CN106661612A

CN106661612A - 制备用于测序的核酸的方法

Info

Publication number: CN106661612A
Application number: CN201580016908.4A
Authority: CN
Inventors: 贾森·迈尔斯; 乔舒亚·斯托尔; 安东尼·约翰·亚弗拉特; 李龙飞; 郑宗立
Original assignee: Archer Dick Ltd; General Hospital Corp
Current assignee: Asherdex LLC; General Hospital Corp
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2015-01-26
Publication date: 2017-05-10
Also published as: EP3099820A4; US11807897B2; EP4219744A3; EP3099820A1; AU2015209079A1; AU2021245236A1; CA2938080A1; EP4219744A2; US10450597B2; US20240158832A1; US20150211050A1; JP2020182453A; AU2021245236B2; JP7016215B2; JP2017504347A; WO2015112974A1; US20200270671A1; AU2015209079B2

Abstract

本文所公开的技术的方面涉及用于制备和分析核酸的方法。在一些实施方式中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。

Description

制备用于测序的核酸的方法

相关申请

根据35U.S.C.§119，本申请要求2014年1月27日提交的美国临时申请U.S.61/931,959的权益，以引用的方式将其整体内容并入本文。

技术领域

本文所述的技术涉及制备和分析核酸的方法。

背景技术

相比全基因组、全外显子组以及全转录组测序，下一代测序(next-generationsequencing)前的靶富集更具成本效益，因此更适于在研究发现和临床应用中广泛实施。例如，由靶富集方法提供的高覆盖深度(high coverage depth)能够实现较宽动态范围的等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)以及对低频突变的检测(用于评价癌症中的体细胞突变的关键特征)。目前用于下一代测序的富集方案的实例包括：基于杂交的捕获分析(TruSeq Capture，Illumina；SureSelect Hybrid Capture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的分析(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，Ion Torrent；TruSeq扩增子，Illumina；乳液/数字PCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获到被捕获探针覆盖的靶向序列，还捕获到了消耗测序能力的附近的脱靶碱基(near off-target bases)。此外，这些方法都比较费时、劳动密集、并且特异性水平较低。

发明内容

本文所公开的技术的方面涉及用于制备和分析核酸的方法。在一些实施方式中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。在一些实施方式中，本文所述的技术针对确定核酸的核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及在测序前对靶核酸进行富集。

本文所公开的技术的方面涉及确定与已知的靶核苷酸序列邻近(contiguous to)的核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与起始靶特异性引物接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与加尾随机引物群接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(e)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套(nested)。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。

在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与起始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。

在一些实施方式中，所述方法进一步涉及在起始靶特异性引物的延伸之后，使样品和/或产物与RNase接触的步骤。在一些实施方式中，加尾随机引物可形成发夹环结构。在一些实施方式中，起始靶特异性引物和第一靶特异性引物相同。在一些实施方式中，在与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的3’核酸序列之间，加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码(barcode)部分。

在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(d)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(c)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(e)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(d)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列、含有6个-12个随机核苷酸的中间的条形码部分以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，在与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列之间，各加尾随机引物进一步包含间隔区核酸序列。在特定的实施方式中，在延伸步骤之后，将未杂交的引物从反应中移除。在一些实施方式中，第二尾引物相对于第一尾引物通过至少3个核苷酸嵌套。在特定的实施方式中，第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不与任何引物的任何其它部分相同的具有高GC含量的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物与全长的第一测序引物相同。在特定的实施方式中，特异性地退火至已知靶标的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中于约65℃的温度下特异性地退火。在一些实施方式中，所述样品包含基因组DNA。在一些实施方式中，所述样品包含RNA，且所述方法进一步包括使所述样品经受逆转录酶方案的第一步骤。在特定的实施方式中，存在于样品中的核酸未经受剪切或消化。在一些实施方式中，所述样品包含单链gDNA或单链cDNA。在特定的实施方式中，逆转录酶方案包括随机六聚体的使用。在一些实施方式中，基因重排包括已知的靶序列。在特定的实施方式中，基因重排存在于选自于由基因组DNA、RNA和cDNA所组成的组中的核酸。在一些实施方式中，基因重排包括癌基因。在特定的实施方式中，基因重排包括融合癌基因。在一些实施方式中，通过下一代测序法对核酸产物进行测序。在特定的实施方式中，下一代测序法包括选自于由如下所组成的组中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序以及DNA纳米球测序。在特定的实施方式中，第一测序引物和第二测序引物兼容所选的下一代测序法。在一些实施方式中，所述方法包括使所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。在特定的实施方式中，所述方法包括使包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。在一些实施方式中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至单独的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。在特定的实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。在特定的实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同外显子。在一些实施方式中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。在特定的实施方式中，加尾随机引物群中的各加尾随机引物进一步包含相同的样品条形码化部分。在一些实施方式中，使多种样品各自与具有样品条形码化部分的单独的加尾随机引物群接触；其中，加尾随机引物群各自具有不同的样品条形码化部分；并且其中，在步骤(b)后将所述样品合并(pooled)。在特定的实施方式中，各扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，对靶特异性引物和尾引物进行设计，从而使其在约61℃-72℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，对靶特异性引物和尾引物进行设计，从而使其在约65℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在特定的实施方式中，靶核酸分子来自样品，任选地所述样品是获得自受试者的生物样品。在一些实施方式中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变(geneticalteration)相关的疾病的受试者。在特定的实施方式中，所述疾病为癌症。在一些实施方式中，所述样品包括肿瘤细胞群。在特定的实施方式中，所述样品是肿瘤活检物(biopsy)。在一些实施方式中，所述癌症为肺癌。在特定的实施方式中，与疾病相关的基因包含已知的靶序列。在一些实施方式中，样品中的基因重排产物包含已知的靶序列。在特定的实施方式中，基因重排产物是癌基因。

本文所公开的技术的方面涉及制备用于分析的核酸的方法。在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在促进模板特异性杂交和靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补靶特异性引物接触；以及(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同杂交序列的5’端，其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有靶特异性引物的特征的序列和具有多个不同引物的至少一个的特征的序列。在一些实施方式中，靶核酸是核糖核酸。在特定的实施方式中，靶核酸是脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，顺序进行步骤(a)和步骤(b)。在特定的实施方式中，步骤(a)中的核酸模板包含从步骤(b)中的多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。在一些实施方式中，步骤(b)中的核酸模板包含从步骤(a)中的靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。在特定的实施方式中，靶核酸是编码自包含基因重排的染色体片段的信使RNA。在一些实施方式中，靶核酸是包含基因重排的一部分的染色体片段。在特定的实施方式中，基因重排是倒位、缺失或易位。在一些实施方式中，所述方法进一步涉及对延伸产物进行扩增。在特定的实施方式中，所述方法进一步涉及在杂交发生在延伸产物和固定的寡核苷酸之间的条件下，使延伸产物或扩增的延伸产物与固定的寡核苷酸接触。在特定的实施方式中，靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的侧翼部分。在一些实施方式中，不同的杂交序列与侧翼部分互补。在特定的实施方式中，靶特异性杂交序列与靶部分互补。在一些实施方式中，靶特异性引物进一步包含：靶特异性杂交序列的5’端；索引序列(index sequence)、条形码序列和接头序列中的至少一个。在特定实施方式中，共同序列包含索引序列、条形码序列和接头序列中的至少一个。在一些实施方式中，接头序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接头序列。

附图说明

图1A和图1B描述了如本文所述的用于对侧翼有3’未知融合伴侣(fusionpartner)的靶核酸进行扩增和测序的工作流程的非限制性实施方式。

图2A和图2B描述了如本文所述的用于对侧翼有5’未知融合伴侣的靶核酸进行扩增和测序的工作流程的非限制性实施方式。

图3描述了如本文所述的使用包含发夹的寡核苷酸对侧翼有3’未知融合伴侣的靶核酸进行扩增和测序的工作流程的非限制性实施方式。

具体实施方式

本文所公开的技术的方面涉及用于制备和分析核酸的方法。在一些实施方式中，本文提供的方法用于确定与已知的靶核苷酸序列邻近(邻接)的未知核苷酸序列。传统测序方法随机地生成序列信息(例如，“鸟枪”测序)，或生成用于设计引物的两个已知序列间的序列信息。相比之下，在一些实施方式中，本文所述的方法使得能够以高特异性水平和高灵敏度水平确定已知序列的单个区域的上游或下游的核苷酸序列(例如，测序)。因此，在一些实施方式中，本文提供的方法用于确定由基因排列(例如，引起癌症或其它病症的重排)产生的融合物(例如，融合mRNA)的序列。在一些实施方式中，本文提供的制备用于分析(例如，用于测序)的核酸的方法涉及：使用靶向靶核酸的已知序列(例如，第一基因的已知序列)的靶特异性引物的第一轮延伸，随后为涉及使用加尾引物(例如，加尾随机引物)的异源性群的第二轮延伸，所述加尾引物的异源性群包括具有与邻接至靶核酸中的已知序列的未知序列互补的杂交序列的加尾引物。在一些实施方式中，加尾引物的尾区域包含促进靶核酸的多重扩增和富集的条形码序列或索引序列。

在本文公开的技术的一些方面，提供了制备用于分析的核酸的方法，所述方法涉及：(a)在促进模板特异性杂交和靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补的靶特异性引物接触；以及(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同杂交序列的5’端，其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有靶特异性引物特征的序列和具有多个不同引物的至少一个的特征的序列。在一些实施方式中，顺序进行上述步骤(a)和步骤(b)。在一些实施方式中，步骤(a)中的核酸模板包含从步骤(b)中的多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。在一些实施方式中，步骤(b)中的核酸模板包含从步骤(a)中的靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。

在一些实施方式中，提供了用于制备核酸的方法，所述核酸具有邻接区域(例如，未知序列的邻接区域)的5’端的靶区域。在一些实施方式中，本文提供的方法可使用一轮或多轮PCR来完成。

例如，图1A-图1B示出了对靶核酸进行扩增的示例性方法的示意图，所述靶核酸具有邻接区域的5’端的已知靶区域(例如，出于对邻接区域进行测序的目的)。在步骤101，在样品中获得或提供起始RNA，并将其用作模板。将RNA模板暴露至包含共同序列的多个加尾引物(例如，加尾随机引物)，所述共同序列为不同杂交序列的5’端并在全部加尾引物群间共享。在一些实施方式中，至少一个引物杂交至RNA分子，并启动逆转录酶反应以产生互补的DNA链。在步骤102中，对未杂交的寡核苷酸进行降解(例如，酶促降解，如通过核酸外切酶降解)。在步骤102中，从互补的DNA链对RNA模板进行降解。

在一些实施方式中，提供了加尾引物，所述加尾引物杂交至RNA分子的多聚A尾。在一些实施方式中，提供了引物序列，所述引物序列杂交至包含多聚dT(例如，定位于3’端的2个dT、3个dT、4个dT、5个dT、6个dT、7个dT、8个dT、9个dT、10个dT或以上的延展段(stretch))的多聚A尾。在一些实施方式中，提供了多个加尾引物，各加尾引物进一步包含条形码序列或索引序列。

应当理解的是，在本文公开的方法中RNA模板可通过任何适当的方法来降解，包括例如通过酶促降解(例如，使用RNaseH、尿嘧啶糖基化酶等)、通过水解(例如，将RNA暴露至相对高的pH条件(例如，pH 10、pH 11、pH 12))等。在一些实施方式中，通过暴露至相对高的pH来水解RNA是有利的，因为其相对便宜(相较于一些其它的方法，如一些酶促方法)，而且因为其同时破坏RNA和DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，在相对高的温度下(例如，高于60℃(例如，60℃至95℃)的温度)，通过暴露至相对高的pH条件而引起的水解来降解RNA。在一些实施方式中，使用相对高的温度是有利的，因为其热度使在先制备步骤中使用的酶(例如，RT酶)失活。在一些实施方式中，起始核酸可以是在样品中获得或提供并被用作模板的DNA。在此类实施方式中，可将步骤101和步骤102省略。

在步骤103中，通过一个或多个起始靶特异性引物来接触通过逆转录产生的DNA分子，所述起始靶特异性引物可与第一靶特异性引物相同或不同。在步骤104中，起始靶特异性引物杂交至靶核酸(“靶序列”)的一部分启动了使用DNA分子作为模板以产生互补的DNA链的延伸反应。在步骤105中纯化延伸产物。然而，在一些实施方式中，可例如通过PCR对在步骤104中产生的DNA进行直接扩增，无需纯化。

在步骤106中，通过第一靶特异性引物和第一尾引物来接触DNA分子。第一靶特异性引物杂交至靶核酸的一部分。在一些实施方式中，可将不同的第一靶特异性引物的池(pool)用于杂交至靶核酸的不同部分。在一些实施方式中，使用不同的靶特异性引物可以是有利的，因为这使得能够产生相对于靶核酸而言具有重叠但交错的序列的不同的延伸产物。在一些实施方式中，可对不同的延伸产物进行测序，以产生重叠的序列读取段(sequence reads)。在一些实施方式中，可对重叠序列读取段进行评估，以评价序列信息的准确性、核酸扩增的保真度和/或检测突变(例如，检测染色体重排的位置(例如，融合断点))方面的增高的置信度。在一些实施方式中，可将不同的第一靶特异性引物的池用于杂交至存在于样品中的不同的靶核酸的不同部分。在一些实施方式中，使用不同的靶特异性引物的池是有利的，因为这促进了不同的靶核酸的平行加工(例如，扩增)和分析。在一些实施方式中，使用了多至2个、多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至7个、多至8个、多至9个、多至10个、多至15个、多至20个、多至100个或更多的不同的第一靶特异性引物的池。在一些实施方式中，使用了2个-5个、2个-10个、5个-10个、5个-15个、10个-15个、10个-20个、10个-100个、50个-100个或更多的不同的第一靶特异性引物的池。

在图1A和图1B中，第一尾引物杂交至由步骤101的加尾引物的尾部分提供的DNA分子的至少一部分。在一些实施方式中，第一尾引物杂交至由步骤101的一个或多个引物的尾提供的共同序列。在一些实施方式中，在步骤106中使用嵌套的靶特异性引物(相对于步骤103的靶特异性引物嵌套)。在一些实施方式中，第一尾引物可包含例如杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在步骤107中，第一靶特异性引物和第一尾核酸分子的杂交使得产物能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增。在一些实施方式中，在步骤108中纯化扩增产物。

在一些实施方式中，对步骤103的ssDNA产物直接进行扩增(例如，通过PCR)，而不进行步骤104的延伸反应和步骤105的纯化。类似地，在本文所公开的任何方法的一些实施方式中，可在纯化和/或PCR前对ssDNA产物直接进行扩增(例如，通过PCR)以产生dsDNA，而不进行延伸反应。在一些实施方式中，可在PCR期间加入第一尾引物和第二尾引物。在一些实施方式中，将引物(例如，第一尾引物、靶特异性引物)用于PCR或延伸反应中，然后使用单链核酸酶将过量的引物移除。随后数轮的PCR或延伸可使用不同的引物(例如，第二尾引物或嵌套引物或第二靶特异性引物)进行，以将不同序列加入到所得到的产物中。

在一些实施方式中，可将核酸外切酶(例如，ExoI)用于降解单链DNA。在一些实施方式中，将核酸外切酶用于降解ssDNA，并根据步骤109_A-B和步骤110_A-B对扩增产物直接进行加工，无需在步骤108的纯化。

在图1A中，在步骤109_A，使步骤107的扩增的DNA产物(例如，在步骤108中纯化的)与第二靶特异性引物和第二尾引物接触。在一些实施方式中，第二靶特异性引物杂交至存在于第一靶特异性引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，从而使所述反应被嵌套。在一些实施方式中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物的嵌套可提高杂交反应的特异性。在一些实施方式中，第二靶特异性引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含例如条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在步骤110_A中，将步骤107的扩增的DNA产物(例如，在步骤108中纯化的)通过PCR进行扩增，其中，通过第二靶特异性引物和第二尾引物启动延伸。在一些实施方式中，对来自步骤107的扩增产物的一部分进行进一步的扩增。在一些实施方式中，使用第三引物，所述第三引物杂交至第二靶特异性引物中的共同尾并添加了诸如条形码序列、接头等的附加序列。

在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含靶特异性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含条形码序列、索引序列或接头序列。在一些实施方式中，第二尾引物杂交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，从而使所述反应被嵌套。在此类实施方式中，对来自步骤106的产物的一部分进行扩增。在一些实施方式中，第二尾引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在PCR反应中，第二靶特异性引物和第二尾引物的杂交使得靶核酸分子的一部分能够指数扩增。

在一些实施方式中，步骤106的第一靶特异性引物可与第二靶特异性引物一起使用。在此类实施方式中，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的杂交使得产物能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增。在一些实施方式中，可将步骤108-步骤110省略。在反应111中将扩增产物纯化，并准备用于分析。例如，可对在步骤111中纯化的产物进行测序(例如，使用下一代测序平台)。在一些实施方式中，第一靶特异性引物或第二靶特异性引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。

在一些实施方式中，如图1B中所描述的，在步骤109_B中，使步骤107的DNA产物(例如，在步骤108中纯化的)与第二靶特异性引物和第二尾引物接触。通过与第二靶特异性引物的共同序列杂交的附加引物(例如，具有3’端测序接头序列/索引序列的引物)，对第二靶特异性引物进行进一步接触。在一些实施方式中，附加引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在一些实施方式中，附加引物是通用的测序接头引物/索引引物。在一些实施方式中，第二靶特异性引物可相对于步骤107中使用的靶特异性引物嵌套。在步骤110_B中，通过PCR对步骤107的DNA产物(例如，在步骤108中纯化的)进行扩增，其中，通过第二靶特异性引物和第二尾引物启动延伸。在PCR反应中，第二靶特异性引物、附加引物以及第二尾引物的杂交使得靶核酸分子的一部分能够指数扩增。在此类实施方式中，对来自步骤108的扩增产物的一部分进行扩增。

在一些实施方式中，步骤106的第一尾引物可与第二靶特异性引物一起使用。在此类实施方式中，第一尾引物和第二靶特异性引物的杂交使得产物能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增，任选地具有与第二靶特异性引物的共同序列杂交的附加引物(例如，具有3’端测序接头序列/索引序列的引物)。在一些实施方式中，可将步骤108-步骤110省略。

将产物在反应111中纯化，并准备用于分析。例如，可对在步骤111中纯化的产物进行测序(例如，使用下一代测序平台)。

在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤101-步骤104、步骤106-步骤107以及步骤109-步骤110，无需任何间插的纯化步骤。在一些实施方式中，步骤101-步骤104、步骤106-步骤107以及步骤109-步骤110中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤101-步骤104。在一些实施方式中，步骤101-步骤104中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤106-步骤107。在一些实施方式中，步骤106-步骤107中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤109_A-步骤110_A或步骤109_B-步骤110_B。在一些实施方式中，步骤109_A-步骤110_A或步骤109_B-步骤110_B中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。

在一些实施方式中，提供了用于制备核酸的方法，所述核酸具有邻接区域(例如，未知序列内含物的邻接区域)的3’端的靶区域。例如，图2示出了对靶核酸进行扩增和测序的示例性方法的示意图，所述靶核酸具有邻接区域的3’端的已知靶区域。在图2A-图2B中，在样品中获得或提供起始RNA(例如，融合mRNA)，并将其用作处理方法的模板。在步骤201，将RNA模板暴露至一个或多个起始靶特异性引物，所述起始靶特异性引物杂交至一个或多个靶核苷酸序列并起到启动逆转录反应的作用，从而使用起始RNA作为模板产生互补的DNA分子。在一些实施方式中，起始靶特异性引物杂交至RNA模板的多聚A尾。在一些实施方式中，杂交至多聚A尾的引物序列包含多聚dT(例如，定位于3’端的2个dT、3个dT、4个dT、5个dT、6个dT、7个dT、8个dT、9个dT、10个dT或以上的延展段)。在步骤202中，对未杂交的引物进行降解(例如酶促降解，如通过核酸外切酶降解)。在步骤202中，从互补的DNA链对RNA模板进行降解(例如酶促降解，如通过RNaseH降解)。

在步骤203中，通过加尾引物(例如，加尾随机引物)的异源性群对通过逆转录生成的DNA分子进行接触。在一些实施方式中，各加尾引物的尾部分是在加尾引物群的全部引物之间相同的共享序列或共同序列。在一些实施方式中，至少一个引物包含与靶核酸模板互补并杂交至靶核酸模板的杂交序列。在步骤204中，将与模板核酸杂交的加尾引物在模板依赖性延伸反应中延伸，以产生加入加尾引物序列和模板序列的互补的DNA链。在步骤205中将所得到的双链DNA产物纯化。

在步骤206中，使在步骤205中纯化的DNA产物与第一靶特异性引物和第一尾引物接触。第一靶特异性引物杂交至DNA的靶序列(区域)。第一尾引物杂交至具有步骤203的加尾引物的尾特征的DNA分子的一部分。在一些实施方式中，第一尾引物杂交至由步骤203的一个或多个引物的尾提供的共同序列。在一些实施方式中，第一尾引物包含条形码序列或索引序列。在步骤207中，第一靶特异性引物和第一尾引物的杂交促进了靶核酸分子的一部分在扩增反应(例如，PCR反应)中的指数扩增。在一些实施方式中，第一尾引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在步骤208中将扩增产物进行纯化。在一些实施方式中，略过在步骤208中的纯化。例如，在一些实施方式，将引物(例如，第二靶特异性引物和第二尾引物)用于PCR或延伸反应中，然后使用单链DNA核酸酶将过量的引物移除。随后数轮的PCR或延伸可使用不同的引物进行，以将不同的序列加入到所得到的产物中。

在一些实施方式中，如在图2A中的步骤209_A所描述的，使步骤207中产生的DNA分子(例如，在步骤208中纯化的)与第二靶特异性引物和第二尾引物接触。在一些实施方式中，第二靶特异性引物相对于步骤207中所使用的靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，对来自步骤209_A的产物的至少一部分进行扩增。

在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含靶特异性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含条形码序列、索引序列或接头序列。在一些实施方式中，第二尾引物杂交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，从而使所述反应被嵌套。在一些实施方式中，对来自步骤209_A的产物的至少一部分进行扩增。

在一些实施方式中，步骤206的第一尾引物可与第二靶特异性引物一起使用。在此类实施方式中，第一尾引物和第二靶特异性引物的杂交使得产物能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增。在此类实施方式中，可将步骤208-步骤210省略。

在一些实施方式中，如在图2B中的步骤209_B所描述的，使在步骤207中产生的DNA分子(例如，在步骤208中纯化的)与第二靶特异性引物和第二尾引物接触，其中，第二靶特异性引物杂交至存在于第一靶特异性引物序列的3’端的模板DNA分子中的靶序列，从而使所述反应被嵌套。在一些实施方式中，对来自步骤209_B的产物的至少一部分进行扩增。

在一些实施方式中，通过附加引物(例如，具有3’端测序接头序列/索引序列的引物)对第二靶特异性引物进行进一步接触，所述附加引物与第二靶特异性引物的共同序列杂交。在一些实施方式中，附加引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在一些实施方式中，附加引物是通用的测序接头引物/索引引物。在此类实施方式中，第二靶特异性引物、附加引物以及第二尾引物的杂交使得靶核酸分子的一部分能够在PCR反应中指数扩增。

在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含靶特异性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含条形码序列、索引序列或接头序列。在一些实施方式中，第二尾引物杂交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，从而使所述反应被嵌套。在一些实施方式中，对来自步骤209_B的产物的至少一部分进行扩增。

在一些实施方式中，第二尾引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在步骤210中，第二靶特异性引物和第二尾引物的杂交促进了靶核酸分子的一部分在扩增反应中(例如，PCR反应)指数扩增。将步骤210的扩增产物在反应211中纯化，并准备用于分析。例如，可对在步骤211中纯化的产物进行测序(例如，使用下一代测序平台)。

在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤201-步骤204。在一些实施方式中，步骤201-步骤204中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤206-步骤207。在一些实施方式中，步骤206-步骤207中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤209_A-步骤210或步骤209_B-步骤210。在一些实施方式中，步骤209_A-步骤210或步骤209_B-步骤210中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。

在一些实施方式中，本文提供的方法涉及使用随机序列作为分子条形码。在一些实施方式中，将分子条形码构建到引物中(例如，RT引物、靶特异性引物、延伸序列引物)，从而使得通过引物产生的个体分子各自获得独特的条形码标签。因此，在一些实施方式中，分子条形码标签使得能够确定测序分子是否独特。在一些实施方式中，分子条形码可用于消除测序错误、提高融合或其它突变所需要的置信度，并提高检测限。

在一些实施方式中，提供了使用包含发夹的寡核苷酸来制备核酸的方法，所述核酸具有邻接区域(例如，未知序列的邻接区域)的5’端的靶区域。在一些实施方式中，寡核苷酸可具有非发夹结构，例如，寡核苷酸可以是线性的。例如，图3示出了用于扩增靶核酸的示例性方法的示意图，所述靶核酸具有邻接区域的5’端的已知靶区域(出于对邻接区域进行测序的目的)。在步骤301，在样品中获得或提供起始RNA，并将其用作处理方法的模板。将RNA模板暴露至包含发夹序列的多个发夹引物(例如，具有发夹尾的随机引物)，所述发夹序列是不同的杂交序列的5’端并在全部引物群之间共享。发夹序列包含位于分子条形码序列(MBC)侧翼的两个互补的共同序列。互补的共同序列碱基配对形成茎环发夹结构并保护MBC序列。在一些实施方式中，多个引物处于另一结构(非发夹结构)中，并包含位于分子条形码序列(MBC)侧翼的两个互补的共同序列。在一些实施方式中，至少一个引物杂交至RNA分子并启动逆转录酶反应，以产生互补的DNA链。在一些实施方式中，引物杂交至RNA分子的多聚A尾。在一些实施方式中，杂交至多聚A尾的引物序列包含多聚dT(例如，定位于3’端的2个dT、3个dT、4个dT、5个dT、6个dT、7个dT、8个dT、9个dT、10个dT或以上的延展段)。在步骤302中，对任何未杂交的寡核苷酸进行酶促降解(例如，通过核酸外切酶降解)。同样，在步骤302中，从互补的DNA链对RNA模板进行酶促降解(例如，通过RNaseH降解)。

在步骤303中，通过一个或多个起始靶特异性引物对通过逆转录产生的DNA分子进行接触，所述起始靶特异性引物可与第一靶特异性引物相同或不同。在步骤304中，第一靶特异性引物杂交至靶核酸引物的一部分启动了如下延伸反应，所述延伸反应使用DNA分子作为模板以产生互补的DNA链。在一些实施方式中，互补的DNA链的合成可降低或消除互补的共同序列的发夹形成。在步骤305中将延伸产物纯化。

在步骤306中，通过第一靶特异性引物和加尾引物对DNA分子进行接触。第一靶特异性引物杂交至靶核酸的一部分。第一尾引物杂交至通过在发夹形成步骤301中涉及的共同序列提供的DNA分子的一部分。在一些实施方式中，在步骤306中使用嵌套的靶特异性引物(例如，相对于步骤303的靶特异性引物嵌套)。在一些实施方式中，第一加尾引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含例如条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。在步骤307中，各第一靶特异性引物和加尾引物的杂交使得靶核酸分子的一部分能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增。在一些实施方式中，在步骤308中将扩增产物纯化。

在步骤309中，使扩增的DNA产物(例如，在步骤308中纯化的扩增的DNA产物)与第二靶特异性引物和共同序列引物接触。在一些实施方式中，第二靶特异性引物杂交至存在于第一靶特异性引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，从而使所述反应被嵌套。在一些实施方式中，共同序列引物与在步骤306中由第一尾引物所提供的序列杂交。在一些实施方式中，在步骤310中，通过PCR对在步骤308中纯化的DNA产物进行扩增，其中，所述延伸通过第二靶特异性引物和共同序列引物启动。在一些实施方式中，可对来自步骤308的扩增产物进行扩增。

在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含靶特异性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含条形码序列、索引序列或接头序列。在一些实施方式中，第二尾引物杂交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，以便使所述反应被嵌套。在此类实施方式中，对来自步骤308的产物的一部分进行扩增。在一些实施方式中，共同序列引物可包含杂交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含条形码序列、索引序列、接头序列或测序引物位点。第二靶特异性引物和共同序列引物的杂交使得靶核酸分子的一部分能够在PCR反应中指数扩增。在一些实施方式中，在反应311中将用于分析的产物纯化。例如，可对在步骤311中纯化的产物进行测序(例如，使用下一代测序平台)。

在一些实施方式中，在步骤301-步骤311中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤301-步骤304、步骤306-步骤307以及步骤309-步骤310，无需任何间插的纯化步骤。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤301-步骤304。在一些实施方式中，在步骤301-步骤304中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤306-步骤307。在一些实施方式中，在步骤306-步骤307中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。在一些实施方式中，在单个反应管中接连进行步骤309-步骤310。在一些实施方式中，在步骤309-步骤310中所涉及的全部组份在反应开始时并在整个反应中存在。

在一些实施方式中，本文提供了涉及确定与已知的靶核苷酸序列邻近(邻接)的核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在合适的杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与起始靶特异性引物接触。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将靶核酸分子保持在促进杂交的起始靶特异性引物延伸(例如，使用靶核酸分子作为模板)的条件下，从而产生第一延伸产物。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在合适的杂交条件下，使延伸产物与加尾随机引物群接触。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将延伸产物保持在促进杂交的加尾随机引物延伸(使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板)的条件下，从而产生第二延伸产物。在一些实施方式中，所述方法进一步包括用第一尾引物和第一靶特异性引物对靶核酸分子的一部分和加尾随机引物序列进行扩增，从而产生第一扩增子。在一些实施方式中，所述方法进一步包括用第二尾引物和第二靶特异性引物对扩增子的一部分进行扩增，从而产生第二扩增子。

在一些实施方式中，所述方法中使用的一个或多个靶特异性引物可相对于一个或多个其它的靶特异性引物嵌套。例如，在一些实施方式中，第二靶特异性引物在第一靶特异性引物内部。在一些实施方式中，靶特异性引物相同。在一些实施方式中，靶特异性引物相对于靶互补物嵌套但重叠。在一些实施方式中，靶特异性引物嵌套且非重叠。在一些实施方式中，在相同或不同的扩增步骤中使用相同和嵌套的靶特异性引物的组合。在一些实施方式中，引物的嵌套增加了靶特异性。在一些实施方式中，所述方法进一步包括使用第一测序引物和第二测序引物对第二扩增子进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括如下单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有5’核苷酸序列(与第一测序引物相同)和包含随机核苷酸(例如，约6个-约12个随机核苷酸)的3’核苷酸。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含能够在适当的退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知核苷酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至第一扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物的尾的共同序列相同的核酸序列。在一些实施方式中，加尾随机引物上的共同序列与第一尾引物上的共同序列的精确匹配。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。

本文所使用的术语“靶核酸”是指感兴趣的核酸分子(例如，待分析的核酸)。在一些实施方式中，靶核酸同时包含靶核苷酸序列(例如，已知或预先确定的核苷酸序列)和待确定的邻接的核苷酸序列(可将其称作未知序列)。靶核酸可具有任何适当的长度。在一些实施方式中，靶核酸是双链的。在一些实施方式中，靶核酸是DNA。在一些实施方式中，靶核酸是基因组DNA或染色体DNA(gDNA)。在一些实施方式中，靶核酸可以是互补的DNA(cDNA)。在一些实施方式中，靶核酸是单链的。在一些实施方式中，靶核酸可以是RNA，例如mRNA、rRNA、tRNA、长链非编码RNA、微小RNA。

本文所使用的术语“已知的靶核苷酸序列”是指其序列(例如，核酸的核苷酸碱基的种类(identity)和顺序)是已知的靶核酸的一部分。例如，在一些实施方式中，已知的靶核苷酸序列是已知的核酸的核苷酸序列或在对核酸的邻接的未知序列进行综合分析(interrogation)之前已测定的核酸的核苷酸序列。已知的靶核苷酸序列可具有任何适当的长度。

在一些实施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)的长度为10个以上的核苷酸、30个以上的核苷酸、40个以上的核苷酸、50个以上的核苷酸、100个以上的核苷酸、200个以上的核苷酸、300个以上的核苷酸、400个以上的核苷酸、500个以上的核苷酸。在一些实施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)的长度范围为10-100个核苷酸、10-500个核苷酸、10-1000个核苷酸、100-500个核苷酸、100-1000个核苷酸、500-1000个核苷酸、500-5000个核苷酸。

在一些实施方式中，本文提供了用于确定核酸的邻近(或邻接)部分的序列的方法。本文所使用的术语“与…邻近的核苷酸序列”是指为紧接另一核苷酸序列(例如，已知的核苷酸序列)的上游或下游的核酸分子(例如，靶核酸)的核苷酸序列。在一些实施方式中，与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列可具有任何适当的长度。在一些实施方式中，与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列包含1kb以下的核苷酸序列，例如1kb以下的核苷酸序列、750bp以下的核苷酸序列、500bp以下的核苷酸序列、400bp以下的核苷酸序列、300bp以下的核苷酸序列、200bp以下的核苷酸序列、100bp以下的核苷酸序列。在一些实施方式中，在样品包含含有已知的靶核苷酸序列的不同的靶核酸(例如，已知的靶核苷酸序列在其基因组中、或在单独的非全同染色体上出现多次的细胞)的情况中，可存在含有“与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列”的多个序列。本文所使用的术语“确定核苷酸序列”是指确定核酸的核苷酸碱基的种类和相对位置。

在本文公开的方法的一些实施方式中，将一个或多个加尾随机引物杂交至核酸模板(例如，包含靶核酸链的模板)。在一些实施方式中，靶核酸存在于或获得自包含多种核酸的样品，所述核酸的一种或多种大多不包含靶核酸。在一些实施方式中，一个或多个引物(例如，一个或多个加尾随机引物)基本上杂交至样品中的所有核酸。在一些实施方式中，一个或多个引物(例如，一个或多个加尾随机引物)杂交至包含靶核酸的核酸并杂交至不包含靶核苷酸序列的核酸。

本文公开的一些方法的方面涉及使核酸模板与共享如下共同序列的多种不同引物接触，所述共同序列为不同的杂交序列的5’端(或上游)。在一些实施方式中，可将多种不同引物称为不同引物群。在一些实施方式中，可将共同序列称为尾，就这方面而言，将引物称为“加尾引物”。在一些实施方式中，群的不同的杂交序列包含在群中随机或伪随机出现的核苷酸序列。在一些实施方式中，在群中随机出现的核苷酸序列不包含可识别的规律，以便对于群中的各序列的各核苷酸而言，核苷酸包含与A、T、G或C互补的碱基的可能性相同。在此类实施方式中，应当理解的是包含与A、T、G或C互补的碱基的各核苷酸可以是天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸。

本文使用的“共同序列”或“共享的序列”是指存在于核酸群的各核酸中的核苷酸序列。在一些实施方式中，共同序列的长度范围为约4个-75个、4个-50个、4个-30个或4个-20个核苷酸。在一些实施方式中，共同序列的长度为4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个或75个核苷酸。

本文所使用的术语“加尾随机引物”是指具有5’核苷酸序列(例如，与第一测序引物相同或互补的5’核苷酸序列)和3’核酸序列的单链核酸分子，其中，3’核苷酸包含随机核苷酸(例如，约3个-约15个随机核苷酸、约6个-约12个随机核苷酸)。在一些实施方式中，包含随机核苷酸的3’核苷酸序列的长度为至少6个核苷酸，例如，长度为6个核苷酸以上、7个核苷酸以上、8个核苷酸以上、9个核苷酸以上、10个核苷酸以上、11个核苷酸以上、12个核苷酸以上、13个核苷酸以上、14个核苷酸以上、15个核苷酸以上、20个核苷酸以上、25个核苷酸以上。在一些实施方式中，包含随机核苷酸的3’核苷酸序列的长度为3个-6个核苷酸、长度为3个-9个核苷酸、长度为3个-12个核苷酸、长度为5个-9个核苷酸、长度为6个-12个核苷酸、长度为3个-25个核苷酸、长度为6个-15个核苷酸或长度为6个-25个核苷酸。在一些实施方式中，在5’核苷酸序列和包含约6个-约12个随机核苷酸的3’核苷酸序列之间，加尾随机引物可进一步包含间隔物。在一些实施方式中，所述间隔物是分子条形码，例如，独立地给模板核酸(例如，模板RNA)加标签的分子条形码。在一些实施方式中，所述间隔物的长度可为3个-6个核苷酸、长度为3个-12个核苷酸、长度为3个-25个核苷酸、长度为3个-45个核苷酸、长度为6个-12个核苷酸、长度为8个-16个核苷酸、长度为6个-25个核苷酸或长度为6个-45个核苷酸。在一些实施方式中，对于引物群而言，所述间隔物由随机核苷酸组成(例如，NNNNNNNNN，其中各个N独立地选自A、G、C和T)。在一些实施方式中，互补的两个共同区域位于所述间隔物(例如，分子条形码(MBC))的侧翼。在一些实施方式中，互补的共同区域碱基配对形成具有环部分的发夹的茎，所述环部分包含MBC(例如，在图3中所描述的)。在一些实施方式中，在5’端融合的情况中，这一发夹构型保护MBC，以免使其退火至抑制延伸反应的RT反应的其它靶标。在一些实施方式中，加尾随机引物群可包含具有变化的3’序列的个体引物。在一些实施方式中，加尾随机引物群可包含具有相同的5’核苷酸序列的个体引物，例如，所述个体引物均与相同的测序引物兼容。在一些实施方式中，加尾随机引物群可包含具有变化的5’核苷酸序列的个体引物，例如，第一个体引物与第一测序引物兼容，且第二个体引物与第二测序引物兼容。

本文所使用的“杂交序列”是指与另一核酸(例如，模板分子、靶序列)的序列充分互补以使得能够在核酸之间杂交的核酸序列(例如，引物的一部分)。在一些实施方式中，杂交序列的长度为约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多的核苷酸。在一些实施方式中，杂交序列的长度范围为5个-50个核苷酸、长度为5个-40个核苷酸、长度为5个-35个核苷酸、长度为5个-30个核苷酸、长度为5个-25个核苷酸、长度为5个-20个核苷酸、长度为5个-15个核苷酸、长度为5个-10个核苷酸、长度为10个-40个核苷酸、长度为10个-30个核苷酸或长度为10-20个核苷酸。

在一些实施方式中，本文所公开的方法包括延伸方案或延伸步骤。在此类实施方式中，延伸可使用杂交有引物的核酸分子作为模板，从一个或多个杂交的加尾随机引物进行。本文对延伸步骤进行了描述。在一些实施方式中，一个或多个加尾随机引物可基本上杂交至样品中的所有核酸，样品中的许多核酸可能不含已知的靶核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，由于使用不含已知的靶核苷酸序列的模板进行杂交，可出现随机引物的延伸。

在一些实施方式中，本文所述的方法可涉及聚合酶链式反应(PCR)扩增方案，所述扩增方案涉及一个或多个扩增循环。本文所使用的术语“扩增方案”是指特异性地扩增感兴趣的核酸(增加感兴趣的核酸的丰度)的程序。在一些实施方式中，当先前的聚合酶延伸产物作为相继的多轮延伸的模板时，指数扩增出现。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法的PCR扩增方案可包括至少1个、在一些情况中至少5个以上的重复循环。在一些实施方式中，各重复循环包括以下步骤：1)链分离(例如，热变性)；2)寡核苷酸引物退火至模板分子；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。应该理解的是，可使用这些步骤中各自涉及的任何适合的条件和时间。在一些实施方式中，选定的条件和时间可取决于与反应中使用的核酸模板和/或引物相关的长度、序列内容物、解链温度、二级结构特征或其它因素。在一些实施方式中，根据本文所述方法的扩增方案在热循环仪中进行，许多热循环仪是可商购的。

在一些实施方式中，核酸延伸反应涉及核酸聚合酶的使用。本文所使用的短语“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合，以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3’末端起始合成，并以朝向模板的5’末端的方向进行。众多的核酸聚合酶在本领域中是已知并可商购的。一组核酸聚合酶是热稳定的，即核酸聚合酶在经受了足以使互补核酸的退火链变性的温度(例如，94℃)或有时更高的温度之后，仍保留功能。扩增方案的非限制性实例涉及在下列条件下使用聚合酶(例如，PhoenixTaq、VeraSeq)：98℃下30秒，随后为包含在98℃下解链10秒的14个-22个循环，然后在68℃退火30秒，随后在72℃下延伸3min，然后将反应保持在4℃下。然而，可使用其它适当的反应条件。在一些实施方式中，可对退火/延伸温度进行调节，以在盐浓度中引起差异(例如，3℃以上对应更高的盐浓度)。在一些实施方式中，减缓例如从98℃至65℃的斜率(ramp rate)(例如，1℃/秒、0.5℃/秒、0.28℃/秒、0.1℃/秒或更慢)改善了在高度复用的样品中的引物性能和覆盖均匀度。

在一些实施方式中，在酶实施模板依赖性延伸的条件下，使用核酸聚合酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶是DNA聚合酶I、Taq聚合酶、Pheonix Taq聚合酶、Phusion聚合酶、T4聚合酶、T7聚合酶、Klenow片段、Klenow exo-、phi29聚合酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、VeraSeq ULtra聚合酶、VeraSeq HF 2.0聚合酶、EnzScript或另外的适当的聚合酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶不是逆转录酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶作用于DNA模板。在一些实施方式中，核酸聚合酶作用于RNA模板。在一些实施方式中，延伸反应涉及针对RNA进行逆转录以产生互补的DNA分子(RNA-依赖性DNA聚合酶活性)。在一些实施方式中，逆转录酶是小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(mouse molony murine leukemiavirus，M-MLV)聚合酶、AMV逆转录酶、RSV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、HIV-2逆转录酶或另外的适当的逆转录酶。

在一些实施方式中，核酸扩增反应涉及包括链分离步骤的循环，所述链分离步骤通常涉及加热反应混合物。本文所使用的术语“链分离”或“将链分离”是指处理核酸样品，从而使互补的双链分子分离成可退火至寡核苷酸引物的两条单链。在一些实施方式中，根据本文所述的方法的链分离通过将核酸样品加热至高于其解链温度(T_m)而实现。在一些实施方式中，对于在适于核酸聚合酶的反应制剂中的含有核酸分子的样品而言，加热至94℃足以实现链分离。在一些实施方式中，适合的反应制剂包含一种或多种盐(例如，1mM-100mMKCl、0.1mM-10mM MgCl₂)、至少一种缓冲试剂(例如，1mM-20mM Tris-HCl)以及载体(例如，0.01％-0.5％BSA)。合适的缓冲液的非限定性实例含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、0.5mM-3mM MgCl₂和0.1％BSA。

在一些实施方式中，核酸扩增涉及将引物退火至核酸模板，所述核酸模板具有靶核酸特征的链。在一些实施方式中，可将靶核酸的链作为模板核酸。

本文所使用的术语“退火”是指在两个核酸之间的一个或多个互补的碱基对的形成。在一些实施方式中，退火涉及两个互补的核酸链或基本上互补的核酸链一起杂交。在一些实施方式中，在延伸反应的背景中，退火涉及将引物杂交至模板，从而形成用于模板依赖性聚合酶的引物延伸底物。在一些实施方式中，退火条件(例如，在引物和核酸模板之间)可基于引物的长度和序列而变化。在一些实施方式中，退火条件基于引物的T_m(例如，计算出的T_m)。在一些实施方式中，延伸方案的退火步骤涉及在链分离步骤后将温度降低至基于引物T_m(例如，计算的T_m)的温度足够长的时间，以使得能够由此退火。在一些实施方式中，可使用多种算法(例如，OLIGO^TM(Molecular Biology Insights Inc.Colorado)引物设计软件和VENTRO NTI^TM(Invitrogen,Inc.California)引物设计软件以及在互联网上可获得的程序，包括Primer3、Oligo Calculator和NetPrimer(Premier Biosoft；Palo Alto，CA；以及在万维网上免费获得的(例如，在premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上))中的任一种来测定T_m。在一些实施方式中，引物的T_m可利用以下公式进行计算，该公式被NetPrimer软件使用并在Frieir等的PNAS 198683:9373-9377中更详细的描述，以引用的方式将其整体并入本文。

T_m＝ΔH/(ΔS+R*In(C/4))+16.6log([K⁺]/(1+0.7[K⁺]))-273.15

其中，ΔH为螺旋形成的焓；ΔS为螺旋形成的熵；R为摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C为核酸浓度；以及[K⁺]为盐浓度。对大多数扩增方案而言，将退火温度选择为低于预测T_m约5℃，尽管可使用更接近T_m和高于T_m的温度(例如，低于预测T_m 1℃和5℃之间的温度或高于预测T_m1℃和5℃之间的温度)，例如，低于预测T_m超过5℃的温度(如，低6℃、低8℃、低10℃或更低)同样可以。在一些实施方式中，退火温度越接近T_m，退火越特异。在一些实施方式中，在延伸反应(例如，在PCR扩增方案的背景中)期间引物退火所使用的时间至少部分地基于反应的体积(例如，较大的体积涉及更长的时间)来确定。在一些实施方式中，在延伸反应(例如，在PCR扩增方案的背景中)期间引物退火所使用的时间至少部分地基于引物和模板的浓度(例如，比起较低的引物与模板的相对浓度，较高的相对浓度涉及较少的时间)来确定。在一些实施方式中，取决于体积和相对的引物/模板浓度，延伸反应中(例如，在PCR扩增方案的背景中)的引物退火步骤范围可为1秒-5分钟、10秒-2分钟或30秒-2分钟。本文所使用的“基本上退火”是指当在PCR扩增方案的背景中使用时，两个核酸之间形成的互补碱基对达到的足以产生可检测水平的特异性扩增产物的程度。

本文所使用的术语“聚合酶延伸”是指至少一个互补的核苷酸通过核酸聚合酶向退火至核酸模板的引物的3’末端的模板依赖性的添加。在一些实施方式中，聚合酶延伸添加多于1个核苷酸，例如，添加多至并包括对应于模板全长的核苷酸。在一些实施方式中，聚合酶延伸的条件至少部分地基于所使用的聚合酶种类。在一些实施方式中，用于聚合酶延伸的温度基于酶的已知活性性质。在一些实施方式中，在退火温度低于酶的最理想温度的情况中，使用较低的延伸温度是可接受的。在一些实施方式中，酶可在其最理想延伸温度以下保留至少部分活性。在一些实施方式中，在65℃-75℃或68℃-72℃下进行聚合酶延伸(例如，热稳定聚合酶进行的聚合酶延伸)(例如，Taq聚合酶和其变体)。在一些实施方式中，本文提供的方法涉及在PCR扩增方案的各循环退火至核酸模板的引物的聚合酶延伸。在一些实施方式中，使用具有相对强的链置换活性的聚合酶进行聚合酶延伸。在一些实施方式中，出于检测融合(例如，5'端融合)的目的，将具有强的链置换活性的聚合酶用于制备核酸。

在一些实施方式中，引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文所使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸以使得延伸产物生成的条件”是指包括例如温度、盐浓度和辅因子浓度、pH和酶浓度的条件的组，核酸聚合酶在所述条件下催化引物延伸。在一些实施方式中，这些条件至少部分地基于所使用的核酸聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可在适合的反应制剂中进行引物延伸反应。在一些实施方式中，适合的反应制剂包含一种或多种盐(例如，1mM-100mM KCl、0.1mM-10mM MgCl₂)、至少一种缓冲试剂(例如，1mM-20mM Tris-HCl)、载体(例如，0.01％-0.5％BSA)以及一种或多种NTPs(例如，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各10μM-200μM)。条件的非限制性组是50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、0.5mM-3mM MgCl₂、dNTP各200μM和0.1％BSA，72℃，聚合酶(例如，Taq聚合酶)在上述条件下催化引物延伸。在一些实施方式中，起始和延伸的条件可包括在适合的缓冲液中存在一种、两种、三种或四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸(例如，选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和聚合诱导剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)。在一些实施方式中，“缓冲液”可包括溶剂(例如，水性溶剂)，加上适当的辅因子以及影响pH、离子强度等的试剂。

在一些实施方式中，核酸扩增涉及多至5轮、多至10轮、多至20轮、多至30轮、多至40轮或更多轮(循环)扩增。在一些实施方式中，核酸扩增可包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，扩增步骤可包括长度为10个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，各扩增步骤可包括长度为12个循环-16个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，退火温度可低于70℃。在一些实施方式中，退火温度可低于72℃。在一些实施方式中，退火温度可低于65℃。在一些实施方式中，退火温度可为约61℃至约72℃。

在不同的实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及用一种或多种类型的本文所述的引物进行PCR扩增方案。本文所使用的“引物”是指能够特异性地退火至核酸模板并提供作为模板依赖性聚合酶的底物的3’末端以产生与所述模板互补的延伸产物的寡核苷酸。在一些实施方式中，用于本文所述方法中的引物是单链的，以便使引物及其互补物能够退火以形成双链。根据本文所述方法和组合物的引物可包含杂交序列(例如，与核酸模板退火的序列)，所述杂交序列的长度为小于或等于300个核苷酸，例如，长度小于或等于300个、或250个、或200个、或150个、或100个、或90个、或80个、或70个、或60个、或50个、或40个、或30个或更少、或20个或更少、或15个或更少的核苷酸、但至少为6个核苷酸。在一些实施方式中，引物的杂交序列的长度可为6个-50个核苷酸、6个-35个核苷酸、6个-20个核苷酸、10个-25个核苷酸。

可使用合成寡核苷酸和引物的任何适合的方法。在一些实施方式中，商业来源提供了适于提供用于本文所述方法和组合物的引物的寡核苷酸合成服务，例如，INVITROGEN^TMCustom DNA Oligos；Life Technologies；Grand Island，NY或来自IDT的custom DNAOligos；Coralville，IA。

在一些实施方式中，在来自加尾随机引物的延伸已发生后，可在第一扩增步骤中对延伸产物和模板进行扩增。在一些实施方式中，扩增可涉及使用第一靶特异性引物和第一尾引物的PCR扩增循环组。在一些实施方式中，扩增可使得存在于延伸产物中的加尾随机引物序列的至少部分被扩增。在一些实施方式中，扩增可使得存在于延伸产物中的加尾随机引物序列的全部被扩增。

本文所使用的术语“第一靶特异性引物”是指包含能够在适合的退火条件下特异性地退火至核酸模板(具有靶核酸特征的链)的核酸序列的单链寡核苷酸。

在一些实施方式中，引物(例如，靶特异性引物)可包含5’标签序列部分。在一些实施方式中，反应中存在的多个引物(例如，所有第一靶特异性引物)可包含相同的5’标签序列部分。在一些实施方式中，在多重PCR反应中，不同的引物种类能够以脱靶方式彼此相互作用，从而引起通过DNA聚合酶进行的引物延伸和随后的扩增。在此类实施方式中，这些引物二聚体一般是短的，并且它们的高效扩增可主导反应并占据优势，从而导致期望的靶序列的扩增不佳。因此，在一些实施方式中，在引物中(例如，在靶特异性引物上)包含有5’标签序列可引起引物二聚体(其在两个末端上含有相同的互补尾)的形成。在一些实施方式中，在随后的扩增循环中，此类引物二聚体将变性成单链DNA引物二聚体，各单链DNA引物二聚体在其两个末端上含有由5’标签引入的互补序列。在一些实施方式中，并非是引物退火至这些单链DNA引物二聚体，而是可发生分子内发夹(锅柄状结构)的形成，这是由于相同的引物二聚体分子上互补标签的接近的可及性(proximate accessibility)，而不是不同的分子上与新引物的分子间相互作用。因此，在一些实施方式中，这些引物二聚体可能难以有效扩增，从而使得引物不会呈指数地被二聚体扩增所消耗；相反，对于期望的靶序列的特异性扩增而言，带标签的引物可保持高且足够的浓度。在一些实施方式中，在多重扩增的上下文中，引物二聚体的累积可能是不期望的，因为引物二聚体竞争并消耗反应中的其它试剂。

在一些实施方式中，5’标签序列可为富含GC的序列。在一些实施方式中，5’标签序列可包含至少50％的GC含量、至少55％的GC含量、至少60％的GC含量、至少65％的GC含量、至少70％的GC含量、至少75％的GC含量、至少80％的GC含量、或更高的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可包含至少60％的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可包含至少65％的GC含量。

在一些实施方式中，靶特异性引物(例如，第二靶特异性引物)是包含3’部分和5’部分的单链寡核苷酸，所述3’部分包含能够特异性地退火至扩增反应的扩增子的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含标签序列(例如，与测序引物(例如，第二测序引物)相同或互补的核苷酸序列)。

在一些实施方式中，扩增方案的第二靶特异性引物相对于扩增方案的第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第二靶特异性引物通过至少3个核苷酸(例如，通过3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、15个以上核苷酸)相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，扩增方案中使用的所有靶特异性引物(例如，第二靶特异性引物)包含相同的5’部分。在一些实施方式中，可对5’部分靶特异性引物进行配置，以阻遏(suppress)本文所述的引物二聚体。

在一些实施方式中，在扩增方案中使用的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物基本上与靶核酸的同一条链互补。在一些实施方式中，特异性地退火至靶序列(例如，已知的靶序列)的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可包含所述已知的靶核苷酸序列的总共至少20个独有(unique)碱基，例如，20个以上独有碱基、25个以上独有碱基、30个以上独有碱基、35个以上独有碱基、40个以上独有碱基或50个以上独有碱基。在一些实施方式中，特异性地退火至靶序列(例如，已知的靶序列)的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可含有所述已知的靶核苷酸序列的总共至少30个独有碱基。

本文所使用的术语“第一尾引物”是指含有与加尾引物的尾部分相同的核酸序列的核酸分子。

本文所使用的术语“第二尾引物”是指含有与第一测序引物、接头、索引引物等的一部分相同的核酸序列并任选相对于第一加尾引物嵌套的核酸分子。在一些实施方式中，第二尾引物位于第一尾引物的外侧，以促进适当的索引标签、接头(例如，用于测序平台)等的添加。在一些实施方式中，第二加尾引物与测序引物相同。在一些实施方式中，第二加尾引物与测序引物互补。

在一些实施方式中，第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，第二尾引物并未相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，扩增方案的尾引物通过至少3个核苷酸(例如，通过3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或更多)相对于彼此嵌套。

在一些实施方式中，第一尾引物包含与步骤(b)链的延伸产物相同或互补的核酸序列，所述核酸序列不被第二尾引物所包含，且与第二尾引物相同或互补的任何序列相比更接近于加尾随机引物的5’末端。因此，在一些实施方式中，第二尾引物位于通过随机尾引物所添加的区域的外侧(5’末端)，例如，通过第一尾引物添加的5’尾内。

在一些实施方式中，第一尾引物可包含与加尾随机引物的最5’端核苷酸延展段(例如，具有约20个核苷酸)相同或互补的核酸序列，且第二尾引物可包含与加尾随机引物的约30个碱基相同或互补的核酸序列，所述第二尾引物具有作为所述加尾随机引物的5’末端的3’端方向的至少3个核苷酸的5’核苷酸。

在一些实施方式中，嵌套尾引物的使用最小化或消除了可扩增(例如，桥式PCR或乳液PCR中)但不能测序的最终扩增子的生成，这是可能在半巢式(hemi-nested)方法中出现的情况。在一些实施方式中，使用与测序引物相同的引物进行的半巢式方法可导致不期望的扩增产物从第一PCR步骤遗留至第二PCR步骤，并将最终产生人为测序读取段。在一些实施方式中，如本文所述，两个尾引物的使用可以减少此类问题，并且在一些实施方式中可消除此类问题。

在一些实施方式中，在第一扩增步骤的第一PCR扩增循环中，第一靶特异性引物能够特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的任何核酸的模板链。在一些实施方式中，根据设计第一靶特异性引物的方向，将合成已知的靶核苷酸序列上游或下游且与模板链互补的序列。在一些实施方式中，在形成包含杂交序列(第一靶特异性引物与所述杂交序列形成互补的碱基对)的延伸产物的情况中，可形成包含以下的双链扩增产物：第一靶特异性引物(以及与其互补的序列)、第一靶特异性引物下游的靶核苷酸序列(以及与其互补的序列)以及加尾随机引物序列(以及与其互补的序列)。在此类实施方式中，在随后的PCR扩增循环中，第一靶特异性引物和第一尾引物两者均能够特异性地退火至扩增产物的适当链，并且已知的核苷酸靶序列和加尾随机引物之间的序列可被扩增。

在本文所述方法的一些实施方式中，在进一步的数轮扩增中对扩增产物(扩增子)的一部分进行扩增。在一些实施方式中，进一步的数轮扩增可涉及使用第二靶特异性引物和第一测序引物或第二尾引物进行的PCR扩增循环。在一些实施方式中，PCR扩增循环可涉及使用与一个或多个其它(例如，在先的)PCR扩增循环的PCR参数相同或不同的PCR参数。在一些实施方式中，PCR扩增方案可具有相同或不同的退火温度、或者相同或不同的延伸步骤时长。

在一些实施方式中，本文所述的方法使得能够确定在已知的靶核苷酸序列的一侧或两侧的侧翼区域上与所述已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列。无论靶核酸是正常地以单链核酸的形式还是双链核酸的形式存在，序列信息能够以5’至3’的单链格式(链A)表示。在一些实施方式中，如果将要测定链A的已知的靶核苷酸序列的5’端的序列，基因特异性引物可与链A互补(退火至链A)。如果将要测定链A的已知的靶核苷酸序列的3’端的序列，基因特异性引物可与链A相同，从而使得所述引物将退火至双链靶核酸的互补链。

在一些实施方式中，本文所述的涉及使用第一基因特异性引物和第二基因特异性引物的方法可使分析具有优秀的靶命中(on-target)率，例如，70％-90％。在一些实施方式中，本文所述的分析和方法可具有至少85％的靶特异率。

在一些实施方式中，对本文所公开的引物(例如，靶特异性引物、尾引物)进行设计，从而使得所述引物在约61℃-72℃(例如，约61℃-69℃、约63℃-69℃、约63℃-67℃、约64℃-66℃)的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，对本文所公开的引物进行设计，从而使得所述引物在低于72℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，对本文所公开的引物进行设计，从而使得所述引物在低于70℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，对本文所公开的引物进行设计，从而使得所述引物在低于68℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，对本文所公开的引物进行设计，从而使得所述引物在约65℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

在一些实施方式中，特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的靶特异性引物的部分将在约61℃-72℃(例如，约61℃-69℃、约63℃-69℃、约63℃-67℃、约64℃-66℃)的温度下特异性地退火。在一些实施方式中，特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性地退火。

在一些实施方式中，本文所述的引物不包含修饰的碱基(例如，引物可不包含封闭3’胺(blocking 3’amine))。然而，在一些实施方式中，本文所述的引物不包含修饰的碱基或天然存在的碱基。在一些实施方式中，可用能够提供可检测信号的标记直接地或间接地对引物进行修饰。此类标记的非限制性实例包括放射性同位素、荧光分子、生物素以及其它。在一些实施方式中，本文所公开的引物可包括生物素接头或其它适合的接头(例如，用于将引物缀合至支持物)。在一些实施方式中，引物可包含核酸内切酶的靶序列，从而用适当的酶切割。在其它实施方式中，引物的5’末端可包含与结合至珠或其它支持物(例如，流通池基底)的核酸互补的序列。引物可包含或可不包含修饰的核苷间键。

在本文所述方法的一些实施方式中，可对核酸(例如，扩增核酸、延伸产物、靶核酸)进行测序。在一些实施方式中，测序可通过下一代测序法进行。本文所使用的“下一代测序”是指寡核苷酸测序技术：所述寡核苷酸测序技术具有以高于传统测序方法(例如，Sanger测序)的可能速度的速度对寡核苷酸进行测序的能力，因为所述下一代测序平行执行和读取数千至数百万个测序反应。下一代测序法/平台的非限制性实例包括：大规模平行签名测序(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸测序(454Life Sciences/RocheDiagnostics)；固相可逆染料终止物测序(Solexa/Illumina)：SOLiD技术(AppliedBiosystems)；Ion半导体测序(ION Torrent)；DNA纳米球测序(Complete Genomics)；以及可从Pacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、Oxford Nanopore Technologies和Helicos Biosciences获得的技术。在一些实施方式中，测序引物可包含可与选定的下一代测序法兼容的部分。下一代测序技术及相关测序引物的限制和设计参数在本领域中是公知的(参见例如，Shendure等，“Next-generation DNA sequencing”，Nature，2008，第26卷，第10期，1135-1145；Mardis，“The impact of next-generation sequencing technology ongenetics”，Trends in Genetics，2007，第24卷，第3期，第133-141页；Su等，“Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics”，ExpertRev Mol Diagn，2011，11(3):333-43；Zhang等，“The impact of next-generationsequencing on genomics”，J Genet Genomics，2011，38(3):95-109；Nyren,P.等，AnalBiochem 208:17175(1993)；Bentley,D.R.，Curr Opin Genet Dev 16:545-52(2006)；Strausberg,R.L.等，Drug Disc Today 13:569-77(2008)；美国专利号7,282,337；美国专利号7,279,563；美国专利号7,226,720；美国专利号7,220,549；美国专利号7,169,560；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国公开号2006/0252077、2007/0070349和20070070349，以引用的方式将其整体并入本文)。

在一些实施方式中，测序步骤涉及第一测序引物和第二测序引物的使用。在一些实施方式中，对第一测序引物和第二测序引物进行选择，以与本文所述的下一代测序法兼容。

将测序读取段与基因组和/或cDNA序列的已知序列数据库进行比对的方法是本领域中公知的，并且用于此过程的软件是可商购的。在一些实施方式中，并未完全映射(map)至野生型序列数据库的读取段(去掉测序引物核苷酸序列)可为基因组重排或大型插入缺失(indel)突变。在一些实施方式中，含有映射至基因组中多个位置的序列的读取段(去掉测序引物核苷酸序列)可为基因组重排。

在一些实施方式中，引物可包含附加序列，例如，标识符(identifier)序列(例如，条形码序列、索引序列)、测序引物杂交序列(例如，Rd1)和接头序列。在一些实施方式中，接头序列是与下一代测序系统一起使用的序列。在一些实施方式中，接头序列是用于基于Illumina的测序技术的P5序列和P7序列。在一些实施方式中，接头序列是与Ion Torrent测序技术兼容的P1序列和A序列。

在一些实施方式中，本文所使用的“条形码”、“分子条形码”、“分子条形码标签”和“索引”可互换使用，其通常是指用作标识符(例如，诸如源标识符、位置标识符、日期标识符或时间标识符(例如，取样或加工的日期或时间)或核酸的其它标识符)的核酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，将此类条形码序列或索引序列用于识别存在于核酸群中的核酸的不同方面。在一些实施方式中，条形码序列或索引序列可向靶核酸提供源标识符或位置标识符。例如，条形码序列或索引序列可用于识别从其获得核酸的患者。在一些实施方式中，条形码序列或索引序列使得能够在单个反应上(例如，在单个流通池中进行)对多个样品进行测序。在一些实施方式中，出于检测个体测序反应的目的，可将索引序列用于定向序列成像仪。在一些实施方式中，条形码序列或索引序列的长度可为2个-25个核苷酸、长度为2个-15个核苷酸、长度为2个-10个核苷酸、长度为2个-6个核苷酸。在一些实施方式中，条形码序列或索引序列可包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或至少25个核苷酸。

在一些实施方式中，当根据本文所述方法使用加尾随机引物群时，在扩增后可存在多个可区别的扩增产物。在一些实施方式中，由于加尾随机引物在贯穿样品的核酸分子的不同位置处杂交，靶特异性引物的组可杂交(和扩增)通过多于1个杂交事件所产生的延伸产物，例如，一个加尾随机引物可在距靶特异性引物杂交位点的第一距离处(例如，100个核苷酸)杂交，且另一加尾随机引物可在距靶特异性引物杂交位点的第二位置处(例如，200个核苷酸)杂交，从而产生两个扩增产物(例如，约100bp的扩增产物和约200bp的扩增产物)。在一些实施方式中，可对这些多个扩增产物各自进行测序。在一些实施方式中，对这些多个扩增产物进行的测序是有利的，因为其提供了多个重叠的序列读取段，可对所述重叠的序列读取段彼此进行比较以检测扩增或测序过程中所引入的序列错误。在一些实施方式中，可对个体扩增产物进行比对，并且在其于特定碱基处存在的序列不同的情况中，可能存在PCR和/或测序的错误或人为假象。

在一些实施方式中，可在方法的任意适当步骤之前和/或之后，将靶核酸和/或其扩增产物从酶、引物、或缓冲液组分中分离。可使用用于分离核酸的任何适合的方法。在一些实施方式中，分离可包括固相可逆固定(Solid Phase Reversible Immobilization，SPRI)纯化。SPRI纯化方法是本领域所熟知的，且试剂盒是可商购的，例如，AgencourtAMPure XP-PCR纯化(目录号A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些实施方式中，酶可通过加热处理失活。

在一些实施方式中，可使用适当的方法(例如，纯化、消化等)将未杂交的引物从核酸制剂中去除。在一些实施方式中，使用核酸酶(例如，核酸外切酶I)从制剂中去除引物。在一些实施方式中，在引物消化后，将此类核酸酶加热失活。在核酸酶失活后，可与其它的适当组分(例如，酶、缓冲液)一起添加进一步的引物组，以进行进一步的扩增反应。

在一些实施方式中，靶核酸可以是基因组DNA或其部分。在一些实施方式中，靶核酸可以是核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)或其部分。在一些实施方式中，靶核酸可以是cDNA或其部分。

许多适于用于本文所述方法的测序方法提供最佳读取段长度为数十至数百核苷酸碱基的测序运行(例如，Ion Torrent技术可产生200bp-400bp的读取段长度)。靶核酸可基本上长于或可基本上不长于这一最佳读取段长度。在一些实施方式中，为了使由扩增核酸部分具有在特定测序技术中使用的适合长度，已知的靶核苷酸序列和靶核酸末端(可将加尾随机引物杂交至该末端)之间的平均距离应尽可能接近所选定技术的最佳读取段长度。在一些实施方式中，如果给定测序技术的最佳读取段长度为200bp，则根据本文所述方法扩增的核酸分子应具有的平均长度为约800bp、约700bp、约600bp、约500bp、约400bp、约300bp、约200bp以下。

可对本文所使用的核酸进行剪切(例如，在测序前)(例如，机械剪切或酶促剪切)，以产生具有任何期望大小的片段。机械剪切方法的非限制性实例包括：超声、雾化以及可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFA^TM剪切技术。在一些实施方式中，可通过超声对核酸进行机械剪切。

在一些实施方式中，不对靶核酸进行剪切或消化。在一些实施方式中，不对制备步骤的核酸产物(例如，延伸产物、扩增产物)进行剪切或酶促消化。

在一些实施方式中，当靶核酸为RNA时，可使样品经受逆转录酶方案以生成DNA模板，并随后可对所述DNA模板进行剪切。在一些实施方式中，可在进行逆转录酶方案前对靶RNA进行剪切。在一些实施方式中，含有靶RNA的样品可用于本文所述的如下方法中：使用从新鲜样本或降解样本提取的总核酸；无需为cDNA测序去除基因组DNA；无需为cDNA测序而使核糖体RNA耗竭；在任何步骤中均不需要机械剪切或酶促剪切；通过使用随机六聚体使RNA经受双链cDNA合成。

在一些实施方式中，已知的靶核苷酸可包含由基因重排产生的融合序列。在一些实施方式中，本文所述的方法适合于确定基因重排的存在和/或种类。在一些实施方式中，基因重排的一部分的种类是先前已知的(例如，待由基因特异性引物所靶向的基因重排的部分)，并可使用本文所公开的方法对其它部分的序列进行确定。在一些实施方式中，基因重排可涉及癌基因。在一些实施方式中，基因重排可包含融合癌基因。

在一些实施方式中，靶核酸存在于或获得自适当的样品(例如，食物样品、环境样品、诸如血液样品的生物样品等)。在一些实施方式中，样品为获得自受试者的生物样品。在一些实施方式中，样品可为获得自受试者的诊断样品。在一些实施方式中，样品可进一步包含蛋白质、细胞、流体、生物流体、保护剂和/或其它物质。以非限制性实例的方式，样品可为面颊拭子(cheek swab)、血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物(alveolar isolates)、胸膜液、心包液、囊液(cyst fluid)、肿瘤组织、组织、活检物、唾液、抽出物(aspirate)或它们的组合。在一些实施方式中，样品可通过切除术或活检物获得。

在一些实施方式中，样品可获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病(例如，癌症或遗传性疾病)的受试者。在一些实施方式中，已知的靶序列存在于与疾病相关的基因中。

在一些实施方式中，样品获得自需要治疗癌症的受试者。在一些实施方式中，样品包含肿瘤细胞群，例如，至少一种肿瘤细胞的群。在一些实施方式中，样品包含肿瘤活检物，包括但不限于未经处理的活检组织或经过处理的活检组织(例如，福尔马林固定的活检组织和/或石蜡包埋的活检组织)。

在一些实施方式中，将样品新鲜收集。在一些实施方式中，在用于本文所述的方法和组合物中之前，将样品储存。在一些实施方式中，样品是未经处理的样品。本文所使用的“未经处理的样品”是指除了稀释于溶液中和/或悬浮于溶液中之外的未曾进行任何事先的样品预处理的生物样品。在一些实施方式中，样品获得自受试者，并在用于本文所述的方法和组合物之前对其进行保存或加工。以非限制性实例的方式，可将样品包埋于石蜡中、冷藏或冷冻。可在根据本文所述的方法和组合物确定核酸的存在之前，将冷冻的样品解冻。在一些实施方式中，样品可为加工过的或处理过的样品。用于处理或加工样品的示例性方法包括但不限于：离心、过滤、超声、均质化、加热、冷冻和解冻、与保护剂(例如，抗凝血剂或核酸酶抑制剂)接触以及它们的任意组合。在一些实施方式中，可用化学试剂和/或生物试剂对样品进行处理。可采用化学试剂和/或生物试剂在加工和/或存储期间保护和/或保持样品或样品所含核酸的稳定性。可替代地或额外地，可采用化学试剂和/或生物试剂使核酸从样品的其它组分中释放。以非限制性实例的方式，在用于本文所述的方法和组合物之前，可用抗凝血剂处理血液样品。可在本文所公开的方法中使用用于核酸分析的样品加工、保存或处理的适合的方法和过程。在一些实施方式中，样品可以是例如通过离心得到的澄清流体样品。在一些实施方式中，可通过低速离心(例如，3000×g以下)并收集含有澄清流体样品的上清液来使样品澄清。

在一些实施方式中，可在用于本文所述的方法和组合物之前，对样品中存在的核酸进行分离、富集或纯化。可使用从样品分离、富集或纯化核酸的适合的方法。例如，用于从各种样品类型分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。在一些实施方式中，本文所述的方法涉及例如在靶核酸的测序之前，富集靶核酸的方法。在一些实施方式中，在测序之前，待富集的靶核酸的一个末端的序列是未知的。在一些实施方式中，本文所述的方法涉及在使用下一代测序技术确定核苷酸序列之前，富集特异性核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，富集特异性核苷酸序列的方法不包括杂交富集。

本文所述的方法能够以多重(multiplex)形式使用。在本文所述方法的实施方式中，多重应用可包括确定与一种或多种已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列。本文所使用的“多重扩增”是指涉及在一个反应容器中进行多于一种靶核酸的同时扩增的过程。在一些实施方式中，方法涉及随后使用一组或多组引物对多重扩增产物的序列进行确定。多重可指在单个反应中检测约2种-1,000种之间的不同的靶序列。本文所使用的多重是指在单个反应中检测2种-1,000种之间的任何范围(例如，5-500种、25-1000种或10-100种之间)的不同靶序列等。当施用至PCR时，术语“多重”意味着在同一PCR反应中存在对于至少两种不同的靶序列具有特异性的引物。

在一些实施方式中，可用多个引物(例如，多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)对样品或样品的单独部分中的靶核酸进行扩增。在一些实施方式中，多个引物(例如，多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)可存在于单个反应混合物中，例如，可在同一反应混合物中产生多种扩增产物。在一些实施方式中，多个引物(例如，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)能够特异性地退火至单独的基因所包含的已知靶序列。在一些实施方式中，至少两组引物(例如，至少两组的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)能够特异性地退火至已知靶序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组引物(例如，至少两组的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)能够特异性地退火至单个基因所包含的已知靶序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组引物(例如，至少两组的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)能够特异性地退火至含有已知的靶序列的基因的不同的外显子。在一些实施方式中，多个引物(例如，第一靶特异性引物)可含有相同的5’标签序列部分。

在本文所述方法的实施方式中，多重应用可包括在一个测序反应或测序运行中确定多个样品中与一个或多个已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列。在一些实施方式中，多个样品可具有不同的来源，例如，来自不同的组织和/或不同的受试者。在此类实施方式中，引物(例如，加尾随机引物)可进一步包含条形码部分。在一些实施方式中，可将具有独特条形码部分的引物(例如，加尾随机引物)添加至各样品，并与其中的核酸连接；可随后将所述样品合并。在此类实施方式中，扩增产物所得到的各测序读取段将包含识别含有模板核酸的样品的条形码，所述扩增产物源自所述模板核酸。

在本文所述方法的一些实施方式中，确定与已知的寡核苷酸靶序列邻近的序列可提供与治疗疾病相关的信息。因此，在一些实施方式中，可将本文所公开的方法用于帮助治疗疾病。在一些实施方式中，样品可来自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。在一些实施方式中，已知的靶序列可以是与疾病相关的基因(例如，癌基因)的序列。在一些实施方式中，与已知的寡核苷酸靶序列邻近的序列和/或所述已知的寡核苷酸靶序列可含有疾病相关的突变或遗传异常，例如，SNP、插入、缺失和/或基因重排。在一些实施方式中，与已知的靶序列邻近的序列和/或存在于样品中的已知的靶序列包含基因重排产物的序列。在一些实施方式中，基因重排可为癌基因，例如，融合癌基因。

癌症的某些治疗对于含有特定癌基因的肿瘤特别有效，例如，靶向给定融合癌基因的作用或表达的治疗剂可对于含有该融合癌基因的肿瘤有效，但对于缺乏该融合癌基因的肿瘤无效。本文所述的方法可促进对揭示癌基因状态(例如，突变、SNP和/或重排)的特异性序列的确定。在一些实施方式中，当侧翼区域的序列已知时，本文所述的方法可进一步使得能够确定特异性的序列，例如，本文所述的方法可确定涉及已知基因(例如，癌基因)的基因重排的存在和种类，其中，在进行本文所述方法之前，精确位置和/或重排伴侣是未知的。

在一些实施方式中，本文所述的技术涉及治疗癌症的方法。因此，在一些实施方式中，本文提供的方法可涉及：检测获得自需要治疗癌症的受试者的肿瘤样品中的一种或多种癌基因重排的存在；以及给予对于具有任何检测到的癌基因重排的肿瘤有效的癌症治疗。在一些实施方式中，本文所述的技术涉及确定需要治疗癌症的受试者是否会对给定的治疗作出响应的方法。因此，在一些实施方式中，本文提供的方法可涉及：检测获得自受试者的肿瘤样品中的癌基因重排的存在；其中，如果检测到存在癌基因重排，则所述受试者被确定为对靶向癌基因重排产物的治疗作出响应。

在一些实施方式中，受试者需要治疗肺癌。在一些实施方式中，例如，当样品获得自需要治疗肺癌的受试者时，已知的靶序列可包含来自选自以下组的基因的序列：ALK、ROS1和RET。因此，在一些实施方式中，基因重排引起涉及ALK、ROS 1或RET的融合。在例如，Soda等，Nature 2007 448561-6；Rikova等，Cell 2007 131:1190-1203；Kohno等，NatureMedicine 2012 18:375-7；Takouchi等，Nature Medicine 201218:378-81中对涉及ALK、ROS 1或RET的基因重排的非限制性实例进行了描述，以引用的方式将它们整体并入本文。然而，应当理解的是，基因重排的精确位置和重排中涉及的第二基因的种类可以是事先未知的。因此，在本文所述的方法中，可以在不必知道重排的位置或基因重排中涉及的第二基因的种类的情况下，对此类重排的存在和种类进行检测。

在一些实施方式中，已知的靶序列可包含来自选自以下组的基因的序列：ALK、ROS1和RET。

在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中的ALK的基因重排的存在可说明所述肿瘤易受用选自于由以下所组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802、ALK激酶活性的二氨基抑制剂和氨基嘧啶抑制剂(例如，NVP-TAE684和PF-02341066)(参见例如，Galkin等，Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:270-275；Zou等，Cancer Res，2007，67:4408-4417；Hallberg和Palmer F1000Med Reports 20113:21；以及Sakamoto等，Cancer Cell 2011 19:679-690)；以及WO 04/079326中公开的分子。以引用的方式将上述所有参考文献整体并入本文。ALK抑制剂可包括降低ALK或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低ALK或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“间变性淋巴瘤激酶”或“ALK”是指在野生型形式中通常在神经元调节中涉及的跨膜酪氨酸激酶。许多物种的ALK基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:2(mRNA)，NCBI Gene ID:238)。

在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中ROS1的基因重排的存在可说明所述肿瘤易受用选自于由如下所组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ROS1抑制剂和如上所述的ALK抑制剂(例如，克唑替尼)。ROS1抑制剂可包括降低ROS1或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低ROS 1或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“c-ros癌基因1”或“ROS1”(在本领域中也称为ROS-1)是指与PTPN6相互作用的sevenless亚家族的跨膜酪氨酸激酶。许多物种的ROS1基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:1(mRNA)，NCBI Gene ID:238)。

在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中的RET的基因重排的存在可说明所述肿瘤易受用选自于由以下所组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A(参见例如，Samadi等，Surgery 2010148:1228-36；Cuccuru等，JNCI 200413:1006-1014；Akeno-Stuart等，Cancer Research 2007 67:6956；Grazma等，J ClinOncol 2010 28:15s 5559；Mologni等，J Mol Endocrinol 2006 37:199-212；Calmomagno等，Journal NCI 2006 98:326-334；Mologni.Curr Med Chem 2011 18:162-175；以及WO06/034833、美国专利公开2011/0201598和美国专利8,067,434中公开的化合物)。以引用的方式将上述所有参考文献整体并入本文。RET抑制剂可包括降低RET或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低RET或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“转染重排(rearranged during transfection)”或“RET”是指钙粘着蛋白超家族的受体酪氨酸激酶，其参与神经嵴发育并识别神经胶质细胞系来源的神经营养因子家族信号分子。许多物种的RET基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4(mRNA)，NCBI Gene ID:5979)。

本文所述方法的应用的进一步非限制性实例包括检测血液恶性肿瘤标志物(hematological malignancy)及其组(panels)(例如，包括用于在淋巴瘤和白血病中检测基因组重排的标志物及其组)、检测肉瘤相关的基因组重排及其组、以及检测针对淋巴瘤测试的IGH/TCR基因重排及其组。

在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用癌症治疗剂来治疗患有或被诊断为具有例如癌症的受试者。患有癌症的受试者可由医师使用目前诊断癌症的方法来鉴定。例如，表征这些病症和有助于诊断的肺癌症状和/或并发症是本领域公知的，包括但不限于：呼吸微弱、锁骨以上淋巴结肿大、肺部异常声音、轻叩(tapped)胸部时有浊音(dullness)、以及胸部疼痛。可有助于诊断例如肺癌的测试包括但不限于X射线、对高水平特定物质(例如，钙)的血液测试、CT扫描和肿瘤活检。肺癌家族病史或暴露于肺癌风险因素(例如，吸烟或暴露于烟雾和/或空气污染)也可有助于确定受试者是否可能患有肺癌或有助于对肺癌进行诊断。

癌症可包括但不限于：恶性肿瘤(carcinoma)，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、脑癌(包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤)；乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌；结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜恶性肿瘤(endometrial carcinoma)、子宫内膜癌(endometrial cancer)；食道癌、胃癌；各种头颈部癌、上皮内肿瘤(包括Bowen病和佩吉特氏病)；血液肿瘤(包括急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病)；卡波济氏肉瘤、毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病、AIDS相关的白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；肾癌(如肾细胞癌)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、淋巴瘤(包括霍奇金病和淋巴细胞性淋巴瘤)；肝癌(如肝恶性肿瘤和肝细胞瘤)、Merkel细胞恶性肿瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(包括鳞状细胞癌)；卵巢癌(包括由上皮细胞产生的卵巢癌)、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)；胰腺癌；皮肤癌(包括黑色素瘤、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞)；前列腺癌、直肠癌；外阴癌、肾癌(包括腺癌)；睾丸癌(包括胚肿瘤(例如，精原细胞瘤)、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤)；甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和甲状腺髓癌)；食道癌、唾液腺恶性肿瘤和Wilm氏肿瘤。在一些实施方式中，癌症可为肺癌。

在一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的组合物(例如，癌症治疗剂)，以减轻癌症症状。本文所使用的“减轻癌症症状”为改善与癌症相关的任何病症或症状。相比等同的未治疗对照，由任何标准技术所测量的此类减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。向受试者给予本文所述组合物的各种手段对本领域技术人员而言是已知的。此类方法可包括但不限于口服给予、肠胃外给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、经皮给予、气道(气雾剂)给予、肺部给予、皮肤给予、局部给予、注射给予或肿瘤内给予。给予可以是局部的或全身的。本文所使用的术语“有效量”是指减轻疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的治疗剂的量，并涉及足以提供期望效果的药物组合物的量。因此，术语“治疗上有效量”是指当给予典型受试者时足以产生特定的抗癌效果的量。本文使用的有效量在不同的上下文中还可涵盖足以延缓疾病症状发展的量、足以改变疾病症状进程(例如但不限于，减缓疾病症状进展)的量、或逆转疾病症状的量。因此，指定精确的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。任何特定剂量的效果可通过合适的生物测定进行监测。剂量可由医师确定，并可在适当时进行调整以适应所观测到的治疗效果。

癌症治疗的非限制性实例可包括放射治疗、外科手术、吉西他滨、顺铂(cisplastin)、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他(vorinostat)、利妥昔单抗(rituximab)、替莫唑胺(temozolomide)、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂，例如，噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如，白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、硫代三乙烯磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；软海绵素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素，例如，烯二炔(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γ1和卡奇霉素Ω1(参见例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐(bisphosphonates)，例如，氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)，aclacinomysins，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博莱霉素，cactinomycin，carabicin，caminomycin，嗜癌霉素，chromomycinis，更生霉素，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代阿霉素、菁基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)，表阿霉素，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素(例如，丝裂霉素C)，麦考酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物，例如，甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如，二叶甲酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如，安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如，卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如，氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱(maytansinoids)，例如，美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，Oreg.)；丙亚胺；根瘤菌素；sizofuran；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、verracurin A、漆斑菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE.RTM.长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如，视黄酸；卡培他滨；康普瑞汀；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb.RTM)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼)和VEGF-A的抑制剂(减少细胞增殖)，以及以上任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法可进一步包括使用放射物或放射疗法。此外，治疗方法可进一步包括使用外科手术治疗。

在一些实施方式中，本文所述的方法可适用于重测序，例如，用于确认由大量核酸的非定向测序获得的特别相关的、低质量和/或复杂的序列。以非限制性实例的方式，本文所述的方法可使得能够：进行靶向疾病基因组(例如，10-100个基因)的定向和/或靶向重测序；进行重测序以确认在大规模测序项目中获得的变体；进行全外显子组(whole exome)重测序；和/或进行用于检测单核甘酸变体、多核苷酸变体、插入、缺失、拷贝数变化以及甲基化状态的靶向重测序。

在一些实施方式中，本文所述的方法可使得能够进行微生物群(microbiota)测序、古代样品(ancient sample)测序和/或新变异病毒基因分型。

为方便起见，下文提供了在说明书、实施例以及所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。提供所述定义以辅助描述具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果在本领域中术语的使用和本文所提供的术语定义之间存在明显不一致，应以本说明书中所提供的定义为准。

为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。

本文使用的术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”通常都意味着统计学上显著量的降低。然而，为避免疑义，“减少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”表示相比参比水平降低至少10％，例如，降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多至并包括降低100％(例如，相比参比样品的缺失水平或不可检测水平)、或相比参比水平降低在10％到100％之间的任意量。在标志物(marker)或症状(symptom)的情况下，意味着此类水平的统计学上显著的降低。例如，所述降低可为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并优选降至被认为是无此种紊乱的个体的正常范围内的水平。

本文使用的术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”通常都意味着统计学上显著量的增加；为避免疑义，术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”表示相比参比水平增加至少10％，例如，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛(cows)、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼(trout)、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物，例如，灵长类动物、如人类。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。

优选地，受试者为哺乳动物。所述哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利于用作代表例如肺癌的动物模型的受试者。受试者可以为雄性或雌性。

受试者可为先前已被诊断患有或鉴定为遭受或患有需要治疗的病症(例如，癌症)或者与此种病症相关的一种或多种并发症的受试者，并且所述受试者任选已接受对所述病症或者与所述病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者还可为先前未曾被诊断为患有所述病症(例如，癌症)或者与所述病症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可为表现出针对所述病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者，或者可为并未表现出风险因素的受试者。

对于特定病症的治疗“有需要的受试者”可为患有该病症、被诊断为患有该病症、或处于发展为该病症的风险中的受试者。

本文所使用的“与遗传改变相关的疾病”指的是至少部分由相对于健康野生型受试者而言受试者的遗传物质的改变(例如，缺失、插入、SNP、基因重排)引起的任何疾病。如果改变增加受试者发展成疾病的风险、增加受试者对疾病(包括传染性疾病或具有传染性组分的疾病)的易感性、引起疾病相关分子的产生、或使细胞变为患病的或不正常的(例如，癌细胞中细胞周期调控的缺失)，疾病可至少部分由受试者遗传物质中的所述改变引起。疾病可与多种遗传改变相关，例如，癌症。

本文所使用的术语“核酸”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，模板核酸为DNA。在另一方面，模板为RNA。合适的核酸分子为DNA，包括基因组DNA或cDNA。其它合适的核酸分子为RNA，包括mRNA。

在核酸的情况下，本文所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”是指从与在其天然来源中见到的核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸；和/或从当通过细胞表达时与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。

本文所使用的术语“互补”是指核苷酸形成氢键碱基配对的能力。在一些实施方式中，互补是指核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对形成偏好，从而使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。本文所使用的“基本上互补”是指核酸分子或其部分(例如，引物)在所述分子或其部分的全长上与第二核苷酸序列具有至少90％的互补性，例如，90％互补、95％互补、98％互补、99％互补或100％互补。本文所使用的“基本上相同”是指核酸分子或其部分在所述分子或其部分的全长上与第二核苷酸序列具有至少90％的一致性，例如，90％一致性、95％一致性、98％一致性、99％一致性或100％一致性。

在靶核酸的特异性引物的情况下，本文所使用的“特异的”指引物与靶标之间的互补性水平，从而使得存在如下的退火温度：在该退火温度时，引物将退火至所述靶核酸并介导所述靶核酸的扩增、而并不退火至样品中存在的非靶序列或介导样品中存在的非靶序列的扩增。

本文所使用的“扩增产物(amplified product/amplification product)”或“扩增子(amplicon)”是指由扩增反应产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸是特定靶核酸模板链和/或其互补序列的一部分的拷贝，其在核苷酸序列上对应于模板核酸序列和/或其互补序列。扩增产物可进一步包含对引物而言特异性的序列和位于序列(其为所述靶核酸和/或其互补物的一部分)侧翼的序列。虽然可以指代其单个链，本文所述的扩增产物通常将为双链DNA。

本文所使用的核酸分子的“部分(portion)”是指由该分子包含的核苷酸的邻近集合。部分可包含由该分子包含的核苷酸的全部或仅子集。部分可为双链的或单链的。

本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗处理，其中，目的是扭转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如，肺癌)相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症、与病症有关的疾病或紊乱的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物得到减少，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病进展得到减少或停止，则治疗是“有效”的。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，也包括与未进行治疗时所预期的情况相比而言症状进展或恶化的中止或至少延缓。有益的或期望的临床结果包括但不限于：减轻一种或多种症状、降低疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或延缓疾病进展、改善或缓和(palliation)疾病状态、缓解(部分或全部)、和/或降低死亡率，无论上述结果是可检测的还是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或不良影响的舒缓(包括姑息治疗(palliative treatment))。

术语“统计学上显著的(statistically significant)”或“显著地(significantly)”是指统计学显著性，并且通常意味着低于正常标志物浓度两个标准差(2SD)或更低。

除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。

本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”用于表示对方法或组合物而言必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。

术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。

本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响该实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的元素。

除非上下文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如，(exempli gratia)，并在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如，(for example)”同义。

细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可以在如下中找到：“The MerckManual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(著)，The Encyclopedia of MolecularBiology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)。分子生物学中常用术语的定义还可在如下中找到：Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等(著)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Current Protocols in Protein Sciences 2009，WileyIntersciences，Coligan等著。

除非另有说明，使用例如在如下中所述的标准程序来进行本发明：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)；以及Davis等，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier Science Publishing,Inc.，New York，USA(1995)，以引用的方式将它们整体全部并入本文。

其它术语在本发明各个方面的描述中进行定义。

出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将本申请通篇所引用的所有专利与其它出版物(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及共同的未决(co-pending)专利申请)明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可用于本文所述技术的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。

对本公开的实施方式的描述不意味着穷举或将本公开限制在所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的对本公开的具体实施方式和实施例进行了描述，本领域技术人员将会认识到，可在本公开范围内作出多种等同修改。例如，虽然将方法步骤或功能以给定顺序给出，其它实施方式可以不同顺序来实施功能、或可以基本上同时实施这些功能。本文所提供的本公开的教导可以适当的方式应用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。如果适当的话，可对本公开的方面进行修改，以利用上述参考和应用的组合物、功能和构思来提供本公开更进一步的实施方式。可根据详细描述来对本公开进行上述改变和其它改变。所有此类修改都落入所附权利要求书所限定的本发明的范围之内。

任何前述实施方式中的具体要素均可进行组合或替代其它实施方式中的要素。此外，尽管与本公开的特定实施方式相关的优势已经在这些实施方式的上下文中描述，其它实施方式也可表现出此类优势，但不是所有实施方式都必须展现出此类优势，才能落入本公开的范围。

本文所述的技术进一步由以下实施例予以说明，但决不应当理解为本文所述的技术被进一步限定。

可根据以下编号段落的任一段对本文所述技术的一些实施方式进行定义：

1.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在杂交条件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与起始靶特异性引物接触；

(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用所述靶核酸分子作为模板；

(c)在杂交条件下，使所述步骤(b)的产物与加尾随机引物群接触；

(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；

(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和所述加尾随机引物序列进行扩增；

(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对所述步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；

(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序；

其中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特异性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火温度下能够特异性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由所述步骤(e)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含与所述加尾随机引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相对于所述第一尾引物嵌套。

2.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在杂交条件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；

(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；

(c)在杂交条件下，使所述步骤(b)的产物与起始靶特异性引物接触；

(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用所述靶核酸分子作为模板；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；

3.如段落1-2中任一段所述的方法，所述方法进一步包括在所述起始靶特异性引物的延伸之后，使所述样品和产物与RNase接触的步骤。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述加尾随机引物可形成发夹环结构。

5.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，所述起始靶特异性引物和所述第一靶特异性引物相同。

6.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的3’核酸序列之间，所述加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码部分。

7.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(c)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和所述加尾随机引物序列进行扩增；

(d)用第二尾引物和第二靶特异性引物对所述步骤(c)产生的扩增子的一部分进行扩增；

(e)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(d)的扩增部分进行测序；

其中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列、含有6个-12个随机核苷酸的中间的条形码部分以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由所述步骤(c)产生的所述扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；

8.如段落7所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述各加尾随机引物进一步包含间隔区核酸序列。

9.如段落7或8所述的方法，其中，在延伸步骤之后，将未杂交的引物从反应中去除。

10.如段落7-9中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物相对于所述第一尾引物通过至少3个核苷酸嵌套。

11.如段落7-10中任一段所述的方法，其中，所述第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不与任何引物的任何其它部分相同的高GC含量的核酸序列。

12.如段落7-11中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物与全长的第一测序引物相同。

13.如段落7-12中任一段所述的方法，其中，特异性地退火至已知靶标的所述靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中于约65℃的温度下特异性地退火。

14.如段落7-13中任一段所述的方法，其中，所述样品包含基因组DNA。

15.如段落7-14中任一段所述的方法，其中，所述样品包含RNA，且所述方法进一步包括使所述样品经受逆转录酶方案的第一步骤。

16.如段落7-15中任一段所述的方法，其中，存在于所述样品中的所述核酸未经受剪切或消化。

17.如段落7-16中任一段所述的方法，其中，所述样品包含单链gDNA或单链cDNA。

18.如段落7-17中任一段所述的方法，其中，所述逆转录酶方案包括随机六聚体的使用。

19.如段落7-18中任一段所述的方法，其中，基因重排包括所述已知的靶序列。

20.如段落19所述的方法，其中，所述基因重排存在于选自于由基因组DNA、RNA和cDNA所组成的组中的核酸中。

21.如段落19-20中任一段所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。

22.如段落21所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。

23.如段落7-22中任一段所述的方法，其中，通过下一代测序法对所述核酸产物进行测序。

24.如段落23所述的方法，其中，所述下一代测序法包括选自于由如下所组成的组中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序以及DNA纳米球测序。

25.如段落7-24中任一段所述的方法，其中，第一测序引物和第二测序引物兼容所选的下一代测序法。

26.如段落7-25中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

27.如段落7-26中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

28.如段落7-27中任一段所述的方法，其中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至由单独的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。

29.如段落7-28中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。

30.如段落7-29中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。

31.如段落7-30中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同的外显子。

32.如段落7-31中任一段所述的方法，其中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。

33.如段落7-32中任一段所述的方法，其中，加尾随机引物群中的各加尾随机引物进一步包含相同的样品条形码化部分。

34.如段落33所述的方法，其中，使多种样品各自与具有样品条形码化部分的单独的加尾随机引物群接触；其中，加尾随机引物群各自具有不同的样品条形码化部分；并且其中，在步骤(b)之后将所述样品合并。

35.如段落7-34中任一段所述的方法，其中，各扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。

36.如段落7-35中任一段所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约61℃-72℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

37.如段落7-36中任一段所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约65℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

38.如段落7-37中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸分子来自样品，任选地所述样品是获得自受试者的生物样品。

39.如段落38所述的方法，其中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。

40.如段落39所述的方法，其中，所述疾病为癌症。

41.如段落38所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤细胞群。

42.如段落38所述的方法，其中，所述样品是肿瘤活检物。

43.如段落40所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。

44.如段落7-43中任一段所述的方法，其中，与疾病相关的基因包含所述已知的靶序列。

45.如段落38所述的方法，其中，所述样品中的基因重排产物包含所述已知的靶序列。

46.如段落45所述的方法，其中，所述基因重排产物是癌基因。

47.一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

(a)在促进模板特异性杂交和所述靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补的靶特异性引物接触；以及

(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与所述靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同的杂交序列的5’端；

其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有靶特异性引物特征的序列和具有多个不同引物的至少一个的特征的序列。

48.如段落47所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。

49.如段落47所述的方法，其中，所述靶核酸是脱氧核糖核酸。

50.如段落47-49中任一段所述的方法，其中，顺序进行步骤(a)和步骤(b)。

51.如段落47-50中任一段所述的方法，其中，步骤(a)中的所述核酸模板包含从步骤(b)中的多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。

52.如段落47-50中任一段所述的方法，其中，步骤(b)中的所述核酸模板包含步骤(a)中的所述靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。

53.如段落48所述的方法，其中，所述靶核酸是编码自包含基因重排的染色体片段的信使RNA。

54.如段落49所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色体片段。

55.如段落48所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。

56.如段落47-55中任一段所述的方法，所述方法进一步包括对所述延伸产物进行扩增。

57.如段落47-55中任一段所述的方法，所述方法进一步包括在杂交发生在所述延伸产物和固定的寡核苷酸之间的条件下，使所述延伸产物或扩增的延伸产物与固定的寡核苷酸接触。

58.如前述段落中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的侧翼部分。

59.如段落58所述的方法，其中，不同的杂交序列与所述侧翼部分互补。

60.如段落58或59中任一段所述的方法，其中，所述靶特异性杂交序列与所述靶部分互补。

61.如段落47-60中任一段所述的方法，其中，所述靶特异性引物进一步包含：所述靶特异性杂交序列的5’端；条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

62.如段落47-60中任一段所述的方法，其中，所述共同序列包括条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

63.如段落1-62中任一段所述的方法，其中，所述接头序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接头序列。

1.一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

(a)在促进模板特异性杂交和靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补的靶特异性引物接触；以及

(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与所述靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同杂交序列的5’端；

2.如段落1所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。

3.如段落1所述的方法，其中，所述靶核酸是脱氧核糖核酸。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，顺序进行步骤(a)和步骤(b)。

5.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，步骤(a)中的所述核酸模板包含从步骤(b)中的所述多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。

6.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，步骤(b)中的所述核酸模板包含步骤(a)中的所述靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。

7.如段落2所述的方法，其中，所述靶核酸是编码自包含基因重排的染色体片段的信使RNA。

8.如段落3所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色体片段。

9.如段落8所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。

10.如段落1-9中任一段所述的方法，所述方法进一步包括对所述延伸产物进行扩增。

11.如段落1-9中任一段所述的方法，所述方法进一步包括在杂交发生在所述延伸产物和固定的寡核苷酸之间的条件下，使所述延伸产物或扩增的延伸产物与固定的寡核苷酸接触。

12.如前述段落中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的侧翼部分。

13.如段落12所述的方法，其中，不同的杂交序列与所述侧翼部分互补。

14.如段落12或13所述的方法，其中，所述靶特异性杂交序列与所述靶部分互补。

15.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，所述靶特异性引物进一步包含：所述靶特异性杂交序列的5’端；条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

16.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，所述共同序列包括条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

17.如段落15或16所述的方法，其中，所述接头序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接头序列。

18.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用所述杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；

(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自所述步骤(f)的扩增部分进行测序；

其中，所述加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由所述步骤(e)产生的所述扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；

19.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与起始靶特异性引物接触；

(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的所述扩增部分进行测序；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由所述步骤(c)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；

20.如段落18-19中任一段所述的方法，所述方法进一步包括在所述起始靶特异性引物的延伸之后，使所述样品和产物与RNase接触的步骤。

21.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述加尾随机引物可形成发夹环结构。

22.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，所述起始靶特异性引物和所述第一靶特异性引物相同。

23.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码部分。7.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用所述杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；

(e)使用第一测序引物和第二测序引物对来自所述步骤(d)的扩增部分进行测序；

其中，所述加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列、含有6个-12个随机核苷酸的中间的条形码部分以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；

24.如段落23所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述各加尾随机引物进一步包含间隔区核酸序列。

25.如段落23或24所述的方法，其中，在延伸步骤之后，将未杂交的引物从所述反应中去除。

26.如段落23-25中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物相对于所述第一尾引物通过至少3个核苷酸嵌套。

27.如段落23-26中任一段所述的方法，其中，所述第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不与任何引物的任何其它部分相同的高GC含量的核酸序列。

28.如段落23-27中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物与所述全长的第一测序引物相同。

29.如段落23-28中任一段所述的方法，其中，特异性地退火至所述已知靶标的所述靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中于约65℃的温度下特异性地退火。

30.如段落23-29中任一段所述的方法，其中，所述样品包含基因组DNA。

31.如段落23-30中任一段所述的方法，其中，所述样品包含RNA，且所述方法进一步包括使所述样品经受逆转录酶方案的第一步骤。

32.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，存在于所述样品中的所述核酸未经受剪切或消化，或者其中，所述样品包含单链gDNA或单链cDNA。

33.如段落23-32中任一段所述的方法，其中，所述逆转录酶方案包括随机六聚体的使用。

34.如段落23-33中任一段所述的方法，其中，基因重排包括所述已知的靶序列。

35.如段落34所述的方法，其中，所述基因重排存在于选自于由基因组DNA、RNA和cDNA所组成的组中的核酸中。

36.如段落34-35中任一段所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。

37.如段落36所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。

38.如段落23-37中任一段所述的方法，其中，通过下一代测序法对所述核酸产物进行测序。

39.如段落38所述的方法，其中，所述下一代测序法包括选自于由如下所组成的组中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序以及DNA纳米球测序。

40.如段落23-39中任一段所述的方法，其中，第一测序引物和第二测序引物兼容所选的下一代测序法。

41.如段落23-40中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

42.如段落23-41中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

43.如段落23-42中任一段所述的方法，其中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至由单独的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。

44.如段落23-43中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。

45.如段落23-44中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。

46.如段落23-45中任一段所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同的外显子。

47.如段落23-46中任一段所述的方法，其中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。

48.如段落23-47中任一段所述的方法，其中，加尾随机引物群中的各加尾随机引物进一步包含相同的样品条形码化部分。

49.如段落48所述的方法，其中，使多种样品各自与具有样品条形码化部分的单独的加尾随机引物群接触；其中，加尾随机引物群各自具有不同的样品条形码化部分；并且其中，在步骤(b)之后，将所述样品合并。

50.如段落23-49中任一段所述的方法，其中，各扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。

51.如段落23-50中任一段所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约61℃-72℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

52.如段落23-51中任一段所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约65℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

53.如段落23-52中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸分子来自样品，任选地所述样品是获得自受试者的生物样品。

54.如段落53所述的方法，其中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。

55.如段落54所述的方法，其中，所述疾病为癌症。

56.如段落53所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤细胞群。

57.如段落53所述的方法，其中，所述样品是肿瘤活检物。

58.如段落55所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。

59.如段落23-58中任一段所述的方法，其中，与疾病相关的基因包含所述已知的靶序列。

60.如段落53所述的方法，其中，所述样品中的基因重排产物包含所述已知的靶序列。

61.如段落60所述的方法，其中，所述基因重排产物是癌基因。

实施例

实施例1：使用逆转录酶与加尾随机寡核苷酸和基因特异性寡核苷酸来扩增3’融合事件的方法

第一链合成

作为对扩增用于序列分析的3’融合事件而言的第一步，从分离自受试者的样品中获得RNA。将以下反应集合在冰上，以合成第一cDNA链：

●12μl纯化RNA和H₂O

●2μl 1.2μg/μl随机引物#1(9mer)

●2μl dNTP

将反应转移至热循环仪，并在65℃下孵育5分钟。然后，将反应离心，并在冰上孵育至少一分钟。

对于上述反应而言，在冰上准备如下：

●2μl 10X M-MuLV逆转录酶缓冲液

●1μl 40U/μl RNase抑制剂

●1μl 200U/μl M-MuLV酶

将反应混合并短暂离心，以收集在管底部的反应物质，然后放回冰上。然后将反应在42℃下孵育60分钟，随后在4℃下孵育。

ExoI处理

将如下添加至上述反应，

●1μl 20U/μl核酸外切酶I

将反应混合并短暂离心，以收集在管底部的反应物质，然后在37℃下孵育10分钟。接着，加入1.28μl的1N NaOH，并通过上下吹吸混合，然后离心以收集物质。将反应在80℃孵育10分钟，然后加入4μl 10mM Tris(pH 8.3)，并通过上下吹吸混合。在冰上将20μl的经核酸外切酶处理的DNA溶液转移至的新的200μl PCR管。

第二链cDNA合成

准备以下反应：

●来自以上的20μl DNA溶液

●11μl无核酸酶的H₂O

●4μl 10X PCR缓冲液II

●4μl 3μM基因特异性引物#1

●1μl 0.5mM dNTP

通过上下吹吸将反应混合，然后短暂离心以收集物质，并置于冰上。然后将反应在95℃下孵育3分钟，然后在22℃下孵育10秒，接着在4℃下孵育，直至进行下一步骤。将反应在冰上孵育至少一分钟。

将如下添加至反应：

●1μl 400U/μl Manta 1.0DNA聚合酶(高浓度)

将反应在25℃下孵育10秒，然后在70℃下孵育10分钟，并保持在4℃下直至进行下一步骤。

用AMPure珠#1纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●88.4μl AMPure珠

将悬浮液充分混合并在室温下孵育5分钟。使用磁体2-4分钟以对珠进行收集，且溶液表现为澄清。弃去上清液，并在磁体上用200μl 70％乙醇将珠洗涤两次。第二次洗涤后，将珠在室温下干燥5分钟。最后，通过从磁体将管移除并将珠重悬于包含在AMPure试剂盒中的12μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脱缓冲液中，从而洗脱DNA。将RNA-珠溶液置于磁体上2分钟。然后，将DNA溶液转移至新的PCR管，确保避免将珠转移至新的管。

应当理解的是，在一些实施方式中，珠与反应混合物的比例可影响返回片段的大小。在一些实施方式中，就融合检测而言，所有片段或基本上所有片段均长于60nt(例如，融合断点或结点各侧上30nt)，从而能够容易地识别各基因。

扩增#1

准备以下反应：

●来自上述纯化#1的10μl纯化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start缓冲液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_条形码引物

●2μl 3μM基因特异性引物#1

●0.5单元-2单元的聚合酶(例如，Pheonix Hot Start Taq，VeraSeq)

按照如下对反应进行孵育：

●步骤1：95℃孵育3分钟

●步骤2：95℃孵育30秒

●步骤3：65℃孵育5分钟，返回至步骤2共14个循环

●步骤4：72℃孵育2分钟

●步骤5：4℃，直至将方案进行下去

用AMPure珠#2纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●36.4μl AMPure珠

将悬浮液充分混合并在室温下孵育5分钟。使用磁体2-4分钟以对珠进行收集，且溶液表现为澄清。弃去上清液，并在磁体上用200μl 70％乙醇将珠洗涤两次。第二次洗涤后，将珠在室温下干燥5分钟。最后，通过从磁体将管移除并将珠重悬于包含在AMPure试剂盒中的9μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脱缓冲液中，从而洗脱DNA。将RNA-珠溶液置于磁体上2分钟。然后，将DNA溶液转移至新的PCR管，确保避免将磁珠转移至新的管。

扩增#2

准备以下反应：

●来自上述纯化#2的8.5μl纯化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start缓冲液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_29bp引物

●2μl 10μM P7条形码引物

●2μl 3μM基因特异性引物#2

●0.2μl 5U/μl Phoenix Hot Start Taq聚合酶

●2μl 10μM P7条形码引物

按照如下对反应进行孵育：

●步骤1：95℃孵育3分钟

●步骤2：95℃孵育30秒

●步骤3：65℃孵育5分钟，返回至步骤2共14个循环

●步骤4：72℃孵育2分钟

●步骤5：4℃，直至将方案进行下去

用AMPure珠#3纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●37.3μl AMPure珠

将悬浮液充分混合并在室温下孵育5分钟。使用磁体2-4分钟以对珠进行收集，且溶液表现为澄清。弃去上清液，并在磁体上用200μl 70％乙醇将珠洗涤两次。第二次洗涤后，将珠在室温下干燥5分钟。最后，通过从磁体将管移除并将珠重悬于包含在AMPure试剂盒中的20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脱缓冲液中，从而洗脱DNA。将RNA-珠溶液置于磁体上2分钟。然后，将DNA溶液转移至新的PCR管，确保避免将磁珠转移至新的管。

文库浓度的定量

使用Illumina的Kapa Biosystems qPCR试剂盒，以对使用上述方案制备的各文库的浓度进行定量。将条形码化的文库以等摩尔浓度合并。然后按照制造商的说明，使用MiSeq v2 300循环试剂盒，以XpM将文库加载到Illumina MiSeq上。使用2x150bp读取段(具有7个碱基编码的索引读取段)对样品进行测序。

实施例2：使用逆转录酶与基因特异性寡核苷酸和加尾随机寡核苷酸来扩增5’融合事件的方法

第一链合成

作为对扩增用于序列分析的5’融合事件而言的第一步，从分离自受试者的样品中获得RNA。将以下反应集合在冰上，以合成第一cDNA链：

●12μl纯化RNA和H₂O

●2μl基因特异性引物#1

●2μl dNTP

对于上述反应而言，在冰上准备如下：

●2μl 10X M-MuLV逆转录酶缓冲液

●1μl 40U/μl RNase抑制剂

●1μl 200U/μl M-MuLV酶

将反应混合并短暂离心，以收集在管底部的反应物质，然后放回冰上。然后将反应在42℃下孵育60分钟，随后在4℃孵育。

ExoI处理

将如下添加至上述反应，

●1μl 20U/μl核酸外切酶I

将反应混合并短暂离心，以收集在管底部的反应物质，然后在37℃下孵育10分钟。接着，加入1.28μl的1N NaOH，并通过上下吹吸混合，然后离心以收集物质。将反应在80℃孵育10分钟，然后加入4μl 10mM Tris(pH 8.3)，并通过上下吹吸混合。将20μl的经核酸外切酶处理的DNA溶液转移至在冰上的新的200μl PCR管。

第二链cDNA合成

准备以下反应：

●来自以上的20μl DNA溶液

●11μl无核酸酶的H₂O

●4μl 10X PCR缓冲液II

●4μl 1.2μg/μl随机引物(9mer)

●1μl 0.5mM dNTP

将如下添加至反应：

●1μl 400U/μl Manta 1.0DNA聚合酶(高浓度)

用AMPure珠#1纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●88.4μl AMPure珠

将悬浮液充分混合并在室温下孵育5分钟。使用磁体2-4分钟以对珠进行收集，且溶液表现为澄清。弃去上清液，并在磁体上用200μl 70％乙醇将珠洗涤两次。第二次洗涤后，将珠在室温下干燥5分钟。最后，通过从磁体将管移除并将珠重悬于包含在AMPure试剂盒中的12μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脱缓冲液中，从而洗脱DNA。将RNA-珠溶液置于磁体上2分钟。然后，将DNA溶液转移至新的PCR管，确保避免将磁珠转移至新的管。

扩增#1

准备以下反应：

●来自上述纯化#1的10μl纯化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start缓冲液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_条形码引物

●2μl 3μM基因特异性引物#1

●0.5单元-2单元的聚合酶(例如，Pheonix Hot Start Taq，VeraSeq)

按照如下对反应进行孵育：

●步骤1：95℃孵育3分钟

●步骤2：95℃孵育30秒

●步骤3：65℃孵育5分钟，返回至步骤2共14个循环

●步骤4：72℃孵育2分钟

●步骤5：4℃，直至将方案进行下去

用AMPure珠#2纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●36.4μl AMPure珠

扩增#2

准备以下反应：

●来自上述纯化#2的8.5μl纯化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start缓冲液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_29bp引物

●2μl 10μM P7条形码引物

●2μl 3μM基因特异性引物#2

●0.2μl 5U/μl Phoenix Hot Start Taq聚合酶

●2μl 10μM P7条形码引物

按照如下对反应进行孵育：

●步骤1：95℃孵育3分钟

●步骤2：95℃孵育30秒

●步骤3：65℃孵育5分钟，返回至步骤2共14个循环

●步骤4：72℃孵育2分钟

●步骤5：4℃，直至将方案进行下去

用AMPure珠#3纯化DNA

将如下添加至上述反应，

●37.3μl AMPure珠

文库浓度的定量

Claims

1.一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有所述靶特异性引物特征的序列和具有所述多个不同引物的至少一个的特征的序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸是脱氧核糖核酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，顺序进行步骤(a)和步骤(b)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述核酸模板包含从步骤(b)中的所述多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的所述核酸模板包含从步骤(a)中的所述靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。

7.如权利要求2所述的方法，其中，所述靶核酸是编码自包含基因重排的染色体片段的信使RNA。

8.如权利要求3所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色体片段。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对所述延伸产物进行扩增。

11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在杂交发生在所述延伸产物和固定的寡核苷酸之间的条件下，使所述延伸产物或扩增的延伸产物与固定的寡核苷酸接触。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的侧翼部分。

13.如权利要求12所述的方法，其中，不同的杂交序列与所述侧翼部分互补。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述靶特异性杂交序列与所述靶部分互补。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述靶特异性引物进一步包含：所述靶特异性杂交序列的5’端；条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述共同序列包括条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述接头序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接头序列。

(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与加尾随机引物群接触；

(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和加尾随机引物序列进行扩增；

(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；

其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(e)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；

20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述起始靶特异性引物的延伸之后，使所述样品和产物与RNase接触的步骤。

21.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述加尾随机引物可形成发夹环结构。

22.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述起始靶特异性引物和所述第一靶特异性引物相同。

23.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码部分。7.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(c)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和加尾随机引物序列进行扩增；

(d)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(c)产生的扩增子的一部分进行扩增；

24.如权利要求23所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述各加尾随机引物进一步包含间隔区核酸序列。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中，在延伸步骤之后，将未杂交的引物从所述反应中去除。

26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，所述第二尾引物相对于所述第一尾引物通过至少3个核苷酸嵌套。

27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，所述第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不与任何引物的任何其它部分相同的高GC含量的核酸序列。

28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中，所述第二尾引物与全长的第一测序引物相同。

29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中，特异性地退火至已知靶标的所述靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中于约65℃的温度下特异性地退火。

30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中，所述样品包含基因组DNA。

31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中，所述样品包含RNA，且所述方法进一步包括使所述样品经受逆转录酶方案的第一步骤。

32.如权利要求23-31中任一项所述的方法，其中，存在于所述样品中的所述核酸未经受剪切或消化，或者其中，所述样品包含单链gDNA或单链cDNA。

33.如权利要求23-32中任一项所述的方法，其中，所述逆转录酶方案包括随机六聚体的使用。

34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，基因重排包括已知的靶序列。

35.如权利要求34所述的方法，其中，所述基因重排存在于选自于由基因组DNA、RNA和cDNA所组成的组中的核酸中。

36.如权利要求34-35中任一项所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。

38.如权利要求23-37中任一项所述的方法，其中，通过下一代测序法对所述核酸产物进行测序。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述下一代测序法包括选自于由如下所组成的组中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序以及DNA纳米球测序。

40.如权利要求23-39中任一项所述的方法，其中，第一测序引物和第二测序引物兼容所选的下一代测序法。

41.如权利要求23-40中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

42.如权利要求23-41中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。

43.如权利要求23-42中任一项所述的方法，其中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至由单独的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。

44.如权利要求23-43中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。

45.如权利要求23-44中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。

46.如权利要求23-45中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同的外显子。

47.如权利要求23-46中任一项所述的方法，其中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。

48.如权利要求23-47中任一项所述的方法，其中，加尾随机引物群中的各加尾随机引物进一步包含相同的样品条形码化部分。

49.如权利要求48所述的方法，其中，使多种样品各自与具有样品条形码化部分的单独的加尾随机引物群接触；其中，加尾随机引物群各自具有不同的样品条形码化部分；并且其中，在步骤(b)之后，将所述样品合并。

50.如权利要求23-49中任一项所述的方法，其中，各扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。

51.如权利要求23-50中任一项所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约61℃-72℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

52.如权利要求23-51中任一项所述的方法，其中，对所述靶特异性引物和所述尾引物进行设计，从而使它们在约65℃的退火温度下特异性地退火至它们的互补序列。

53.如权利要求23-52中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸分子来自样品，任选地所述样品是获得自受试者的生物样品。

54.如权利要求53所述的方法，其中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。

55.如权利要求54所述的方法，其中，所述疾病为癌症。

56.如权利要求53所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤细胞群。

57.如权利要求53所述的方法，其中，所述样品是肿瘤活检物。

58.如权利要求55所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。

59.如权利要求23-58中任一项所述的方法，其中，与疾病相关的基因包含已知的靶序列。

60.如权利要求53所述的方法，其中，所述样品中的基因重排产物包含已知的靶序列。

61.如权利要求60所述的方法，其中，所述基因重排产物是癌基因。