JP2017504347A - 配列決定のために核酸を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、35U.S.C.119条の下で、2014年1月27日に出願された米国特許仮出願第61/931,959号の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/931,959号の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書に記載の技術は、核酸を調製および分析する方法に関する。
次世代配列決定前の標的濃縮は、全ゲノム、全エクソーム、および全トランスクリプトームの配列決定より費用対効果が大きく、従って、幅広い実施、すなわち、研究発見と臨床応用の両方に実際に役に立つ。例えば、標的濃縮アプローチによって得られる高いカバレッジデプス(coverage depth)から、(遺伝子発現およびコピー数評価の際に)対立遺伝子を数えるための、ならびに癌の体細胞変異を評価するための重要な特徴である低頻度変異を検出するためのダイナミックレンジがさらに広くなる。次世代配列決定のための現行の濃縮プロトコールの例には、ハイブリダイゼーションベースの捕捉アッセイ(TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースのアッセイ(HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina; エマルジョン/デジタルPCR, Raindance)が含まれる。ハイブリダイゼーションベースのアプローチでは、捕捉プローブがカバーする標的配列だけではなく、配列決定能力を消費する、標的でない近くの塩基も捕捉される。さらに、これらの方法は比較的時間がかかり、大きな労働力を要し、比較的低レベルの特異性を欠点として持つ。
本明細書において開示された技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。一部の態様において、配列分析のために(例えば、次世代配列決定を用いた配列分析のために)核酸を調製するための方法が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載の技術は、核酸のヌクレオチド配列を決定する方法に関する。一部の態様において、本明細書に記載の方法は、配列決定前に標的核酸を濃縮することに関する。
本明細書において開示された技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。一部の態様において、本明細書に記載の方法は、既知の標的ヌクレオチド配列に隣接する(既知の標的ヌクレオチド配列の隣にある)未知のヌクレオチド配列を決定するのに有用である。従来の配列決定法では、ランダムに配列情報が得られるか(例えば、「ショットガン」配列決定)、またはプライマーを設計するのに用いられた2つの既知配列の間の配列情報が得られる。対照的に、本明細書に記載の方法を用いると、一部の態様では、高レベルの特異性および感度で1つの既知配列領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列の決定(例えば、配列決定)が可能になる。従って、一部の態様では、本明細書において提供される方法は、遺伝子再編成(例えば、癌または他の障害を引き起こす再編成)に起因する融合(例えば、融合mRNA)の配列を決定するのに有用である。一部の態様では、分析(例えば、配列決定)のために核酸を調製するための本明細書において提供される方法は、標的核酸の既知配列(例えば、第1の遺伝子の既知配列)を標的とする標的特異的プライマーを用いた1回目の伸長と、それに続く、標的核酸中の既知配列の隣にある未知配列と相補的なハイブリダイゼーション配列を有するテール付プライマーを含む、テール付プライマー(例えば、テール付ランダムプライマー)の不均一な集団の使用を伴う2回目の伸長を伴う。一部の態様において、テール付プライマーのテール領域は、標的核酸のマルチプレックス増幅および濃縮を容易にするバーコード配列またはインデックス配列を含む。
Tm=ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
を用いて計算することができる。式中、ΔHは、ヘリックス形成のためのエンタルピーであり、ΔSはヘリックス形成のためのエントロピーであり、Rは、モル気体定数(1.987cal/℃*mol)であり、Cは核酸濃度であり、[K+]は塩濃度である。ほとんどの増幅レジメンについて、アニーリング温度はTm予測値より約5℃低くなるように選択されるが、Tmに近い温度またはTmを上回る温度(例えば、Tm予測値より1℃〜5℃低い温度またはTm予測値より1℃〜5℃高い温度)を使用することができ、同様に、例えば、Tm予測値より5℃以上低い(例えば、6℃低い、8℃低い、10℃低い、またはこれより低い)温度を使用することができる。一部の態様において、アニーリング温度がTmに近づけば近づくほど、アニーリングは特異的になる。一部の態様において、(例えば、PCR増幅レジメンの文脈の中での)伸長反応中にプライマーアニーリングのために用いられる時間は、少なくとも部分的に、反応容積に基づいて決定される(例えば、容積が大きくなると時間が長くなる)。一部の態様において、(例えば、PCR増幅レジメンの文脈の中での)伸長反応中にプライマーアニーリングのために用いられる時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレートの濃度に基づいて決定される(例えば、テンプレートに対するプライマーの相対濃度が大きくなると、相対濃度が低い場合より時間が短くなる)。一部の態様において、容積およびプライマー/テンプレートの相対濃度に応じて、(例えば、増幅レジメンの文脈の中での)伸長反応におけるプライマーアニーリング工程は、1秒〜5分、10秒および2分、または30秒〜2分の範囲でもよい。本明細書で使用する「実質的にアニールする」とは、PCR増幅レジメンの文脈で用いられた時に、検出可能なレベルの特異的に増幅された産物を生成するのに十分な、2つの核酸間で相補的塩基対が形成する程度を指す。
1. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、テンプレートとして、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、アニーリング温度で、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(e)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。
2. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を、テール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、テンプレートとして、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、アニーリング温度で、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。
3. 初期標的特異的プライマーの伸長後に、前記試料および産物をRNアーゼと接触させる工程をさらに含む、パラグラフ1〜2のいずれか一つに記載の方法。
4. テール付ランダムプライマーがヘアピンループ構造を形成することができる、パラグラフ1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5. 初期標的特異的プライマーおよび第1の標的特異的プライマーが同一である、パラグラフ1〜4のいずれか一つに記載の方法。
6. テール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、6〜12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間に6〜12ランダムヌクレオチドを含むバーコード部分をさらに含む、パラグラフ1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を、テール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、テンプレートとして、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(d)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(c)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(e)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(d)からの増幅された部分を配列決定する工程を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列;中央のバーコード部分;および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、アニーリング温度で、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。
8. それぞれのテール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間にスペーサー核酸配列をさらに含む、パラグラフ7に記載の方法。
9. ハイブリダイズしなかったプライマーが伸長工程後に反応から取り除かれる、パラグラフ7または8に記載の方法。
10. 第2のテールプライマーが、少なくとも3ヌクレオチド分だけ第1のテールプライマーに対して入れ子構造になっている、パラグラフ7〜9のいずれか一つに記載の方法。
11. 第1の標的特異的プライマーが、どのプライマーの他のどの部分とも実質的に相補的でもなく実質的に同一でもない、高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分をさらに含む、パラグラフ7〜10のいずれか一つに記載の方法。
12. 第2のテールプライマーが完全長の第1の配列決定プライマーと同一である、パラグラフ7〜11のいずれか一つに記載の方法。
13. 既知の標的に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部がPCR緩衝液中で約65℃の温度で特異的にアニールする、パラグラフ7〜12のいずれか一つに記載の方法。
14. 試料がゲノムDNAを含む、パラグラフ7〜13のいずれか一つに記載の方法。
15. 試料がRNAを含み、方法が、試料を逆転写酵素レジメンに供する第1の工程をさらに含む、パラグラフ7〜14のいずれか一つに記載の方法。
16. 試料中に存在する核酸が剪断にも消化にも供されていない、パラグラフ7〜15のいずれか一つに記載の方法。
17. 試料が一本鎖gDNAまたはcDNAを含む、パラグラフ7〜16のいずれか一つに記載の方法。
18. 逆転写酵素レジメンがランダムヘキサマーの使用を含む、パラグラフ7〜17のいずれか一つに記載の方法。
19. 遺伝子再編成が、既知の標的配列を含む、パラグラフ7〜18のいずれか一つに記載の方法。
20. 遺伝子再編成が、ゲノムDNA;RNA;およびcDNAからなる群より選択される核酸に存在する、パラグラフ19記載の方法。
21. 遺伝子再編成が癌遺伝子を含む、パラグラフ19〜20のいずれか一つに記載の方法。
22. 遺伝子再編成が融合癌遺伝子を含む、パラグラフ21記載の方法。
23. 核酸産物が次世代配列決定法によって配列決定される、パラグラフ7〜22のいずれか一つに記載の方法。
24. 次世代配列決定法が、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454; Massively Parallel Signature Sequencing固相可逆的ダイターミネーター配列決定;およびDNAナノボール配列決定からなる群より選択される方法を含む、パラグラフ23記載の方法。
25. 第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーが、選択された次世代配列決定法と適合性である、パラグラフ7〜24のいずれか一つに記載の方法。
26. 試料または試料の別々の部分を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、パラグラフ7〜25のいずれか一つに記載の方法。
27. 試料を含む単一の反応混合物を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、パラグラフ7〜26のいずれか一つに記載の方法。
28. 複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、別々の遺伝子に含まれる既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする、パラグラフ7〜27のいずれか一つに記載の方法。
29. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールする、パラグラフ7〜28のいずれか一つに記載の方法。
30. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列を含む単一の遺伝子の異なる部分に特異的にアニールする、パラグラフ7〜29のいずれか一つに記載の方法。
31. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知のヌクレオチド標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールする、パラグラフ7〜30のいずれか一つに記載の方法。
32. 複数種の第1の標的特異的プライマーが、同一の5'タグ配列部分を含む、パラグラフ7〜31のいずれか一つに記載の方法。
33. テール付ランダムプライマーの集団中のそれぞれのテール付ランダムプライマーが、同一の試料バーコード部分をさらに含む、パラグラフ7〜32のいずれか一つに記載の方法。
34. 複数の試料がそれぞれ、試料バーコード部分を有するテール付ランダムプライマーの別々の集団と接触され、テール付ランダムプライマーの集団がそれぞれ別個の試料バーコード部分を有し、試料が工程(b)後にプールされる、パラグラフ33記載の方法。
35. それぞれの増幅工程が、長さが5サイクル〜20サイクルの1セットのPCR増幅レジメンサイクルを含む、パラグラフ7〜34のいずれか一つに記載の方法。
36. 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが約61〜72℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、パラグラフ7〜35のいずれか一つに記載の方法。
37. 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが約65℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、パラグラフ7〜36のいずれか一つに記載の方法。
38. 標的核酸分子が試料に由来し、任意で、試料が、対象から得られた生物学的試料である、パラグラフ7〜37のいずれか一つに記載の方法。
39. 試料が、遺伝子変化に関連する疾患に対する処置を必要とする対象から得られたものである、パラグラフ38記載の方法。
40. 疾患が癌である、パラグラフ39記載の方法。
41. 試料が腫瘍細胞の集団を含む、パラグラフ38記載の方法。
42. 試料が腫瘍生検材料である、パラグラフ38記載の方法。
43. 癌が肺癌である。パラグラフ40記載の方法。
44. 疾患関連遺伝子が、既知の標的配列を含む、パラグラフ7〜43のいずれか一つに記載の方法。
45. 試料中の遺伝子再編成産物が、既知の標的配列を含む、パラグラフ38記載の方法。
46. 遺伝子再編成産物が癌遺伝子である、パラグラフ45記載の方法。
47. 分析のために核酸を調製する方法であって、
(a)標的核酸の第1の鎖を含む核酸テンプレートを、標的特異的ハイブリダイゼーション配列を含む相補的標的特異的プライマーと、該標的特異的プライマーのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で接触させる工程;ならびに
(b)標的核酸の第1の鎖に相補的な第2の鎖を含む核酸テンプレートを、異なるハイブリダイゼーション配列の5'側にある共通配列を有する複数の異なるプライマーと、該複数の異なるプライマーの少なくとも1つのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で接触させる工程を含み、
伸長産物が、標的特異的プライマーに特徴的な配列と、複数の異なるプライマーの少なくとも1つに特徴的な配列の両方を含むように生成される、方法。
48. 標的核酸がリボ核酸である、パラグラフ47記載の方法。
49. 標的核酸がデオキシリボ核酸である、パラグラフ47記載の方法。
50. 工程(a)および(b)が連続して行われる、パラグラフ47〜49のいずれか一つに記載の方法。
51. 工程(a)の核酸テンプレートが、工程(b)の複数の異なるプライマーの少なくとも1つのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、パラグラフ47〜50のいずれか一つに記載の方法。
52. 工程(b)の核酸テンプレートが、工程(a)の標的特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、パラグラフ47〜50のいずれか一つに記載の方法。
53. 標的核酸が、遺伝子再編成を含む染色体セグメントからコードされるメッセンジャーRNAである、パラグラフ48記載の方法。
54. 標的核酸が、遺伝子再編成の一部を含む染色体セグメントである、パラグラフ49記載の方法。
55. 遺伝子再編成が逆位、欠失、または転座である、パラグラフ8記載の方法。
56. 伸長産物を増幅する工程をさらに含む、パラグラフ47〜55のいずれか一つに記載の方法。
57. 伸長産物と、固定化されたオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、伸長産物または増幅された伸長産物を、固定化されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含む、パラグラフ47〜55のいずれか一つに記載の方法。
58. 標的核酸が、既知の配列を有する標的部分および未知の配列を有する隣接部分を含む、前記パラグラフのいずれか一つに記載の方法。
59. 異なるハイブリダイゼーション配列が隣接部分に相補的である、パラグラフ58記載の方法。
60. 標的特異的ハイブリダイゼーション配列が標的部分に相補的である、パラグラフ58または59記載の方法。
61. 標的特異的プライマーが、標的特異的ハイブリダイゼーション配列の5'側に、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つをさらに含む、パラグラフ47〜60のいずれか一つに記載の方法。
62. 共通配列が、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つを含む、パラグラフ47〜60のいずれか一つに記載の方法。
63. アダプター配列が、フローセルの中にオリゴヌクレオチドを固定化するための切断可能なアダプター配列である、パラグラフ1〜62のいずれか一つに記載の方法。
1. 分析のために核酸を調製する方法であって、
(a)標的核酸の第1の鎖を含む核酸テンプレートを、標的特異的ハイブリダイゼーション配列を含む相補的標的特異的プライマーと、該標的特異的プライマーのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で、接触させる工程;ならびに
(b)標的核酸の第1の鎖に相補的な第2の鎖を含む核酸テンプレートを、異なるハイブリダイゼーション配列の5'側にある共通配列を有する複数の異なるプライマーと、該複数の異なるプライマーの少なくとも1つのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で、接触させる工程
を含み、
伸長産物が、標的特異的プライマーに特徴的な配列と、複数の異なるプライマーの少なくとも1つに特徴的な配列の両方を含むように生成される、方法。
2. 標的核酸がリボ核酸である、パラグラフ1記載の方法。
3. 標的核酸がデオキシリボ核酸である、パラグラフ1記載の方法。
4. 工程(a)および(b)が連続して行われる、パラグラフ1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5. 工程(a)の核酸テンプレートが、工程(b)の複数の異なるプライマーの少なくとも1つのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、パラグラフ1〜4のいずれか一つに記載の方法。
6. 工程(b)の核酸テンプレートが、工程(a)の標的特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、パラグラフ1〜4のいずれか一つに記載の方法。
7. 標的核酸が、遺伝子再編成を含む染色体セグメントからコードされるメッセンジャーRNAである、パラグラフ2記載の方法。
8. 標的核酸が、遺伝子再編成の一部を含む染色体セグメントである、パラグラフ3記載の方法。
9. 遺伝子再編成が、逆位、欠失、または転座である、パラグラフ8記載の方法。
10. 伸長産物を増幅する工程をさらに含む、パラグラフ1〜9のいずれか一つに記載の方法。
11. 伸長産物と、固定化されたオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、伸長産物または増幅された伸長産物を、固定化されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含む、パラグラフ1〜9のいずれか一つに記載の方法。
12. 標的核酸が、既知の配列を有する標的部分および未知の配列を有する隣接部分を含む、前記パラグラフのいずれか一つに記載の方法。
13. 異なるハイブリダイゼーション配列が隣接部分に相補的である、パラグラフ12記載の方法。
14. 標的特異的ハイブリダイゼーション配列が標的部分に相補的である、パラグラフ12または13記載の方法。
15. 標的特異的プライマーが、標的特異的ハイブリダイゼーション配列の5'側に、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つをさらに含む、パラグラフ1〜14のいずれか一つに記載の方法。
16. 共通配列が、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つを含む、パラグラフ1〜14のいずれか一つに記載の方法。
17. アダプター配列が、フローセルの中にオリゴヌクレオチドを固定化するための切断可能なアダプター配列である、パラグラフ15または16記載の方法。
18. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列とアニーリング温度で特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(e)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。
19. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列とアニーリング温度で特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。
20. 初期標的特異的プライマーの伸長後に、試料および産物をRNアーゼと接触させる工程をさらに含む、パラグラフ18〜19のいずれか一つに記載の方法。
21. テール付ランダムプライマーがヘアピンループ構造を形成することができる、パラグラフ1〜3のいずれか一つに記載の方法。
22. 初期標的特異的プライマーおよび第1の標的特異的プライマーが同一である、パラグラフ1〜4のいずれか一つに記載の方法。
23. テール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、6〜12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間に6〜12ランダムヌクレオチドを含むバーコード部分をさらに含む、パラグラフ1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7. 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(d)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(c)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(e)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(d)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列、中央のバーコード部分、および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、アニーリング温度で標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造になっている、方法。
24. それぞれのテール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間にあるスペーサー核酸配列をさらに含む、パラグラフ23記載の方法。
25. ハイブリダイズしなかったプライマーが伸長工程後に反応から取り除かれる、パラグラフ23または24記載の方法。
26. 第2のテールプライマーが、少なくとも3ヌクレオチド分だけ第1のテールプライマーに対して入れ子構造になっている、パラグラフ23〜25のいずれか一つに記載の方法。
27. 第1の標的特異的プライマーが、どのプライマーの他のどの部分とも実質的に相補的でもなく実質的に同一でもない、高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分をさらに含む、パラグラフ23〜26のいずれか一つに記載の方法。
28. 第2のテールプライマーが完全長の第1の配列決定プライマーと同一である、パラグラフ23〜27のいずれか一つに記載の方法。
29. 既知の標的に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部がPCR緩衝液中で約65℃の温度で特異的にアニールする、パラグラフ23〜28のいずれか一つに記載の方法。
30. 試料がゲノムDNAを含む、パラグラフ23〜29のいずれか一つに記載の方法。
31. 試料がRNAを含み、方法が、試料を逆転写酵素レジメンに供する第1の工程をさらに含む、パラグラフ23〜30のいずれか一つに記載の方法。
32. 試料中に存在する核酸が剪断にも消化にも供されていないか、または、試料が一本鎖gDNAまたはcDNAを含む、パラグラフ23〜31のいずれか一つに記載の方法。
33. 逆転写酵素レジメンがランダムヘキサマーの使用を含む、パラグラフ23〜32のいずれか一つに記載の方法。
34. 遺伝子再編成が、既知の標的配列を含む、パラグラフ23〜33のいずれか一つに記載の方法。
35. 遺伝子再編成が、ゲノムDNA、RNA、およびcDNAからなる群より選択される核酸に存在する、パラグラフ34記載の方法。
36. 遺伝子再編成が癌遺伝子を含む、パラグラフ34〜35のいずれか一つに記載の方法。
37. 遺伝子再編成が融合癌遺伝子を含む、パラグラフ36記載の方法。
38. 核酸産物が次世代配列決定法によって配列決定される、パラグラフ23〜37のいずれか一つに記載の方法。
39. 次世代配列決定法が、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、Massively Parallel Signature Sequencing固相可逆的ダイターミネーター配列決定、およびDNAナノボール配列決定からなる群より選択される方法を含む、パラグラフ38記載の方法。
40. 第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーが、選択された次世代配列決定法と適合性である、パラグラフ23〜39のいずれか一つに記載の方法。
41. 試料または試料の別々の部分を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、パラグラフ23〜40のいずれか一つに記載の方法。
42. 試料を含む単一の反応混合物を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、パラグラフ23〜41のいずれか一つに記載の方法。
43. 複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、別々の遺伝子に含まれる既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする、パラグラフ23〜42のいずれか一つに記載の方法。
44. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールする、パラグラフ23〜43のいずれか一つに記載の方法。
45. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列を含む単一の遺伝子の異なる部分に特異的にアニールする、パラグラフ23〜44のいずれか一つに記載の方法。
46. 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知のヌクレオチド標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールする、パラグラフ23〜45のいずれか一つに記載の方法。
47. 複数種の第1の標的特異的プライマーが、同一の5'タグ配列部分を含む、パラグラフ23〜46のいずれか一つに記載の方法。
48. テール付ランダムプライマーの集団中のそれぞれのテール付ランダムプライマーが、同一の試料バーコード部分をさらに含む、パラグラフ23〜47のいずれか一つに記載の方法。
49. 複数の試料がそれぞれ、試料バーコード部分を有するテール付ランダムプライマーの別々の集団と接触され、テール付ランダムプライマーの集団がそれぞれ別個の試料バーコード部分を有し、試料が工程(b)後にプールされる、パラグラフ48記載の方法。
50. それぞれの増幅工程が、長さが5サイクル〜20サイクルの1セットのPCR増幅レジメンサイクルを含む、パラグラフ23〜49のいずれか一つに記載の方法。
51. 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが、約61〜72℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、パラグラフ23〜50のいずれか一つに記載の方法。
52. 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが、約65℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、パラグラフ23〜51のいずれか一つに記載の方法。
53. 標的核酸分子が試料に由来し、任意で、試料が、対象から得られた生物学的試料である、パラグラフ23〜52のいずれか一つに記載の方法。
54. 試料が、遺伝子変化に関連する疾患に対する処置を必要とする対象から得られたものである、パラグラフ53記載の方法。
55. 疾患が癌である、パラグラフ54記載の方法。
56. 試料が腫瘍細胞の集団を含む、パラグラフ53記載の方法。
57. 試料が腫瘍生検材料である、パラグラフ53記載の方法。
58. 癌が肺癌である、パラグラフ55記載の方法。
59. 疾患関連遺伝子が、既知の標的配列を含む、パラグラフ23〜58のいずれか一つに記載の方法。
60. 試料中の遺伝子再編成産物が、既知の標的配列を含む、パラグラフ53記載の方法。
61. 遺伝子再編成産物が癌遺伝子である、パラグラフ60記載の方法。
逆転写酵素とテール付ランダムオリゴヌクレオチドおよび遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いて3'融合事象を増幅する方法
配列分析のために3'融合事象を増幅する最初の工程として、対象から単離された試料からRNAを得た。以下の反応物:
・12μLの精製RNAおよびH2O
・2μLの1.2μg/μLランダムプライマー#1(9マー)
・2μLのdNTP
を氷上で組み立てて第1のcDNA鎖を合成した。
・2μLの10X M-MuLV逆転写酵素緩衝液
・1μLの40U/μL RNアーゼ阻害剤
・1μLの200U/μL M-MuLV酵素
を氷上で調製した。
上記の反応物に以下:
・1μLの20U/μLエキソヌクレアーゼI
を添加した。
以下の反応物:
・20μLの上記からのDNA溶液
・11μLのヌクレアーゼフリーH2O
・4μLの10X PCR緩衝液II
・4μLの3μM遺伝子特異的プライマー#1
・1μLの0.5mM dNTP
を調製した。
・1μLの400U/μL Manta 1.0 DNAポリメラーゼ(高濃度)
を添加した。
上記の反応物に以下:
・88.4μLのAMPureビーズ
を添加した。
以下の反応物:
・10μLの上記精製#1からの精製DNA
・4μLの5X Phoenix Hot Start緩衝液
・2μLの2mM dNTP
・2μLの10μM P5_バーコードプライマー
・2μLの3μM遺伝子特異的プライマー#1
・0.5〜2単位のポリメラーゼ(例えば、Pheonix Hot Start Taq, VeraSeq)
を調製した。
・工程1:95℃で3分間
・工程2:95℃で30秒間
・工程3:65℃で5分間、工程2に戻って14サイクル
・工程4:72℃で2分間
・工程5:プロトコールを続行するまで4℃
上記の反応物に以下:
・36.4μLのAMPureビーズ
を添加した。
以下の反応物:
・8.5μLの上記精製#2からの精製DNA
・4μLの5X Phoenix Hot Start緩衝液
・2μLの2mM dNTP
・2μLの10μM P5 29bpプライマー
・2μLの10μM P7バーコードプライマー
・2μLの3μM遺伝子特異的プライマー#2
・0.2μLの5U/μL Phoenix Hot Start Taqポリメラーゼ
・2μLの10μM P7バーコードプライマー
を調製した。
・工程1:95℃で3分間
・工程2:95℃で30秒間
・工程3:65℃で5分間、工程2に戻って14サイクル
・工程4:72℃で2分間
・工程5:プロトコールを続行するまで4℃
上記の反応物に以下:
・37.3μLのAMPureビーズ
を添加した。
Illumina用のKapa Biosystems qPCRキットを用いて、上記プロトコールを用いて調製した各ライブラリーの濃度を定量した。バーコード付(barcoded)ライブラリーを等モル濃度でプールした。次いで、ライブラリーを、MiSeq v2 300サイクル試薬キットを用いて製造業者の説明書に従ってXpM のIllumina MiSeqにロードした。試料を、2x150bpリードと、7塩基によってコードされるインデックスリードを用いて配列決定した。
逆転写酵素と遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびテール付ランダムオリゴヌクレオチドを用いて5'融合事象を増幅する方法
第1鎖合成
配列分析のために5'融合事象を増幅する最初の工程として、対象から単離された試料からRNAを得た。以下の反応物:
・12μLの精製RNAおよびH2O
・2μLの遺伝子特異的プライマー#1
・2μLのdNTP
を氷上で組み立てて第1のcDNA鎖を合成した。
・2μLの1OX M-MuLV逆転写酵素緩衝液
・1μLの40U/μL RNアーゼ阻害剤
・1μLの200U/μL M-MuLV酵素
を氷上で調製した。
上記の反応物に以下:
・1μLの20U/μLエキソヌクレアーゼI
を添加した。
以下の反応物:
・20μLの上記からのDNA溶液
・11μLのヌクレアーゼフリーH2O
・4μLの10X PCR緩衝液II
・4μLの1.2μg/μLランダムプライマー(9マー)
・1μLの0.5mM dNTP
を調製した。
・1μLの400U/μL Manta 1.0 DNAポリメラーゼ(高濃度)
を添加した。
上記の反応物に以下:
・88.4μLのAMPureビーズ
を添加した。
以下の反応物:
・10μLの上記精製#1からの精製DNA
・4μLの5X Phoenix Hot Start緩衝液
・2μLの2mM dNTP
・2μLの10μM P5_バーコードプライマー
・2μLの3μM遺伝子特異的プライマー#1
・0.5〜2単位のポリメラーゼ(例えば、Pheonix Hot Start Taq, VeraSeq)
を調製した。
・工程1:95℃で3分間
・工程2:95℃で30秒間
・工程3:65℃で5分、工程2に戻って14サイクル
・工程4:72℃で2分間
・工程5:プロトコールを続行するまで4℃
上記の反応物に以下:
・36.4μLのAMPureビーズ
を添加した。
以下の反応物:
・8.5μLの上記精製#2からの精製DNA
・4μLの5X Phoenix Hot Start緩衝液
・2μLの2mM dNTP
・2μLの10μM P5_29 bpプライマー
・2μLの10μM P7バーコードプライマー
・2μLの3μM遺伝子特異的プライマー#2
・0.2μLの5U/μL Phoenix Hot Start Taqポリメラーゼ
・2μLの10μM P7バーコードプライマー
を調製した。
・工程1:95℃で3分間
・工程2:95℃で30秒間
・工程3:65℃で5分間、工程2に戻って14サイクル
・工程4:72℃で2分間
・工程5:プロトコールを続行するまで4℃
上記の反応物に以下:
・37.3μLのAMPureビーズ
を添加した。
Illumina用のKapa Biosystems qPCRキットを用いて、上記プロトコールを用いて調製した各ライブラリーの濃度を定量した。バーコード付ライブラリーを等モル濃度でプールした。次いで、ライブラリーを、MiSeq v2 300サイクル試薬キットを用いて製造業者の説明書に従ってXpM のIllumina MiSeqにロードした。試料を、2x150bpリードと、7塩基によってコードされるインデックスリードを用いて配列決定した。
Claims (62)
- 分析のために核酸を調製する方法であって、
(a)標的核酸の第1の鎖を含む核酸テンプレートを、標的特異的ハイブリダイゼーション配列を含む相補的標的特異的プライマーと、該標的特異的プライマーのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で、接触させる工程;ならびに
(b)標的核酸の第1の鎖に相補的な第2の鎖を含む核酸テンプレートを、異なるハイブリダイゼーション配列の5'側にある共通配列を有する複数の異なるプライマーと、該複数の異なるプライマーの少なくとも1つのテンプレート特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する条件下で、接触させる工程
を含み、
伸長産物が、標的特異的プライマーに特徴的な配列と、複数の異なるプライマーの少なくとも1つに特徴的な配列の両方を含むように生成される、方法。 - 標的核酸がリボ核酸である、請求項1記載の方法。
- 標的核酸がデオキシリボ核酸である、請求項1記載の方法。
- 工程(a)および(b)が連続して行われる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 工程(a)の核酸テンプレートが、工程(b)の複数の異なるプライマーの少なくとも1つのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 工程(b)の核酸テンプレートが、工程(a)の標的特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長に起因する伸長産物を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 標的核酸が、遺伝子再編成を含む染色体セグメントからコードされるメッセンジャーRNAである、請求項2記載の方法。
- 標的核酸が、遺伝子再編成の一部を含む染色体セグメントである、請求項3記載の方法。
- 遺伝子再編成が、逆位、欠失、または転座である、請求項8記載の方法。
- 伸長産物を増幅する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 伸長産物と、固定化されたオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、伸長産物または増幅された伸長産物を、固定化されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 標的核酸が、既知の配列を有する標的部分および未知の配列を有する隣接部分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 異なるハイブリダイゼーション配列が隣接部分に相補的である、請求項12記載の方法。
- 標的特異的ハイブリダイゼーション配列が標的部分に相補的である、請求項12または13記載の方法。
- 標的特異的プライマーが、標的特異的ハイブリダイゼーション配列の5'側に、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 共通配列が、インデックス配列、バーコード配列、およびアダプター配列の少なくとも1つを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- アダプター配列が、フローセルの中にオリゴヌクレオチドを固定化するための切断可能なアダプター配列である、請求項15または16記載の方法。
- 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列とアニーリング温度で特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(e)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。 - 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)工程(b)の産物を初期標的特異的プライマーとハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(d)ハイブリダイズした初期標的特異的プライマーによってプライミングされ、テンプレートとして標的核酸分子を使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(e)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(f)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(e)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(g)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(f)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列とアニーリング温度で特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、かつ
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造にある、方法。 - 初期標的特異的プライマーの伸長後に、試料および産物をRNアーゼと接触させる工程をさらに含む、請求項18〜19のいずれか一項記載の方法。
- テール付ランダムプライマーがヘアピンループ構造を形成することができる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 初期標的特異的プライマーおよび第1の標的特異的プライマーが同一である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- テール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、6〜12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間に6〜12ランダムヌクレオチドを含むバーコード部分をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 既知の標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子をテール付ランダムプライマーの集団とハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズしたテール付ランダムプライマーによってプライミングされ、ハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部をテンプレートとして使用する、テンプレート依存性伸長反応を行う工程;
(c)第1のテールプライマーおよび第1の標的特異的プライマーを用いて、標的核酸分子の一部およびテール付ランダムプライマー配列を増幅する工程;
(d)第2のテールプライマーおよび第2の標的特異的プライマーを用いて、工程(c)に起因するアンプリコンの一部を増幅する工程;
(e)第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーを用いて、工程(d)からの増幅された部分を配列決定する工程
を含み、
テール付ランダムプライマーの集団が、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列、中央のバーコード部分、および約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を含み、
第1の標的特異的プライマーが、アニーリング温度で標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることができる核酸配列を含み、
第2の標的特異的プライマーが、工程(c)に起因するアンプリコンに含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部と特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分、および第2の配列決定プライマーと同一の核酸配列を含む5'部分を含み、第2の標的特異的プライマーが第1の標的特異的プライマーに対して入れ子構造にあり、
第1のテールプライマーが、テール付ランダムプライマーと同一の核酸配列を含み、
第2のテールプライマーが、第1の配列決定プライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第1のテールプライマーに対して入れ子構造になっている、方法。 - それぞれのテール付ランダムプライマーが、第1の配列決定プライマーと同一の5'核酸配列と、約6〜約12ランダムヌクレオチドを含む3'核酸配列との間にあるスペーサー核酸配列をさらに含む、請求項23記載の方法。
- ハイブリダイズしなかったプライマーが伸長工程後に反応から取り除かれる、請求項23または24記載の方法。
- 第2のテールプライマーが、少なくとも3ヌクレオチド分だけ第1のテールプライマーに対して入れ子構造になっている、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
- 第1の標的特異的プライマーが、どのプライマーの他のどの部分とも実質的に相補的でもなく実質的に同一でもない、高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分をさらに含む、請求項23〜26のいずれか一項記載の方法。
- 第2のテールプライマーが完全長の第1の配列決定プライマーと同一である、請求項23〜27のいずれか一項記載の方法。
- 既知の標的に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部がPCR緩衝液中で約65℃の温度で特異的にアニールする、請求項23〜28のいずれか一項記載の方法。
- 試料がゲノムDNAを含む、請求項23〜29のいずれか一項記載の方法。
- 試料がRNAを含み、方法が、試料を逆転写酵素レジメンに供する第1の工程をさらに含む、請求項23〜30のいずれか一項記載の方法。
- 試料中に存在する核酸が剪断にも消化にも供されていないか、または、試料が一本鎖gDNAまたはcDNAを含む、請求項23〜31のいずれか一項記載の方法。
- 逆転写酵素レジメンがランダムヘキサマーの使用を含む、請求項23〜32のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子再編成が、既知の標的配列を含む、請求項23〜33のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子再編成が、ゲノムDNA、RNA、およびcDNAからなる群より選択される核酸に存在する、請求項34記載の方法。
- 遺伝子再編成が癌遺伝子を含む、請求項34〜35のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子再編成が融合癌遺伝子を含む、請求項36記載の方法。
- 核酸産物が次世代配列決定法によって配列決定される、請求項23〜37のいずれか一項記載の方法。
- 次世代配列決定法が、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、Massively Parallel Signature Sequencing固相可逆的ダイターミネーター配列決定、およびDNAナノボール配列決定からなる群より選択される方法を含む、請求項38記載の方法。
- 第1の配列決定プライマーおよび第2の配列決定プライマーが、選択された次世代配列決定法と適合性である、請求項23〜39のいずれか一項記載の方法。
- 試料または試料の別々の部分を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、請求項23〜40のいずれか一項記載の方法。
- 試料を含む単一の反応混合物を、複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーと接触させる工程を含む、請求項23〜41のいずれか一項記載の方法。
- 複数のセットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、別々の遺伝子に含まれる既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする、請求項23〜42のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールする、請求項23〜43のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知の標的ヌクレオチド配列を含む単一の遺伝子の異なる部分に特異的にアニールする、請求項23〜44のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも2セットの第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーが、既知のヌクレオチド標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールする、請求項23〜45のいずれか一項記載の方法。
- 複数種の第1の標的特異的プライマーが、同一の5'タグ配列部分を含む、請求項23〜46のいずれか一項記載の方法。
- テール付ランダムプライマーの集団中のそれぞれのテール付ランダムプライマーが、同一の試料バーコード部分をさらに含む、請求項23〜47のいずれか一項記載の方法。
- 複数の試料がそれぞれ、試料バーコード部分を有するテール付ランダムプライマーの別々の集団と接触され、テール付ランダムプライマーの集団がそれぞれ別個の試料バーコード部分を有し、試料が工程(b)後にプールされる、請求項48記載の方法。
- それぞれの増幅工程が、長さが5サイクル〜20サイクルの1セットのPCR増幅レジメンサイクルを含む、請求項23〜49のいずれか一項記載の方法。
- 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが、約61〜72℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、請求項23〜50のいずれか一項記載の方法。
- 標的特異的プライマーおよびテールプライマーが、約65℃のアニーリング温度で相補的配列に特異的にアニールするように設計されている、請求項23〜51のいずれか一項記載の方法。
- 標的核酸分子が試料に由来し、任意で、試料が、対象から得られた生物学的試料である、請求項23〜52のいずれか一項記載の方法。
- 試料が、遺伝子変化に関連する疾患に対する処置を必要とする対象から得られたものである、請求項53記載の方法。
- 疾患が癌である、請求項54記載の方法。
- 試料が腫瘍細胞の集団を含む、請求項53記載の方法。
- 試料が腫瘍生検材料である、請求項53記載の方法。
- 癌が肺癌である、請求項55記載の方法。
- 疾患関連遺伝子が、既知の標的配列を含む、請求項23〜58のいずれか一項記載の方法。
- 試料中の遺伝子再編成産物が、既知の標的配列を含む、請求項53記載の方法。
- 遺伝子再編成産物が癌遺伝子である、請求項60記載の方法。
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