TWI811831B - 用於檢測基因變異的靶向定序方法及套組 - Google Patents
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Abstract
本案係提供一種用於測定基因變異（例如基因融合）的方法。本案亦提供一種用於測定基因變異的套組。本案還提供一種用於治療個體的方法，其係藉由測定個體是否有特定癌症類型或基因型的風險並施用合適的治療。
Description
本案係關於分子診斷、腫瘤遺傳學(cancer genetics)、及分子生物學的領域。更具體地，本案係關於一種用於檢測基因融合事件的方法及套組。本案亦關於一種用於藉由以下步驟對一個體施用合適的治療的方法：測定特定癌症類型或基因型的風險並施用合適的治療。
基因變異泛指正常DNA序列中的變化，例如基因融合、點突變、插入、刪除、擴增(amplification)、及重排(rearrangement)。當DNA序列發生變異，可能會產生功能異常或異常活化的蛋白質，從而導致疾病(例如癌症)。於此，檢測基因變異乃為改善疾病監測及提供後續治療的重要步驟。
基因融合係在腫瘤形成中扮演重要角色之其中一種基因變異。二個原本分開且功能不同的基因可能彼此融合，從而導致轉位(translocation)、中間缺失(interstitial deletion)、或染色體倒置(chromosomal inversion)，產生各種不同型態的基因融合。基因融合的一種普遍型態係包括激酶基因(kinase gene)與高度表現之夥伴基因(partner gene)融合，其會導致腫瘤形成(因為該經融合的基因現可產生過量之具有潛在異常活性的蛋白質)。由於許多基因融合會導致癌症，可使用融合基因作為藥物發展的標靶。因此，為了識別出可受益於該些靶向療法的病患，檢測所有可能的基因融合是重要的。
近年來，許多用於檢測基因融合的平台係基於已知序列的基因融合。舉例言之，在傳統的PCR中，對於擴增過程係需要已知序列以適當地設計標靶專一性的正向與反向引子。然而，因為許多基因融合是先前未被鑑定的且具有未知序列，難以使用該等PCR技術檢測全部可能的基因融合。諸如5’/3’快速擴增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)等方法雖可用於克服此項困難，但具低質量且低含量之融合基因的臨床樣品仍對該些方法帶來限制。
基於靶向次世代定序(targeted next-generation sequencing(NGS))的平台在臨床實務中是理想的，且可區分為雜交捕獲(hybrid capture)(例如FoundationOne 94、97)與基於擴增子(amplicon-based)(例如Archer FusionPlex Solid Tumor Panel 120、121)的用於標靶富集(target enrichment)的方法。基於擴增子的方法係藉由在文庫構建期間，使用基因專一性引子對標靶序列進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增來標靶基因體、或轉錄體序列。至於多重PCR，係藉由使用一端為基因專一性引子且另一端為通用引子的PCR擴增而將通用序列添加至標靶序列。基於RNA的NGS技術可藉由在多重檢測(multiplexed assays)中(例如OmniFusion RNA Lung Cancer Panel)使用通用引子及基因專一性引子來檢測3’融合夥伴、或者可藉由轉接子連接技術(adapter ligation technology)(例如Archer FusionPlex NGS assay)來檢測任何已知或未知的5’或3’融合夥伴。然而，新穎融合或含有新穎斷裂點(breakpoint)之已知融合的檢測表現係受到文庫製備技術、外顯子覆蓋範圍及檢測效率的影響。
因此，醫療上仍需要精準且高靈敏的基因融合檢測方法，該方法須能夠在低質量且低含量的臨床樣品中鑑定出含有未知序列的基因融合。
本案係提供一種檢測基因變異的方法，包含以下步驟：
(a)將自生物樣品獲得之一標靶RNA、一模板轉換寡核苷酸(template-switching oligo)、一反轉錄酶、及一反轉錄(RT)引子混合成一混合物，其中該模板轉換寡核苷酸包含一第一通用引子序列，且該RT引子包含一第二通用引子序列；(b)使該混合物處於進行反轉錄的條件下，以提供與該標靶RNA互補的一標靶DNA；(c)使用一第一對引子擴增該標靶DNA，以獲得一第一PCR產物，其中該第一對引子包含一基因專一性引子及一通用引子，該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及在嚴格條件下雜交至標靶基因的3’端序列，該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，且該第一轉接子序列及第二轉接子序列彼此不同；(d)使用一第二對引子擴增該第一PCR產物，以獲得一第二PCR產物，其中該第二對引子係各自分別包含5’端一第三轉接子序列或一第四轉接子序列、及雜交至該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的3’端序列，且該第三轉接子序列及該第四轉接子序列彼此不同；以及(e)對該第二PCR產物進行分析，以檢測基因變異的存在，藉由使用至少一個轉接子序列的定序分析對該第二PCR產物進行分析。
如上述，該RT引子係包含一具有至少5個隨機核苷酸的線性結構。
如上述，該RT引子係包含一莖環(stem-loop)結構、及具有至少5個隨機核苷酸的一懸垂(overhang)結構。
如上述，該莖環結構為髮夾莖環結構或Y型莖環結構。
如上述，該莖環結構係包含一條碼序列。
如上述，該莖環結構至少為該第二通用引子序列的長度。
如上述，該第二通用引子序列的長度小於30個鹼基對(bp)。
如上述，該莖環結構的莖的長度為8bp。
如上述，該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的至少一者係包括一條碼序列。
如上述，該標靶DNA的長度為至少100bp。
如上述，該標靶DNA的長度為100bp至4000bp。
如上述，該標靶DNA的長度為100bp至500bp。
如上述，係在步驟(c)中藉由使用至少二個基因專一性引子的多重PCR對該標靶DNA進行擴增。
如上述，係藉由該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子來產生及分離該第一PCR產物。
如上述，該基因專一性引子係自融合接點邊界(fusion junction boundary)至少25bp的距離處雜交至該標靶DNA。
如上述，該雜交至標靶基因的3’端序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14-35、及其任何互補序列。
如上述，該第一通用引子序列或該第二通用引子序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：1-10、及其任何互補序列。
如上述，該基因變異為一基因融合其包含一序列選自由以下已知基因所組成的群組：ABL1、AKT3、ALK、ARV7、BCR、BRAF、CD74、EGFR、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、
FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2。
如上述，該生物樣品係來自固態腫瘤。
如上述，該生物樣品為福馬林固定石蠟包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE)的組織樣品。
如上述，該第二PCR產物係藉由次世代定序進行分析。
在一方面，本案亦提供一種用於檢測生物樣品中之基因變異的套組，包含：(a)一模板轉換寡核苷酸，其係包含一第一通用引子序列；(b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一莖環結構、以及具有至少5個隨機尾端核苷酸的一懸垂結構，其中該RT引子係包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)分別互補於該第一轉接子序列及該第二轉接子序列的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列或該第四轉接子序列係彼此不同；
(e)一反轉錄酶；(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
本案亦提供一種用於檢測生物樣品中之基因變異的套組，包含：(a)一模板轉換寡核苷酸，其係包含一第一通用引子序列；(b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一具有至少5個隨機尾端核苷酸的線性結構，其中該RT引子係包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)分別互補於該第一轉接子序列及第二轉接子序列的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列或該第四轉接子序列係彼此不同；(e)一反轉錄酶；(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
如上述，該第二通用引子序列的長度小於30bp。
如上述，該莖環結構的莖的長度為8bp。
如上述，該懸垂結構係一長度為5至10個核苷酸的隨機核苷酸。
如上述，該套組係進一步包含至少一個經標記的dNTP，其中該dNTP係由生物素、地高辛(Digoxigenin，DIG)或其他分子所標記。
另一方面，本案亦提供一種用於治療個體的方法，包含以下步驟：(a)藉由使用本發明方法檢測自個體獲得之生物樣品中的基因變異，以測定該個體是否有增加的特定癌症類型風險、或者有與特定基因型相關之特定癌症類型風險；以及(b)治療具該特定癌症類型的該個體，例如對該個體施用：(i)一治療有效量之siRNA，其係標靶該特定基因變異類型；(ii)一治療有效量之融合蛋白抑制劑，該融合蛋白係由該特定基因變異類型所編碼；(iii)一治療有效量之試劑，其係抑制由該特定基因變異類型所編碼之融合蛋白；(iv)一治療有效量之抗癌劑，其係根據該基因變異類型而選自由以下所組成的群組：細胞激素、細胞凋亡誘導劑、抗血管新生劑、化療試劑、放射治療試劑、及抗癌免疫毒素；或者(v)在該個體細胞內提供一靶向基因體編輯程序。
在後附圖式的圖中，係藉由例示而非限制的方式來闡述一或多個實施態樣，其中具有相同引用數字標記的元件全文代表相同的元件。除非另有揭露，否則圖式並非按比例繪製。
圖1A至1C係根據本案之一實施態樣的一種用於檢測基因變異的方法的示意說明。
圖2係本案之不同RT引子設計的示意說明。
圖3係可用於本發明之其他不同RT引子設計的示意說明。
圖4A至4F係顯示藉由使用不同RT引子而獲得之具有不同大小的PCR產物的相對螢光單位(RFU)值。
圖5A至5B係顯示藉由使用具有不同長度之隨機尾端核苷酸的RT引子而獲得的具有不同大小的PCR產物的相對螢光單位(RFU)值。
該些圖式僅為示意而非限制性的。在該些圖式中，為了說明之目的，部分元件的大小可能被誇大且非按比例繪製。該尺寸及相對尺寸不一定對應至本說明書實施態樣的實際縮減。
本說明書之實施態樣的製造及使用係於以下詳細討論。但應當理解，該些實施態樣提供許多可應用在廣泛的各種不同具體內容中的發明概念。所討論的具體實施態樣僅係製造及使用該實施態樣的具體方法說明，而非用於限制本文揭示的範圍。
在本說明書之技術背景中及全文各處所引據或描述的各種不同刊物、文獻、專利及專利申請案；該些參考資料之全文係各自藉由引用而併入本文中。包括在本案說明書中之文件、行為、材料、裝置、物品等的討論是為了提供本案內容之目的。該等討論並不代表任何或全部的該些事項構成了部分關於所揭露或所請任何發明的先前技術。
除非另有定義，否則本文中所使用的全部科技及科學術語皆具有如本領域具有通常知識者一般所理解的意義。如本文中所使用，除非上下文另有明確的規定，否則單數形式的「一(a、an)及該(the」係包括複數。
在此說明書中，基因變異係包含基因融合、點突變、插入、刪除、擴增、或重排。
所謂「基因融合」或「融合基因」係指基因變異，包括由二個原本獨立之基因或其部分所形成的雜交基因、或者由至少二個獨立外顯子所形成的特定基因。在此說明書中，將MET外顯子14跳躍(MET exon 14 skipping)視為一種融合型態。舉例言之，MET基因融合係至少部份MET基因與部分高表現夥伴基因之間的融合。MET基因融合亦是由導致MET基因之外顯子13與外顯子15之間的融合(MET外顯子14跳躍)的異常剪接所造成。當染色體上之第一基因(或該第一基因的一部分)與在相同或不同染色體上之第二基因(或該第二基因的一部分)融合而導致基因變異(例如轉位、中間缺失、或染色體倒置)，係形成一融合基因。「基因融合」亦指「基因轉位」或「基因重排」。舉例言之，當NTRK基因(或其部分)為基因融合的一部分，該等基因融合係稱為「NTRK基因融合」或「NTRK融合」。
在融合基因之5’端的基因係指該融合基因的「5’基因」，且在融合基因之3’端的基因係指該融合基因的「3’基因」。融合基因具有「融合基因斷裂點」，為基因發生融合的位置。本文中所使用之「融合基因斷裂點」可與「斷裂點」交互使用。融合基因斷裂點係位於融合基因之由融合接點序列(fusion junction sequence)所定義的區域中，該融合接點序列涵蓋來自5’基因的序列以及來自3’基因的序列。不同的融合基因斷裂點會導致不同的「融合型態」。因為融合斷裂點可發生在融合基因的任何位置，二個特定基因之間的融合可產生不同的融合基因。舉例言之，在第一基因的第一外顯子與第二基因的第二外顯子之間的融合為一種融合型態，而在該第一基因的第三外顯子與該第二基因的第一外顯子間的融合為另一種融合型態。
可藉由鑑定在一DNA或在該DNA之RNA轉錄本(transcript)中的融合接點來檢測基因融合。如本文中所使用，「融合型態」係指存在融合基因之RNA轉錄本中獨特的融合接點序列。換言之，儘管二個特定基因的融合基因在其DNA序列中可能有不同的融合接點序列，只要該等融合基因的RNA轉錄本中含有相同融合接點序列，即視為相同融合。當二個特定基因之間的融合發生在相同內含子區域內的不同位置，該等融合基因可能是相同的融合型態。舉例言之，基因A之外顯子3與基因B之外顯子5間的融合可能具有一含有以下的DNA融合區域：一小部分延伸自基因A之外顯子3及4間的外顯子3的內含子、以及一大部分延伸自基因B之外顯子4及5間的外顯子5的內含子。或者，該等融合可具有一含有以下的DNA融合區域：一大部分延伸自基因A之外顯子3及4間的外顯子3的內含子、以及一小部分延伸自基因B之外顯子4及5間的外顯子5的內含子。這二種融合(雖然具有不同的DNA融合接點)被視為相同的「融合態樣」，因為自該二個融合基因所產生的RNA轉錄本具有相同的融合接點序列。
如本文中所使用，所謂「反轉錄引子」或「RT引子」係指含有一通用引子序列、以及一線性結構或莖環結構的DNA引子，其中該線性結構係至少5個隨機尾核苷酸，以及該莖環結構具有至少5個隨機尾核苷酸的一懸垂結構。該RT引子係結合至RNA序列的3’端，以利用反轉錄來製造第一股cDNA。
如本文中所使用，所謂「模板轉換寡核苷酸」或「TS寡核苷酸」或「TSO」係指一寡核苷酸序列，其自5’端至3’端係含有一通用引子序列及一互補於在所合成cDNA之3’端的非模板核苷酸的序列。當利用一RNA模板藉由一反轉錄酶合成cDNA時，在接近該RNA之5’端上，該反轉錄酶的末端轉移酶活性增加了些許額外的非模板核苷酸(例如：當使用莫洛尼氏鼠類白血腫瘤病毒(MMLV)反轉錄酶，大部分為去氧胞核苷)至新合成之cDNA股的3’端。該些
非模板核苷酸的作用係作為TS寡核苷酸之結合位(anchoring site)。在TS寡核苷酸及非模板核苷酸之間進行鹼基配對後，反轉錄酶係將模板股自RNA「轉換」(switches)成TS寡核苷酸，且持續複製到TS寡核苷酸的5’端。如此一來，所產生的cDNA係含有該轉錄本完整的5’端，並將所選的通用引子序列添加至反轉錄產物。可如美國第2021/0180051號專利申請公開本(「擴增短RNA標靶的方法及系統(METHODS AND SYSTEMS TO AMPLIFY SHORT RNA TARGETS)」)所述般地合成TS寡核苷酸，其全文係藉由引用而併入本文中。
如本文中所使用，「基因專一性引子」乙詞係指一DNA引子，其係設計來特定地結合至一有興趣之基因的標靶DNA序列。在本案的部分實施態樣中，該基因專一性引子係特定地結合至一融合基因的DNA片段。
如本文中所使用，「通用引子」乙詞係指一DNA引子，其係設計來擴增包括該通用引子之核苷酸序列的任何DNA。
如本文中所使用，「轉接子」、「第一轉接子」、「第二轉接子」、「第三轉接子」及「第四轉接子」等詞係指一DNA轉接子，其係設計來添加種類標記物(varietal tag)、條碼至該cDNA，以產生序列庫、或者包括用於定序儀辨識的平台專一性序列。
本文中所描述之各個基因係對應至在NCBI基因資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中所列的「基因名稱(或符號)」。因此，該NCBI基因資料庫可用於識別一基因的序列或該基因名稱的同義詞。
如本文中所使用，有關本案方法「施用」乙詞，係指如本文所描述之用於治療性地或預防性地避免、治療或減緩一症候群、失調或疾病(例如癌症)的方法。該等方法包括在療程期間的不同時間、或同時以一組合形式施用有效量的所述治療劑。可理解本案方法係包含全部已知治療性的治療方案。
如本文中所使用，「治療有效量」乙詞係指活性化合物或醫藥試劑在一組織系統、動物或人體中消除生物或醫藥反應的含量(此係藉由研究者、獸醫、醫師、或其他臨床從業人員進行探尋)，包括避免、治療或減緩一所治療之症候群、失調或疾病、或者該所治療之症候群、失調或疾病的症狀。
在本說明書中，係提供一種用於檢測基因變異的方法。該方法包含以下步驟：(a)將自生物樣品獲得之一標靶RNA、一模板轉換寡核苷酸、一反轉錄酶、及一反轉錄(RT)引子混合成一混合物，其中該模板轉換寡核苷酸包含一第一通用引子序列，且該RT引子包含一第二通用引子序列；(b)使該混合物處於進行反轉錄的條件下，以提供與該標靶RNA互補的一標靶DNA；(c)使用一第一對引子擴增該標靶DNA，以獲得一第一PCR產物，其中該第一對引子包含一基因專一性引子及一通用引子，該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及在嚴格條件下雜交至標靶基因的3’端序列，該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，且該第一轉接子序列及該第二轉接子序列彼此不同；(d)使用一第二對引子擴增該第一PCR產物，以獲得一第二PCR產物，其中該第二對引子係各自分別包含5’端一第三轉接子序列或一第四轉接子序列、及雜交至該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的3’端序列，且該第三轉接子序列及第四轉接子序列彼此不同；以及(e)對該第二PCR產物進行分析，以檢測基因變異的存在，藉由使用至少一個轉接子序列的定序分析對該第二PCR產物進行分析。
在部分實施態樣中，係自一生物樣品製備RNA。該生物樣品可為獲得自動物或人類個體的任何樣品。該生物樣品的例子係包括福馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織切片、血液、血漿、或細胞。在部分實施態樣中，該生物樣品係源自於癌症病患。在部分實施態樣中，該生物樣品係源自於惡性腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、血癌、或骨髓瘤。在部分實施態樣中，該生物樣品係源自於患有腦癌、乳癌、大腸癌、內分泌腺癌、食道癌、雌性生殖器官癌、頭頸癌、肝膽系統癌、腎臟癌、肺癌、間質細胞瘤、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、胰臟外分泌腫瘤及泌尿系統癌。
可藉由本領域已知的各種方法自生物樣品製備總RNA。一種典型方法為使用有機溶劑(例如酚/氯仿)的RNA萃取，並藉由離心沉澱。亦可自商業購得用於RNA分離或純化的套組。一旦獲得RNA，便使用反轉錄酶與四種去氧核醣核苷三磷酸(dNTP；包括dATP、dCTP、dTTP、及dGTP)，以自模板RNA產生cDNA，此一過程稱為反轉錄。可使用SuperScript cDNA synthesis kit(購自Invitrogen，產品編號：11754050)進行反轉錄。
在部分實施態樣中，本發明方法可檢測序列為已知的遺傳基因變異。在部分實施態樣中，本發明方法可檢測序列的至少一端為已知遺傳基因變異。在部分實施態樣中，本發明方法可檢測已知的融合基因。在部分實施態樣中，本發明方法可檢測一已知基因與一未知基因的基因融合。在部分實施態樣中，本發明方法係檢測5’夥伴為已知且3’夥伴為未知的基因融合。在部分實施態樣中，本發明方法係檢測同一已知夥伴與複數個不同的未知夥伴的一系列基因融合。在部分實施態樣中，本發明方法可檢測複數個不同的已知夥伴與複數個不同的未知夥伴的多個基因融合。
在部分實施態樣中，可藉由固相核酸萃取(例如陰離子交換物質純化、或磁珠核酸純化)而分離本發明方法之步驟(d)中的第二PCR產物。
在部分實施態樣中，該第一轉換子序列或第二轉換子序列的至少一者包括一條碼序列。
在部分實施態樣中，該標靶DNA的長度為至少100bp。
在部分實施態樣中，該標靶DNA的長度為100bp至4000bp。
在部分實施態樣中，該標靶DNA的長度為100bp至500bp。
在部分實施態樣中，所揭露之方法係進一步包括以下步驟：在步驟(c)中藉由使用至少二個基因專一性引子的多重PCR對該標靶DNA進行擴增。
在部分實施態樣中，藉由該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子來產生及分離該第一PCR產物。
在部分實施態樣中，該基因專一性引子係自融合接點邊界至少25bp的距離處雜交至該標靶DNA。
在部分實施態樣中，該雜交至標靶基因的3’端序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14-35、及其任何互補序列。
在部分實施態樣中，該第一通用引子序列或該第二通用引子序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：1-10、及其任何互補序列。
在其他實施態樣中，該基因變異為一基因融合其包含一序列選自由以下已知基因所組成的群組：ABL1、AKT3、ALK、ARV7、BCR、BRAF、CD74、EGFR、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、
NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2。
在部分實施態樣中，係對該第二PCR產物進行定序來鑑定遺傳基因變異的存在。在部分實施態樣中，可藉由Sanger定序、次世代定序、或焦磷酸定序對該第二PCR產物進行定序。在部分實施態樣中，係對該第二PCR產物的定序結果進一步進行序列比對，以鑑定遺傳基因變異。在部分實施態樣中，該序列比對可能需要第一或第二比對。可使用數種比對演算法或軟體的其中一者而進行該第一或第二比對，例如：Blastn、BLAT、BWN、BreakDancer、Burrows-Wheeler Aligner(BWA)、BWA-MEM、BWA-SW、Bowtie、Stampy、Torrent Mapping Alignment Program(TMAP)、或TopHat。
在部分實施態樣中，本發明方法係使用RT引子及模板轉換寡核苷酸，以進行該標靶DNA的通用引子序列延伸。在部分實施態樣中，該模板轉換寡核苷酸係結合至任意基因變異序列的5’端，且該RT引子係結合至該任何基因變異序列的3’端。在部分實施態樣中，該RT引子係包含一莖環結構及具有至少5個隨機核苷酸的一懸垂結構。在部分實施態樣中，該RT引子係包含一第二通用引子序列與至少5個隨機尾核苷酸的串聯。在部分實施態樣中，該莖環結構為髮夾莖環結構或Y型莖環結構。在部分實施態樣中，該懸垂序列為一隨機六聚體(一具有6個連續核苷酸的隨機序列)。在部分實施態樣中，該莖環結構係包含一條碼序列。在部分實施態樣中，該莖環結構至少為該第二通用引子序列的長度。在部分實施態樣中，該RT引子包含一長度小於30bp的第二通用引子序列。在部分實施態樣中，該莖環結構的莖的長度為8bp。在部分實施態樣中，該莖環結構包含一第二通用引子序列、「GPS」條碼序列及樣品條碼序列(圖2)。
在部分實施態樣中，係使用包含至少一個經標記之dNTP的dNTP來合成該標靶DNA。在部分實施態樣中，對於合成該標靶DNA，未經標記之dNTP與經標記之dNTP的比例係介於4：1至7：1之範圍。在部分實施態樣中，係以生物素或其他官能基標記該dNTP。在部分實施態樣中，係藉由一連接子，以生物素或其他官能基標記該dNTP。在部分實施態樣中，該連接子係位在dNTP上無法形成DNA氫鍵的位置。在部分實施態樣中，該連接子為碳鏈。在部分實施態樣中，該連接子為16碳鏈(16C)。在部分實施態樣中，該經標記之dNTP包含生物素-16C-dCTP。在部分實施態樣中，該經生物素或其他官能基標記之dNTP可與鏈親和素磁珠(streptavidin-conjugated magnetic beads)或其他磁珠連接。在部分實施態樣中，該經生物素或其他官能基標記之標靶DNA可與鏈親和素磁珠或其他磁珠連接。在部分實施態樣中，該鏈親和素磁珠或其他磁珠會被磁場吸引。在部分實施態樣中，係以地高辛(DIG)標記該dNTP。在部分實施態樣中，該經DIG標記的dNTP可連接至通常接合有辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)或螢光染劑的抗DIG抗體。在部分實施態樣中，該經DIG標記的標靶DNA可連接至通常接合有HRP、AP或螢光染劑的抗DIG抗體。
如本文中所使用，所謂「分子(molecule)」係指可標記在dNTP或標靶DNA上的物質，例如生物素、其他官能基、或DIG。所謂「餌(bait)」係指能夠連接至該分子以捕獲該標靶DNA的其他物質，例如鏈親和素磁珠、其他磁珠、或抗DIG抗體。
在部分實施態樣中，可藉由分子專一性結合來分離標靶DNA。在部分實施態樣中，可藉由以下步驟來分離標靶DNA：(1)將經分子標記的標靶DNA與餌連接；(2)捕獲該與標靶DNA連接的餌；(3)將除了標靶DNA以外的任何試劑洗除。在部分實施態樣中，可藉由以下步驟來分離標靶DNA：(1)將經生
物素或其他官能基標記的標靶DNA與鏈親和素磁珠或其他磁珠連接；(2)提供磁場以捕獲該與標靶DNA連接之鏈親和素磁珠或其他磁珠；(3)將除了標靶DNA以外的所有試劑洗除。在部分實施態樣中，可藉由以下步驟來分離標靶DNA：(1)修飾抗DIG抗體至一固定相(solid phase)上；(2)將經DIG標記的標靶DNA與固定相上的抗DIG抗體連接；(3)將除了標靶DNA以外的所有試劑洗除。
本文係提供一種用於檢測基因變異的套組。在某些實施態樣中，該套組係包含：(a)一模板轉換寡核苷酸與一第一通用引子序列之串聯；(b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一莖環結構及至少5個隨機尾核苷酸的一垂懸結構，其中該RT引子係包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)分別互補於該第一轉接子序列及該第二轉接子序列的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列及該第四轉接子序列係彼此不同；(e)一反轉錄酶；
(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
在其他實施態樣中，該套組係包含：(a)一模板轉換寡核苷酸，其係包含一第一通用引子序列；(b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一具有至少5個隨機尾核苷酸的線性結構，其中該RT引子包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)一分別互補於該第一轉接子序列及該第二轉接子的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列及該第四轉接子序列係彼此不同；(e)一反轉錄酶；(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
本文亦提供一種測定一個體是否有特定癌症類型風險、或者是否有與特定基因型相關之癌症特定類型風險的方法，該方法係包含藉由以下步驟來檢測基因變異：(a)將自生物樣品獲得之一標靶RNA、一模板轉換寡核苷酸、一反轉錄酶、及一反轉錄(RT)引子混合成一混合物，其中該模板轉換寡核苷酸係包含一第一通用引子序列，以及該RT引子係包含一第二通用引子序列；(b)使該混合物處於進行反轉錄的條件下，以提供一與標靶RNA互補的標靶DNA；(c)使用一第一對引子擴增該標靶DNA，以獲得一第一PCR產物，其中該第一對引子包含一基因專一性引子及一通用引子，該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及在嚴格條件下雜交至標靶基因的3’端序列，該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，且該第一轉接子序列及第二轉接子序列彼此不同；(d)使用一第二對引子擴增該第一PCR產物，以獲得一第二PCR產物，其中該第二對引子係各自分別包含5’端一第三轉接子序列或一第四轉接子序列、及雜交至該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的3’端序列，且該第三及第四轉接子序列彼此不同；以及(e)對該第二PCR產物進行分析，以檢測基因變異的存在，藉由使用至少一個轉接子序列的定序分析對該第二PCR產物進行分析。
本文亦提供一種用於治療個體的方法，包含以下步驟：
(a)藉由使用如本文中所述之方法檢測自個體所獲得之生物樣品中的基因變異，以測定該個體是否有增加的癌症特定類型風險、或者是否有與特定基因型相關之癌症特定類型風險；以及(b)治療具該癌症特定類型的該個體，例如對該個體施用：(i)一治療有效量之siRNA，其係標靶該特定基因變異類型；(ii)一治療有效量之融合蛋白抑制劑，該融合蛋白係由該特定基因變異類型所編碼；(iii)一治療有效量之試劑，其係抑制由該特定基因變異類型所編碼之融合蛋白；(iv)一治療有效量之抗癌劑，其係根據該基因變異類型而選自由以下所組成的群組：細胞激素、細胞凋亡誘導劑、抗血管新生劑、化療試劑、放射治療試劑、及抗癌免疫毒素；或者(v)在該個體細胞內提供一靶向基因體編輯程序。
在某些實施態樣中，在個體中治療癌症特定類型的步驟係包含依基因變異檢測持續使用先前施用的治療劑。在其他實施態樣中，在個體中治療癌症特定類型的步驟係包含依基因變異檢測中斷先前施用的治療劑並施用不同的治療劑。
茲以下列實施例進一步說明本發明，該等實施例係提供作為例示，而非限制本發明。
實施例1
以PCR及模板轉換技術藉由標靶RNA定序來檢測基因融合
發展一種(特別是自質量不佳且低含量的樣品中)獲得任意未知的DNA或RNA序列的方法，尤其是在任意之可標靶序列附近含有基因變異(例如基因融合)的DNA或RNA。圖1係顯示一例示性方法的整體步驟，其係以一RNA序列作為起始模板來檢測基因融合。為了獲得未知之序列，係使用一引子(例如購自Integrated Device Technology(IDT)公司)與標靶RNA片段結合，並藉由反轉錄製造標靶DNA，接著使用通用引子進行PCR擴增，最後會獲得含有未知序列的PCR產物，並藉由Sanger法進行定序。
於實驗步驟1，獲取自福馬林固定石蠟包埋(FFPE)之RNA樣品係在65℃下變性5分鐘、在冰上冷卻、然後與在引子5’端含有一通用序列A(即，第二通用引子序列)的反轉錄(RT)隨機引子反應來合成第一股cDNA。在Template Switching RT Enzyme Mix(購自New England Biolabs公司)中的反轉錄酶接觸RNA模板的5’端後，會添加一些非模板核苷酸至所合成之DNA的3’端。該非模板核苷酸係作為模板轉換(TS)寡核苷酸的結合位。
於實驗步驟2，製備含有一通用引子B之序列(即，第一通用引子序列)的模板轉換寡核苷酸(TSO)。在TS寡核苷酸及非模板核苷酸之間鹼基配對後，反轉錄酶係將模板股自RNA轉換至TS寡核苷酸，並持續將cDNA延伸至該TS寡核苷酸的5’端，添加通用序列B至所合成之cDNA的3’端。根據製造商流程(OmniFusionTM RNA)使用商業購得之套組對所合成之cDNA進行RT淨化(cleanup)反應及RT後純化。
於實驗步驟3，藉由使用二個引子池進行標靶cDNA的富集。該引子池1及引子池2係分別用於檢測未知5’融合夥伴及未知3’融合夥伴。對於未知5’融合夥伴的檢測，係藉由使用一與Read1序列(即，第一轉接子序列或第二轉接子序列)連接之正向通用引子B(雜交至通用序列B)、以及一與Read2序列(即，
第一轉接子序列或第二轉接子序列)連接之反向3’基因專一性引子來進行多重PCR。對於未知3’融合夥伴的檢測，係使用一與Read2序列連接之反向通用引子A(雜交至通用序列A)、以及一與Read1序列連接之正向5’基因專一性引子來進行多重PCR。在標靶富集後，根據製造商流程(OmniFusionTM RNA)使用商業購得之套組進行mPCR後純化、消化反應及消化後純化。
於實驗步驟4，對於第二PCR擴增(索引目的)，來自步驟3之經純化DNA二端的轉接子序列(Read1及Read2)係作為具有次世代定序平台轉接子序列P5、P7(即，第三轉接子序列或第四轉接子序列)之專一性引子進行鹼基配對的黏合位。接著，係製備出第二PCR產物以藉由Sanger定序或次世代定序(例如illumina或ion torrent)進行融合事件檢測。
圖1係顯示本發明方法的整體流程。當夥伴基因為未知或不包括在小組(panel)中時，二階段的PCR方法可成功地富集存在潛在基因融合之標靶產物，以檢測該基因融合事件。
通用引子A或通用引子B可為表1中所列的任何引子序列，其中各個通用引子序列可用作為通用正向引子或通用反向引子。
實施例2
比較不同RT引子的PCR產物大小
基於本文中所述之用於檢測新穎融合轉錄本的設計，基因專一性引子係分為二個不同的引子池，即，一個用於檢測5’融合基因，另一個用於檢測3’融合基因。圖2係說明可用於本發明方法中的引子設計。
為了測試不同反轉錄(RT)相關引子對於反轉錄之效益及專一性的影響，係藉由利用三種含有通用引子序列的RT引子，以PBMC之RNA混合物作為模板進行細胞外反轉錄，來構建cDNA文庫。經評估之RT引子係包括在5’端上具有通用引子標記物之線性形式隨機六聚體引子、僅在環狀區域具有通用引子標記物之莖環形式隨機六聚體引子、以及在環狀及莖部區域均具有通用引子標記物之莖環形式隨機六聚體引子(圖3)。
圖4A至4F、5A及5B係顯示使用不同RT相關引子時，不同大小之PCR產物的相對螢光單位(RFU)值。該結果係顯示，三種RT引子皆可成功地合成用於進一步之PCR擴增程序的cDNA產物(圖4A至4F)。在經設計之線性隨機六聚體引子及經設計之莖環結構引子間的專一性與表現不同，可基於需求在文庫構建系統中選擇合適的RT引子作為RT轉換寡核苷酸。
實施例3
測定潛在的MET基因變異
基於MET基因之RNA轉錄本中的已知融合接點序列的核苷酸序列(示於表3)，設計標靶MET外顯子14跳躍突變核酸的3’或5’基因專一性引子(示於表2)。使用該3’或5’基因專一性引子以藉由本發明方法來檢測包含該已知融合接點及其他融合型態的基因融合事件。在表3中的前20個及後20個鹼基對
係分別來自5’夥伴(MET基因的外顯子13)及3’夥伴(MET基因的外顯子15)。亦可使用其他3’或5’基因專一性引子序列，以藉由本發明方法來檢測MET基因融合事件。
實施例4
測定潛在的NTRK基因變異
表4係顯示各種不同的NTRK融合型態以及部分可用於本發明方法的3’或5’基因專一性引子。基於在NTRK基因融合之RNA轉錄本中的融合區域的核苷酸序列，設計標靶NTRK外顯子突變核酸的3’或5’基因專一性引子。使用該引子以藉由本發明方法檢測基因融合事件。亦可使用其他3’或5’基因專一性引子序列，以藉由本發明方法來檢測NTRK基因融合事件。
實施例5
測定潛在的EGFRvIII基因變異
基於EGFR-EGFR融合基因之RNA轉錄本中的融合區域的核苷酸序列(如表6所示)，設計標靶EGFR外顯子突變核酸的3’或5’基因專一性引子(示於表5)。使用該3’或5’基因專一性引子，以藉由本案方法檢測基因融合事件。亦可使用其他3’或5’基因專一性引子序列，以藉由本發明方法來檢測EGFR基因融合事件。
此案申請專利範圍係主張於2020年11月3日提交之美國第63/108,932號臨時申請案、以及於2021年2月26日提交之美國第63/153,956號臨時申請案的優先權。各案說明書之全文係藉由引用而併入本文中。
此案含有一序列表，該序列表係以ASCII之序列表格式經由EFS-Web進行電子呈送(檔名為「066997-1WO1序列表」；創建日期為2021年10月12日；且檔案大小為7.1kb)。該經由EFS-Web呈送之序列表為本說明書的一部分且其全文係藉由引用而併入本文中。
<110> 香港商行動基因(智財)有限公司(ACT Genomics(IP)Limited)
<120> 用於檢測基因變異的靶向定序方法及套組
<130> 066997.11002/1WO1
<140> 110140841
<141> 2021-11-02
<150> US63/108,932
<151> 2020-11-03
<150> US63/153,956
<151> 2021-02-26
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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<223> EGFR-EGFR融合
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Claims (27)
- 一種檢測生物樣品中之基因變異的方法，包含以下步驟：(a)將自一生物樣品獲得之一標靶RNA、一模板轉換寡核苷酸(template-switching oligo)、一反轉錄酶、及一反轉錄(RT)引子混合成一混合物，其中該模板轉換寡核苷酸包含一第一通用引子序列，且該RT引子包含一第二通用引子序列；(b)使該混合物處於進行反轉錄的條件下，以提供與該標靶RNA互補的一標靶DNA；(c)使用一第一對引子擴增該標靶DNA，以獲得一第一PCR產物，其中該第一對引子包含一基因專一性引子及一通用引子，該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，且該第一轉接子序列及該第二轉接子序列彼此不同，其中，藉由該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子來產生及分離該第一PCR產物；(d)使用一第二對引子擴增該第一PCR產物，以獲得一第二PCR產物，其中該第二對引子係各自分別包含5’端一第三轉接子序列或一第四轉接子序列、及雜交至該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的3’端序列，且該第三轉接子序列及該第四轉接子序列彼此不同；以及(e)對該第二PCR產物進行分析，以檢測基因變異的存在，藉由使用至少一個轉接子序列的定序分析對該第二PCR產物進行分析。
- 如請求項1所述之方法，其中該RT引子係包含一具有至少5個隨機核苷酸的線性結構。
- 如請求項1所述之方法，其中該RT引子係包含一莖環(stem-loop)結構、及具有至少5個隨機核苷酸的一懸垂(overhang)結構。
- 如請求項3所述之方法，其中該莖環結構為髮夾莖環結構或Y型莖環結構。
- 如請求項3所述之方法，其中該莖環結構係包含一條碼序列。
- 如請求項3至5中任一項所述之方法，其中該莖環結構至少為該第二通用引子序列的長度。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該第二通用引子序列的長度小於30個鹼基對(bp)。
- 如請求項3至5中任一項所述之方法，其中該莖環結構的莖的長度為8bp。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該第一轉接子序列或該第二轉接子序列的至少一者係包含一條碼序列。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該標靶DNA的長度為至少100bp。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該標靶DNA的長度為100bp至4000bp。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該標靶DNA的長度為100bp至500bp。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其係在步驟(c)中藉由使用至少二個該基因專一性引子的多重PCR對該標靶DNA進行擴增。
- 如請求項1所述之方法，其中該基因專一性引子係自融合接點邊界(fusion junction boundary)至少25bp的距離處雜交至該標靶DNA。
- 如請求項1所述之方法，其中該雜交至標靶基因的3’端序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14-35、及其任何互補序列。
- 如請求項1所述之方法，其中該第一通用引子序列或該第二通用引子序列係選自由以下所組成的群組：SEQ ID NO：1-10、及其任何互補序列。
- 如請求項1所述之方法，其中該基因變異為一基因融合其包含一序列選自由以下已知基因所組成的群組：ABL1、AKT3、ALK、ARV7、BCR、BRAF、CD74、EGFR、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該生物樣品係來自固態腫瘤。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該生物樣品為福馬林固定石蠟包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE)的組織樣品。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該第二PCR產物係藉由次世代定序進行分析。
- 一種用於檢測生物樣品中之基因變異的套組，包含：(a)一模板轉換寡核苷酸，其係包含一第一通用引子序列；(b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一莖環結構、以及具有至少5個隨機尾端核苷酸的一懸垂結構，其中該RT引子包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)分別互補於該第一轉接子序列及該第二轉接子序列的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列或該第四轉接子序列係彼此不同；(e)一反轉錄酶；(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
- 一種用於檢測生物樣品中之基因變異的套組，包含：(a)一模板轉換寡核苷酸，其係包含一第一通用引子序列； (b)一反轉錄(RT)引子，其係包含一具有至少5個隨機尾端核苷酸的線性結構，其中該RT引子包含一第二通用引子序列；(c)一引子池，其包含一基因專一性引子以及一通用引子，其中該基因專一性引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及一雜交至標靶基因的3’端序列，其中該通用引子包含5’端一第一轉接子序列或一第二轉接子序列、及包含該第一通用引子序列或雜交至該第二通用引子序列的3’端序列，其中該基因專一性引子的該第一轉接子序列係不同於該通用引子的該第二轉接子序列，或者該基因專一性引子的該第二轉接子序列係不同於該通用引子的該第一轉接子序列，其中該引子池是依照該雜交至標靶基因的3’端序列為3’基因專一性引子或5’基因專一性引子被分為不同的引子池；(d)分別互補於該第一轉接子序列及該第二轉接子序列的一引子對，其中該引子對的各個引子係分別包含一第三轉接子序列或一第四轉接子序列，且其中該第三轉接子序列或該第四轉接子序列係彼此不同；(e)一反轉錄酶；(f)一DNA聚合酶；以及(g)一去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
- 如請求項21或22所述之套組，其中該第二通用引子序列的長度小於30bp。
- 如請求項21所述之套組，其中該莖環結構的莖的長度為8bp。
- 如請求項21所述之套組，其中該懸垂結構係長度為5至10個核苷酸的一隨機核苷酸。
- 如請求項21或22所述之套組，其中該套組係進一步包含至少一個經標記的dNTP，其中該dNTP係由生物素、地高辛(Digoxigenin，DIG)或其他分子所標記。
- 如請求項1至5中任一項所述之方法，該方法進一步包含依據檢測自一個體獲得之生物樣品中的基因變異，以測定該個體是否有增加的特定癌症類型風險、或者是否有與特定基因型相關之特定癌症類型風險，來決定一治療方案的步驟。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015112974A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
| WO2020118200A1 (en) * | 2018-12-07 | 2020-06-11 | Qiagen Sciences, Llc | Methods for preparing cdna samples for rna sequencing, and cdna samples and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3064205A1 (en) * | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Abvitro Llc | High-throughput polynucleotide library sequencing and transcriptome analysis |
| US11639517B2 (en) * | 2018-10-01 | 2023-05-02 | Becton, Dickinson And Company | Determining 5′ transcript sequences |
| JP2022516446A (ja) * | 2018-12-28 | 2022-02-28 | バイオブロックス エイビー | 相補的ｄｎａを調製するための方法およびキット |
| US20210180051A1 (en) | 2019-12-16 | 2021-06-17 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and systems to amplify short rna targets |
-
2021
- 2021-11-02 TW TW110140841A patent/TWI811831B/zh active
- 2021-11-02 JP JP2023527994A patent/JP2023547732A/ja active Pending
- 2021-11-02 US US18/034,732 patent/US20230399693A1/en active Pending
- 2021-11-02 EP EP21807261.9A patent/EP4240842A1/en active Pending
- 2021-11-02 WO PCT/IB2021/060130 patent/WO2022097021A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015112974A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
| WO2020118200A1 (en) * | 2018-12-07 | 2020-06-11 | Qiagen Sciences, Llc | Methods for preparing cdna samples for rna sequencing, and cdna samples and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Peng, Q., Vijaya Satya, R., Lewis, M. et al. Reducing amplification artifacts in high multiplex amplicon sequencing by using molecular barcodes. BMC Genomics, VOL. 16, NO. 589, 2015/08/07, page1-12 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023547732A (ja) | 2023-11-13 |
| EP4240842A1 (en) | 2023-09-13 |
| WO2022097021A1 (en) | 2022-05-12 |
| TW202223101A (zh) | 2022-06-16 |
| US20230399693A1 (en) | 2023-12-14 |
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