra, un ARN mensajero 302 se hibrida con cebadores aleatorios 304 (por ejemplo, hexámeros aleatorios) en condiciones adecuadas para la hibridación. Tras el cebado aleatorio, se logra la síntesis la primera cadena de ADNc por extensión dependiente de plantilla usando una enzima transcriptasa inversa para generar un híbrido de ADN/ARN 306. La cadena de ARN del híbrido de ADN/ARN se escinde enzimática o químicamente. Los fragmentos de ARN resultantes 308 que quedan hibridados con la cadena de ADN 310 sirven de cebadores para la síntesis de la segunda cadena de ADNc por la acción de una polimerasa. La inactivación de la polimerasa tras la síntesis de la segunda cadena de ADNc puede ser conveniente, por ejemplo, para prevenir la actividad de exonucleasa 5 '^ 3 ' y/o 3 '^ 5 ' durante la reparación de extremos. Tras la síntesis de la segunda cadena de ADNc, el ADNc bicatenario 312 se somete a reparación de extremos para generar ADNc fosforilado en 5' de extremos romos 314. Se puede realizar purificación SPRI (por ejemplo, AMPure) tras la reparación de extremos. Ya que las etapas posteriores en el proceso pueden implicar añadir un nucleótido modificado por resto de captura a un extremo 3' del ácido nucleico, puede ser preferible retirar cualquier dNTP residual en la muestra. Por lo tanto, se prevé que cualquier método de purificación capaz de retirar dNTP de la disolución es adecuado en esta técnica. Se puede añadir y/o incorporar un nucleótido modificado por resto de captura en un ácido nucleico en una etapa de preparación previa de los ácidos nucleicos (por ejemplo, fragmentación, cebado aleatorio o específico, síntesis de la primera cadena, síntesis de la segunda cadena y/o reparación de extremos). Por lo tanto, se puede desear realizar una etapa de purificación que precede a la etapa de añadir y/o incorporar el nucleótido modificado por resto de captura.

El ADNc fosforilado en 5' de extremos romos 314 se elonga con un dATP marcado con biotina 316 (biotina-11 -ATP) que comprende un enlace tioato (por ejemplo, un enlace fosforotioato) en su extremo 3' y se somete a purificación SPRI antes de ser ligado con un ácido nucleico adaptador para generar un fragmento de biblioteca ligado por adaptador 318. Se mostró que la inclusión de un agente de amontonamiento (20 %) aumentaba la eficiencia de ligación del adaptador. El fragmento ligado por adaptador 318 se captura introduciendo un perla paramagnética recubierta con estreptavidina 320. Una vez se ha formado el complejo no covalente de biotina-estreptavidina, la aplicación de un campo magnético 322 captura los ácidos nucleicos ligados por adaptador para aislar el producto deseado de los adaptadores no ligados.

Como se muestra en la FIG. 3, el ácido nucleico ligado por adaptador capturado se puede someter a una primera ronda de PCR 324 en forma de un producto inmovilizado en perlas. Como se muestra en la FIG. 4, el ácido nucleico ligado por adaptador capturado se puede eluir de la perla paramagnética 320 antes de la primera ronda de PCR 324. La elución de los ácidos nucleicos ligados por adaptador capturados de las perlas se puede realizar, a modo de ejemplo y no limitación, usando un reactivo químico y/o calor. El reactivo químico puede ser una base (por ejemplo, NaOH). El ácido nucleico ligado por adaptador capturado se puede eluir con una baja concentración (por ejemplo, inferior a 1 M, inferior a 0,5 M, inferior a 0,1 M, inferior a 0,05 M, inferior a 0,01 M, inferior a 0,001 M, inferior a 0,0001 M) de NaOH. El ácido nucleico ligado por adaptador capturado se puede eluir con una baja concentración de NaOH y calor.

El ácido nucleico ligado por adaptador inmovilizado (por ejemplo, como en la FIG. 3) o eluido (por ejemplo, como en la FIG. 4) se somete a una primera ronda de PCR 324 usando un primer cebador específico de gen ("GSP1") que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador ("P5_1") que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador. De esta forma, P5_1 ceba la cadena generada por GSP1. Como se muestra, GSP1 (por ejemplo, un primer cebador específico de diana) se elonga con una región 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana. Una región de cola 5' puede prevenir los dímeros de cebadores, por ejemplo, teniendo un contenido de secuencia que minimiza la aparición de dímeros de cebadores. En algunas realizaciones, GSP1 no se elonga con la región elongada de 5'. Como se muestra aún más en la FIG. 3, se realiza una segunda ronda de PCR 326 usando un segundo cebador específico de gen ("GSP2") y un segundo cebador adaptador ("P5_2"). Como se muestra, GSP2 está anidado con respecto a GSP1. También como se muestra, GSP2 se elonga con una región 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana. De un modo similar a la primera ronda de PCR, P5_2 ceba la cadena generada por GSP2. En esta segunda ronda de PCR, se incluye un cebador adicional ("CEBADOR ÚNICO") que contiene (i) una región 3' que es idéntica a al menos una porción de la región 5' elongada de GSP2 y (ii) una región 5' que contiene elementos adicionales útiles para la secuenciación, tal como un sitio de unión de cebador de secuenciación y un índice de muestra. Después de que P5_2 genere una hebra codificante de la hebra complementaria generada por GSP2, el cebador adicional ceba entonces la secuencia ahora complementaria de la región elongada de GSP2 para generar el producto listo para secuenciación 328.

Purificación de muestras

Se pueden aislar ácidos nucleicos diana y/o productos de amplificación de los mismos de enzimas, cebadores, o componentes tampón antes y/o después de cualquier etapa apropiada de un método. Se puede usar cualquier método adecuado para aislar ácidos nucleicos. El aislamiento puede comprender purificación por inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). Los métodos para la purificación SPRI son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, purificación por PCR Agencourt AMPure XP (Cat N.° A63880, Beckman Coulter; Brea, CA). Las enzimas se pueden inactivar por tratamiento con calor. Los dNTP no marcados se pueden retirar por tratamiento enzimático.

Se pueden retirar cebadores no hibridados de una preparación de ácido nucleico usando métodos apropiados (por ejemplo, purificación, digestión, etc.). Se puede usar una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa I) para retirar cebadores de una preparación. Dichas nucleasas pueden ser inactivadas por calor después de la digestión del cebador. Una vez se inactivan las nucleasas, se puede añadir un conjunto adicional de cebadores junto con otros componentes apropiados (por ejemplo, enzimas, tampones) para realizar una reacción de amplificación adicional.

En algunas realizaciones, las etapas de los métodos proporcionados en el presente documento comprenden opcionalmente una etapa de purificación de muestras intermedia. En algunas realizaciones, una etapa de purificación de muestras comprende una etapa de lavado. En algunas realizaciones, una etapa de purificación de muestras comprende la purificación SPRI (por ejemplo, AMPure). Por ejemplo, un método de preparación de ácidos nucleicos para análisis puede comprender: (a) preparar un ADNc realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ARN como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla, en donde la preparación de ARN comprende una secuencia de nucleótidos diana; (b) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos que comprende la secuencia de nucleótidos diana; (c) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos sobre un sustrato o superficie paramagnético; (d) lavar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos inmovilizado; (e) liberar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético; (f) añadir uno o más nucleótidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario de extremos romos liberado; (g) ligar un adaptador que comprende una porción de dúplex ligable y una secuencia protuberante al ácido nucleico producido en la etapa (f) para producir un producto de ligación, en donde la secuencia protuberante es complementaria al uno o más nucleótidos; (h) sin lavar el producto de ligación, amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador; (i) amplificar un producto de amplificación de la etapa (h) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana, en donde el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana; (j) inmovilizar el producto de amplificación de la etapa (i) en un sustrato o superficie paramagnético; (k) lavar el producto de amplificación inmovilizado; y (l) liberar el producto de amplificación inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético.

En algunas realizaciones, las etapas de los métodos proporcionados en el presente documento comprenden opcionalmente añadir uno o más nucleótidos a un ácido nucleico, en donde al menos uno del uno o más nucleótidos comprende un resto de captura, y capturar el ácido nucleico por una interacción entre el resto de captura y un componente de unión del resto de captura. Por ejemplo, un método de preparación de ácidos nucleicos para análisis puede comprender: (a) preparar un ADNc realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ácido nucleico como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla, en donde la preparación de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos diana; (b) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos que comprende la secuencia de nucleótidos diana; (c) lavar el ácido nucleico bicatenario de extremos romos; (d) añadir uno o más nucleótidos al extremo 3' del ácido nucleico lavado en la etapa (c), opcionalmente en donde al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura; (e) lavar el ácido nucleico producido en la etapa (d); (f) ligar un ácido nucleico adaptador que comprende una porción de dúplex ligable y una secuencia protuberante al ácido nucleico lavado en la etapa (e) para producir un producto de ligación, en donde la secuencia protuberante es complementaria al uno o más nucleótidos; (g) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador; (h) amplificar un producto de amplificación de la etapa (g) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana, en donde el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana; y (j) lavar el producto de amplificación de la etapa (h).

Adaptador de ácidos nucleicos

Como se usa en el presente documento, el término "adaptador de ácidos nucleicos" o "adaptador" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se puede ligar a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diana para proporcionar uno o más elementos útiles durante la amplificación y/o secuenciación de la secuencia de nucleótidos diana. En algunas realizaciones, un adaptador es monocatenario. Un adaptador puede ser bicatenario. Un adaptador bicatenario puede comprender un primer extremo de dúplex ligable y un segundo extremo no apareado. Un adaptador puede comprender una cadena de amplificación y una cadena de bloqueo. La cadena de amplificación puede comprender una porción no apareada en 5' y una porción de dúplex en 3'. La cadena de amplificación puede comprender además un nucleótido protuberante en 3'. El nucleótido protuberante en 3' puede ser un nucleótido protuberante T en 3'. La cadena de amplificación puede comprender secuencias de nucleótidos idénticas a un primer y segundo adaptador de cebador. La cadena de bloqueo del adaptador puede comprender una porción 5' de dúplex y una porción 3' no extensible. La cadena de bloqueo puede comprender además una porción de 3' no apareada. Las porciones de dúplex de la cadena de amplificación y la cadena de bloqueo pueden ser sustancialmente complementarias y la porción de dúplex puede ser de longitud suficiente para permanecer en la forma de dúplex a la temperatura de ligación.

La porción de la cadena de amplificación que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a un primer y segundo cebador adaptador puede estar comprendida, al menos en parte, por la porción sin aparear de 5' de la cadena de amplificación.

El adaptador pueden tener una forma de "Y", es decir, el segundo extremo no apareado comprende una porción no apareada de 5' de una cadena de amplificación y una porción de 3' de una cadena de bloqueo. La porción no apareada de 3' de la cadena de bloqueo puede ser más corta, más larga o de longitud igual a la porción no apareada de 5' de la cadena de amplificación. La porción no apareada de 3' de la cadena de bloqueo puede ser más corta que la porción no apareada de 5' de la cadena de amplificación. Los adaptadores en forma de Y tienen la ventaja de que la porción no apareada de la cadena de bloqueo no experimentará extensión de 3' durante un régimen de PCR.

La cadena de bloqueo del adaptador puede comprender además una porción no apareada de 3' que no es sustancialmente complementaria a la porción no apareada de 5' de la cadena de amplificación, en donde la porción no apareada de 3' de la cadena de bloqueo no es sustancialmente complementaria ni sustancialmente idéntica a ninguno de los cebadores. La cadena de bloqueo puede comprender además una porción no apareada de 3' que no se hibrida específicamente con la porción no apareada de 5' de la cadena de amplificación a la temperatura de hibridación, en donde la porción no apareada de 3' de la cadena de bloqueo no se hibridará específicamente con ninguno de los cebadores o los complementos de los mismos a la temperatura de hibridación. Un ácido nucleico adaptador puede comprender, como mínimo, una secuencia de índice de muestra para la multiplexación. Sin embargo, el ácido nucleico adaptador puede comprender además un código de barras molecular aleatorio.

Amplificación

Los aspectos de la presente divulgación se refieren a técnicas que pueden comprender una o más rondas de amplificación. En algunas realizaciones, se realiza una primera ronda de amplificación usando un primer cebador específico de diana y un primer cebador adaptador.

Como se usa en el presente documento, un "primer cebador específico de diana" es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que se puede hibridar específicamente, en condiciones de hibridación adecuadas, con una secuencia de nucleótidos diana de un ácido nucleico de plantilla. Durante la amplificación, el primer cebador específico de diana genera una cadena que es complementaria a su plantilla, y esta hebra complementaria es capaz de ser hibridada con un primer cebador adaptador.

Como se usa en el presente documento, un "primer cebador adaptador" es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que se puede hibridar específicamente, en condiciones de hibridación adecuadas, con una secuencia complementaria de un ácido nucleico adaptador. Por lo tanto, como el primer cebador adaptador es idéntico a al menos una porción del adaptador, se hibrida con la hebra complementaria generada por el primer cebador específico de diana para permitir que avance la amplificación.

En algunas realizaciones, en el primer ciclo de amplificación por PCR de la primera etapa de amplificación, un primer cebador específico de diana puede hibridarse específicamente con una cadena no codificante de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diana. Dependiendo de la orientación con la que se diseñó el primer cebador específico de diana, se sintetizará una secuencia en la dirección 5' o en la dirección 3' de la secuencia de nucleótidos diana como una cadena complementaria a la cadena no codificante. Si, durante la fase de extensión de la PCR, el extremo 5' de una cadena no codificante termina en un adaptador ligado, el extremo 3' de la cadena complementaria recién sintetizada comprenderá una secuencia capaz de hibridarse con un primer cebador adaptador. En ciclos posteriores de amplificación por PCR, tanto el primer cebador específico de diana como el primer cebador adaptador serán capaces de hibridarse específicamente con las cadenas apropiadas de la secuencia de ácido nucleico diana y se puede amplificar la secuencia entre la secuencia diana de nucleótidos conocida y el adaptador. En algunas realizaciones, se realiza una segunda ronda de amplificación usando un segundo cebador específico de diana y un segundo cebador adaptador.

Como se usa en el presente documento, un "segundo cebador específico de diana" es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que se puede hibridar específicamente, en condiciones de hibridación adecuadas, con una porción de la secuencia de nucleótidos diana comprendida por el amplicón resultante de una etapa de amplificación precedente. Durante la amplificación, el segundo cebador específico de diana genera una cadena que es complementaria a su plantilla, y esta cadena complementaria es capaz de ser hibridada con un segundo cebador adaptador.

Como se usa en el presente documento, un "segundo cebador adaptador" es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse específicamente, en condiciones de hibridación adecuadas, con una secuencia complementaria de un ácido nucleico adaptador. Por lo tanto, como el primer cebador adaptador es idéntico a al menos una porción del adaptador, se hibrida con la hebra complementaria generada por el segundo cebador específico de diana para permitir que avance la amplificación.

En algunas realizaciones, un segundo cebador específico de diana está anidado con respecto a un primer cebador específico de diana. El uso de cebadores adaptadores anidados puede eliminar la posibilidad de producir amplicones finales que son amplificables (por ejemplo, durante la PCR de puente o PCR en emulsión), pero no se puede secuenciar, una situación que puede surgir durante los métodos semi-anidados. En otras situaciones, los enfoques semi-anidados usando un cebador idéntico a un cebador de secuenciación pueden producir un remanente de productos de amplificación no deseados desde la primera etapa de PCR hasta la segunda etapa de PCR y por último lugar daría lecturas de secuenciación artificiales. Un segundo cebador específico de diana puede estar anidado con respecto a un primer cebador específico de diana en al menos 1 nucleótido, por ejemplo, en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos. Un segundo cebador específico de diana puede estar anidado con respecto a un primer cebador específico de diana en aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 10 nucleótidos, en aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 15 nucleótidos, en aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 20 nucleótidos, o en aproximadamente 20 nucleótidos o más.

Entre otros aspectos, las técnicas descritas en el presente documento pueden implicar el uso de uno o más cebadores anidados. El uso de cebadores anidados puede reducir la unión no específica en productos de PCR debido a la amplificación de sitios de unión de cebador inesperados. Como se usa en el presente documento, el término "anidado" se usa para describir una relación de posición entre el sitio de hibridación de un cebador de un par de cebadores y el sitio de hibridación de otro cebador de otro par de cebadores. Por ejemplo, un segundo cebador puede estar anidado por 1,2, 3 o más nucleótidos con respecto a un primer cebador, lo que significa que se une a un sitio en la cadena no codificante que está cambiada en el marco en 1, 2, 3 o más nucleótidos.

En algunas realizaciones, un segundo cebador específico de diana comprende una porción en 3' que se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos diana y una cola en 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana. La cola en 5' puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a un segundo cebador de secuenciación. Múltiples cebadores (por ejemplo, uno o más cebadores específicos de diana y/o uno o más cebadores adaptadores) presentes en una reacción pueden comprender porciones idénticas de secuencia de cola en 5'.

Una cola en 5' puede ser una secuencia rica en GC. Una secuencia de cola en 5' puede comprender al menos 50 % de contenido de GC, al menos 55 % de contenido de GC, al menos 60 % de contenido de GC, al menos 65 % de contenido de GC, al menos 70 % de contenido de GC, al menos 75 % de contenido de GC, al menos 80 % de contenido de GC, o mayor contenido de GC. Una secuencia de cola en 5' puede comprender al menos 60 % de contenido de GC. Una secuencia de cola en 5' puede comprender al menos 65 % de contenido de GC.

En algunas realizaciones, una segunda ronda de amplificación incluye un segundo cebador específico de diana que comprende una cola en 5', un primer cebador adaptador y un cebador adicional. En algunas realizaciones, el cebador adicional comprende una porción en 3' que es idéntica a la cola en 5' del segundo cebador específico de diana. El cebador adicional puede comprender secuencias adicionales 5' con respecto a la secuencia de hibridación que pueden incluir secuencias de códigos de barras, de índice, adaptadoras, o sitios de cebador de secuenciación. El cebador adicional puede ser un cebador adaptador/de índice de secuenciación genérico.

El primer y segundo cebadores específicos de diana pueden ser sustancialmente complementarios a la misma cadena del ácido nucleico diana. Las porciones del primer y segundo cebadores específicos de diana que se hibridan específicamente con la secuencia diana conocida pueden comprender un total de al menos 20 bases únicas de la secuencia de nucleótidos diana conocida, por ejemplo, 20 o más bases únicas, 25 o más bases únicas, 30 o más bases únicas, 35 o más bases únicas, 40 o más bases únicas, o 50 o más bases únicas. En algunas realizaciones, las porciones del primer y segundo cebadores específicos de diana que se hibridan específicamente con la secuencia diana conocida pueden comprender un total de al menos 30 bases únicas de la secuencia de nucleótidos diana conocida.

El primer cebador adaptador puede comprender una secuencia de ácido nucleico idéntica a aproximadamente las 20 bases más hacia 5' de la cadena de amplificación del adaptador y el segundo cebador adaptador puede comprender una secuencia de ácido nucleico idéntica a aproximadamente 30 bases de la cadena de amplificación del adaptador, con una base en 5' que está al menos 1 nucleótido 3' del extremo 5' de la cadena de amplificación.

Un ácido nucleico ligado por adaptador (por ejemplo, un producto de ligación) puede ser mínimo. En dichos métodos, se puede usar un primer cebador adaptador que contiene una porción de la secuencia nucleica adaptadora en su extremo 3' y luego información importante de la secuenciación adicional en su extremo 5'. Se puede usar un segundo cebador adaptador que contiene, en su extremo 3', el extremo 5' del primer cebador adaptador. El segundo cebador adaptador también puede tener una secuencia de nucleótidos que permite la secuenciación en su extremo 5'. En dichos métodos, es posible producir, usando PCR, una biblioteca que es compatible con la secuenciación.

Cebadores

Lo cebadores (por ejemplo, el primer y segundo cebadores específicos de diana y el primer y segundo cebadores adaptadores) se pueden diseñar de forma que se hibriden específicamente con sus secuencias complementarias a una temperatura de hibridación de desde aproximadamente 61 hasta 72 °C, por ejemplo, desde aproximadamente 61 hasta 69 °C, desde aproximadamente 63 hasta 69 °C, desde aproximadamente 63 hasta 67 °C, desde aproximadamente 64 hasta 66 °C. Los cebadores se pueden diseñar de forma que se hibriden específicamente con sus secuencias complementarias a una temperatura de hibridación inferior a 72 °C. Los cebadores se pueden diseñar de forma que se hibriden específicamente con sus secuencias complementarias a una temperatura de hibridación inferior a 70 °C. Los cebadores se pueden diseñar de forma que se hibriden específicamente con sus secuencias complementarias a una temperatura de hibridación inferior a 68 °C. Los cebadores se pueden diseñar de forma que se hibriden específicamente con sus secuencias complementarias a una temperatura de hibridación de aproximadamente 65 °C. Los sistemas proporcionados en el presente documento se pueden configurar para alterar la temperatura del recipiente (por ejemplo, por ciclos entre diferentes intervalos de temperatura) para facilitar la hibridación de cebadores.

Las porciones de los cebadores específicos de diana que se hibridan específicamente con la secuencia de nucleótidos diana conocida pueden hibridarse específicamente a una temperatura de aproximadamente 61 a 72 °C, por ejemplo, desde aproximadamente 61 hasta 69 °C, desde aproximadamente 63 hasta 69 °C, desde aproximadamente 63 hasta 67 °C, desde aproximadamente 64 hasta 66 °C. Las porciones de los cebadores específicos de diana que se hibridan específicamente con la secuencia de nucleótidos diana conocida se pueden hibridar específicamente a una temperatura de aproximadamente 65 °C en un tampón de PCR.

Extensión, amplificación y PCR de ácidos nucleicos

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender un régimen o etapa de extensión. La extensión puede avanzar a partir de uno o más cebadores aleatorios hibridados, usando las moléculas de ácidos nucleicos con las que los cebadores se hibridan como plantillas. En el presente documento se describen etapas de extensión. Se pueden hibridar uno o más cebadores aleatorios con sustancialmente todos los ácidos nucleicos en una muestra, muchos de los cuales pueden no comprender una secuencia de nucleótidos diana. Por consiguiente, la extensión de cebadores aleatorios puede ocurrir debido a la hibridación con plantillas que no comprenden una secuencia de nucleótidos diana.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden implicar un régimen de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que implica uno o más ciclos de amplificación. Las etapas de amplificación de los métodos descritos en el presente documento pueden cada una comprender un régimen de amplificación por PCR, es decir, un conjunto de ciclos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se usa en el presente documento, el término "régimen de amplificación" se refiere a un proceso de amplificar específicamente (aumentar la abundancia de) un ácido nucleico de interés. En algunas realizaciones, la amplificación exponencial ocurre cuando los productos de una extensión por polimerasa previa sirven de plantillas para las sucesivas rondas de extensión. Un régimen de amplificación por PCR según los métodos desvelados en el presente documento puede comprender al menos uno, y en algunos casos al menos 5 o más ciclos iterativos. Cada ciclo iterativo comprende las etapas de: 1) separación de cadenas (por ejemplo, desnaturalización térmica); 2) hibridación de cebadores de oligonucleótidos con moléculas plantilla; y 3) extensión por polimerasa de ácido nucleico de los cebadores hibridados. Se debe apreciar que se puede usar cualquier condición y tiempos adecuados implicados en cada una de estas etapas. Las condiciones y los tiempos seleccionados pueden depender de la longitud, el contenido de secuencia, la temperatura de fusión, las características estructurales secundarias, u otros factores referentes a la plantilla y/o cebadores de ácido nucleico usados en la reacción. Un régimen de amplificación según los métodos descritos en el presente documento se puede realizar en un ciclador térmico, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender amplificación lineal. Por ejemplo, se pueden realizar etapas de amplificación realizadas usando cebadores anidados usando amplificación lineal. La amplificación se puede realizar usando amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). Por ejemplo, la amplificación puede comprender una reacción de NASBA mediada por T7.

Una reacción de extensión de ácido nucleico puede implicar el uso de una polimerasa de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, la expresión "polimerasa de ácido nucleico" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización dependiente de plantilla de trifosfatos nucleosídicos para formar productos de extensión de cebadores que son complementarios a la secuencia de ácido nucleico plantilla. Una enzima polimerasa de ácido nucleico inicia la síntesis en el extremo 3' de un cebador hibridado y avanza en la dirección hacia el extremo 5' de la plantilla. Se conocen en la técnica numerosas polimerasas de ácido nucleico y están comercialmente disponibles. Un grupo de polimerasas de ácido nucleico son termoestables, es decir, retienen la función después de someterse a temperaturas suficientes para desnaturalizar cadenas hibridadas de ácidos nucleicos complementarios, por ejemplo, 94 °C, o algunas veces superior. Un ejemplo no limitante del protocolo para la amplificación implica el uso de una polimerasa (por ejemplo, Phoenix Taq, VeraSeq) en las siguientes condiciones: 98 °C durante 30 s, seguido por 14-22 ciclos que comprenden fusión a 98 °C durante 10 s, seguido por hibridación a 68 °C durante 30 s, seguido por extensión a 72 °C durante 3 min, seguido por mantenimiento de la reacción a 4 °C. Sin embargo, se pueden usar otras condiciones de reacción apropiadas. Se pueden ajustar las temperaturas de hibridación/extensión para explicar las diferencias en la concentración de sales (por ejemplo, 3 °C superior a mayores concentraciones de sales). Ralentizando la tasa de rampa (por ejemplo, 1 °C/s, 0,5 °C/s, 0,28 °C/s, 0,1 °C/s o más lento), por ejemplo, desde 98 °C hasta 65 °C, se puede mejorar el rendimiento del cebador y la uniformidad de la cobertura en muestras altamente multiplexadas. Los sistemas proporcionados en el presente documento se pueden configurar para alterar la temperatura del recipiente (por ejemplo, por ciclado entre diferentes intervalos de temperatura, que tienen tasas de aumento o disminución de rampa controladas) para facilitar la amplificación.

Se puede usar una polimerasa de ácido nucleico en condiciones en las que la enzima realice una extensión dependiente de plantilla. La polimerasa de ácido nucleico puede ser la ADN polimerasa I, Taq polimerasa, Phoenix Taq polimerasa, Phusion polimerasa, T4 polimerasa, T7 polimerasa, fragmento de Klenow, Klenow exo-, phi29 polimerasa, transcriptasa inversa de AMV, transcriptasa inversa de M-MuLV, transcriptasa inversa del VIH-1, polimerasa VeraSeq ULtra, polimerasa VeraSeq HF 2.0, EnzScript, u otra polimerasa apropiada. Una polimerasa de ácido nucleico puede no ser una transcriptasa inversa. Una polimerasa de ácido nucleico puede actuar sobre un plantilla de ADN. La polimerasa de ácido nucleico puede actuar sobre un plantilla de ARN. Una reacción de extensión puede implicar la transcripción inversa realizada en un ARN para producir una molécula de ADN complementaria (actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN). Una transcriptasa inversa puede ser una polimerasa de ratón del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV), transcriptasa inversa de AMV, transcriptasa inversa de RSV, transcriptasa inversa del VIH-1, transcriptasa inversa del VIH-2, u otra transcriptasa inversa apropiada.

Una reacción de amplificación de ácido nucleico puede implicar ciclos que incluyen una etapa de separación de cadenas que implica, en general, calentar la mezcla de reacción. Como se usa en el presente documento, el término "separación de cadenas" o "separar las cadenas" significa el tratamiento de una muestra de ácido nucleico de forma que se separen moléculas bicatenarias complementarias en dos cadenas individuales disponibles para la hibridación con un cebador de oligonucleótidos. La separación de cadenas según los métodos descritos en el presente documento se puede lograr calentando la muestra de ácido nucleico por encima de su temperatura de fusión (Tm). Para una muestra que contiene moléculas de ácidos nucleicos en una preparación de reacción adecuada para una polimerasa de ácido nucleico, el calentar hasta 94 °C puede ser suficiente para lograr la separación de cadenas. Una preparación de reacción adecuada puede contener una o más sales (por ejemplo, KCl 1 a 100 mM, MgCl20,1 a 10 mM), al menos un agente de tamponamiento (por ejemplo, Tris-HCl 1 a 20 mM) y un vehículo (por ejemplo, 0,01 a 0,5 % de BSA). Un ejemplo no limitante de un tampón adecuado comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25 °C), MgCl2 0,5 a 3 mM y 0,1 % de BSA. Un ejemplo no limitante adicional de un tampón adecuado comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25 °C), MgCl2 0,5 a 5 mM (por ejemplo, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM) y 0,1 % de BSA.

En algunas realizaciones, una amplificación de ácido nucleico implica hibridar cebadores con plantillas de ácido nucleico que tienen cadenas características de un ácido nucleico diana. Una cadena de un ácido nucleico diana puede servir de ácido nucleico de plantilla. Como se usa en el presente documento, el término "hibridar" se refiere a la formación de uno o más pares de bases complementarias entre dos ácidos nucleicos. La hibridación implica dos cadenas de ácido nucleico complementarias o sustancialmente complementarias que se hibridan juntas. En el contexto de una reacción de extensión, la hibridación puede implicar la hibridación del cebador con una plantilla de manera que se forme un sustrato de extensión de cebador para una enzima polimerasa dependiente de plantilla. Las condiciones de hibridación (por ejemplo, entre un cebador y la plantilla de ácido nucleico) pueden variar basándose en la longitud y la secuencia de un cebador. Las condiciones de hibridación se basan en una Tm (por ejemplo, una Tm calculada) de un cebador. Una etapa de hibridación de un régimen de extensión puede implicar reducir la temperatura tras una etapa de separación de cadenas hasta una temperatura basada en la Tm (por ejemplo, una Tm calculada) para un cebador, durante un tiempo suficiente para permitir dicha hibridación. Se puede determinar una Tm usando cualquiera de varios algoritmos (por ejemplo, software de diseño de cebadores OLIGO™ (Molecular Biology Insights Inc. Colorado) y software de diseño de cebadores VENTRO NTI™ (Invitrogen, Inc. California) y programas disponibles en internet, que incluyen Primer3, Oligo Calculator y NetPrimer (Premier Biosoft; Palo Alto, CA; y libremente disponibles en la malla mundial (por ejemplo, en premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html)). La Tm de un cebador se puede calcular usando la siguiente fórmula, que es usada por el software NetPrimer y se describe con más detalle en Frieir, et al. PNAS 198683:9373-9377.

Tm = AH/(AS R * ln(C/4)) 16,6 log ([K+]/(l 0,7 [K+])) - 273,15

en donde: AH es la entalpia para la formación de la hélice; AS es la entropía para la formación de la hélice; R es la constante molar de los gases (1,987 cal/°C * mol); C es la concentración de ácidos nucleicos; y [K+] es la concentración de sales. Para la mayoría de los regímenes de amplificación, la temperatura de hibridación se selecciona para ser aproximadamente 5 °C por debajo de la Tm predicha, aunque se pueden usar temperaturas más próximas a Tm y superiores (por ejemplo, entre 1 °C y 5 °C por debajo de la Tm predicha o entre 1 °C y 5 °C por encima de la Tm predicha), como pueden ser, por ejemplo, temperaturas superiores a 5 °C por debajo de la Tm predicha (por ejemplo, 6 °C por debajo, 8 °C por debajo, 10 °C por debajo o menores). Cuanto más próxima sea la temperatura de hibridación a Tm, más específica puede ser la hibridación. El tiempo usado para la hibridación de cebadores durante una reacción de extensión (por ejemplo, dentro del contexto de un régimen de amplificación por PCR) se puede determinar basándose, al menos en parte, en el volumen de la reacción (por ejemplo, implicando mayores volúmenes tiempos más largos). El tiempo usado para la hibridación de cebadores durante una reacción de extensión (por ejemplo, dentro del contexto de un régimen de amplificación por PCR) se puede determinar basándose, al menos en parte, en las concentraciones de cebador y plantilla (por ejemplo, implicando mayores concentraciones relativas de cebador con respecto a plantilla menos tiempo que las concentraciones relativas más bajas). Dependiendo del volumen y la concentración relativa cebador/plantilla, las etapas de hibridación de cebador en una reacción de extensión (por ejemplo, dentro del contexto de un régimen de amplificación) pueden estar en el intervalo de 1 segundo a 5 minutos, 10 segundos a 2 minutos, o 30 segundos a 2 minutos. Como se usa en el presente documento, "hibridar sustancialmente" se refiere a un grado al que se forman pares de bases complementarias entre dos ácidos nucleicos que, cuando se usan en el contexto de un régimen de amplificación por PCR, es suficiente para producir un nivel detectable de un producto específicamente amplificado.

Como se usa en el presente documento, el término "extensión de polimerasa" se refiere a la adición dependiente de plantilla de al menos un nucleótido complementario, por una polimerasa de ácido nucleico, al extremo 3' de un cebador que se hibrida con la plantilla de ácido nucleico. La extensión de polimerasa puede añadir más de un nucleótido, por ejemplo, hasta y que incluye nucleótidos correspondientes a la longitud completa de la plantilla. Las condiciones para la extensión de polimerasa se pueden basar, al menos en parte, en la identidad de la polimerasa usada. La temperatura usada para la extensión de polimerasa se puede basar en las propiedades de actividad conocidas de la enzima. En algunos casos, en los que las temperaturas de hibridación están por debajo de las temperaturas óptimas para la enzima, puede ser aceptable usar una menor temperatura de extensión. Las enzimas pueden retener actividad al menos parcial por debajo de sus temperaturas de extensión óptimas. Se puede realizar una extensión de polimerasa (por ejemplo, realizada con polimerasas termoestables tales como Taq polimerasa y variantes de la misma) a 65 °C a 75 °C o 68 °C a 72 °C. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden implicar la extensión de polimerasa de cebadores que se hibridan con las plantillas de ácido nucleico en cada ciclo de un régimen de amplificación por PCR. Se puede realizar una extensión de polimerasa usando una polimerasa que tiene una actividad de desplazamiento de cadenas relativamente fuerte. Las polimerasas que tienen un fuerte desplazamiento de las cadenas pueden ser útiles para preparar ácidos nucleicos con el fin de detectar fusiones (por ejemplo, fusiones de 5').

Las polimerasas que tienen actividad de exonucleasa 5'—^ 3' (por ejemplo, Taq polimerasa) pueden ser útiles para producir fragmentos largos de bibliotecas.

Se puede realizar la extensión de cebadores en condiciones que permiten la extensión de cebadores de oligonucleótidos hibridados. Como se usa en el presente documento, el término "condiciones que permiten la extensión de un oligonucleótido hibridado de forma que se generen productos de extensión" se refiere al conjunto de condiciones (por ejemplo, temperatura, concentraciones de sal y cofactor, pH y concentración de enzima) en las que una polimerasa de ácido nucleico cataliza la extensión de cebadores. Dichas condiciones se pueden basar, al menos en parte, en la polimerasa de ácido nucleico que se usa. Una polimerasa puede realizar una reacción de extensión de cebadores en una preparación de reacción adecuada.

Una preparación de reacción adecuada puede contener una o más sales (por ejemplo, KCl 1 a 100 mM, MgCl20,1 a 10 mM), al menos un agente de tamponamiento (por ejemplo, Tris-HCl 1 a 20 mM), un vehículo (por ejemplo, 0,01 a 0,5 % de BSA) y uno o más NTP (por ejemplo, 10 a 200 pM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP). Un conjunto no limitante de condiciones es KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25 °C), MgCl2 0,5 a 3 mM, 200 pM de cada dNTP y 0,1 % de BSA a 72 °C, bajo las cuales una polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa) cataliza la extensión de cebadores.

Una preparación de reacción adecuada puede contener una o más sales (por ejemplo, KCl 1 a 100 mM, MgCl2 0,5 a 5 mM), al menos un agente de tamponamiento (por ejemplo, Tris-HCl 1 a 20 mM), un vehículo (por ejemplo, 0,01 a 0,5 % de BSA) y uno o más NTP (por ejemplo, 50 a 350 pM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP). Un conjunto no limitante de condiciones es KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25 °C), MgCl23 mM, 200 pM de cada dNTP y 0,1 % de BSA a 72 °C, bajo las cuales una polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa) cataliza la extensión de cebadores. Un conjunto no limitante adicional de condiciones es KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25 °C), MgCl2 3 mM, dATP 266 pM, dCTP 200 pM, dGTP 133 pM, dTTP 200 pM y 0,1 % de BSA a 72 °C, bajo las cuales una polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa) cataliza la extensión de cebadores.

Las condiciones para el inicio y la extensión pueden incluir la presencia de uno, dos, tres o cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósido diferentes (por ejemplo, seleccionados de dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y un agente inductor de la polimerización, tal como ADN polimerasa o transcriptasa inversa, en un tampón adecuado. Un "tampón" puede incluir disolventes (por ejemplo, disolventes acuosos) más cofactores y reactivos apropiados que afectan el pH, la fuerza iónica, etc. Los dos, tres o cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósido diferentes pueden estar presentes en concentraciones equimolares, o aproximadamente equimolares. Los dos, tres o cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósido diferentes pueden estar presentes en diferentes concentraciones, que se ha determinado experimentalmente que son adecuadas para una implementación particular de la tecnología.

La amplificación de ácidos nucleicos puede implicar hasta 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 o más rondas (ciclos) de amplificación. La amplificación de ácidos nucleicos puede comprender un conjunto de ciclos de un régimen de amplificación por PCR desde 5 ciclos hasta 20 ciclos de longitud. Una etapa de amplificación puede comprender un conjunto de ciclos de un régimen de amplificación por PCR desde 10 ciclos hasta 20 ciclos de longitud. Cada etapa de amplificación puede comprender un conjunto de ciclos de un régimen de amplificación por PCR desde 12 ciclos hasta 16 ciclos de longitud. Una temperatura de hibridación puede ser inferior a 70 °C. Una temperatura de hibridación puede ser inferior a 72 °C. Una temperatura de hibridación puede ser aproximadamente 65 °C. Una temperatura de hibridación puede ser desde aproximadamente 61 hasta aproximadamente 72 °C.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento se refieren a la realización de un régimen de amplificación por PCR con uno o más de los tipos de cebadores descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de hibridarse específicamente con una plantilla de ácido nucleico y proporcionar un extremo 3' que sirve de sustrato para una polimerasa dependiente de plantilla para producir un producto de extensión que es complementario a la plantilla. Un cebador puede ser monocatenario, de forma que el cebador y su complemento puedan hibridarse para formar dos cadenas. Los cebadores según los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de hibridación (por ejemplo, una secuencia que se hibrida con una plantilla de ácido nucleico) que es inferior o igual a 300 nucleótidos de longitud, por ejemplo, inferior o igual a 300, o 250, o 200, o 150, o 100, o 90, o 80, o 70, o 60, o 50, o 40, o 30 o menos, o 20 o menos, o 15 o menos, pero al menos 6 nucleótidos de longitud. Una secuencia de hibridación de un cebador puede tener 6 a 50 nucleótidos de longitud, 6 a 35 nucleótidos de longitud, 6 a 20 nucleótidos de longitud, 10 a 25 nucleótidos de longitud.

Se puede usar cualquier método adecuado para sintetizar oligonucleótidos y cebadores. Las fuentes comerciales ofrecen servicios de síntesis de oligonucleótidos adecuados para proporcionar cebadores para su uso en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento (por ejemplo, oligonucleótidos de ADN a medida de INVITROGEN™ (Life Technologies, Grand Island, NY) u oligonucleótidos de ADN a medida de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)).

Ácido nucleico diana

Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico diana" y "ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diana" se refieren a una molécula de ácido nucleico de interés (por ejemplo, un ácido nucleico que se va a preparar para análisis). Un ácido nucleico diana puede comprender tanto una secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos conocida o predeterminada) como una secuencia de nucleótidos adyacente que se va a determinar (que se puede denominar una secuencia desconocida). Un ácido nucleico diana puede ser de cualquier longitud apropiada. Un ácido nucleico diana puede ser bicatenario. Un ácido nucleico diana puede ser ADN. Un ácido nucleico diana puede comprender ADN genómico (ADNg) o cromosómico. Un ácido nucleico diana puede comprender ADN complementario (ADNc). Un ácido nucleico diana puede ser monocatenario. Un ácido nucleico diana puede comprender ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ADNcl, ARNcl, ARN largo no codificante, microARN).

Muchos de los métodos de secuenciación adecuados para su uso en los métodos descritos en el presente documento proporcionan series de secuenciación con longitudes de lectura óptimas de decenas de cientos de bases nucleotídicas (por ejemplo, la tecnología Ion Torrent puede producir longitudes de lectura de 200-400 pb). Los ácidos nucleicos diana comprendidos, por ejemplo, por ADN genómico o ARNm, pueden estar comprendidos por moléculas de ácidos nucleicos que son sustancialmente más largas que esta longitud de lectura óptima. Con el fin de que la porción de ácido nucleico amplificado resultante de la segunda etapa de amplificación sea de una longitud adecuada (por ejemplo, hasta 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 1 kb, 2 kb) para su uso en una tecnología de secuenciación particular, la distancia promedio entre la secuencia de nucleótidos diana conocida y un extremo del ácido nucleico diana al que se puede ligar el adaptador debe ser tan próxima como sea posible a la longitud de lectura óptima de la tecnología seleccionada. Por ejemplo, si la longitud de lectura óptima de una tecnología de secuenciación dada es 200 pb, entonces las moléculas de ácidos nucleicos amplificadas según los métodos descritos en el presente documento deben tener una longitud promedio de aproximadamente 400 pb o menos. Sin embargo, se debe apreciar que las técnicas descritas en el presente documento se pueden implementar cuando las moléculas de ácidos nucleicos superen los 400 pb de longitud. Por ejemplo, los fragmentos de ácido nucleico pueden ser de aproximadamente 400 o más nucleótidos, 500 o más nucleótidos, 600 o más nucleótidos, 700 o más nucleótidos, 800 o más nucleótidos, 900 o más nucleótidos, 1000 o más nucleótidos, 1500 o más nucleótidos, 2000 o más nucleótidos, 2500 o más nucleótidos, 3000 o más nucleótidos, 4000 o más nucleótidos, 5000 o más nucleótidos, 10000 o más nucleótidos.

Los ácidos nucleicos diana comprendidos por, por ejemplo, ADN genómico o ARNm, pueden ser cizallados, por ejemplo, cizallados mecánicamente o enzimáticamente, para generar fragmentos de cualquier tamaño deseado. Los ejemplos no limitantes de procesos de cizallamiento mecánico incluyen sonicación, nebulización y tecnología de cizallamiento AFA™ disponible de Covaris (Woburn, MA). Un ácido nucleico diana que comprendido por el ADN genómico puede ser mecánicamente cizallado por sonicación.

Cuando el ácido nucleico diana está comprendido por el ARN, la muestra se puede someter a un régimen de transcriptasa inversa para generar una plantilla de ADN. Entonces se puede cizallar la plantilla de ADN. En algunos casos, la plantilla de ADN no se cizalla. Por ejemplo, la concentración de cebadores usada durante un régimen de transcriptasa inversa se puede ajustar de forma que el producto ADNc sea de una longitud "fragmentada" apropiada. El ARN diana puede ser cizallado antes de realizar el régimen de transcriptasa inversa. Se puede usar una muestra que comprende ARN diana en los métodos descritos en el presente documento usando ácidos nucleicos totales extraídos de o bien especímenes recién recogidos o degradados; sin la necesidad de retirada de ADN genómico para la secuenciación de ADNc; sin la necesidad de la reducción de ARN ribosómico para la secuenciación de ADNc; sin la necesidad de cizallamiento mecánico o enzimático en cualquiera de las etapas; sometiendo el ARN para la síntesis de ADNc bicatenario usando hexámeros aleatorios; y sometiendo el ácido nucleico a reparación de extremos, fosforilación y adenilación.

Una secuencia de nucleótidos diana puede comprender una reordenación génica. Los métodos descritos en el presente documento son aptos para determinar la presencia y/o identidad de una reordenación génica, ya que la identidad de solo la mitad de la reordenación génica debe ser previamente conocida (es decir, la mitad de la reordenación génica que va a ser elegida por los cebadores específicos de genes). La reordenación génica puede comprender un oncogén. La reordenación génica puede comprender un oncogén de fusión. La reordenación génica puede comprender un producto de recombinación de V(D)J.

Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de nucleótidos diana conocida" o "secuencia de nucleótidos diana" se refiere a una porción de un ácido nucleico diana de la que se conoce la secuencia (por ejemplo, la identidad y el orden de las bases nucleotídicas del ácido nucleico). Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos diana es una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que se conoce o que ha sido determinada de antemano de una consulta de una secuencia del ácido nucleico desconocida adyacente. Una secuencia de nucleótidos diana conocida puede ser de cualquier longitud apropiada.

Una secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos diana conocida) puede tener una longitud de 10 o más nucleótidos, 30 o más nucleótidos, 40 o más nucleótidos, 50 o más nucleótidos, 100 o más nucleótidos, 200 o más nucleótidos, 300 o más nucleótidos, 400 o más nucleótidos, 500 o más nucleótidos, 600 o más nucleótidos, 700 o más nucleótidos, 800 o más nucleótidos, 900 o más nucleótidos, 1000 o más nucleótidos, 1500 o más nucleótidos, 2000 o más nucleótidos, 2500 o más nucleótidos, 3000 o más nucleótidos, 4000 o más nucleótidos, 5000 o más nucleótidos, 10000 o más nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos diana conocida) puede tener una longitud en el intervalo de 10 a 100 nucleótidos, 10 a 500 nucleótidos, 10 a 1000 nucleótidos, 100 a 500 nucleótidos, 100 a 1000 nucleótidos, 500 a 1000 nucleótidos, 500 a 5000 nucleótidos.

Se proporcionan métodos en el presente documento para determinar las secuencias de porciones contiguas (o adyacentes) de un ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de nucleótidos contigua a" se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico diana) que está inmediatamente en la dirección 5' o en la dirección 3' de otra secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos conocida). Una secuencia de nucleótidos contigua a una secuencia de nucleótidos diana conocida puede ser de cualquier longitud apropiada. Una secuencia de nucleótidos contigua a una secuencia de nucleótidos diana conocida puede comprender 1 kb o menos de secuencia de nucleótidos, por ejemplo, 1 kb o menos de secuencia de nucleótidos, 750 pb o menos de secuencia de nucleótidos, 500 pb o menos de secuencia de nucleótidos, 400 pb o menos de secuencia de nucleótidos, 300 pb o menos de secuencia de nucleótidos, 200 pb o menos de secuencia de nucleótidos, 100 pb o menos de secuencia de nucleótidos. En algunos casos en los que una muestra comprende diferentes ácidos nucleicos diana que comprenden una secuencia de nucleótidos diana conocida (por ejemplo, una célula en la que una secuencia de nucleótidos diana conocida ocurre múltiples veces en su genoma, o en cromosomas separados no idénticos), puede haber múltiples secuencias que comprenden "una secuencia de nucleótidos contigua a" la secuencia de nucleótidos diana conocida. Como se usa en el presente documento, el término "determinar una (o la) secuencia de nucleótidos" se refiere a determinar la identidad y posiciones relativas de las bases nucleotídicas de un ácido nucleico.

Un ácido nucleico diana conocido puede contener una secuencia de fusión resultante de una reordenación génica. Los métodos descritos en el presente documento pueden ser aptos para determinar la presencia y/o identidad de una reordenación génica. La identidad de una porción de una reordenación génica puede ser previamente conocida (por ejemplo, la porción de una reordenación génica que va a ser elegida por los cebadores específicos de gen) y la secuencia de la otra porción se puede determinar usando los métodos desvelados en el presente documento. Una reordenación génica puede implicar un oncogén. Una reordenación génica puede comprender un oncogén de fusión.

Códigos de barras moleculares y secuencias de índice

Los cebadores y/o adaptadores pueden contener secuencias adicionales, tales como una secuencia identificadora (por ejemplo, un código de barras, un índice), secuencias de hibridación de cebadores de secuenciación (por ejemplo, Rd1) y secuencias adaptadoras. Las secuencias adaptadoras pueden ser secuencias usadas con un sistema de secuenciación de nueva generación. Las secuencias adaptadoras pueden ser secuencias P5 y P7 para la tecnología de secuenciación basada en Illumina. La secuencia adaptadora puede ser P1 y A compatible con la tecnología de secuenciación de Ion Torrent.

Como se usa en el presente documento, se pueden usar indistintamente "código de barras", "código de barras molecular" y "marca de código de barras molecular " y, en general, se refieren a una región de un ácido nucleico adaptador que es útil como identificador para el ácido nucleico específico al que se liga. Un código de barras molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico aleatorizada que proporciona un identificador único para el ácido nucleico al que se liga. Se puede usar un código de barras molecular para identificar fragmentos únicos y "desduplicar" las lecturas de secuenciación de una muestra. Se puede usar un código de barras molecular para identificar y retirar duplicados de PCR. Un código de barras molecular puede ser de 2 a 25 nucleótidos de longitud, 2 a 15 nucleótidos de longitud, 2 a 10 nucleótidos de longitud, 2 a 6 nucleótidos de longitud. Un código de barras molecular puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o al menos 25 nucleótidos. Un código de barras molecular puede comprender 8 nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, "índice", "secuencia de índice", "región de índice" e "índice de muestra" se pueden usar indistintamente y se refieren, en general, a una región de un ácido nucleico adaptador que es útil como identificador para la población a la que pertenece el ácido nucleico ligado. Un índice puede comprender una secuencia de ácido nucleico ligada que se puede usar para identificar un conjunto de secuencias que pertenecen a una biblioteca común. Por ejemplo, se puede usar un índice para identificar una muestra que corresponde a un ácido nucleico. Se puede usar un índice, por ejemplo, como identificador de fuente, identificador de localización, identificador de fecha o de hora (por ejemplo, fecha u hora del muestreo o procesamiento), u otro identificador de un ácido nucleico referente a una propiedad compartida o común (por ejemplo, común entre otros ácidos nucleicos de una biblioteca). Dichas secuencias de índice son útiles para identificar diferentes aspectos de un ácido nucleico que están presentes en una población de ácidos nucleicos. Las secuencias de índice pueden proporcionar un localizador de fuente o localización para un ácido nucleico diana. Por ejemplo, una secuencia de índice puede servir para identificar un paciente del que se obtiene un ácido nucleico. Las secuencias de índice pueden permitir la secuenciación de múltiples muestras diferentes en una reacción única (por ejemplo, realizada en una única celda de flujo). Se puede usar una secuencia de índice para orientar un aparato de obtención de secuencias para los fines de detectar reacciones de secuenciación individuales. Una secuencia de índice puede ser de 2 a 25 nucleótidos de longitud, 2 a 15 nucleótidos de longitud, 2 a 10 nucleótidos de longitud, 2 a 6 nucleótidos de longitud. Un índice puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o al menos 25 nucleótidos.

Cuando se usa una población de cebadores aleatorios elongados según los métodos descritos en el presente documento, pueden estar presentes múltiples productos de amplificación distinguibles después de la amplificación.

Debido a que los cebadores aleatorios elongados se hibridan en diversas posiciones en las moléculas de ácido nucleico de una muestra, un conjunto de cebadores específicos de diana pueden hibridar (y amplificar) los productos de extensión creados por más de 1 acontecimiento de hibridación, por ejemplo, un cebador aleatorio elongado se puede hibridar en una primera distancia (por ejemplo, 100 nucleótidos) de un sitio de hibridación de cebador específico de diana, y otro cebador aleatorio elongado se puede hibridar en una segunda distancia (por ejemplo, 200 nucleótidos) de un sitio de hibridación de cebador específico de diana, por lo que se producen dos productos de amplificación (por ejemplo, un primer producto de amplificación que comprende aproximadamente 100 pb y un segundo producto de amplificación que comprende aproximadamente 200 pb). Cada uno de estos productos de amplificación múltiple se puede secuenciar usando tecnología de secuenciación de nueva generación. La secuenciación de estos múltiples productos de amplificación puede ser ventajosa debido a que proporciona múltiples lecturas de secuencias de solapamiento que se pueden comparar entre sí para detectar errores de secuencia introducidos durante los procesos de amplificación o secuenciación. Los productos de amplificación individuales (por ejemplo, derivados de una única molécula) se pueden alinear y donde se diferencien en la secuencia presente en una base particular, puede estar presente un artefacto o error de PCR y/o secuenciación.

Cizallamiento/fragmentación de ADN

Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden ser cizalladas (por ejemplo, cizalladas mecánicamente o enzimáticamente, cizalladas por nebulizador) para generar fragmentos de cualquier tamaño deseado. Los ejemplos no limitantes de procesos de cizallamiento mecánico incluyen sonicación, nebulización y tecnología de cizallamiento AFA™ disponible de Covaris (Woburn, MA). Un ácido nucleico puede ser mecánicamente cizallado por sonicación. Un ácido nucleico diana puede ser no cizallado ni digerido. Los productos de ácido nucleico de etapas preparativas (por ejemplo, productos de extensión, productos de amplificación) pueden ser no cizallados ni digeridos enzimáticamente.

Cuando una secuencia de nucleótidos diana comprende ARN, la muestra se puede someter a un régimen de transcriptasa inversa para generar una plantilla de ADN y entonces se puede cizallar la plantilla de ADN. El ARN diana puede ser cizallado antes de realizar un régimen de transcriptasa inversa. Se puede usar una muestra que comprende ARN diana en los métodos descritos en el presente documento usando ácidos nucleicos totales extraídos de o bien especímenes recién recogidos o degradados; sin la necesidad de retirada de ADN genómico para la secuenciación de ADNc; sin la necesidad de reducción de ARN ribosómico para la secuenciación de ADNc; sin la necesidad de cizallamiento mecánico o enzimático en cualquiera de las etapas; sometiendo el ARN para la síntesis de ADNc bicatenario usando hexámeros aleatorios.

Secuenciación

En algunos aspectos, la tecnología descrita en el presente documento se refiere a métodos de enriquecimiento de muestras de ácido nucleico para la secuenciación de oligonucleótidos. La secuenciación se puede realizar por un método de secuenciación de nueva generación. Como se usa en el presente documento, "secuenciación de nueva generación" se refiere a las tecnologías de secuenciación de oligonucleótidos que tienen la capacidad de secuenciar oligonucleótidos a velocidades por encima de las posibles con los métodos de secuenciación convencionales (por ejemplo, secuenciación de Sanger), debido a la realización y a la lectura de miles a millones de reacciones de secuenciación en paralelo. Los ejemplos no limitantes de métodos/plataformas de secuenciación de nueva generación incluyen secuenciación masiva paralela de distintivos (Lynx Therapeutics); pirosecuenciación 454 (454 Life Sciences/ Roche Diagnostics); secuenciación por colorante-terminador reversible en fase sólida (Solexa/Illumina); tecnología sólida (Applied Biosystems); secuenciación semiconductora de Ion (ION Torrent); secuenciación de nanobolas de ADN (Complete Genomics); y tecnologías disponibles de Pacific Biosciences, Intelligen Bio-systems y Oxford Nanopore Technologies. Los cebadores de secuenciación pueden comprender porciones compatibles con el método de secuenciación de nueva generación seleccionado. Las tecnologías de secuenciación de nueva generación y las limitaciones y los parámetros de diseño de los cebadores de secuenciación asociados son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Shendure, et al., "Next-generation DNA sequencing," Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145; Mardis, "The impact of next-generation sequencing technology on genetics", Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141; Su, et al., "Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics" Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11 (3):333-43; Zhang et al., "The impact of next-generation sequencing on genomics", J Genet Genomics, 2011,38(3):95-109; (Nyren, P. et al. Anal Biochem 208: 17175 (1993); Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545-52 (2006); Strausberg, R. L., et al. Drug Disc Today 13:569-77 (2008); patente de EE. UU. N.° 7.282.337; patente de EE. UU. N.° 7.279.563; patente de EE. UU. N.° 7.226.720; patente de EE. UU. N.° 7.220.549; patente de EE. UU. N.° 7.169.560; patente de EE. UU. N.° 6.818.395; patente de EE. UU. N.° 6.911.345; publicaciones de EE. UU. N° 2006/0252077; 2007/0070349; y 20070070349).

La etapa de secuenciación se puede basar en el uso de un primer y segundo cebadores de secuenciación. El primer y segundo cebadores de secuenciación se pueden seleccionar para ser compatibles con un método de secuenciación de nueva generación como se describe en el presente documento.

Los métodos de alineación de lecturas de secuenciación con bases de datos de secuencias conocidas de secuencias genómicas y/o de ADNc se conocen bien en la técnica, y hay software comercialmente disponible para este proceso. Las lecturas (menos la secuencia de cebador de secuenciación y/o de nucleótidos adaptadora) que no se cartografían, en su totalidad, con bases de datos de secuencias no mutantes pueden ser reordenaciones genómicas o mutaciones de indeles grandes. Las lecturas (menos la secuencia de cebador de secuenciación y/o de nucleótidos adaptadora) que comprenden secuencias que se cartografían con múltiples localizaciones en el genoma pueden ser reordenaciones genómicas. Se puede construir y utilizar un ensamblaje de novo de lecturas que se solapan en secuencias contiguas, o "cóntigos", en el alineamiento de lecturas de secuenciación. Se puede utilizar una referencia de punto caliente que no se basa en una base de datos genómica públicamente accesible.

Muestras

Un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico diana, ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diana) puede estar presente en una muestra apropiada u obtenerse a partir de ella (por ejemplo, una muestra de comida, muestra medioambiental, muestra biológica, por ejemplo, muestra de sangre, etc.). El ácido nucleico diana puede ser una muestra biológica obtenida de un sujeto. Una muestra puede ser una muestra de diagnóstico obtenida de un sujeto. Una muestra puede comprender además proteínas, células, líquidos, líquidos biológicos, conservantes y/u otras sustancias. A modo de ejemplo no limitante, una muestra puede ser un hisopado de mejilla, sangre, suero, plasma, esputo, líquido cefalorraquídeo, orina, lágrimas, aislados alveolares, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido quístico, tejido tumoral, tejido, una biopsia, saliva, un aspirado o combinaciones de los mismos. Una muestra se puede obtener por resección o biopsia.

La muestra se puede obtener de un sujeto en necesidad de tratamiento para una enfermedad asociada a una alteración genética, por ejemplo, cáncer o una enfermedad hereditaria. Una secuencia diana conocida puede estar presente en un gen asociado a enfermedad.

Se puede obtener una muestra de un sujeto en necesidad de un tratamiento para el cáncer. La muestra puede comprender una población de células tumorales, por ejemplo, al menos una célula tumoral. La muestra puede comprender una biopsia tumoral, que incluye, pero no se limita a, tejido de biopsia no tratado o tejido de biopsia tratado (por ejemplo, tejido de biopsia fijado en formol y/o incorporado en parafina).

La muestra puede ser recién recogida. La muestra se puede almacenar antes de ser usada en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. La muestra puede ser una muestra no tratada. Como se usa en el presente documento, "muestra no tratada" se refiere a una muestra biológica que no ha tenido ningún pretratamiento de muestra previo, excepto dilución y/o suspensión en una disolución. Se puede obtener una muestra de un sujeto y conservar o procesar antes de ser utilizada en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. A modo de ejemplo no limitante, una muestra se puede incorporar en cera de parafina, refrigerar o congelar. Una muestra congelada se puede descongelar antes determinar la presencia de un ácido nucleico según los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. La muestra puede ser una muestra procesada o tratada. A modo de ejemplo, los métodos de tratamiento o procesamiento de una muestra incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, sonicación, homogenización, calentamiento, congelación y descongelación, poner en contacto con un conservante (por ejemplo, anticoagulante o inhibidor de nucleasas) y cualquier combinación de los mismos. Una muestra se puede tratar con un reactivo químico y/o biológico. Se pueden emplear reactivos químicos y/o biológicos para proteger y/o mantener la estabilidad de la muestra o el ácido nucleico comprendido por la muestra durante el procesamiento y/o el almacenamiento. Además, o alternativamente, se pueden emplear reactivos químicos y/o biológicos para liberar los ácidos nucleicos de otros componentes de la muestra. A modo de ejemplo no limitante, una muestra de sangre se puede tratar con un anticoagulante antes de ser utilizada en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. Se pueden usar métodos y procesos adecuados para procesar, conservar o tratar muestras para el análisis de ácidos nucleicos en el método desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, una muestra puede ser una muestra de líquido clarificado. Una muestra puede ser clarificada por centrifugación a baja velocidad (por ejemplo, 3.000 x g o menos) y recogida del sobrenadante que comprende la muestra de líquido clarificado.

Un ácido nucleico presente en una muestra se puede aislar, enriquecer o purificar antes de ser utilizada en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. Se pueden usar métodos adecuados de aislamiento, enriquecimiento o purificación de ácidos nucleicos de una muestra. Por ejemplo, están comercialmente disponibles kits para el aislamiento de ADN genómico de diversos tipos de muestras (por ejemplo, N.° de catálogo 51104, 51304, 56504 y 56404; Qiagen; Germantown, MD). Los métodos descritos en el presente documento se refieren a métodos de enriquecimiento de ácidos nucleicos diana, por ejemplo, antes de una secuenciación de los ácidos nucleicos diana. Una secuencia de un extremo del ácido nucleico diana a enriquecer puede ser desconocida antes de la secuenciación. Los métodos descritos en el presente documento se refieren a métodos de enriquecimiento de secuencias de nucleótidos específicas antes de la determinación de la secuencia de nucleótidos usando una tecnología de secuenciación de nueva generación. Los métodos de enriquecimiento de secuencias de nucleótidos específicas pueden no comprender enriquecimiento por hibridación.

Genes diana y aplicaciones terapéuticas

Una determinación de la secuencia contigua a una secuencia diana de oligonucleótidos conocida puede proporcionar información relevante sobre el tratamiento de una enfermedad. Por lo tanto, los métodos desvelados en el presente documento se pueden usar para ayudar en el tratamiento de una enfermedad. Una muestra puede ser de un sujeto en necesidad de tratamiento para una enfermedad asociada a una alteración genética. Una secuencia diana conocida puede ser una secuencia de un gen asociado a enfermedad, por ejemplo, un oncogén. Una secuencia contigua a una secuencia diana de oligonucleótidos conocida y/o la secuencia diana de oligonucleótidos conocida puede comprender una mutación o anomalía genética que está asociada a la enfermedad, por ejemplo, un SNP, una inserción, una deleción y/o una reordenación génica. Una secuencia contigua a una secuencia diana conocida y/o una secuencia diana conocida presente en una muestra puede comprender una secuencia de una producto de reordenación génica. Una reordenación génica puede ser un oncogén, por ejemplo, un oncogén de fusión.

Ciertos tratamientos para el cáncer son particularmente eficaces contra tumores que comprenden ciertos oncogenes, por ejemplo, un agente de tratamiento que dirige la acción o expresión de un oncogén de fusión dado puede ser eficaz contra tumores que comprenden ese oncogén de fusión, pero no contra tumores que carecen del oncogén de fusión. Los métodos descritos en el presente documento pueden facilitar la determinación de secuencias específicas que revelan el estado del oncogén (por ejemplo, mutaciones, SNP y/o reordenaciones). Los métodos descritos en el presente documento pueden permitir además la determinación de secuencias específicas cuando se conoce la secuencia de una región flanqueante, por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden determinar la presencia e identidad de reordenaciones génicas que implican a genes conocidos (por ejemplo, oncogenes) en los que la localización precisa y/o el asociado de reordenación son desconocidos antes de realizar los métodos descritos en el presente documento.

Un sujeto puede estar en necesidad de tratamiento para cáncer de pulmón (por ejemplo, con EGFR-TKI, una terapia dirigida contra el cáncer). En algunos casos, por ejemplo, cuando la muestra se obtiene de un sujeto en necesidad de tratamiento para cáncer de pulmón, la secuencia diana conocida puede comprender una secuencia de un gen seleccionado del grupo de ALK, ROS1 y RET. Por consiguiente, las reordenaciones génicas pueden dar como resultado fusiones que implican a ALK, ROS1 o RET. Los ejemplos no limitantes de las disposiciones de genes que implican a ALK, ROS1 o RET se describen en, por ejemplo, Soda et al. Nature 2007448561 -6: Rikova et al. Cell 2007 131:1190-1203; Kohno et al. Nature Medicine 2012 18:375-7; Takouchi et al. Nature Medicine 2012 18:378-81. Sin embargo, se debe apreciar que la localización precisa de una reordenación génica y la identidad del segundo gen implicado en la reordenación puede no ser conocida de antemano. Por consiguiente, en los métodos descritos en el presente documento, la presencia y la identidad de dichas reordenaciones puede ser detectada sin tener que conocer la localización de la reordenación o la identidad del segundo gen implicado en la reordenación génica.

La secuencia diana puede comprender la secuencia de un gen seleccionado del grupo de: ALK, ROS1 y RET.

La presencia de una reordenación génica de ALK en una muestra obtenida de un tumor en un sujeto puede indicar que el tumor es sensible al tratamiento con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de ALK; EGFR; crizotinib (PF-02341066); AP26113; LDK378; 3-39; AF802; IPI-504; ASP3026; AP-26113; X-396; GSK-1838705A; CH5424802; inhibidores de diamino y aminopirimidina de actividad de ALK cinasa, tales como NVP-TAE684 y PF-02341066 (véanse, por ejemplo, Galkin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104:270-275; Zou et al., Cancer Res, 2007, 67:4408-4417; Hallberg y Palmer F1000 Med Reports 2011 3:21; Sakamoto et al., Cancer Cell 2011 19:679-690; y moléculas desveladas en el documento de patente WO 04/079326). Un inhibidor de ALK puede incluir cualquier agente que reduzca la expresión y/o la actividad de la cinasa de ALK o una porción de la misma, que incluye, por ejemplo, oligonucleótidos, moléculas pequeñas y/o péptidos que reducen la expresión y/o la actividad de ALK o una porción de la misma. Como se usa en el presente documento, "cinasa del linfoma anaplásico" o "ALK" se refiere a una tirosina cinasa transmembranaria normalmente implicada en la regulación neuronal en la forma natural. Se conocen las secuencias de nucleótidos del gen ALK y el ARNm de varias especies, que incluyen la humana (por ejemplo, como se indica en el ID de NCBI Gene: 238).

La presencia de una reordenación génica de ROS1 en una muestra obtenida de un tumor en un sujeto puede indicar que el tumor es sensible a tratamiento con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de ROS1 y un inhibidor de ALK como se describe en el presente documento anteriormente (por ejemplo, crizotinib). Un inhibidor de ROS1 puede incluir cualquier agente que reduzca la expresión y/o la actividad de cinasa de ROS1 o una porción del mismo, que incluye, por ejemplo, oligonucleótidos, moléculas pequeñas y/o péptidos que reducen la expresión y/o la actividad de ROS1 o una porción de la misma. Como se usa en el presente documento "oncogén 1 de c-ros" o "ROS1" (también denominado en la técnica ros-1) se refiere a una tirosina cinasa transmembranaria de la subfamilia sevenless y que interactúa con PTPN6. Se conocen las secuencias de nucleótidos del gen ROS1 y el ARNm de varias especies, que incluyen la humana (por ejemplo, como se indica en el ID de NCBI Gene: 6098).

La presencia de una reordenación génica de RET en una muestra obtenida de un tumor en un sujeto puede indicar que el tumor es sensible al tratamiento con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de RET; DP-2490, DP-3636, SU5416; BAY 43-9006, BAY 73-4506 (regorafenib), ZD6474, NVP-AST487, sorafenib, RPI-1, XL184, vandetanib, sunitinib, imatinib, pazopanib, axitinib, motesanib, gefitinib y conaferina A (véase, por ejemplo, Samadi et al., Surgery 2010 148:1228-36; Cuccuru et al., JNCI 2004 13:1006-1014; Akeno-Stuart et al., Cancer Research 200767:6956; Grazma et al., J Clin Oncol 201028:15s 5559; Mologni et al., J Mol Endocrinol 200637:199-212; Calmomagno et al., Journal NCI 200698:326-334; Mologni, Curr Med Chem 2011 18:162-175; y los compuestos desvelados en documento de patente WO 06/034833; publicación de patente de EE. UU. 2011/0201598 y patente de EE. UU. 8.067.434). Un inhibidor de RET puede incluir cualquier agente que reduzca la expresión y/o la actividad de cinasa de RET o una porción del mismo, que incluye, por ejemplo, oligonucleótidos, moléculas pequeñas y/o péptidos que reducen la expresión y/o la actividad de RET o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, "reordenado durante la transfección" o "RET" se refiere a una tirosina cinasa de receptor de la superfamilia de cadherina que participa en el desarrollo de la cresta neural y reconoce moléculas de transducción de señales de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea de células de la glía. Se conocen las secuencias de nucleótidos del gen RET y el ARNm de varias especies, que incluyen la humana (por ejemplo, como se indica en el ID de NCBI Gene: 5979).

La secuencia diana conocida puede comprender un gen seleccionado de la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias diana conocidas

Otros ejemplos no limitantes de aplicaciones de los métodos descritos en el presente documento incluyen la detección de marcadores de tumores malignos hematológicos y paneles de los mismos (por ejemplo, que incluyen aquellos para detectar reordenaciones genómicas en linfomas y leucemias), detección de reordenaciones genómicas relacionadas con sarcoma y paneles de las mismas; y detección de reordenaciones de genes IGH/TCR y paneles de las mismas para la prueba de linfoma.

Los métodos descritos en el presente documento se pueden referir a tratar un sujeto que tiene o que ha sido diagnosticado con que tiene, por ejemplo, cáncer con un tratamiento para el cáncer. Los sujetos que tienen cáncer pueden ser identificados por un médico usando los métodos actuales de diagnóstico del cáncer. Por ejemplo, los síntomas y/o las complicaciones del cáncer de pulmón que caracterizan a estas afecciones y ayudan en el diagnóstico se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, respiración débil, ganglios linfáticos inflamados por encima de la clavícula, sonidos anormales en los pulmones, matidez cuando se golpea el pecho y dolor torácico. Las pruebas que pueden ayudar en un diagnóstico de, por ejemplo, cáncer de pulmón incluyen, pero no se limitan a, rayos X, análisis de sangre para niveles elevados de ciertas sustancias (por ejemplo, calcio), TAC y biopsia de tumor. Un antecedente familiar de cáncer de pulmón, o exposición a factores de riesgo para el cáncer de pulmón (por ejemplo, fumar o exposición al humo y/o contaminación del aire) también pueden ayudar en la determinación de si es probable que un sujeto tenga cáncer de pulmón o en hacer un diagnóstico de cáncer de pulmón.

El cáncer puede incluir, pero no se limita a, carcinoma, que incluye adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma, leucemia, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no hodgkiniano, cáncer pancreático, glioblastoma, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer cerebral que incluye glioblastomas y meduloblastomas; cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma; cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, cáncer endometrial; cáncer de esófago, cáncer gástrico; diversos tipos de cánceres de cabeza y cuello, neoplasias intraepiteliales que incluyen enfermedad de Bowen y enfermedad de Paget; neoplasias hematológicas que incluyen leucemia linfocítica y mielógena aguda; sarcoma de Kaposi, leucemia de células pilosas; leucemia mielógena crónica, leucemias asociadas al sida y leucemia/linfoma de linfocitos T en el adulto; cáncer de riñón, tal como carcinoma de células renales, leucemia/linfoma linfoblástico agudo de linfocitos T, linfomas que incluyen enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticos; cáncer de hígado, tal como carcinoma hepático y hepatoma, carcinoma de células de Merkel, melanoma, mieloma múltiple; neuroblastomas; cáncer de boca que incluye carcinoma de células escamosas; cáncer de ovario que incluye los que surgen de células epiteliales, sarcomas que incluyen leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma; cáncer pancreático; cáncer de piel que incluye melanoma, células del estroma, células germinativas y células mesenquimatosas; cáncer de próstata, cáncer rectal; cáncer vulvar, cáncer renal que incluye adenocarcinoma; cáncer testicular que incluye tumores germinales, tales como seminoma, no seminoma (teratomas, coriocarcinomas), tumores del estroma y tumores de células germinativas; cáncer de tiroides que incluye adenocarcinoma de tiroides y carcinoma medular; cáncer de esófago, carcinoma de glándulas salivales y tumores de Wilms. El cáncer puede ser cáncer de pulmón.

Métodos múltiples

Los métodos descritos en el presente documento se pueden emplear en un formato múltiple. Las aplicaciones múltiples pueden incluir determinar la secuencia de nucleótidos contigua a una o más secuencias de nucleótidos diana conocidas. Como se usa en el presente documento, "amplificación múltiple" se refiere a un proceso que implica la amplificación simultánea de más de un ácido nucleico diana en uno o más recipientes de reacción. Los métodos pueden implicar la posterior determinación de la secuencia de los productos de amplificación múltiple usando uno o más conjuntos de cebadores. Múltiple se puede referir a la detección de entre aproximadamente 2-1.000 secuencias diana diferentes en una única reacción. Sin embargo, múltiple se puede referir a la detección de entre aproximadamente 1.000-10.000 secuencias diana diferentes en una única reacción. Múltiple se puede referir a la detección de entre aproximadamente 10.000-100.000 secuencias diana diferentes en una única reacción. Como se usa en el presente documento, múltiple se refiere a la detección de cualquier intervalo entre 2-1.000, por ejemplo, entre 5-500, 25-1.000 o 10-100 secuencias diana diferentes en una única reacción, etc. El término "múltiple", como se aplica a PCR, implica que existen cebadores específicos para al menos dos secuencias diana diferentes en la misma reacción de PCR.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana en una muestra, o porciones separadas de una muestra, se pueden amplificar con una pluralidad de cebadores (por ejemplo, una pluralidad del primer y segundo cebadores específicos de diana). La pluralidad de cebadores (por ejemplo, una pluralidad del primer y segundo cebadores específicos de diana) puede estar presente en una única mezcla de reacción, por ejemplo, se pueden producir productos de amplificación múltiple en la misma mezcla de reacción. La pluralidad de cebadores (por ejemplo, una pluralidad de conjuntos del primer y segundo cebadores específicos de diana) se pueden hibridar específicamente con secuencias diana conocidas que comprenden genes separados. En algunos métodos, al menos dos conjuntos de cebadores (por ejemplo, al menos dos conjuntos del primer y segundo cebadores específicos de diana) se pueden hibridar específicamente con diferentes porciones de una secuencia diana conocida. Puede ser que al menos dos conjuntos de cebadores (por ejemplo, al menos dos conjuntos del primer y segundo cebadores específicos de diana) puedan hibridarse específicamente con diferentes porciones de una secuencia diana conocida que comprende un único gen. Puede ser que al menos dos conjuntos de cebadores (por ejemplo, al menos dos conjuntos del primer y segundo cebadores específicos de diana) se puedan hibridar específicamente con diferentes exones de un gen que comprende una secuencia diana conocida. La pluralidad de cebadores (por ejemplo, primeros cebadores específicos de diana) puede comprender porciones de secuencias de marca en 5' idéntica.

En los métodos descritos en el presente documento, las aplicaciones múltiples pueden incluir la determinación de la secuencia de nucleótidos contigua a una o más secuencias de nucleótidos diana conocidas en múltiples muestras en una reacción de secuenciación o serie de secuenciación. Las múltiples muestras pueden ser de diferentes orígenes, por ejemplo, de diferentes tejidos y/o diferentes sujetos. Los cebadores (por ejemplo, cebadores aleatorios elongados) pueden comprender además una porción de código de barras. Se puede añadir un cebador (por ejemplo, un cebador aleatorio elongado) con una porción de código de barras única a cada muestra y ligar a los ácidos nucleicos en su interior; las muestras se pueden reunir posteriormente. En dichos métodos, cada lectura de secuenciación resultante de un producto de amplificación comprenderá un código de barras que identifica la muestra que contiene el ácido nucleico de plantilla del que deriva el producto de amplificación.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar ciertas realizaciones descritas en el presente documento, que incluyen ciertos aspectos de la presente invención, pero no ejemplifican el alcance completo de la invención.

Ejemplo 1: Diseño de ácidos nucleicos adaptadores específicos de tecnología

Se diseñaron y generaron ácidos nucleicos adaptadores y cebadores adaptadores correspondientes adecuados para su uso en diversas tecnologías de secuenciación de nueva generación.

Un ejemplo de un ácido nucleico adaptador y cebadores adaptadores que se pueden usar en aplicaciones específicas de Illumina se muestra a continuación:

Ácido nucleico adaptador y cebadores adaptadores específicos de Illumina

Cadena superior (amplificación) (5 '^3 '):

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCCGTACACACTCTTTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACCGCCAGGAG-T (SEQ ID NO.: 1), donde "N" representa un nucleótido de una secuencia de código de barras molecular y "*T" representa una T que tiene un enlace fosfotioato.

Cadena inferior (bloqueo) (5 '^3 '):

5phosCTCCTGGCGGTTt (SEQ ID NO.: 2), donde "t" representa una nucleobase de timina modificada (por ejemplo, una timina invertida)

Primer cebador adaptador (5'—^ 3'):

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA (SEQ ID NO.: 3)

Segundo cebador adaptador

ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC (SEQ ID NO.: 4)

Como se muestra, el primer y segundo cebadores adaptadores contienen secuencias que son idénticas a una porción de la cadena superior (amplificación). Como resultado de este diseño, cada cebador es capaz de cebar hebras complementarias generadas por un primer y segundo cebador específico de diana durante una primera y segunda etapa de PCR, respectivamente. El segundo cebador adaptador en este ejemplo contiene dos nucleótidos adicionales y está anidado con respecto al primer cebador adaptador.

Un ejemplo de un ácido nucleico adaptador y cebadores adaptadores que se pueden usar en las aplicaciones específicas de semiconductores de Ion se muestra a continuación:

Ácido nucleico adaptador y cebadores adaptadores específicos de Ion

Cadena superior (amplificación)

3'):

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACNNNNNNNNGCTCTTC CGATC-T (SEQ ID NO.: 5), donde "N" representa un nucleótido de una secuencia de código de barras molecular y "*T" representa una T que tiene un enlace fosfotioato.

Cadena inferior (bloqueo)

5phosGATCGGAAGAGCt (SEQ ID NO.: 6), donde "t" representa una nucleobase de timina modificada (por ejemplo, una timina invertida)

Primer cebador adaptador

CCATCTCATCCCTGCGTGTC (SEQ ID NO.: 7)

Segundo cebador adaptador (5'—3'):

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (SEQ ID NO.: 8)

Como se muestra, el primer y segundo cebadores adaptadores contienen secuencias que son idénticas a una porción de la cadena superior (amplificación). Como resultado de este diseño, cada cebador es capaz de cebar hebras complementarias generadas por un primer y segundo cebador específico de diana durante una primera y segunda etapa de PCR, respectivamente. El segundo cebador adaptador en este ejemplo contiene diez nucleótidos adicionales y está anidado con respecto al primer cebador adaptador.

Ejemplo 2: Preparación de una muestra de ácido nucleico para análisis

Un ejemplo de una secuencia de trabajo que ilustra un método de preparación de una muestra de ácido nucleico para análisis se muestra en la FIG. 5. Una muestra de moléculas de ARN se hibrida con cebadores aleatorios. Esta hibridación se puede lograr, por ejemplo, mediante la adición de hexámeros aleatorios a la muestra, seguido por calentamiento a 65 °C durante 5 minutos. Tras la hibridación, se logra la síntesis de la primera cadena de ADNc por extensión del cebador (por ejemplo, a temperatura ambiente) usando una enzima transcriptasa inversa para generar un híbrido de ADN/Ar N.

En este momento, se puede realizar un ensayo de QC de ARN "PreSeq" para evaluar la complejidad de la biblioteca. Usando este ensayo, se comparó 600 ng de hexámeros aleatorios (hibridados a 65 °C durante 5 minutos) con el uso de 100 ng de hexámeros aleatorios (hibridados a 65 °C durante 5 minutos). La determinación de un valor de "Ct" proporciona una indicación de la complejidad de la biblioteca y una predicción de la probabilidad de la inflación de códigos de barras moleculares durante etapas posteriores. En general, se usa un Ct umbral de 28 como punto de referencia, siendo los más deseables los valores por debajo de este umbral. Se encontró que al aumentar la concentración de cebadores aleatorios se minimiza ventajosamente Ct.

Tras el ensayo PreSeq opcional, se escinde ARN del híbrido de ADN/ARN, por ejemplo, tratando la muestra con RnasaH. Los fragmentos de ARN resultantes que siguen hibridados con el ADN sirven de cebadores para la síntesis de la segunda cadena de ADNc. Esto se logra usando ADN Pol l e incubando la muestra, por ejemplo, a 16 °C durante 60 minutos. Tras este periodo, se inactiva la ADN Pol l por calor (por ejemplo, incubando la muestra a 75 °C durante 20 minutos). Se encontró que la inactivación por calor de la ADN Pol l aumentó enormemente la integridad de la muestra en las posteriores etapas de preparación de muestras.

Como se muestra en la FIG. 6, la inactivación por calor de ADN Pol l produjo muestras que mostraron bandas mucho más limpias por cromatografía en gel tras la síntesis de la segunda cadena cuando se comparó con la inactivación sin calor. Se supone que la ADN Pol l se vuelve activa durante la reparación de extremos y está dañando fragmentos debido a su actividad de exonucleasa 5 '^ 3 ' y/o 3 '^ 5 '— la inactivación por calor de la ADN Pol l tras la síntesis de la segunda cadena previene que esto ocurra.

La muestra de ADNc bicatenario se somete a reparación de extremos para hacer romo el extremo del ADNc y fosforilar los extremos 5'. En esta etapa, se añade un exceso de ADN polimerasa T4 y polinucleótido cinasa T4 a la muestra junto con dNTP suficientes y se deja que se incuben (por ejemplo, durante 30 minutos a 25 °C). Una purificación AMPure (2,5x) tras este periodo es crítica, ya que elimina el dATP residual de la preparación de biblioteca antes de elongar con dATP marcado con biotina. Esta etapa de purificación previene el marcado de fragmentos de bibliotecas con dATP en lugar de biotina-dATP, que produciría la pérdida de fragmentos erróneamente marcados durante la etapa de captura.

Los fragmentos de la biblioteca son adenilados en extremos 3' con dATP marcado con biotina en una primera etapa de ligación usando fragmento de Klenow (3'-5' exo-). Esto se puede lograr, por ejemplo, incubando la muestra y los componentes necesarios a 37 °C durante 15 minutos. Una purificación AMPure (2,5x) tras la adenilación es crítica, ya que retira el dATP marcado con biotina de la preparación de biblioteca antes de la etapa de captura. Esta purificación previene que biotina-dATP libre sature los sitios de unión a estreptavidina, produciendo la pérdida de fragmentos de la biblioteca durante la captura.

En una segunda etapa de ligación, los ácidos nucleicos adaptadores se ligan a los fragmentos de la biblioteca adenilados con biotina usando ADN ligasa. Es interesante señalar que se encontró que la adición de un agente de amontonamiento a la mezcla de ligación mejoró enormemente la eficiencia de la ligación en todas las bases terminales. Como se muestra en la FIG. 7, independientemente de la base del extremo 5', la inclusión de 10 % de PEG adicional minimizó los fragmentos no ligados (ninguno) y fragmentos individualmente ligados (L1), mientras que aumentó concomitantemente los fragmentos doblemente ligados (L2). Además, se logró la ligación del adaptador con 10 % de PEG en 5 minutos en comparación con el protocolo "estándar" que se realizó en 60 minutos. Datos adicionales han mostrado que un 20 % de PEG mejora aún más la eficiencia de ligación (no mostrado).

La FIG. 8A representa un adaptador de ácidos nucleicos usado en estos experimentos. Como se muestra, la cadena superior (cadena de amplificación) contiene, en 5 '^3 ', una región de sitio de cebador adaptador universal, una región de índice de muestra, una región de sitio de cebador de secuenciación, una región de código de barras molecular, una porción de dúplex en 3' y un nucleótido protuberante T en 3'. La cadena inferior (cadena de bloqueo) contiene una región común que se duplica con la porción en 3' del dúplex de la cadena superior, un extremo fosforilado en 5' y una base dT invertida que previene la extensión de la cadena.

Tras la ligación del adaptador, la purificación de la ligación se realiza por captura de fragmentos de la biblioteca por perlas recubiertas de estreptavidina. Esto se realiza usando dynabeads de estreptavidina M-280 (concentración 10 mg/ml almacenadas en PBS 0,1 % de BSA+ 0,02 % de azida). El tampón de almacenamiento se intercambia con el tampón de purificación por ligación (NaCl 1 M, EDTA 1 mM, 0,1 % de Tween, 10 Tris mM a pH 8) antes de añadir las perlas a la muestra. El producto de ADN ligado (50 pL) se mezcla con las perlas de purificación por ligación (50 pl para un total de 100 pl). Posteriormente se aplica un campo magnético a la muestra para capturar fragmentos de la biblioteca, y el sobrenadante se retira. Las perlas unidas a biblioteca se transfieren entonces a una mezcla separada de componentes para una primera etapa de PCR.

Se realiza una primera ronda de PCR usando un primer cebador específico de diana y un primer cebador adaptador. El primer cebador adaptador es idéntico a al menos una porción de la cadena de amplificación, de forma que se hibrida con la hebra complementaria generada por el primer cebador específico de diana. Se realiza una segunda ronda de PCR usando un segundo cebador específico de diana y un segundo cebador adaptador, siendo el último similarmente idéntico a una porción de la cadena de amplificación. El segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana y además se pone en contacto por un cebador adicional.

Como se muestra en la FIG. 8B, el segundo cebador específico de diana contiene una cola en 5' que no se hibrida con la región específica de diana. Se incluye un cebador adicional que contiene una región que es idéntica a la cola en 5' junto con una segunda región de índice de muestra y una región adaptador de secuenciación. De esta forma, el segundo cebador específico de diana ceba la cadena de plantilla para generar una cadena complemento que tiene una región elongada poco común. Como en la primera ronda de PCR, el segundo adaptador ceba esta cadena complementaria para generar una copia de la cadena no codificante. Como esta copia de la cadena no codificante contendrá una región que es complementaria a la secuencia de la cola en 5', el cebador adicional que contiene la segunda región de índice de la muestra y la región adaptadora de secuenciación cebará esta secuencia para generar una cadena inferior que ya está lista para la secuenciación.

EQUIVALENTES

Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en el presente documento se indican para ser a modo de ejemplo y que los parámetros actuales, dimensiones, materiales y/o configuraciones dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para la/s que se usa/n las enseñanzas inventivas. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a los aspectos específicos descritos en el presente documento. La presente divulgación se refiere a cada característica individual, sistema, artículo, material, kit y/o método descrito en el presente documento. Además, cualquier combinación de dos o más de dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos, si dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos no son mutualmente incoherentes, se incluye dentro de la presente divulgación.

Se debe entender que todas las definiciones, como se definen y usan en el presente documento, prevalecen sobre las definiciones del diccionario, y/o los significados habituales de los términos definidos.

Se debe entender que los artículos indefinidos "un " y "una", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, significan "al menos uno".

La expresión "y/o", como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe entender que significa "cualquiera o ambos" de los elementos así unidos, es decir, elementos que están conjuntivamente presentes en algunos casos y disyuntivamente presentes en otros casos. Los múltiples elementos enumerados con "y/o" se deben interpretar del mismo modo, es decir, "uno o más" de los elementos así unidos. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o", tanto relacionados como sin relacionar con los elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con el lenguaje de extremos abiertos, tal como "que comprende", se puede referir, en una realización, a A solo (que incluye opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, a B solo (que incluye opcionalmente elementos distintos de A); en otra realización más, a tanto A como a B (que incluye opcionalmente otros elementos); etc.

Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe entender que "o" tiene el mismo significado que "y/o" como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, cuando se separan puntos en una lista, "o" o "y/o" se deben interpretar como que están ambos incluidos, es decir, la inclusión de al menos uno, pero que también incluye más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente, puntos adicionales no listados. Solo términos claramente indicados al contrario, tales como "solo uno de " o "exactamente uno de", o, cuando se usa en las reivindicaciones, "que consiste en", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término "o", como se usa en el presente documento, solo se debe interpretar como que indica alternativas exclusivas (es decir, "una o la otra, pero no ambas") cuando va precedido por términos de exclusividad, tales como "o", "uno de", "solo uno de" o "exactamente uno de". "Que consiste esencialmente en", cuando se usa en las reivindicaciones, debe tener su significado habitual, como se usa en el campo de la ley de patentes.

Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, se debe entender que significa al menos un elemento seleccionado de uno cualquiera o más de los elementos en la lista de elementos, pero no necesariamente que incluya al menos uno de cada uno y cada elemento listado específicamente dentro de la lista de elementos y que no excluye combinaciones de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que puedan estar opcionalmente presentes elementos distintos de los elementos identificados específicamente dentro de la lista de elementos a la que se refiere la expresión "al menos uno", tanto relacionados como sin relacionar con los elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, "al menos uno de A y B" (o, equivalentemente, "al menos uno de A o B," o, equivalentemente "al menos uno de A y/o B") se pueden referir a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, sin B presente (y que incluye opcionalmente elementos distintos de B); al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B, sin A presente (y que incluye opcionalmente elementos distintos de A); al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, y al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, B (y que incluye opcionalmente otros elementos); etc.

También se debe entender que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluye más de una etapa o acto, el orden de las etapas o actos del método no está limitado necesariamente al orden en que se citan las etapas o actos del método.

En las reivindicaciones, así como en la memoria descriptiva anterior, se debe entender que todas las expresiones de transición, tales como "que comprende", "que incluye", "que lleva", "que tiene", "que contiene", "que implica", "que mantiene", "compuesto de" y similares, son de extremos abiertos, es decir, que significan que incluyen, pero no se limitan a. Solo las expresiones de transición "que consiste en' y "que consiste esencialmente en"' serán expresiones de transición cerradas o semicerradas, respectivamente. Se debe apreciar que las realizaciones descritas en este documento usando una expresión de transición de extremos abiertos (por ejemplo, "que comprende") también se contempla como "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" la característica descrita por la expresión de transición de extremos abiertos. Por ejemplo, si la divulgación describe "una composición que comprende A y B", la divulgación también contempla las realizaciones alternativas "una composición que consiste en A y B" y "una composición que consiste esencialmente en A y B".

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de ácidos nucleicos para análisis, comprendiendo el método:

(a) añadir uno o más nucleótidos a un extremo 3' de un ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de nucleótidos diana, en donde al menos uno del uno o más nucleótidos es un nucleótido modificado por resto de captura;

(b) ligar un ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario al que se ha añadido el nucleótido modificado por resto de captura para producir un producto de ligación, en donde una secuencia de uno o más nucleótidos en un extremo 3' del ácido nucleico adaptador es complementaria al uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a);

(c) capturar el producto de ligación poniendo en contacto el producto de ligación con un componente de unión del nucleótido modificado por resto de captura; y

(d) amplificar el producto de ligación por reacción en cadena de la polimerasa usando un primer cebador específico de diana que se hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos diana y un primer cebador adaptador que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria del ácido nucleico adaptador.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) comprende combinar el ácido nucleico adaptador, el ácido nucleico bicatenario y una ligasa en condiciones en las que la ligasa liga el ácido nucleico adaptador al ácido nucleico bicatenario, en donde el ácido nucleico adaptador que se combina con el ácido nucleico bicatenario comprende una porción de dúplex y una secuencia protuberante, en donde la secuencia protuberante comprende la secuencia de uno o más nucleótidos en el extremo 3' del ácido nucleico adaptador que es complementaria con el uno o más nucleótidos añadidos al extremo 3' del ácido nucleico bicatenario en la etapa (a), o

en donde la etapa (b) comprende combinar el ácido nucleico adaptador, el ácido nucleico bicatenario y una ligasa en condiciones en las que la ligasa liga el ácido nucleico adaptador con el ácido nucleico bicatenario, en donde el ácido nucleico adaptador que se combina con el ácido nucleico bicatenario es monocatenario.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

(e) amplificar un producto de amplificación de la etapa (d) por reacción en cadena de la polimerasa usando un segundo cebador adaptador y un segundo cebador específico de diana.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el segundo cebador específico de diana está anidado con respecto al primer cebador específico de diana.

5. El método de la reivindicación 3 o 4, en donde el segundo cebador específico de diana comprende una cola en 5' que no se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana, que comprende opcionalmente además añadir un cebador adicional que comprende una porción en 3' que es idéntica a la cola en 5' del segundo cebador específico de diana.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el resto de captura es un resto de biotina.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina, uracilo y citosina, o derivado(s) de los mismos.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el nucleótido modificado por resto de captura comprende una nucleobase de adenina o derivado de la misma, opcionalmente en donde el resto de captura se liga covalentemente a la nucleobase de adenina o derivado de la misma en la posición 5, 6, 7 u 8.

9. El método de la reivindicación 6, en donde el resto de biotina se liga covalentemente a la nucleobase por un conector de 5 a 20 átomos de longitud.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nucleótido modificado por resto de captura es biotina-n-dNTP, en donde n es un número entero desde 5 a 20 que representa el número de átomos conectores entre un grupo carbonilo del resto de biotina y la posición de ligación en una nucleobase del NTP.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el componente de unión es estreptavidina, opcionalmente en donde la estreptavidina está ligada a una perla paramagnética.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además, después de la etapa (c) y antes de la etapa (d):

i) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario, que comprende el nucleótido modificado por resto de captura, sobre un sustrato o superficie paramagnético;

ii) lavar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado; y opcionalmente

iii) liberar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además, antes de la etapa (a): i) preparar ADNc realizando una reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada usando una preparación de ARN como plantilla y una reacción de síntesis de la segunda cadena usando un producto de la reacción de síntesis de la primera cadena aleatoriamente cebada como plantilla;

ii) reparar los extremos del ADNc para producir un ácido nucleico bicatenario de extremos romos; y opcionalmente que comprende además, después de la etapa ii):

iii) inmovilizar el ácido nucleico bicatenario, que comprende el nucleótido modificado por resto de captura, sobre un sustrato o superficie paramagnético;

iv) lavar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado; y

v) liberar el ácido nucleico bicatenario inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además:

(f) inmovilizar el producto de amplificación de la etapa (e) sobre un sustrato o superficie paramagnético;

(g) lavar el producto de amplificación inmovilizado; y

(h) liberar el producto de amplificación inmovilizado lavado del sustrato o superficie paramagnético.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, en la etapa (b), el ácido nucleico bicatenario se liga al ácido nucleico adaptador en presencia de un agente de amontonamiento, opcionalmente en donde el agente de amontonamiento es polietilenglicol en una cantidad que representa del 5 % al 50 % de una mezcla de ligación.