KR20240037181A - 핵산 농축 및 검출 - Google Patents
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Abstract
가피로인산분해 반응을 기초로 한 혼성화 포획 방법이 개시된다. 본 발명에 따르면, 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키는 방법이 제공된다.
Description
본 출원은 2021년 4월 15일자로 출원된 GB 출원 제2105405.1호, 2021년 4월 15일자로 출원된 GB 출원 제2105388.9호 및 2021년 8월 6일자로 출원된 GB 출원 제2111381.6호를 우선권으로 주장하며, 이의 개시내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
2022년 4월 15일자로 생성된, 15,464 바이트의 파일 크기를 갖는 "40018-601_SEQUENCE_LISTING_ST25"라는 명칭의 본 명세서에 제출된 컴퓨터 판독 가능한 서열 목록의 텍스트는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
야생형 분자의 풀에서 저빈도 변이체의 표적화된 검출은 암의 조기 검출, 암 진행의 모니터링, 암 요법의 표적화, 비-침습적 산전 시험, 특정 (네오-)항원을 표적화하는 T-세포 집단의 모니터링, 및 장기 이식 거부의 조기 경고에 임상적으로 중요하다. 혼성화-포획 및 차세대 시퀀싱(NGS)의 조합은 저빈도 변이체의 표적화 및 다중 검출을 위해 가장 일반적으로 적용되는 방법이지만, 몇 가지 차선책 특성을 갖는다. 일반적으로, 혼성화 포획은 관심 표적 영역에 대해 풍부하지만 변이체 분자에 대해서는 그렇지 않다. 이는 대부분의 시퀀싱 리드(sequencing read)가 변이체 분자보다는 야생형으로부터 유래하는 결과를 낳는다. 이는 낭비적이고, 비용을 추가하고, 저장, 라이브러리 제조 및 시퀀싱으로부터의 오류의 배경에 대해 희귀 변이체를 검출하기 어렵게 한다. 이는 NGS가 약 0.1% 미만의 변이체의 일상적인 검출에 대해 불충분한 특이성을 갖도록 하였다. 변형된 라이브러리 제조 방법(예컨대, 듀플렉스 시퀀싱)은 특이성을 증가시켜, 단일 분자로부터 정확한 시퀀싱 데이터를 생성할 수 있다. 불행히도, 듀플렉스 시퀀싱과 같은 방법은 또한 (예를 들어, 말단-복구를 피하기 위해 라이브러리 제조 방법을 변경하고 분자 병목 현상을 의도적으로 부과함으로써) 감도를 감소시킨다. 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 가피로인산분해(pyrophosphorolysis: PPL)에 기반한 변형된 혼성화 포획 방법을 사용하여 관심 표적 영역 내에 위치한 변이체 분자의 농축을 가능하게 한다. 이는 둘 모두 필요한 시퀀싱 리드의 수를 감소시킬 뿐만 아니라 NGS의 검출의 전류 한계 미만의 저빈도 변이체 분자의 다중 검출로 가는 기회를 열어 준다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 가피로인산분해 반응에 기반한 혼성화 방법이 제공된다. 이러한 방법은 가피로인산분해의 이중-가닥 특이성을 이용하며; 이러한 반응은 뉴클레오타이드 미스매치의 차단기를 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 기질 또는 이중-가닥 기질과 함께 효율적으로 진행되지 않을 것이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 샘플(예를 들어, 2개 이상의 상이한 핵산 분자를 함유함)을 프로브 및 가피로인산분해 반응 시약과 접촉시키는 단계, 및 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자에 대한 프로브의 상이한 상보성에 기반하여, 제2 핵산에 비해 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시켜 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자에 혼성화될 때 프로브의 상이한 수준의 가피로인산분해를 초래하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 방법은 제1 핵산 분자를, 샘플에서 다른 핵산 분자에 비해 제1 핵산 분자의 표적 영역과 상보적으로 상이한 프로브와 접촉시키고; 가피로인산분해 반응을 수행하고; 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시킴으로써, 핵산 분자들의 혼합물을 포함하는 샘플에서 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 샘플에서 제2 핵산의 상응하는 표적 영역보다 제1 핵산 분자의 표적 영역에 대해 더 큰 상보성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 프로브는 샘플에서 제2 핵산의 상응하는 표적 영역보다 제1 핵산 분자의 표적 영역에 대해 더 적은 상보성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 서열 변이(예를 들어, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 멀티뉴클레오타이드 변화, 융합 등)에 의해 상이하다. 일부 실시형태에서, 프로브는 더 큰 상보성의 서열의 표적 영역에 완전히 상보적이고 더 적은 상보성의 서열의 상응하는 표적 영역에서 발견되는 서열 변이에 대해 하나 이상의 미스매치를 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자 둘 모두의 표적 영역에 대한 하나 이상의 미스매치를 함유하지만, 더 적은 상보성의 핵산의 표적 영역에 대한 더 많은 미스매치를 함유한다. 특히, 프로브는 프로브가 제2 핵산에 비해 제1 핵산에 혼성화될 때 가피로인산분해의 정도가 상이하여, 가피로인산분해에 의해 생성된 상이한 반응 생성물을 기반으로 하여 제2 핵산에 비해 제1 핵산의 선택적 농축 또는 고갈을 허용하도록 설계된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 a) 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열과 상보적으로 상이한 프로브에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하는 샘플을 노출시키는 단계; b) 가피로인산분해 반응을 수행하는 단계; 및 c) 제2 핵산 서열에 비해 제1 핵산 서열을 농축시키거나 고갈시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키거나 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키는 방법으로서, 샘플은 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하며, 방법은
a. 하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열에 대해 차등 상보성을 갖는 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0(예를 들어, 상기 프로브의 3' 말단은 제1 서열 또는 제2 서열 중 하나에 완전하게 상보적이지만 다른 것에 불완전하게 상보적임)을 포함하는, 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계;
b. 단계 (a)에 의해 생성된 반응 혼합물을,
ii. 가피로인산분해 효소; 및
iii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제2 반응 혼합물에 도입하는 단계를 포함하되, A0은 핵산 서열들 중 하나에 (예를 들어, 완전하게) 어닐링되어 A0(예를 들어, A0의 3' 말단)이 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 중간 생성물을 생성하며, A0은 3' 말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되며, 다른 서열에 덜 완전하게(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 임의의 A0은 상기 덜 완전한(예를 들어, 불완전한) 어닐링으로 인해 더 적은 정도로 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는, 상기 반응 혼합물을 도입하는 단계;
c. 하기에 의해 더 완전하게(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 임의의 A0 서열 복합체들을 분리시키는 단계:
iv. 가피로인산분해 반응의 결과로서 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)되게 하는 것; 또는
v. 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)되기에 충분하지만 덜 완전하게(예를 들어, 불완전하게) 어닐링되어 분리(예를 들어, 용융)된 임의의 A0의 가닥에 필요한 온도 미만인 온도로 반응 혼합물을 가열하는 것; 및
d. A0에 어닐링되지 않은 임의의 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 핵산 서열을 분리시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
프로브에는 가피로인산분해 반응 전 또는 동안 제거되는 하나 이상의 성분이 제공될 수 있다. 예를 들어, 프로브에는 차단기가 제거될 때까지 가피로인산분해 또는 중합효소 반응의 개시를 방지하는 이들의 3' 말단에 비-상보적 플랩 또는 다른 차단기가 제공될 수 있다. 차단기는 임의의 적합한 메카니즘(예를 들어, 효소적 절단, 화학 반응, 온도 이동 등)에 의해 제거될 수 있다. 별개의 핵산 분자에 혼성화될 때, 차등적 가피로인산분해 생성물을 제공하는 프로브의 서열은 초기 프로브의 임의의 적합한 위치에 포지셔닝될 수 있다. 예를 들어, 미스매치 서열은 프로브의 3' 말단의 3' 말단 염기에 포지셔닝될 수 있다. 미스매치 서열은 3' 말단에서 프로브의 내부에 포지셔닝될 수 있다. 미스매치 서열은 프로브의 중앙에 포지셔닝될 수 있다. 미스매치 서열은 프로브의 5' 절반 내에 포지셔닝될 수 있다.
프로브의 5' 말단은 식별자(예를 들어, 샘플 식별자)로서 작용하는 영역(예를 들어, 5' 꼬리)을 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들어, 특정 샘플 또는 혼합된 샘플로부터의 하나씩의 특정 영역으로부터 포획된 분자를 선택적으로 풀다운시키기 위해 사용된다. 이러한 식별자는 다수의 상이한 표적이 동일한 샘플 또는 동일한 반응 용기에서 반응을 겪고 있는 다중 영역에서 특히 사용될 수 있다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 분석물/서열은 추구되는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 천연-발생 또는 합성 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산이다. 일부 실시형태에서, 분석물/서열은 통상적으로 이를 함유하는 수용액 및 다른 생물학적 물질에 존재할 것이며, 일부 실시형태에서, 분석물/서열은 시험 목적을 위해 관심 대상이 아닌 다른 배경 핵산 분자와 함께 존재할 것이다. 일부 실시형태에서, 분석물/서열은 이러한 다른 핵산 성분에 비해 소량으로 존재할 것이다. 바람직하게는, 예를 들어, 분석물이 세포 물질을 함유하는 생물학적 시편으로부터 유래되는 경우, 방법의 단계 (i)를 수행하기 전에 이러한 다른 핵산 및 외래 생물학적 물질의 일부 또는 모두는 여과, 원심분리, 크로마토그래피 또는 전기영동과 같은 샘플-제조 기술을 사용하여 제거될 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 환경(예를 들어, 물, 토양, 공기 등) 샘플 및 생물학적 샘플을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 유형의 샘플에 대해 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은 식물, 동물, 감염성 질병 인자 등을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 적합하게는, 일부 실시형태에서, 분석물/서열은 혈액, 혈장, 가래, 소변, 피부, 생검 또는 외과적 절제와 같은 포유동물 대상체(특히 인간 환자)로부터 채취된 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 분석물/서열이 존재하는 임의의 세포를 파괴함으로써 방출되도록 용해될 것이다. 다른 실시형태에서, 분석물/서열은 이미 샘플 자체; 예를 들어, 혈액 또는 혈장에서 순환하는 무세포 DNA 내에 유리 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 관심 분석물의 낮은 대립유전자 분획을 가질 수 있는 역사적으로 어려운 샘플 유형과 함께 특히 사용된다. 이러한 샘플은 혈액, 소변, 세포해면-수집된 샘플(예를 들어, 식도 샘플), 기관지폐포 세척액(BAL) 유래 샘플, 흉수, 및 뇌척수액(CSF)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 풀링된 샘플(pooled sample)이다. 풀링된 샘플은 풀링된 집합체가 시험되는 배치에서 다수의 샘플을 함께 혼합하는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 보다 제한된 양의 자원을 사용하여 시험될 수 있는 개별 샘플의 수를 증가시킨다. 풀링된 관심 대상 샘플은 공여된 혈액 샘플, 농업용 샘플, 식품 샘플, 정자 샘플, 및 감염성 질병 인자(예를 들어, SARS-CoV-2, HIV, HCV 등)의 존재에 대해 시험된 생물학적 샘플을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 풀링된 샘플은 생성의 특성에 의해 다수의 상이한 공급원으로부터 풀링된 샘플을 갖는 환경적으로 수집된 샘플(예를 들어, 폐수 샘플)이다. 샘플의 풀링은 샘플이 서로 희석됨에 따라 변이체의 대립유전자 분획을 감소시킬 수 있지만, 이는 스크리닝 효율의 극적인 증가를 제공할 수 있다. 본 명세서에 제공된 기술은 매우 낮은 대립유전자 분획에서 검출을 가능하게 하기 때문에, 이는 풀링된 샘플의 분석에 특히 매우 적합하다. 일부 실시형태에서, 각각의 초기 샘플의 분획은 바코드 또는 다른 복잡한 제조 단계를 사용하지 않고 풀링되고, 풀링된 샘플이 시험된다. 양성 결과가 얻어지면, 풀링되지 않은 샘플의 나머지 분획은 개별적으로 시험될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용되는 조성물(예를 들어, 시약, 키트, 반응 혼합물, 기구, 소프트웨어)이 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 수행하는 데 필요하거나, 충분하거나, 유용한 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 A0(여기서 A0은 공지된 제1 서열 및 공지된 제2 서열과 차등적으로 상보적인(예를 들어, 공지된 제1 서열에 완전하게 상보적이지만 공지된 제2 서열과 불완전하게 상보적인) 서열(예를 들어, 3' 말단)을 포함함); 하나 이상의 가피로인산분해 효소; 및 피로포스페이트 이온의 하나 이상의 공급원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 가피로인산분해 반응 후에 상기 프로브(예를 들어, 상기 프로브의 3' 말단)에 덜 완전하게(예를 들어, 불완전하게) 상보적인 핵산 분자로부터 상기 프로브(예를 들어, 상기 프로브의 3' 말단)에 보다 완전하게(예를 들어, 완전하게) 상보적인 표적 핵산 분자를 분리시키는 표적 핵산 단리 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 고체 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, A0은 공지된 제1 서열 또는 공지된 제2 서열에 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, A0은 포획 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 포획 모이어티를 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오타이드 C0을 추가로 포함하고, 여기서 A0의 5' 꼬리 영역은 C0의 영역에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 바이오틴이고, 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 포획 올리고뉴클레오타이드 C0를 포함하고, 여기서 A0의 5' 꼬리 영역은 C0의 영역에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드(예를 들어, 자성 또는 상자성 비드)이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 후성적 변형 민감성 또는 의존성 제한 효소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 트랜스포솜을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 트랜스포사제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 리가제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드는 가피로인산분해에 내성이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 증폭(예를 들어, PCR), 시퀀싱(예를 들어, 차세대 시퀀싱), 또는 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 분자 프로브를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 분자 프로브는 형광 표지된다. 일부 실시형태에서, A0(예를 들어, A0의 3' 말단)은 인간 게놈의 야생형 서열에 더 상보적(예를 들어, 완전하게 상보적)이고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자에 덜 상보적(예를 들어, 불완전하게 상보적)이다. 일부 실시형태에서, A0(예를 들어, A0의 3' 말단)은 인간 게놈의 야생형 서열에 대해 덜 상보적(예를 들어, 불완전하게 상보적)이고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자에 더 상보적(예를 들어, 완전히 상보적)이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 RNA의 cDNA로의 전사를 위한 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 특정 시점에서 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 반응을 포함하는 반응 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 가피로인산분해 전에 존재한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 가피로인산분해 동안 존재한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 가피로인산분해 후에 존재한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 본 명세서에 기재된 방법의 프로브/핵산 혼성화 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 본 명세서에 기재된 방법의 포획된 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 가피로인산분해 반응을 겪은 샘플에 존재한 요망되는 표적 핵산의 농도보다 높거나 낮은 요망되는 표적 핵산의 농도를 포함하는 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플; 가피로인산분해 농도의 가피로인산분해 시약(즉, 가피로인산분해에 유리한 시약 농도); 서열을 갖는 프로브에 혼성화된 샘플로부터의 제1 핵산 분자로서, 프로브의 식별 영역은 제1 핵산 분자에 상보적인 제1 핵산 분자; 및 상기 서열을 갖는 프로브를 혼성화시킨 샘플로부터의 제2 핵산 분자로서, 프로브의 식별 영역은 제2 핵산 분자에 완전히 상보적이지 않은 제2 핵산 분자를 포함하는 반응 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 샘플; 가피로인산분해 농도의 가피로인산분해 시약; 및 반응 혼합물의 제1 영역에서 제1 핵산 분자를 포함하는, 반응 혼합물이 제공되며, 여기서 제1 핵산은 샘플에서 제1 핵산의 농도보다 더 높거나 더 낮은 농도를 갖는다.
또한, 본 명세서에는 조성물의 용도(예를 들어, 키트의 용도, 반응 혼합물의 용도, 시약의 용도, 기기의 용도, 소프트웨어의 용도)가 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에는 샘플에서 표적 핵산을 농축 또는 고갈시키기 위한 조성물의 용도가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 디바이스 및 기구가 제공된다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 샘플을 수집하고 반응 용기에 분배하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 방법을 수행하기 위한 반응 챔버를 제공한다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 반응을 수용하고/하거나 농축된 요망되는 표적 핵산을 단리하거나 요망되는 표적 핵산을 고갈시키기 위한 다수의 구역 또는 영역(예를 들어, 웰, 채널 등)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 핵산 분자를 증폭 또는 시퀀싱하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 핵산 분자를 검출하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 디바이스 및 기구는 사용자로부터 정보를 수신하거나 전송하기 위해 사용된다. 예를 들어, 디바이스 및 기구는 사용자 지시를 수신하기 위한 사용자 인터페이스 및 결과를 사용자에게 시각적으로 제시하기 위한 디스플레이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 컴퓨팅 디바이스가 제공된다. 컴퓨팅 디바이스는 본 명세서에 기재된 방법을 용이하게 하기 위해 기구 또는 디바이스를 제어하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 컴퓨팅 디바이스는 데이터를 수집, 분석 및 보고한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨팅 디바이스는 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨팅 디바이스는 프로세서가 컴퓨팅 단계들 중 하나 이상을 수행하도록 지시하는 명령어를 포함하는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체(예를 들어, 소프트웨어)를 포함한다.
도 1: 바이오티닐화된 프로브가 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드에 사전-결합된 본 발명의 일 실시형태의 개략도. 비드-결합된 프로브는 이후 표적 DNA에 혼성화되고 가피로인산분해된다. 이 예에서, 비드-결합된 프로브는 야생형 서열에 완전하게 상보적이고 변이체 서열과 불완전하게 상보적/미스매칭된다. 야생형 서열에 혼성화된 프로브는 가피로인산분해되고 야생형 DNA는 비드로부터 용액으로 방출되는 반면, 변이체 서열에 혼성화된 프로브는 미스매치되어 야생형 서열과 동일한 정도로 가피로인산분해되지 않아, 비드 결합이 남아 있는 변이체 서열이 생성된다. 그 후, 변이체 서열은 하나의 예에서, 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
도 2: 바이오티닐화된 프로브가 표적 DNA에 혼성화되고, 가피로인산분해된 후, 스트렙타비딘 상자성 비드 상에 포획되는 본 발명의 일 실시형태의 개략도. 이 예에서, 프로브는 야생형 서열에 완전하게 상보적이고 변이체 서열과 불완전하게 상보적/미스매칭된다. 야생형 서열에 혼성화된 프로브는 가피로인산분해되고 야생형 DNA는 프로브로부터 방출되는 반면, 미스매칭된 변이체 서열에 혼성화된 프로브는 야생형 서열과 동일한 정도로 가피로인산분해되지 않으며, 따라서 변이체 서열은 프로브 결합된 상태로 유지된다. 프로브는 이후 스트렙타비딘 상자성 비드 상에 포획되며, 따라서 변이체 서열만이 비드-결합된다. 그 후, 변이체 서열은 하나의 예에서, 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
도 3: 도 1에 기재된 것에 따른 본 발명의 일 실시형태의 개략도로서, 프로브를 표적 DNA에 혼성화시키기 전에, 표적 DNA가 어댑터 태깅 및 PCR에 의한 증폭을 겪는다. 혼성화 후, 프로브는 가피로인산분해를 겪고 어댑터 태깅된 변이체 서열은 비드-결합된 상태로 유지된다. 비드-결합된 변이체 서열은 이후 PCR에 의해 증폭된다.
도 4: 표적 분자의 가피로인산분해 의존성 방출. Cq 값이 낮을수록, 비드로부터 상청액으로 방출된 표적 서열이 더 많다. Cq 값은 가피로인산분해 반응이 수행될 때 농축 프로브에 완전히 상보적인 표적 서열에 대해 더 낮다. 이는 관심 표적이 비드로부터 방출되었음을 나타낸다. 가피로인산분해 반응이 수행되는지 여부에 관계없이, 미스매칭된 표적 서열에 대한 Cq 값에는 차이가 없었다. 이는 미스매칭된 표적이 비드에 남아 있고 상청액으로 방출되지 않았음을 나타낸다.
도 5: EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출. 그래프는 T790M의 PPi 의존적 검출을 보여준다. 혼성화 단계의 온도를 60℃로 증가시킴으로써, 더 많은 T790M 변이체 분자가 회수된다. 혼성화 단계의 온도를 60℃로 증가시키면 WT(야생형) 분자의 회수가 감소한다. 주어진 조건에서 0.2 fM의 T790M 변이체 분자가 검출될 수 있다.
도 6: 상이한 변이체 대립유전자 분획(VAF)에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출. 0.1% VAF만큼 낮은 PPi-의존적 검출을 나타낸다. 도 6A. 그래프는 0 내지 50% VAF로부터 T790M 변이체의 검출을 보여준다. 도 6B. 0.1% VAF의 검출을 확대한다.
도 7: 0.1% VAF에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출에 대한 혼성화 완충제 및 혼성화 시간의 효과. 이 특정 실험에서, 1시간의 혼성화는 관심 변이체를 검출하기에 충분하지 않다. 3시간 혼성화 단계를 사용할 때 최상의 성능은 완충제 2로 달성된다(실시예 3 참조).
도 8: EGFR 엑손 20 T790M 변이체에 대한 농축 인자. 그래프는 0.1 및 1% VAF에 대한 농축 인자 및 혼성화 단계 동안 사용되는 완충제에 대한 이의 의존성을 보여준다. 농축 인자의 증가는 PPi의 존재에 의존적이다. 가장 높은 농축 인자는 완충제 2 및 완충제 5로 달성된다(실시예 3 참조).
도 2: 바이오티닐화된 프로브가 표적 DNA에 혼성화되고, 가피로인산분해된 후, 스트렙타비딘 상자성 비드 상에 포획되는 본 발명의 일 실시형태의 개략도. 이 예에서, 프로브는 야생형 서열에 완전하게 상보적이고 변이체 서열과 불완전하게 상보적/미스매칭된다. 야생형 서열에 혼성화된 프로브는 가피로인산분해되고 야생형 DNA는 프로브로부터 방출되는 반면, 미스매칭된 변이체 서열에 혼성화된 프로브는 야생형 서열과 동일한 정도로 가피로인산분해되지 않으며, 따라서 변이체 서열은 프로브 결합된 상태로 유지된다. 프로브는 이후 스트렙타비딘 상자성 비드 상에 포획되며, 따라서 변이체 서열만이 비드-결합된다. 그 후, 변이체 서열은 하나의 예에서, 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
도 3: 도 1에 기재된 것에 따른 본 발명의 일 실시형태의 개략도로서, 프로브를 표적 DNA에 혼성화시키기 전에, 표적 DNA가 어댑터 태깅 및 PCR에 의한 증폭을 겪는다. 혼성화 후, 프로브는 가피로인산분해를 겪고 어댑터 태깅된 변이체 서열은 비드-결합된 상태로 유지된다. 비드-결합된 변이체 서열은 이후 PCR에 의해 증폭된다.
도 4: 표적 분자의 가피로인산분해 의존성 방출. Cq 값이 낮을수록, 비드로부터 상청액으로 방출된 표적 서열이 더 많다. Cq 값은 가피로인산분해 반응이 수행될 때 농축 프로브에 완전히 상보적인 표적 서열에 대해 더 낮다. 이는 관심 표적이 비드로부터 방출되었음을 나타낸다. 가피로인산분해 반응이 수행되는지 여부에 관계없이, 미스매칭된 표적 서열에 대한 Cq 값에는 차이가 없었다. 이는 미스매칭된 표적이 비드에 남아 있고 상청액으로 방출되지 않았음을 나타낸다.
도 5: EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출. 그래프는 T790M의 PPi 의존적 검출을 보여준다. 혼성화 단계의 온도를 60℃로 증가시킴으로써, 더 많은 T790M 변이체 분자가 회수된다. 혼성화 단계의 온도를 60℃로 증가시키면 WT(야생형) 분자의 회수가 감소한다. 주어진 조건에서 0.2 fM의 T790M 변이체 분자가 검출될 수 있다.
도 6: 상이한 변이체 대립유전자 분획(VAF)에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출. 0.1% VAF만큼 낮은 PPi-의존적 검출을 나타낸다. 도 6A. 그래프는 0 내지 50% VAF로부터 T790M 변이체의 검출을 보여준다. 도 6B. 0.1% VAF의 검출을 확대한다.
도 7: 0.1% VAF에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출에 대한 혼성화 완충제 및 혼성화 시간의 효과. 이 특정 실험에서, 1시간의 혼성화는 관심 변이체를 검출하기에 충분하지 않다. 3시간 혼성화 단계를 사용할 때 최상의 성능은 완충제 2로 달성된다(실시예 3 참조).
도 8: EGFR 엑손 20 T790M 변이체에 대한 농축 인자. 그래프는 0.1 및 1% VAF에 대한 농축 인자 및 혼성화 단계 동안 사용되는 완충제에 대한 이의 의존성을 보여준다. 농축 인자의 증가는 PPi의 존재에 의존적이다. 가장 높은 농축 인자는 완충제 2 및 완충제 5로 달성된다(실시예 3 참조).
일부 실시형태에서, 본 방법은 요망되는 핵산 서열을 농축시키거나 고갈시키는 방법으로서 가피로인산분해를 사용한다. 가피로인산분해 반응은 혼성화된 가닥들 사이의 상보성에 의존하므로, 미스매치가 없거나 더 적은 미스매치를 갖는 가닥만을 소화한다. 반응은 상보적인 특정 서열을 선택적으로 단축시키는 한편, 미스매칭된 서열은 덜 소화되게 한다. 반응은 단축된 서열에 혼성화된 분자가 회수되고 분석되도록 수행될 수 있다. 대안적으로, 반응은 덜 단축된 서열이 분석되도록 수행될 수 있다. 대안적으로, 반응은 임의의 가피로인산분해를 거치지 않은 서열이 분석되도록 수행될 수 있다.
농축 또는 고갈은 관심 서열에 대한 샘플을 추가로 농축시키기 위해 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 라운드의 농축 또는 고갈은 제1 라운드와 동일한 시약을 사용하여 제1 라운드가 완료된 후 발생한다. 다른 실시형태에서, 농축되거나 제거되는 표적 핵산의 상이한 서열에 선택적인 상이한 프로브가 사용된다. 이러한 접근법은 풍부하거나 고갈될 서열이 적어도 2개의 염기 위치만큼 제거될 서열과 상이한 경우에 특히 적합하다. 예를 들어, 야생형에 비해 2개의 다형성을 함유하는 표적 핵산은 제1 다형성에 기반한 제1 라운드의 농축 또는 고갈 및 제2 다형성에 기반한 제2 라운드의 농축 또는 고갈을 겪을 수 있다. 농축 또는 고갈의 지수적 수준은 다중 라운드를 이용함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 농축 또는 고갈 전에 합성 서열(예를 들어, 다형성의 첨가)을 생성하도록 변형되어, 합성 서열이 합성 서열을 함유하지 않는 서열에 비해 농축 또는 고갈을 위해 표적화된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산은 다중 프로브의 사용에 의해 임의의 주어진 라운드의 반응에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 핵산은 반응의 하나 이상의 라운드에서 농축될 수 있는 반면, 제2 핵산은 반응의 하나 이상의 라운드에서 고갈될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 변경시키기 위한 방법으로서, 샘플은 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하며, 방법은
a.
하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0(여기서, 프로브는 제1 서열 및 제2 서열과 차등적으로 상보적임)(예를 들어, 상기 프로브의 3' 말단 또는 다른 영역은 제1 서열 또는 제2 서열 중 하나에는 완전하게 상보적이지만 다른 하나에는 불완전하게 상보적임);
ii. 가피로인산분해 효소; 및
iii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, A0은 제1 핵산 서열에 (예를 들어, 완전하게) 어닐링되어 A0(예를 들어, A0의 3' 말단)이 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 중간 생성물을 생성하며, A0은 3' 말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는 반면, 제2 서열에 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 임의의 A0은 상기 더 적은(예를 들어, 불완전한) 어닐링으로 인해 더 적은 정도로 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는, 상기 샘플을 도입하는 단계;
b. 제1 서열에 더 양호하게(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 임의의 단축된 A0 서열 복합체를 선택적으로 변성시키는 단계; 및
c. A0에 어닐링되지 않은 제1 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 제2 핵산 서열을 분리시킴으로써, 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 변경시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태에서, 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키는 방법으로서, 샘플은 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하며, 방법은
a.
하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0(여기서, 상기 프로브(예를 들어, 상기 프로브의 3' 말단 또는 다른 영역)은 제1 서열 또는 제2 서열 중 하나에 더 상보적이지만(예를 들어, 완전하게 상보적) 다른 서열에 덜 상보적(예를 들어, 불완전하게 상보적)임)를 포함하는 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계;
b. 단계 (a)에 의해 생성된 반응 혼합물을
ii. 가피로인산분해 효소; 및
iii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제2 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, A0은 핵산 서열들 중 하나에 (예를 들어, 완전하게) 어닐링되어 A0(예를 들어, A0의 3' 말단)이 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 중간 생성물을 생성하며, A0은 3' 말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는 반면, 다른 서열에 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 임의의 A0은 상기 더 적은(예를 들어, 불완전한) 어닐링으로 인해 더 적은 정도로 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는, 상기 반응 혼합물을 도입하는 단계;
c. 하기에 의해 더 잘(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 임의의 A0 서열 복합체를 분리시키는 단계:
i. 가피로인산분해 반응의 결과로서 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)되게 하는 것; 또는
ii. 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)되기에 충분하지만 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 임의의 A0의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)하는데 필요한 온도 미만인 온도로 반응 혼합물을 가열하는 것; 및
d. A0에 어닐링되지 않은 임의의 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 핵산 서열을 분리시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 더 나은(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 임의의 A0 서열 복합체의 분리는 A0 서열 복합체에 비해 더 적은(예를 들어, 불완전한) 어닐링된 A0 서열 복합체에 유리한 반응 조건을 사용함으로써 일어난다. 이는 반응 혼합물 온도에 대한 변화 및/또는 반응 혼합물의 pH에 대한 변화 및/또는 반응 혼합물의 염도에 대한 변화의 형태를 취할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 반응 혼합물 및 제2 반응 혼합물은 단계 (a)의 제1 반응 혼합물이 가피로인산분해 효소 및 피로포스페이트 이온의 공급원을 추가로 포함하도록 조합된다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체를 형성하기 위해 핵산 서열들 중 하나에 더 잘(예를 들어, 완전하게) 어닐링되는 A0은 이중-가닥 복합체가 핵산 서열로부터 분리(예를 들어, 용융)되어 단축된 A0이 분리되는 정도로 가피로인산분해된다. 다른 서열에 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 A0은 상기 서열과 이중-가닥 복합체로 남아 있다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 가열되어 변성될 수 있다. 따라서, 더 잘(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 A0 서열을 포함하는 이중-가닥 복합체는 분리(예를 들어, 용융)되고, 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링되고 덜 가피로인산분해된 A0를 포함하는 이중-가닥 복합체는 더 많은 상보적인 염기-쌍이 남아 있기 때문에 더 높은 용융 온도를 갖는 이러한 복합체로 인해 이중-가닥으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물의 pH는 상승하여 변성될 수 있다. 따라서, 더 양호하게(예를 들어, 완전하게) 어닐링되어, 이에 따라 더욱 완전히 가피로인산분해된 A0 서열을 포함하는 이중-가닥 복합체는 변성되는 반면, 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링되고 덜 가피로인산분해된 A0을 포함하는 이러한 이중-가닥 복합체는 보다 상보적인 염기-쌍을 보유하고 변성되기 위해 훨씬 더 높은 pH를 필요로 하는 이러한 복합체로 인해 이중-가닥 상태로 남아 있다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물의 염 농도는 낮아진다. 따라서, 더 양호하게(예를 들어, 완전하게) 어닐링되어, 이에 따라 더욱 완전히 가피로인산분해된 A0 서열을 포함하는 이중-가닥 복합체는 변성되는 반면, 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링되고 덜 가피로인산분해된 A0을 포함하는 이러한 이중-가닥 복합체는 보다 상보적인 염기-쌍을 보유하고 변성되기 위해 훨씬 더 낮은 염 농도를 필요로 하는 이러한 복합체로 인해 이중-가닥 상태로 남아 있다.
일부 실시형태에서, 농축 또는 고갈을 용이하게 하기 위해 화학적 제제(예를 들어, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 포름아마이드 등)가 사용되어 핵산을 변성시킨다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자(올리고뉴클레오타이드를 대체함) 및 효소 또는 단백질은 별개의 혼성화된 핵산 분자가 사용된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물의 하기 특성들 중 둘 이상이 변경되어, 더 양호하게(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 A0 서열을 포함하는 이중-가닥 복합체의 분리가 발생하는 반면 덜 잘(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 A0를 포함하는 이중-가닥 복합체는 혼성화된 상태로 남아 았다:
- 반응 혼합물의 pH;
- 반응 혼합물의 온도;
- 반응 혼합물의 염 농도;
- 화학적 변성제의 첨가.
일부 실시형태에서, 고체 지지체 상으로의 A0의 포획은 단계 (a) 전 또는 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단계 (d)에서의 분리는 단계 (a) 전 또는 후에 고체 지지체 상으로의 A0의 포획을 통해 수행된다.
일부 실시형태에서, A0은 서열 중 어느 하나에 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적의 정방향 가닥에 대해 하나 및 역방향 가닥에 대해 하나의 2개의 프로브가 사용된다. 일부 실시형태에서, 가피로인산분해를 겪을 수 있는 작제물을 형성하기 위해 서로 혼성화하지 않도록 프로브를 설계하는 것이 유리하다(예를 들어, 이들은 서로 혼성화될 때 3' 오버행을 갖는다).
일부 실시형태에서, 고체 지지체 상으로의 포획은, A0의 5' 꼬리 영역을, A0에 대한 혼성화 전 또는 후에 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 포함하는 또 다른 올리고 C0에 혼성화함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, A0은 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 바이오틴이고, 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, A0은 후속 포획을 위해 바이오티닐화된 뉴클레오타이드와의 반응에서 연장된다.
일부 실시형태에서, 디포스포하이드롤라제 효소(예를 들어, 아피라제)는 본 발명의 방법 또는 조성물에 제공된다. 디포스포하이드롤라제 효소 가수분해는 최적의 가피로인산분해 반응 조건을 유지하면서, 가피로인산분해 반응으로부터 뉴클레오타이드를 방출하였다.
일부 실시형태에서, 무기 피로포스파타제 효소는 본 발명의 방법 또는 조성물에 제공된다. 무기 피로포스파타제는 피로포스페이트 이온의 존재가 바람직하지 않거나 차선책일 수 있는 후속 단계 전 및 가피로인산분해 후에 피로포스페이트 이온을 제거한다.
기술은 관심 핵산 분자를 분할하거나 농축시키기 위한 포획의 사용으로 제한되지 않는다. 분자는, 예를 들어, 크기, 전하, 또는 형상 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성의 차이에 기초하여 분할되거나 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 모이어티는 관심 핵산에 (예를 들어, 클릭 화학 변형을 통해) 첨가되고, 이에 의해 첨가된 모이어티는 관심 핵산에 선택 가능한 구별되는 특성을 부여한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다.
일부 실시형태에서, 비드는 자성 또는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세척 단계는 하나 이상의 단계 사이에 수행된다.
일부 실시형태에서, 세척 및 혼성화 단계는 25 내지 95℃의 상승된 온도에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 샘플은 핵산 분석물의 어댑터 태깅된 라이브러리이다.
일부 실시형태에서, 단계 (d) 후에, A0에 어닐링된 채로 남아 있는 핵산, 또는 A0에 어닐링되지 않은 핵산이 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 증폭 반응(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 다중 치환 증폭(MDA), 전사-매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 리콤비나제 중합효소 증폭(RPA), 헬리카제 의존성 증폭(HDA), 닉킹 및 연장 증폭 반응(NEAR) 등)에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 등온 확인에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 PCR에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 마이크로어레이 분석에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 시퀀싱에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 서열은 차세대 시퀀싱(NGS)(예를 들어, 브리지 증폭 시퀀싱(Illumina), SMRT 시퀀싱(PacBio), Ion Torrent 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 파이로시퀀싱 등)에 의해 확인된다.
일부 실시형태에서, 각각이 상이한 표적 서열에 어닐링(예를 들어, 완전하게 어닐링)하도록 설계된 상이한 서열(예를 들어, 3' 말단 서열)을 갖는 다수의 상이한 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0이 사용되며, 여기서 다수의 표적 서열의 농도는 비-표적 서열에 비해 동시에 증가된다.
일부 실시형태에서, 상이한 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0은 질환의 존재, 치료 또는 모니터링과 관련된 유전적 변이체를 포함하는 인간 게놈의 서열에 어닐링(예를 들어, 완전하게 어닐링)하는 서열(예를 들어, 3' 말단 서열)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 단계 (d) 후, 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 이에 의해 질환의 존재 또는 부재가 추론된다.
일부 실시형태에서, 단계 (d) 후, 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출된 핵산 서열의 확인에 의해 추론되며, 이에 의해 질환에 대한 적절한 치료가 추론된다.
일부 실시형태에서, 단계 (d) 후, 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출된 핵산 서열의 확인, 및 특정 질환 치료에 대한 환자의 반응을 통해 추론된다.
일부 실시형태에서, 단계 (d) 후, 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 하나 이상의 환자 치료 결정은 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 기초로 하여 이루어진다.
일부 실시형태에서, 샘플은 인간 혈액 또는 조직 샘플이다.
일부 실시형태에서, 질환은 암이다.
일부 실시형태에서, 암은 폐암이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 혼성화 단계는 하나 이상의 단계 사이에 수행된다.
일부 실시형태에서, 분석된 핵산은 메틸화된 서열이거나 메틸화된 서열로부터 유래된다. 이 기술은 표적 핵산의 임의의 특정 또는 다수의 위치에서 메틸화 상태를 구별하는 데 사용된다. 메틸화된 서열은 먼저 화학적 처리(예를 들어, 산화, 환원, 바이설파이트 처리)를 사용하거나 메틸화 의존성 제한 효소에 노출 또는 임의의 다른 적합한 접근법에 이어 변형된 서열의 농축 및/또는 확인에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 전에 바이설파이트 처리된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 후에 바이설파이트 처리된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 전에 사이토신을 우라실로 전환시키기 위해 효소적으로 처리된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 후에 사이토신을 우라실로 전환시키기 위해 효소적으로 처리된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 전에 후성-의존적/민감성 제한 효소에 노출된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 핵산 서열은 방법의 단계 (a) 후에 후성-의존적/민감성 제한 효소에 노출된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 RNA의 표적화된 영역은 방법의 단계 (a) 전에 DNA로 전사된다.
일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 RNA의 표적화된 영역은 방법의 단계 (a) 후에 DNA로 전사된다.
일부 실시형태에서, 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는 샘플로부터 관심 표적 핵산 서열을 포획하는 방법으로서,
a.
하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0(여기서, 상기 프로브가 제1 또는 제2 서열 중 하나에 상보적(예를 들어, 완전히 상보적)이지만 다른 서열에 덜 상보적인(예를 들어, 불완전하게 상보적인) 서열(예를 들어, 3' 말단 또는 다른 곳에서)을 함유하는 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계;
b. 단계 (a)에 의해 생성된 반응 혼합물을,
i. 가피로인산분해 효소; 및
ii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제2 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, A0(예를 들어, A0의 3' 말단)이 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 중간 생성물을 생성하기 위해 A0이 핵산 서열들 중 하나에 어닐링(예를 들어, 완전하게 어닐링)되고, A0은 이의 3'-말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는 반면, 다른 서열에 대해 더 적은 정도로(예를 들어, 불완전하게) 어닐링된 임의의 A0은 상기 덜(예를 들어, 불완전한) 어닐링으로 인해 더 적은 정도로 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는, 상기 반응 혼합물을 도입하는 단계;
c.
하기에 의해 더 잘(예를 들어, 완전하게) 어닐링된 임의의 A0 서열 복합체를 분리시키는 단계:
i. 가피로인산분해 반응의 결과로서 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)되게 하는 것; 또는
ii. 반응 혼합물을, 상기 복합체의 가닥이 분리(예를 들어, 용융)하기에 충분하지만 덜 잘 어닐링된(예를 들어, 불완전하게 어닐링된) 임의의 A0의 가닥이 분리(예를 들어, 용해)되는 데 필요한 온도 미만인 온도로 가열하는 것; 및
d. A0에 어닐링되지 않은 임의의 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 핵산 서열을 분리시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 중합체 및/또는 수지 코팅된 고체 표면이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 폴리스타이렌 고체 지지체이다.
일부 실시형태에서, 폴리스타이렌(C8H8)n은 n이 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 11,000, 12,000, 12,500, 15,000, 16,000, 17,000, 17,500, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000 또는 그 이상이거나, n이 이들 포인트들 중 임의의 것들 사이의 임의의 정수이거나, n이 이러한 포인트들 중 임의의 2개 사이에서 유도 가능한 임의의 범위 내에 있는 중합체이다.
일부 실시형태에서, 폴리스타이렌 고체 지지체는 입자, 미세입자, 자성 비드, 자성 미세입자, 상자성 비드, 상자성 미세입자, 수지 또는 폴리스타이렌 중합체를 포함하는 임의의 미립자이다.
일부 실시형태에서, 폴리스타이렌 지지체는 하기 작용기 중 하나 이상을 포함하도록 개질된다: 아민, 카복실레이트, 설포네이트, 트라이메틸아민 및/또는 에폭사이드.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 자성 또는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 상기 비드의 표면적을 최대화하는 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 규칙적인 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 불규칙한 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 또는 0.1 미크론 이하의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 자성 또는 상자성 폴리스타이렌 비드이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 폴리스타이렌 비드는 산화철을 포함한다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 폴리스타이렌 비드는 스트렙타비딘-커플링된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 스트렙타비딘-커플링된 Dynabead(RTM)이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 덱스트란-개질된 표면이다.
일부 실시형태에서, 덱스트란-개질된 표면은 입자, 미세 입자, 자성 또는 상자성 비드, 수지 또는 덱스트란 중합체를 포함하는 임의의 미립자이다.
일부 실시형태에서, 덱스트란 중합체는 1000 내지 410000의 대략적인 분자량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 덱스트란 중합체는 25000 내지 약 100000의 대략적인 분자량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 개질된 덱스트란-표면은 하나 이상의 작용기를 포함하도록 추가로 개질된다.
일부 실시형태에서, 덱스트란-개질된 표면은 하기 작용기 중 하나 이상을 포함하도록 개질된다: 아민, 카복실레이트, 설포네이트, 트라이메틸아민 및/또는 에폭사이드.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 자성 또는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 상기 비드의 표면적을 최대화하는 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 규칙적인 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 불규칙한 형상이다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 또는 0.1 미크론 이하의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 자성 또는 상자성 비드는 Nanomag® 덱스트란(ND); Nanomag® 덱스트란-SO3H(ND-SO3H); BioMag® 덱스트란-코팅된 숯; 또는 BioMag® Plus 덱스트란으로부터 선택된 덱스트란 자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-개질된 표면이다.
일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-개질된 표면은 PEG를 포함하는 입자, 미세 입자, 자성 또는 상자성 비드, 수지 또는 임의의 미립자이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, PEG, (CH2O)n은 n이 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 11,000, 12,000, 12,500, 15,000, 16,000, 17,000, 17,500, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000 이상이거나, n 임의의 이러한 포인트들 사이의 임의의 정수이거나, n이 이러한 점들 중 임의의 2개 사이에서 유도 가능한 임의의 범위 내에 있는 중합체이다.
일부 실시형태에서, 사용된 PEG는 PEG-200, PEG-300, PEG-400, PEG-600, PEG-l000, PEG-1300-1600, PEG-1450, PEG-3000-3700, PEG-3500, PEG-6000, PEG-8000 또는 PEG-17500이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-개질된 표면이 자성 또는 상자성 마이크로입자 또는 비드인 일부 실시형태에서, 마이크로입자 또는 비드는 Nanomag® PEG-300(Plain) 또는 Nanomag®-D로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 PVP-개질된 표면이다.
일부 실시형태에서, PVP 또는 PVP-개질된 표면은 입자, 미세 입자, 자성 또는 상자성 비드, 수지 또는 PVP를 포함하는 임의의 미립자이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, PVP, n-비닐 피롤리돈은 n이 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 11,000, 12,000, 12,500, 15,000, 16,000, 17,000, 17,500, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000이거나 n이 임의의 이러한 포인트들 사이의 임의의 정수이거나, n이 이러한 포인트들 중 임의의 2개 사이에서 유도 가능한 임의의 범위 내에 있는 중합체이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 다당류 또는 다당류-개질된 표면이다.
일부 실시형태에서, 다당류 또는 다당류-개질된 표면은 입자, 미세 입자, 자성 또는 상자성 비드, 수지 또는 다당류를 포함하는 임의의 미립자이다.
일부 실시형태에서, 다당류는 덱스트란, 피콜, 글리코겐, 아라비아 검, 잔탄 검, 카라기난, 아밀로스, 아가, 아밀로펙틴, 자일란 및/또는 베타-글루칸 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 화학적 수지 또는 화학적 수지-개질된 표면이다.
일부 실시형태에서, 화학적 수지 또는 화학적-수지 개질된 표면은 하기 수지 중 하나 이상으로부터 선택된다: 아이소사이아네이트, 글리세롤, 피페리디노-메틸, 폴리DMAP(중합체-결합된 다이메틸 4-아미노피리딘), DIPAM(다이아이소프로필아미노메틸, 아미노메틸, 폴리스타이렌 알데하이드, 트리스(2-아미노메틸) 아민, 모르폴리노-메틸, BOBA(3-벤질옥시벤즈알데하이드), 트라이페닐-포스핀 또는 벤질티오-메틸.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 화학적으로-절단 가능한 링커, 예를 들어, 다이설파이드, 알릴, 또는 아자이드-마스킹된 헤미아미날 에터 링커를 통해 고체 지지체에 공유적으로 부착된다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 아마이드 또는 포스포로티오에이트 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 부착된다.
당업자라면 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체에 공유 및 비공유 고정화하기 위한 기술이 다수 존재함을 이해할 것이며, 예를 들어, Integrated DNA Technologies(IDT®)에 의해 생성된 문헌["Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports" (2014)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 고체 지지체는 상보적 서열을 보유하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 용융 온도를 변화시키기 위해 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 당업자에게 공지된 다른 이러한 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 당업자에게 공지된 이러한 다른 변형의 존재는 용융 온도의 감소를 초래한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 당업자에게 공지된 이러한 다른 변형의 존재는 용융 온도의 증가를 초래한다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 내지 200개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10, 20, 30, 40, 50 및 100개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40 및 10 내지 50개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10 내지 20, 10 내지 30 및 10 내지 40개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10 내지 20 및 10 내지 30개 염기이다.
일부 실시형태에서, 상보적 서열의 길이는 10 내지 20개 염기이다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 화학적 변형을 포함하고, 화학적 변형과 고체 지지체 사이의 상호작용을 통해 고체 지지체에 부착된다.
일부 실시형태에서, 화학적 변형은 바이오틴이고, 고체 지지체는 스트렙타비딘을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 포획된 올리고뉴클레오타이드 서열은 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 포획된 올리고뉴클레오타이드 서열은 화학적 변성에 의해 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 화학적 변성은 적합한 농도의 염기의 사용에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 0.1M의 NaOH가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 다이설파이드 링커에 대한 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 다이티오트레이톨(DTT); 팔라듐 착물 또는 알릴 링커; 또는 아자이드-마스킹된 헤미아미날 에터 링커에 대한 TCEP의 첨가를 통해 화학적 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 비-정규 염기를 제거하고, 생성된 무염기 부위에서 절단함으로써 고체 지지체로부터 방출된다. 일부 실시형태에서, 비-정규 염기는 우라실이며, 이는 우라실 DNA 글리코실라제에 의해 제거된다. 대안적인 실시형태에서, 비-정규 염기는 8-옥소구아닌이며, 이는 포름아미도피리미딘 DNA 글리코실라제(Fpg)에 의해 제거된다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 영역이고, 방출은 반응 혼합물의 가열을 통해 수행된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 1 내지 20분에 걸쳐 37℃ 내지 100℃로 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 1 내지 15분에 걸쳐 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 1 내지 10분에 걸쳐 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 1 내지 5분에 걸쳐 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 5분에 걸쳐 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 37℃ 내지 85℃로 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 37℃ 내지 75℃로 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 37℃ 내지 65℃로 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 37℃ 내지 55℃로 가열된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 37℃ 내지 45℃로 가열된다.
당업자라면 반응 혼합물이 가열되어 상보적인 올리고뉴클레오타이드 영역의 방출을 일으키는 온도가 상기 영역의 길이에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 방출은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열의 절단을 통해 달성된다. 이러한 절단은 이전에 또는 후속하여 기재된 임의의 수단에 의해 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 효소적으로 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 제한 효소에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 후성적 변형 민감성 또는 의존성 제한 효소에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 메틸화 민감성 또는 의존성 제한 효소에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 하이드록시메틸화 민감성 또는 의존성 제한 효소에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 변이체 또는 야생형 서열의 농축 전 또는 후에, 서열은 이들의 메틸화 상태의 검출을 가능하게 하도록 효소적으로 또는 화학적으로 전환된다. 당업자라면 용어 '농축'이 전술하거나 후술한 바와 같이 표적 서열과 비-표적 서열의 혼합물로부터 표적 서열의 선택적 분리를 지칭함을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 제한 효소는 엔도뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 광절단성 링커를 포함하고, 올리고뉴클레오타이드 서열은 이 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 이러한 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 가피로인산화분해 효소가 결합하거나 가피로인산분해 반응이 계속되도록 A0에 서열과의 충분한 상보성이 부족할 때까지 분해가 계속된다. 이는 통상적으로 서열과 프로브 사이에 6 내지 20개의 상보적인 뉴클레오타이드가 남아 있을 때 일어난다. 일부 실시형태에서, 이는 6 내지 40개의 상보적인 뉴클레오타이드가 남아 있을 때 일어난다.
이론에 의해 제한되지 않고, 이전에 또는 다른 곳에서 기술된 것 이외에, 가피로인산분해 반응이 중단될 수 있는 다수의 상이한 방식이 존재한다.
가피로인산분해효소가 '미리 판독하는' 능력을 갖는 경우, 소화는 3'의 미스매치 또는 염기 변형을 중단시킬 수 있다. 이러한 활성은 고세균 DNA 중합효소에서 관찰되었다.
일부 실시형태에서, 가피로인산분해 반응은 A0의 백본에서의 변형의 존재로 인해 중단될 수 있다.
이러한 변형은 변형된 염기일 수 있다. 염기는 가피로인산분해에 내성일 수 있다.
이러한 변형은 화학적 백본 변형일 수 있다.
일부 실시형태에서, 가피로인산분해 반응은 A0에서 미스매치의 존재로 인해 중단될 수 있다. 이러한 미스매치의 위치는 이러한 규정된 지점에서 소화가 중단되도록 의도적으로 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물의 온도는 가피로인산분해 효소를 열-불활성화시키기 위해 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도는 프로브-표적 듀플렉스가 용융되게 하도록 증가된다.
일부 실시형태에서, 가피로인산분해 효소의 불활성화를 유발할 수 있는 임의의 시약이 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, pH 농도는 가피로인산분해 효소를 불활성화시키도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 염 농도는 가피로인산분해 효소를 불활성화시키도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세제 농도는 가피로인산분해 효소를 불활성화시키도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온 농도는 가피로인산분해 효소를 불활성화시키도록 변형될 수 있다.
당업자라면 효소 촉매된 반응이 중단될 수 있는 다수의 추가 방식이 존재하며 상기 개시 내용이 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다.
적합하게는, 가피로인산분해는 적어도 가피로인산분해 활성을 나타내는 중합효소 및 피로포스페이트 이온의 공급원의 존재 하에 20℃ 내지 90℃ 범위의 온도에서 반응 매질에서 수행된다. 폴리뉴클레오타이드의 소화에 적용되는 가피로인산분해 반응에 대한 추가 정보는 예를 들어, 문헌[J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028]에서 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가피로인산분해 단계는 과량의 폴리피로포스페이트의 공급원, 3개 이상의 인 원자를 함유하는 화합물을 포함하는 적합한 공급원의 존재에 의해 구동된다.
일부 실시형태에서, 가피로인산분해 단계는 과량의 변형된 피로포스페이트의 공급원의 존재에 의해 구동된다. 적합한 변형된 피로포스페이트는 브릿징 산소 대신에 치환된 다른 원자 또는 기를 갖는 것들, 또는 다른 산소 상에서 치환 또는 변형 기를 갖는 피로포스페이트(또는 폴리-피로포스페이트)를 포함한다. 당업자라면 본 발명에 사용하기에 적합할 변형된 피로포스페이트의 많은 이러한 예가 있음을 이해할 것이며, 이들의 비제한적인 선택은 다음과 같다:
하나의 바람직한 실시형태에서, 피로포스페이트 이온의 공급원은 PNP, PCP 또는 트라이폴리인산(PPPi)이다.
추가로, 비제한적으로, 가피로인산분해 단계에서 사용하기 위한 피로포스페이트 이온의 공급원의 예는 WO2014/165210호 및 WO00/49180호에서 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 과량의 변형된 피로포스페이트의 공급원은 Y-H로서 표현될 수 있고, 여기서 Y는 일반식 (XO)2P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))n-에 상응하며, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이며; 각각의 Z-는 -O-, -NH- 또는 -CH2-로부터 독립적으로 선택되며; 각각의 B는 독립적으로 O 또는 S이며; X 기는 -H, -Na, -K, 알킬, 알케닐, 또는 헤테로사이클릭 기로부터 독립적으로 선택되며, 단 Z 및 B 둘 모두가 -O-에 상응하고 n이 1일 때 적어도 하나의 X 기는 H가 아니다.
일부 실시형태에서, Y는 일반식 (X-O)2P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))n-에 상응하며, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이다. 또 다른 실시형태에서, Y 기는 일반 화학식 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-H)-에 상응하며, 여기서 X 기 중 하나는 -H이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, Y는 일반식 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-X)--에 상응하며, 여기서 X 기 중 적어도 하나는 메틸, 에틸, 알릴 또는 다이메틸알릴로부터 선택된다.
대안적인 실시형태에서, Y는 일반식 (H-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-H)-(여기서 Z는 -NH- 또는 -CH2-임) 또는 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-X)--(여기서 X 기는 모두 -Na 또는 -K이고, Z는 -NH- 또는 -CH2-임) 중 하나에 상응한다.
또 다른 실시형태에서, Y는 화학식 (H-O)2P(=B)-O-P(=B)(O-H)-에 상응하며, 여기서 각각의 B 기는 독립적으로 O 또는 S이고, 적어도 하나는 S이다.
Y의 바람직한 실시형태의 특정 예는 화학식 (X1-O)(HO)P(=O)-Z-P(=O)(O-X2)의 것들을 포함하고, 여기서 Z는 O, NH 또는 CH2이고, (a) X1은 γ,γ-다이메틸알릴이고, X2는 -H이고; 또는 (b) X1 및 X2는 둘 모두 메틸이고; 또는 (c) X1 및 X2가 둘 모두 에틸이고; 또는 (d) X1이 메틸이고 X2가 에틸이거나 또는 그 반대이다.
당업자라면 DNA를 단편화하는 데 사용될 수 있는 다수의 기술이 있음을 이해할 것이다. 이러한 방법은 초음파 처리, 바늘 전단, 분무, 포인트-싱크 전단, 압력 셀을 통한 통과(French press) 및 효소적 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단편화는 초음파 처리에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, Bioruptor®(뉴저지 덴빌 소재) 디바이스가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화는 음향 전단에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, Covaris® 기기(매사추세츠주 워번 소재)가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화는 분무에 의해 달성된다. 분무는 분무기 유닛의 작은 구멍을 통해 DNA를 강제하고, 이는 수집되는 미세 미스트의 형성을 초래한다. 단편 크기는 분무기를 통해 DNA를 밀어내는 데 사용되는 가스의 압력, DNA 용액이 구멍을 통해 통과하는 속도, 용액의 점도, 및 온도에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 유체역학적 전단에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, Digilab(매사추세츠주 말보로 소재)의 Hydroshear가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화는 포인트-싱크 전단에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 바늘 전단에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 프렌치 프레스의 사용을 통해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 효소적 단편화에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 트랜스포솜 매개 단편화이다.
일부 실시형태에서, 단편화는 Cas9에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 US10577644호에 기재된 바와 같이 Cas9에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 상이한 단편화 기술이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동일하거나 상이한 단편화 기술 중 하나 이상이 방법의 하나 이상의 상이한 지점에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열의 단편화 및 어댑터 태깅은 방법의 동일한 시간에 또는 동일한 단계에서 일어난다. 하나의 그러한 예는 Illumina의 Nextera DNA Library Prep Kit이다.
당업자라면 어댑터 태깅된 서열/라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있는 다수의 기술이 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 핵산의 말단은 폴리싱되고, 하나 이상의 어댑터에 라이게이션되기 전에 A-테일링될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 핵산의 말단은 폴리싱되고 평활-말단 라이게이션 반응에서 어댑터에 라이게이션될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 어댑터는 단일-가닥 DNA에 라이게이션된다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 말단 트랜스퍼라제 효소는 사용되어 단편의 3' 말단에 비-주형화된 염기를 첨가하여, 단편을 이중-가닥으로 만들기 위한 프라이밍을 위한 부위를 제공한다.
일부 실시형태에서, 토포이소머라제가 DNA 리가제 대신에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, TOPO 클로닝은 단편화된 DNA에 어댑터를 첨가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 트랜스포사제는 핵산에 어댑터 서열을 첨가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편화 후, 표준 트랜스포존이 사용될 수 있지만, 이후 올리고뉴클레오타이드 대체를 사용하여 Y-형상 어댑터를 생성하도록 변형될 수 있다.
샘플이 어댑터 태깅된 라이브러리인 일부 실시형태에서, 차단 올리고뉴클레오타이드는 라이브러리 분자의 교차-혼성화(소위 '데이지 체인화')를 방지하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 차단 올리고뉴클레오타이드는 가피로인산분해에 내성이다. 이 내성은 이전에 또는 이후에 설명된 바와 같을 수 있다.
라이브러리가 어댑터 태깅되고 PCR 증폭된 경우, 이중 가닥 분자는 가닥 5'-어댑터1 - 삽입체 - 어댑터2'-3' 및 5'-어댑터2 - 삽입체 - 어댑터1'-3'를 갖는다. 혼성화 동안, 한 가닥의 5'-어댑터1-3' 서열은 제2 가닥의 5'-어댑터1'-3' 서열에 혼성화될 수 있다. 유사하게, 한 가닥의 5'-어댑터2'-3' 서열은 제2 가닥의 5'-어댑터2-3' 서열에 혼성화될 수 있다. 이러한 혼성화 사건은 함께 사슬을 형성하여, 표적 분자 및 비-표적 분자 둘 모두를 포함하는 분자의 소위 '데이지 체인'을 생성할 수 있다.
가피로인산분해 반응의 맥락에서, 5'-어댑터1-3' 및 5'-어댑터1'-3'의 혼성화 또는 5'-어댑터2-3' 및 5'-어댑터2'-3'의 혼성화는 둘 모두 가피로인산분해될 수 있는 3' 말단을 생성한다.
이러한 맥락에서, 가피로인산분해는 표적 분자의 3'로부터 염기를 제거하여 PCR 동안 이의 증폭을 방지할 수 있다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 데이지-체인화를 완화시키기 위해 혼성화 포획에 사용된다.
상기 기재된 분자의 맥락에서, 이들은 어댑터1'에 상보적인 서열 및 어댑터2'에 상보적인 서열일 수 있다. 차단 올리고뉴클레오타이드는 3' 포스포로티오에이트 결합의 첨가에 의해 또는 어댑터 태깅된 분자의 3'가 차단 올리고뉴클레오타이드에 비-상보적임을 보장함으로써 가피로인산분해로부터 보호될 수 있다. 또 다른 예에서, 가피로인산분해를 억제하는 포스포로티오에이트 결합을 도입하는 알파-티오-dNTP는 가피로인산분해 전에 PCR, 또는 프라이머 연장 반응에 포함될 수 있다.
따라서, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 차단 올리고뉴클레오타이드는 방법에 사용되는 실시형태가 제공된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 반응 혼합물은 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 반응 혼합물은 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드는 단계 (b) 전에 제1 반응 혼합물에 도입된다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 Maxam-Gilbert 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 Sanger 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 샷건 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 단일-분자 실시간 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 이온 반도체 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 파이로시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 조합 프로브 앵커 합성(cPAS)이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 라이게이션에 의한 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 나노포어 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 방법의 시퀀싱은 GenapSys 시퀀싱이다.
일부 실시형태에서, 시퀀싱은 차세대 시퀀싱(NGS)이다.
일부 실시형태에서, 환자로부터 유래된 샘플에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법의 임의의 이전에 또는 후속하여 기재된 실시형태의 사용을 포함하는 환자를 스크리닝하기 위한 방법이 제공된다.
당업자라면 이러한 스크리닝이 이식 수용자 환자를 모니터링하는 데 유용할 것임을 이해할 것이다.
당업자라면 이러한 스크리닝이 하나 이상의 병태에 대한 치료를 받는 환자를 모니터링하는 데 유용할 것이며, 이의 치료 상태는 환자 샘플에서 하나 이상의 핵산 서열의 수준에 의해 확인될 수 있음을 이해할 것이다.
예를 들어, 하나 이상의 암에 대한 치료를 받는 환자의 치료 상태는 이들의 혈액에서 하나 이상의 핵산 서열의 수준 및/또는 하나 이상의 특정 변이체의 존재 및/또는 부재에 의해 확인될 수 있다. 높은 수준의 순환 종양 핵산 서열 및/또는 하나 이상의 특정 변이체의 존재 및/또는 부재는 특정 치료가 요망되는 효과를 갖는지 여부를 추론하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 치료의 성공 여부를 모니터링하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 이러한 성공은 환자로부터 유래된 샘플에서 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재 및/또는 이들의 개개의 수준에 의해 추론될 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환의 임의의 재발을 검출하기 위해 관해 상태의 환자를 모니터링하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 하나 이상의 질환 상태의 존재를 검출하기 위해 명목상 건강한 사람들을 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 질환 상태로 진단된 환자에서 하나 이상의 유전자 마커의 존재 및/또는 부재를 검출하고 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 부재를 사용하여 환자들 받아야 하는 치료를 결정하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 환자로부터 유래된 샘플에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법의 임의의 이전에 또는 후속하여 기재된 실시형태의 사용을 포함하는, 환자에서 하나 이상의 암의 진단 및/또는 모니터링을 위한 방법이 제공된다.
당업자라면 하나 이상의 특정 핵산 서열이 개체에 특이적일 수 있고(예를 들어, 시퀀싱과 같은 확인 방법에 의해 조직 생검 또는 외과적 절제로부터 확인됨) 이러한 경우에 개별 환자 특정 패널이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
당업자라면 일부 실시형태에서, 패널이 주어진 암 유형에서 반복적으로 돌연변이되는 인간 게놈의 공지된 핫스팟 영역을 커버할 것임을 추가로 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 환자가 임신한 환자인, 환자로부터 유래된 샘플에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법의 임의의 이전에 또는 후속하여 기재된 실시형태의 사용을 포함하는 비-침습적 태아기 시험(NIPT)을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임신한 환자의 혈액의 혈장 및/또는 혈청이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 이러한 샘플과 관련된 공통 SNP의 패널을 사용하여 샘플의 태아 분획을 농축 및/또는 정량화하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 환자를 치료하는 방법으로서,
- 환자로부터 유래된 샘플에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 부재 또는 존재를 검출하기 위해 본 발명의 임의의 이전에 또는 후속하여 기재된 실시형태를 수행하는 단계;
- 상기 서열의 존재 또는 부재에 기초하여 하나 이상의 치료 결정을 내리는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 개시이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 중단이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 용량의 증가이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 용량의 감소이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 투여 빈도의 증가이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 특정 치료의 투여 빈도의 감소이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 기존의 치료 요법에 추가 약물의 첨가이다.
일부 실시형태에서, 치료 결정은 기존 치료 요법으로부터 약물의 제거이다.
본 발명의 양태에서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 디바이스가 제공된다.
일부 실시형태에서, 방법의 단계 (a) 내지 (c)를 수행하기 위한 디바이스가 제공된다.
일부 실시형태에서, 방법의 단계 (a) 및 (b)를 수행하기 위한 디바이스가 제공된다.
본 발명의 양태에서, 하나 이상의 실시형태에서 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 효소, 시약 또는 성분을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 키트로서,
- 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 A0(여기서 A0은
o 공지된 제1 서열에 상보적(예를 들어, 완전하게 상보적)이지만 공지된 제2 서열에 덜 상보적인(예를 들어, 불완전하게 상보적인) 서열(예를 들어, A0 또는 다른 곳의 3' 말단에서)을 포함함);
- 하나 이상의 가피로인산분해 효소; 및
- 피로포스페이트 이온의 하나 이상의 공급원을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 고체 지지체를 추가로 포함한다. 이러한 고체 지지체는 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 완충제를 추가로 포함한다. 이러한 완충제는 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 크로우제(crowing agent)(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 덱스트란 설페이트 등)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 세제(예를 들어, 소듐 도데실 설페이트(SDS), TWEEN20 등)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 용매(예를 들어, 포름아마이드, 에틸렌 카보네이트 등)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 포스포하이드롤라제(예를 들어, 아피라제)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 피로포스파타제(예를 들어, 열안정성 무기 피로포스파타제(TIPP)(New England Biolabs))를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 완충제는 반복적인 서열에 혼성화하는 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 완충제는 C0t-1 DNA, 연어 정자 DNA, 리보솜 RNA를 차단하는 올리고뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, A0은 공지된 제1 서열 또는 공지된 제2 서열에 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 추가로 포함한다. A0은 이전에 또는 이후에 기술된 바와 같을 수 있다. 일부 실시형태에서, A0은 포획 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같이, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오타이드(C0)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 포획 모이어티를 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오타이드 C0을 추가로 포함하고, 여기서 A0의 5' 꼬리 영역은 C0의 영역에 상보적이다.
일부 실시형태에서, 포획 모이어티는 바이오틴이고, 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 포획 올리고뉴클레오타이드 C0를 포함하고, 여기서 A0의 5' 꼬리 영역은 C0의 영역에 상보적이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다.
일부 실시형태에서, 비드는 자성 또는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 후성적 변형 민감성 또는 의존성 제한 효소를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 트랜스포솜을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 Cas9를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 트랜스포사제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 리가제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 금속 이온을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드는 가피로인산분해에 내성이다.
일부 실시형태에서, 키트는 등온 증폭 시약을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시약(예를 들어, 열안정성 DNA 중합효소, 프라이머, dNTP, 완충 용액)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 시퀀싱 시약을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 차세대 시퀀싱(NGS) 시약(예를 들어, 중합효소, dNTP, 완충 용액)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 DNA 라이브러리 제조 키트(예를 들어, 요망되는 경우, 중합효소, 리가제, 어댑터, dNTP, 완충 용액을 함유함)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 분자 프로브를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 형광 표지된 하나 이상의 분자 프로브를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, A0의 영역(예를 들어, 이의 3' 말단)은 인간 게놈의 야생형 서열에 더 상보적(예를 들어, 완전히 상보적)이고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자에 덜 상보적(예를 들어, 이에 불완전하게 상보적)이다.
일부 실시형태에서, A0의 영역(예를 들어, 이의 3' 말단)은 인간 게놈의 야생형 서열에 덜 상보적(예를 들어, 불완전하게 상보적)이고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자에 더 상보적(예를 들어, 완전히 상보적)이다.
일부 실시형태에서, 키트는 RNA의 cDNA로의 전사를 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 이전에 또는 후속하여 기재되거나 당업자에게 달리 공지된 바와 같이, 시퀀싱을 위한 어댑터 태깅된 라이브러리의 제조를 위한 하나 이상의 키트를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 이전에 또는 후속하여 기재되거나 당업자에게 달리 공지된 바와 같이, 핵산의 단편화를 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 이전에 또는 후속하여 기재되거나 당업자에게 달리 공지된 바와 같이, 핵산의 물리적 단편화를 위한 하나 이상의 디바이스를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 대안적으로 이전에 또는 후속하여 기재되거나 당업자에게 달리 공지된 바와 같이, 핵산의 효소적 단편화를 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 핵산의 물리적 단편화를 위한 하나 이상의 성분 및 핵산의 효소적 단편화를 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같이, 다수의 A0를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 각각이 개별 돌연변이에 완전히 상보적인 서열(예를 들어, 3' 말단)을 갖는 1 내지 1,000,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공되고, 여기서 동일한 서열(예를 들어, 3' 말단 또는 다른 곳에서)은 상기 돌연변이의 야생형 서열과 불완전하게 상보적이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 100,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 내지 10,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 내지 1,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 각각이 개별 돌연변이에 불완전하게 상보적인 서열(예를 들어, 3' 말단 또는 다른 곳에서)을 갖는 1 내지 1,000,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공되고, 여기서 동일한 서열(예를 들어, 3'에서 말단 또는 다른 곳에서)은 상기 돌연변이의 야생형 서열에 완전히 상보적이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 100,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 내지 10,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 내지 1,000개의 개별 A0 프로브를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 다중 포획 올리고뉴클레오타이드(C0)를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 다수의 고체 지지체를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 공지된 서열에 완전히 상보적인 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에서)을 갖는 다수의 A0를 포함하는 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 공지된 서열과 불완전하게 상보적인 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에서)을 갖는 다수의 A0를 포함하는 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 주어진 암 유형 또는 암 유형의 범위에서 공지된 변이체에 완전히 상보적인 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에서)을 갖는 다수의 A0을 포함하는 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 주어진 암 유형 또는 암 유형의 범위에서 공지된 변이체에 불완전하게 상보적인 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에서)을 갖는 다수의 A0을 포함하는 패널이 제공되고, 여기서 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단)은 야생형 서열에 완전하게 상보적이다.
일부 실시형태에서, 주어진 암 유형 또는 암 유형의 범위에서 공지된 변이체에 완전하게 상보적인 반면 다른 것들은 불완전하게 상보적인 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에서)을 갖는 다수의 A0를 포함하는 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 패널은 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오타이드(C0)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 패널은 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같은 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
다형성(예를 들어, 돌연변이)은 이전에 또는 후속하여 기재되거나 공지된 임의의 다형성(예를 들어, 돌연변이)으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 당업자라면 본 발명의 범위 내에 임의의 원종양유전자, 종양유전자, 또는 이전에 또는 후속하여 기재되거나 공지된 하나 이상의 질환 상태에 대한 유전적 마커에 하나 이상의 다형성(예를 들어, 돌연변이)의 검출에 유용할 수 있는 패널이 포함됨을 이해할 것이다.
당업자라면 본 발명의 범위 내에 하나 이상의 질환 상태에 대한 유전자 마커의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수 있는 더 많은 변이체의 검출에 유용할 수 있는 패널이 포함되거나, 예를 들어, 종양-정보 모니터링을 위해 주어진 환자, 조직, 또는 세포에 특이적인 것임을 추가로 이해할 것이다.
당업자라면 본 발명의 범위 내에 아직 알려지지 않은 하나 이상의 변이체의 검출에 유용할 수 있지만 그럼에도 불구하고 하나 이상의 질환 상태의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수 있는 패널이 포함된다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 많은 상이한 암 유형에 대한 돌연변이 시그니처가 공지되어 있으며, 이들은 CpG 디뉴클레오타이드에서 과잉 C>T와 같은 돌연변이유발의 우선적인 모드이다. 패널은 일어나는 이러한 유형의 사건을 검출하도록 설계된 프로브를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 패널은 1 내지 1,000,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 10,000 내지 1,000,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 100,000 내지 1,000,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 200,000 내지 1,000,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 10,000 내지 100,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 1,000 내지 100,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 1,000 내지 10,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 500 내지 10,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 500 내지 1,000개의 개별 프로브 분자를 포함하고, 이들 각각은 표적 돌연변이를 포함하는 특정 표적 영역에 상보적일 수 있는 서열(예를 들어, 이들의 3' 말단에)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 패널은 5 내지 500개의 개별 프로브 분자를 포함하며, 각각은 특정 표적 돌연변이에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 패널은 5 내지 400개의 개별 프로브 분자를 포함하며, 각각은 특정 표적 돌연변이에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 패널은 5 내지 300개의 개별 프로브 분자를 포함하며, 각각은 특정 표적 돌연변이에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 패널은 5 내지 200개의 개별 프로브 분자를 포함하며, 각각은 특정 표적 돌연변이에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 패널은 5 내지 100개의 개별 프로브 분자를 포함하며, 각각은 특정 표적 돌연변이에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 패널은 각각이 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 내지 50개의 개별 프로브 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 동일한 돌연변이에 특이적인 복수의 프로브 분자가 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 패널의 각각의 돌연변이에 특이적인 단 하나의 프로브 분자가 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 패널이 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공되고, 여기서 하나 이상의 프로브는 EGFR 돌연변이에 상보적이고, 하나 이상의 프로브는 KRAS 돌연변이에 상보적이며, 하나 이상의 프로브는 ERBB2/HER2 돌연변이에 상복적이며, 하나 이상의 프로브는 EML4-ALK 돌연변이에 상보적이고, 하나 이상의 프로브는 ROS1 돌연변이에 상보적이며, 하나 이상의 프로브는 RET 돌연변이에 상보적이고, 하나 이상의 프로브는 MET 돌연변이에 상보적이다.
일부 실시형태에서, 패널이 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공되고, 여기서 하나 이상의 프로브는 EGFR 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브는 KRAS 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브는 ERBB2/HER2 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브는 EML4-ALK 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브는 ROS1 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브는 RET 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 이상의 프로브 MET 돌연변이에 상보적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 EGFR, KRAS, BRAF, ERBB2/HER2, EML4-ALK, ROS1, RET, MET 돌연변이에 선택적인 프로브의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, EGFR 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, KRAS 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, BRAF 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, ERBB2/HER2 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, EML4-ALK 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, ROS1 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, RET 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, NTRK 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, ROS1 돌연변이에 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, MET 엑손 14 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 코딩 서열(CDS)에 선택적인 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 전술한 패널 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 전술한 패널 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같을 수 있는 하나 이상의 시약과 함께, 이전에 또는 후속하여 기재된 바와 같을 수 있는 패널을 포함하는 키트가 제공된다.
당업자라면 용어 'DNA' 및 '핵산'이 본 출원 내에서 상호교환적으로 사용됨을 이해할 것이다. 따라서, 'DNA'를 지칭하는 실시형태의 개시내용은 'DNA'가 '핵산'으로 대체된 실시형태를 포함하고 개시하는 것으로 이해될 수 있다. 당업자라면 'DNA'를 지칭하는 실시형태가 'DNA'가 'RNA'로 대체된 실시형태를 포함하고 개시하는 것으로 이해될 수 있음을 이해할 것이다.
당업자라면 본 발명이 여러 실시형태를 참조하여 예로서 가재되었지만, 개시된 실시형태로 제한되지 않으며 대안적인 실시형태가 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 구성될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "자성 미세입자"는 자기장에 의해 끌리는 자기 반응성 미세입자이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 자성 미세입자는 자성 금속 옥사이드 코어를 포함하며, 이는 일반적으로 DNA, RNA, 또는 PNA에 결합할 수 있는 표면을 생성하는 중합체 코트에 의해 둘러싸여 있다. 자성 금속 옥사이드 코어는 바람직하게는 철 옥사이드이고, 여기서 철은 Fe2+와 Fe3+의 혼합물이다. 바람직한 Fe2+/Fe3+ 비는 바람직하게는 2/1이지만, 약 0.5/1 내지 약 4/1로 다양할 수 있다.
생물정보학 접근법은 시퀀싱 데이터를 분석하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 특정 변이체의 존재 또는 부재를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 다수의 변이체로부터의 데이터는 배합되어 종양 DNA의 존재 또는 부재에 대한 확률 추정치를 도출한다.
예를 들어, Illumina 시퀀싱 데이터 분석은 bcl2fastq와 같은 도구를 사용하여 BCL 파일을 FASTQ 형식으로 변환 및 역다중화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 리드(sequencing read)는 분자 식별자를 포함한다. 이 경우, 분자 식별자는 시퀀싱 리드로부터 추출되고, FASTQ 헤더에 첨부되고, 시퀀싱 리드는 클리핑될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-정규 염기(A, C, G 또는 T가 아님)를 갖는 바코드는 여과될 수 있다. 생성된 리드는 이후 -C 옵션을 사용하여 바코드 서열을 정렬에 추가하는 bwa mem과 같은 도구를 사용하여 정렬될 수 있다. 정렬은 이후 biobambam2 bamsormadup 및 bammarkduplicatesopt를 사용하여 좌표, 마킹된 중복 리드, 및 리드 좌표, 메이트 좌표 및 광학 중복 보조 태그로 주석이 달린 리드에 의해 정렬될 수 있다. 리드는 적절한 쌍으로 마킹되지 않거나 광학 중복, 보충, QC 실패, 매핑되지 않은 또는 이차 정렬로 마킹되는 경우 필터링될 수 있다. 이후, 각각의 리드는 참조 명칭, 분류된 리드 및 메이트 단편화 중단점, 정방향 및 역방향 리드 바코드, 및 리드 가닥을 포함하는 보조 태그로 마킹될 수 있다.
일부 실시형태에서, 시퀀싱 데이터는 보조 태그 데이터를 사용하지 않는 변이체 호출 알고리즘을 사용하여 분석된다. 이 경우, 시퀀싱 데이터의 분석은 두 모델에서 데이터를 관찰할 확률을 비교한다. 첫 번째는 시퀀싱 아티팩트의 분포를 지정하는 널(null) 모델이다. 두 번째는 진정한 변이를 허용하는 모델이다. 이 경우 대체 모델의 확률이 널 모델의 확률을 초과하면 변형이 호출된다. 일부 실시형태에서, 미리 특성규명된 샘플의 패널은 (제1 모델)에 대한 오차 분포를 모델링하는 것을 도울 수 있다.
일부 실시형태에서, 보조 태그는 동일한 입력 분자, 및/또는 동일한 입력 분자의 동일한 가닥으로부터 유래될 가능성이 있는 리드를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공통 염기 품질 스코어는 동일한 보조 태그를 공유하는 리드로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 변이체는 컨볼루션 신경망과 같은 인공 지능 알고리즘을 사용하여 식별된다.
일부 실시형태에서, 시퀀싱 데이터는 아티팩트를 제거하기 위해 추가로 필터링될 수 있다. 예시적인 필터는 주어진 시퀀싱 리드에 존재하는 미스매치의 수; 정렬 스코어 및 차선책 정렬 스코어; 염기 품질 스코어 또는 공통 염기 품질 스코어; 주어진 변이 부위를 커버하는 최소 리드 수; 시퀀싱 리드 내의 변이체의 위치; 리드가 5' 클리핑되는지 여부; 리드가 부적절한 쌍인지 여부; 리드가 indel을 포함하는지 여부; 및 주어진 변이체의 변이체 대립유전자 분율을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공통 SNP를 포함하거나 아티팩트를 정렬시키기 쉬운 게놈의 영역이 필터링된다. 당업자에게 공지된 많은 다른 필터가 있다.
일부 실시형태에서, 대조군 샘플은 변이체를 필터링하기 위해 시퀀싱된다. 예를 들어, 협측 상피 또는 다른 조직 공급원으로부터의 DNA는 생식세포 계열 변이체를 제거하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 버피 코트(buffy coat) 또는 백혈구 DNA는 클론 조혈로부터 유래된 체세포 돌연변이를 필터링하기 위해 시퀀싱될 수 있다.
본 발명의 조성물, 방법, 및 키트는 다양한 범위의 적용 및 설정에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 이들은 샘플에서 서열을 검출하고자 하는 임의의 방법론에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 이들은 복잡한 샘플에서 소수(예를 들어, 희귀) 서열을 검출하고자 하는 임의의 방법론에서 사용된다. 상기 기재된 예시적인 용도 이외에, 다수의 추가적인 예시적 용도가 하기에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조성물, 방법, 및 키트는 감염성 질환의 분석 및 치료에 사용된다. 이 기술은 샘플에 존재할 수 있는 저빈도 돌연변이의 검출에 특히 유용하다. 예를 들어, 이 기술은 치료 내성(예를 들어, 항생제 내성, 항바이러스 내성 등) 감염성 질환(예를 들어, HIV, 결핵 등)과 관련된 저빈도 돌연변이의 검출을 위해 사용된다. 이 기술은 시퀀싱을 위한 박테리아 또는 바이러스 DNA 또는 RNA의 선택적 풀다운(pulldown)에서 추가로 사용된다.
상기 언급된 바와 같이, 이 기술은 복잡한 샘플에서 분석물의 분석 및/또는 농축에 특히 매우 적합하다. 성장하는 연구 및 임상 관심의 한 영역은 기술이 시퀀싱 또는 다른 분석을 위해 요망되는 박테리아 DNA의 훨씬 더 높은 특이성 선택을 제공하기 위해 사용되는 미생물군유전체 분석이다.
이 기술은 또한 다수의 상이한 샘플의 고처리량 분석 뿐만 아니라 다중 분석에도 사용된다. 이러한 이점은 법의학 분석, 친자/모성 시험, 질환 분석(예를 들어, 암, 감염성 질환), 약물 감수성 시험, 농업 및 식품 시험(예를 들어, 선택적 육종을 돕기 위해, 미량 오염물 등을 식별하기 위해, 등)을 포함하는, 매우 다양한 유전자형 적용에서 사용된다.
이 기술은 합성 핵산(예를 들어, DNA) 오류 정정에서 사용된다. 합성 핵산은 연구, 진단 및 임상 적응증에 사용된다. 의도하지 않거나 원하지 않는 서열을 갖는 핵산 분자의 사용을 피하거나 최소화하는 것이 종종 중요하다. 이 기술은 원하지 않는 분자로부터 원하는 분자의 확인 및 단리에 사용된다.
핵산 편집은 연구, 합성 생물학, 및 임상 적용에서 중요한 공정으로 부상하고 있다. 예를 들어, 핵산의 CRISPR/CAS 편집, 및 관련 공정은 중요한 공정으로 부상하고 있다. 이러한 편집 기술 중 다수는 의도된 편집된 생성물, 편집되지 않은 생성물, 및 의도하지 않은 편집된 생성물을 포함하는 혼합된 분자 집단을 초래한다. 본 명세서에 제공된 기술은 의도된 편집된 생성물의 식별, 선택 및 단리를 용이하게 한다.
이 기술은 또한 환경 모니터링에도 사용된다. 농업 용도에 추가하여, 이 기술은 미량의 관심 분석물을 함유할 수 있는 환경 샘플의 분석에 특히 매우 적합하다. 이러한 샘플은 유기체의 천연 및 침입 종의 분석, 침입 종의 조기 검출, 공기 및 수질 오염, 및 고대 DNA 분석을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 샘플 유형은 토양, 물, 눈, 분변, 점액, 생식세포, 탈피된 피부, 사체, 모발, 및 공기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
이 기술은 다른 서브세트로부터의 특정 샘플로부터 핵산의 원하는 서브세트의 단리에 사용된다. 예를 들어, 이 기술은 엽록체 및 미토콘드리아 게놈의 단리 및 분석에 사용된다.
이 기술은 조작된 및 천연 세포에 대한 세포주 스크리닝에서 사용된다. 이러한 세포주는 세포 배양물(원발성 및 불멸화), 줄기 세포(배아, 유도 다능성, 역분화 등), 세포 요법을 위해 의도된 분화된 세포, 연구 또는 임상 적용을 위한 생체외 변형된 세포(예를 들어, CAR T 세포), 및 유전적으로 조작된 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
이 기술은 손상되지 않거나 원하는 핵산으로부터 손상되거나 다른 원하지 않는 핵산을 제거하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이 기술은 메틸화 분석 전에 샘플로부터 손상된 DNA를 제거하는 데 사용될 수 있다.
이 기술은 대상체에 투여하기 전에 세포(예를 들어, 배아, 난자, 정자), 리포솜, 엑소솜, 핵산 벡터(예를 들어, 유전자 요법 벡터) 등의 이식-전 스크리닝에서 사용된다.
이 기술은 약물 독성 스크리닝에서 사용된다. 이 기술은 특정 약물의 사용과 관련될 수 있는 DNA 손상, 돌연변이의 생성, 메틸화 변화 등의 확인에 특히 적합하다.
이 기술은 핵산의 단편 분석에서 사용된다. 예를 들어, 특정 서열을 관련 상관 정보(예를 들어, 기원 조직, 암과 같은 질환과의 연관성 등)와 연관시키는 중단점 위에 있거나 이와 정렬된 프로브가 사용될 수 있다.
이 기술은 핵산 복잡성 감소가 요망되는 임의의 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 기술은 전체 게놈 복잡성 감소에 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시형태에서, 제한 효소 소화 또는 다른 핵산 단편화 공정이 이용되고, 이어서 공지된 말단 서열과 매칭되는 프로브를 사용하여 절단된 분자만을 뽑아내는 단계가 이어진다.
이 기술은 미세부수체 불안정성(MSI)을 평가하는 데 사용된다. 반복된 뉴클레오타이드(예를 들어, GT/CA 반복부)의 존재, 수 또는 특성이 상이한 표적 핵산 분자는 샘플에서 농축되고/거나 확인된다. MSI는 결장암, 위암, 자궁내막암, 난소암, 간담도암, 요로암, 뇌암, 및 피부암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다수의 질환 및 병태와 관련이 있다.
이 기술은 또한 종양 돌연변이 부담(TMB)을 평가하는 데 사용된다. TMB는 특히, 면역 체크포인트 요법에 대한 예측 바이오마커로 부상하였다. 현재, TMB를 평가하기 위해 차세대 전체-엑솜 시퀀싱이 이용되거나, 유전자 서브세트의 서열을 제공하는 유전자 패널이 평가된다. 본 명세서에서 제공되는 기술의 사용은 보다 민감하고 유의하게 덜 비용이 많이 들고 부담이 되는 TMB 평가를 가능하게 한다.
이 기술은 하플로타이핑(haplotyping)에서 사용된다. 유전자형보다는 일배체형으로 보고되는 게놈 정보는 개인화 의학 뿐만 아니라 다양한 연구 응용 분야에서 점점 더 중요해지고 있다. 단일 뉴클레오타이드 변이체와 같은 덜 복잡한 변이체보다 더 특이적인 일배체형은 또한 예후 및 진단, 종양 분석, 및 이식을 위한 조직의 타이핑에 적용된다. 현재, 시퀀싱은 분자 하플로타이핑의 가장 일반적인 형태이다. 시퀀싱 기술의 오류율은 정확한 정보를 얻는 데 장애가 된다. 본 명세서에 제공된 기술은 효율적이고 매우 정확한 일배플로팅을 가능하게 한다.
임의의 요망되는 서열 또는 관심분야를 풍부하게 하는 기술의 능력은 기술이 기존의 핵산 방법론을 향상시킬 수 있게 한다. 예를 들어, 많은 핵산 시퀀싱 접근법은 표적 핵산에 반복적인 서열 영역이 있을 때 어려움을 겪는다. 본 명세서에 제공된 기술은 반복 영역의 제거를 허용하여, 이러한 시퀀싱 반응을 보다 정확하고 효율적으로 만든다.
실시예
실시예 1: 관심 표적 서열의 가피로인산분해 의존성 방출
1. 비드 제조
샘플당 1uL의 비드(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin T1 cat. 65601)을 1.5mL Eppendorf 튜브에 넣었다. 최대 100uL의 비드를 1mL의 차단 용액으로 차단할 수 있다. 이어서, 튜브를 자석 상에 배치한 후 저장 완충제를 제거하였다. 이어서, 튜브에 1mL의 차단 완충제(1 ug/mL tRNA를 갖는 1xPBS)를 첨가한 다음, 실온(RT)에서 30분 동안 회전(40 rpm)시켰다.
2. 올리고뉴클레오타이드 어닐링
1xAB 완충제(Tris HCl pH=7.5 1mM, NaCl 50mL, EDTA 0.2mM) 중의 올리고뉴클레오타이드의 희석액을 제조하였다.
프로브 A0 20nM
20nM 완전히 상보적인 올리고뉴클레오타이드 20nM 또는 미스매칭된 올리고뉴클레오타이드
최대 50 uL
이어서, 생성된 혼합물을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 서서히 냉각시켰다.
올리고뉴클레오타이드 혼합물을 냉각시킨 후, 혼합물을 1000배 희석시켰다.
프로브 A0(서열번호 1):
여기서, /5Biosg/는 5' 말단의 바이오틴을 나타낸다
완전 상보성 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2):
미스매칭된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3):
3. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
차단된 비드를 2000 x g의 미니-원심분리기에서 5초 동안 회전시키고 자석의 상부에 놓은 후 흡인에 의해 차단 용액을 제거하였다. 이어서, 튜브에 비드 1 uL 마다 10uL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 첨가하였다.
비드/올리고 및 완충제의 비율은 하기와 같았다:
40uL의 2x 결합 완충제
10uL의 비드
1000배 희석된 50uL의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드.
이어서, 튜브를 실온에서 30분 동안 회전(40 rpm)시켰다.
4. 세척 단계
이어서, 비드를 100 uL 1x 세척 완충제(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)로 1회 세척하였다.
5. 0.01% Triton-X를 사용하여 비드 세척 완충제를 100 uL 1x BFF6 완충제로 교환함
0.01% Triton-X 조성을 갖는 1x BFF6
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
포타슘 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
TWEEN20 0.01%
6. 가피로인산분해
이어서, 1x BFF6 0.01% Triton-X 완충제를 제거하고, PPL 혼합물(4℃에서 저장)을 비드에 첨가하였다.
PPL 혼합물은 하기로 구성되었다:
0.1% TWEEN20을 갖는 1x BFF6
10 U/mL 클레나우(Klenow)(엑소-)
2 U/mL 아피라제
0.5mM PPi
총 부피 10 uL
생성된 혼합물을 45℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
7. PPi의 불활성화
2.5uL의 TIPP 혼합물을 불활성화된 PPi에 첨가하였다.
TIPP 혼합물을 하기로 구성하였다:
0.1% TWEEN20을 갖는 1x BFF6
16 U/mL의 TIPP
포인트 6으로부터의 10uL의 혼합물.
총 부피 12.5 uL
생성된 혼합물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
8. 관심 표적의 방출 및 검출
포인트 7로부터의 혼합물을 5분 동안 60℃까지 가열하였다. 혼합물을 갖는 튜브를 상청액으로부터 자성 비드를 분리하기 위해 60℃로 설정된 핫 플레이트에 배치된 자성 랙(magnetic rack)으로 옮겼다.
2uL의 투명한 상청액을 하기로 구성된 검출 믹스에 첨가하였다:
1x Q5U 버퍼
0.4mM dNTP
0.2 uM 프라이머 믹스
20 U/mL Q5U DNA 중합효소
10 U/mL UDG
1x SybrGreenI
총 부피: 12.5 uL
Q5 완충제
Q5 완충제 조성물은 공개적으로 입수 가능하지 않다.
프라이머 믹스:
Fwd(서열번호 4): 5'-C*C*C*AACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTG-3'
Rev(서열번호 5): 5'-/5Phos/GGGACCTTACCTTATACACCGTGCCG-3'
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, /5Phos/는 5' 말단 포스페이트를 나타낸다
이어서, 생성된 혼합물을 하기에 지시된 바와 같이 인큐베이션하였다:
37℃ 1분
55℃ 10분
98℃ 1분
(98℃ 10초
63℃ 15초
72℃ 15초) × 50
72℃ 5분
4℃ 휴지(pause)
fam 채널에서 모든 사이클 후에 형광 판독을 수행하였다. 결과는 도 4에서 볼 수 있다.
실시예 2: 관심 표적 서열의 가피로인산분해 의존적 농축
1. 비드 제조
샘플당 1uL의 비드(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin T1 cat. 65601)을 1.5mL Eppendorf 튜브에 넣었다. 최대 100uL의 비드를 1mL의 차단 완충제로 차단할 수 있다. 튜브를 자석에 놓은 다음, 저장 완충제를 제거하였다. 1mL의 차단 완충제(1 ug/mL tRNA를 갖는 1x PBS, Triton-X 0.1%)를 튜브에 첨가한 다음, 실온(RT)에서 30분 동안 회전(40 rpm)시켰다.
2. 1% MAF 및 10% MAF 샘플 제조
1% MAF: 100nM의 야생형 올리고뉴클레오타이드를 100μL의 최종 부피로 1nM의 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드와 혼합하였다.
10% MAF: 100nM의 야생형 올리고뉴클레오타이드를 100μL의 최종 부피로 10nM의 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드와 혼합하였다.
야생형 올리고뉴클레오타이드(서열번호 6):
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7):
여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다
3. 올리고뉴클레오타이드 어닐링
1x AB 완충제(Tris HCl pH=7.5 1mM, NaCl 50mM, EDTA 0.2mM) 중 올리고뉴클레오타이드의 희석액을 제조하였다.
프로브 A0 20nM
10uL의 1% MAF 또는 10% MAF 샘플
뉴클레아제가 없는 물로 최대 50 uL로 구성하였다.
이어서, 생성된 혼합물을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 서서히 냉각시켰다.
올리고뉴클레오타이드 혼합물을 냉각시킨 후, 혼합물을 1000배 희석시켰다.
프로브 A0(서열번호 8):
여기서, /5Biosg/는 5' 말단의 바이오틴을 나타낸다
4. 표적 사전-비드 prep의 dPCR 정량화
어닐링되고 희석된 혼합물에서 야생형 및 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드의 농도를 dPCR을 사용하여 정량화하였다. 1% MAF 및 10% MAF 샘플의 1000배 희석(포인트 3에서 취함)을 추가로 20배 희석한 다음, 1:1의 연속 희석을 6회 수행하여 기준 곡선을 생성하였다.
dPCR 혼합물을 하기로 구성하였다:
1x Q5U 버퍼
0.4mM dNTP
0.2μM 프라이머 믹스
20 U/mL Q5U 중합효소
10 U/mL UDG
2x 에바그린
0.0003 μg/mL Alexa 700
0.2% TWEEN20
4μL DNA 주형
총 부피: 12μL
Q5 완충제
Q5 완충제 조성물은 공개적으로 입수 가능하지 않다.
프라이머 믹스:
FWD(서열번호 9): 5'-G*C*C*TCCCTCGCGCCATCAGCATCTGCCTCACCTCCACCG-3'
REV(서열번호 10): 5'-/5Phos/GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATTGTCTTTGTTCCCGGA-3'
또는
FWD(서열번호 11):
5'-A*C*G*TACTGGTGAAAACACCGCAG-3'
REV(서열번호 12):
5'-/5Phos/GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3'
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, /5Phos/는 5' 말단 포스페이트를 나타내고, 야생형 및 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드의 정량화를 위해 상이한 프라이머 혼합물을 사용하였다.
이어서, 생성된 혼합물을 하기에 지시된 바와 같이 인큐베이션하였다:
37℃ 1분
55℃ 10분
98℃ 1분
(98℃ 10초
63℃ 15초
72℃ 15초)×30
72℃ 5분
35℃ 휴지
인큐베이션 후 형광 판독을 수행하고, dPCR 제조사 소프트웨어를 상이한 올리고의 정량화를 위해 사용하였다.
5. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
차단된 비드를 2000 xg의 미니-원심분리기에서 5초 동안 회전시키고, 자석의 상부에 놓은 후, 흡인에 의해 차단 용액을 제거하였다. 비드 1μL당 10uL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 튜브에 첨가하였다.
비드/올리고 및 완충제의 비율은 하기와 같았다:
40μL의 2x 결합 완충제
10μL의 비드
1000배 희석된 50μL의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드(포인트 3으로부터).
이어서, 튜브를 실온에서 30분 동안 회전(40 rpm)시켰다.
6. 세척 단계
이어서, 비드를 100μL 1x 세척 완충제(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)로 1회 세척하였다.
7. 비드 세척 완충제를 0.01% TWEEN20을 갖는 100μL 1xBFF6 완충제로 교환
0.01% TWEEN20 조성을 갖는 1xBFF6
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
포타슘 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
TWEEN20 0.01%
8. 가피로인산분해
이어서, 1x BFF6 0.01% TWEEN20 완충제를 제거하고, PPL 혼합물(4℃에서 저장)을 비드에 첨가하였다.
PPL 혼합물은 하기로 구성되었다:
0.1% TWEEN20을 갖는 1x BFF6
20 U/mL 클레나우(엑소-)
2 U/mL 아피라제
0.5mM PPi
총 부피 20μL
생성된 혼합물을 40℃에서 1분 동안 인큐베이션하였다.
0.1% TWEEN20 조성을 갖는 1xBFF6
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
포타슘 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
TWEEN20 0.1%
9. PPi의 불활성화
5μL의 TIPP 혼합물을 첨가하여 PPi를 불활성화시켰다.
TIPP 혼합물을 하기로 구성하였다:
0.1% TWEEN20을 갖는 1x BFF6
16 U/mL의 TIPP
포인트 8로부터의 20μL의 믹스.
총 부피 25μL
생성된 혼합물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
10. 관심 표적의 방출 및 검출
포인트 9로부터의 혼합물을 10분 동안 60℃까지 가열하였다. 혼합물을 갖는 튜브를 60℃로 설정된 핫 플레이트에 놓인 자기 랙으로 옮겨 상청액으로부터 자성 비드를 분리하였다.
11. 비드로부터 방출된 표적의 dPCR 정량화
이어서, 상청액에서 야생형 및 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드의 농도를 dPCR을 사용하여 정량화하였다.
4μL의 투명한 상청액을 하기로 구성된 검출 믹스에 첨가하였다:
1x Q5U 버퍼
0.4mM dNTP
0.2μM 프라이머 믹스
20 U/mL Q5U DNA 중합효소
10 U/mL UDG
2x 에바그린
0.0003 μg/mL Alexa 700 0.0003 μg/mL
0.2% TWEEN20
총 부피: 12μL
Q5 완충제
Q5 완충제 조성물은 공개적으로 입수 가능하지 않다.
프라이머 믹스:
FWD(서열번호 9): 5'-G*C*C*TCCCTCGCGCCATCAGCATCTGCCTCACCTCCACCG-3'
REV(서열번호 10): 5'-/5Phos/GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATTGTCTTTGTTCCCGGA-3'
또는
FWD(서열번호 11):
5'-A*C*G*TACTGGTGAAAACACCGCAG-3'
REV(서열번호 12):
5'-/5Phos/GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3'
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, /5Phos/는 5' 말단 포스페이트를 나타내고, 야생형 및 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드의 정량화를 위해 상이한 프라이머 혼합물을 사용하였다.
이어서, 생성된 혼합물을 하기에 지시된 바와 같이 인큐베이션하였다:
37℃ 1분
55℃ 10분
98℃ 1분
(98℃ 10초
63℃ 15초
72℃ 15초)×30
72℃ 5분
35℃ 휴지
인큐베이션 후 형광 판독을 수행하고, dPCR 제조사 소프트웨어를 상이한 올리고의 정량화를 위해 사용하였다.
올리고뉴클레오타이드의 정량화에 대한 결과는 하기 표에 제시되어 있다.
실시예 3: EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 분석
1. 비드 제조
a. 비드 차단 단계
- 샘플당 1μL의 비드를 취하고, 1.5mL eppendorf 튜브(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin C1 cat. 65001)에 넣는다. 최대 100μL의 비드를 1mL의 차단 용액으로 차단할 수 있다.
- 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고, 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 저장 완충제를 제거한다.
- 비드가 있는 튜브에 1mL 차단 완충제(1xPBS, 0.1% Tween-20, 1 μg/mL
t-RNA)를 첨가한다.
- 실온에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
b. 완충제 교환
- 비드를 회전시키고, 이를 자석에 놓는다. 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 차단 용액을 제거한다.
- 1μL의 비드당 10μL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 첨가한다.
- 5초 동안 와동(vortexing)시킴으로써 비드를 혼합한다.
2. 올리고뉴클레오타이드 혼성화
- 1xSSC 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS) 중 올리고뉴클레오타이드의 희석액을 제조한다
- 프로브 올리고뉴클레오타이드 2 pM
- WT 또는 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 0.2/2 fM
- 비드 1μL당 50μL의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다.
- 95℃에서 5분 동안 및 50/60℃에서 72시간 동안 인큐베이션한다.
프로브 올리고뉴클레오타이드(서열번호 13):
WT 올리고뉴클레오타이드(서열번호 14):
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드(서열번호 15):
여기서, /5Biosg/는 5' 말단의 바이오틴을 나타낸다.
3. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
- 비드 및 올리고뉴클레오타이드를 하기 비율로 혼합한다:
40μL의 2x 결합 완충제
10μL의 단계 1로부터의 비드.
50μL의 단계 2로부터의 올리고뉴클레오타이드.
- RT에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
4. 비드 세척
- 부착 단계를 완료한 후, 샘플을 스핀 다운시키고 이를 자석에 놓고 7분 동안 대기시킨다.
- 100μL 상청액 중 80μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충제(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)를 첨가한다.
- 10초 동안 샘플을 와동시키고 이들을 스핀 다운시킨다.
- 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
- 120μL 상청액 중 90μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석 상의 샘플 위치를 10회 변경하여 샘플을 혼합한다. 2분을 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 샘플을 자석에서 꺼내고 100μL의 1x 세척 완충제를 첨가한다.
- 자석 상의 샘플 위치를 10회 변경하여 샘플을 혼합한다. 2분을 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 샘플을 자석에서 꺼내고 100μL 1xBFF6 완충제(Tris 아세테이트 pH=7.0 10mM, 포타슘 아세테이트 30mM, 마그네슘 아세테이트 17.125mM, TWEEN20 0.01%)를 첨가한다.
- 샘플을 스핀 다운시키고 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
- 1x BFF6 완충제를 제거한다.
5. PPL 반응
- 4℃에서 유지된 비드에 PPL 믹스를 첨가한다. PPL은 하기 조성을 갖는다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
20 U/mL 클레나우(엑소-)
2 U/mL 아피라제
+/- 0.05mM PPi
총 부피: 20μL
- 40℃에서 10분 동안 인큐베이션, 4℃ 휴지
6. TIPP 반응
- PPL 반응이 4℃에 도달하면, 하기를 갖는 5μL의 TIPP 혼합물을 첨가한다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
16 U/mL TIPP
20μL의 5단계로부터의 혼합물.
총 부피: 25μL
- 37℃에서 5분, 60℃ 10분 동안 인큐베이션, 60℃ 휴지
7. 예비증폭
- 핫 플레이트 상에 유지된 자석 상에 단계 6으로부터의 샘플을 놓고 60℃까지 가열한다.
-비드를 분리한 후, 2μL의 상청액을 취하고 하기 혼합물에 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 1 0.1μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
UDG 10 U/mL
총 부피: 12.5μL
Q5U 완충제:
프라이머 믹스 1은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 16): 5'-AGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 17): 5'-CTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCC-3'
- 샘플을 열순환기에 넣고 105℃에서 뚜껑을 덮고 인큐베이션한다
1. UDG 37℃ 1분
2. Int. 변성 98℃ 1분
3. 변성 98℃ 10초
4. 어닐링 63℃ 15초
5. 신장 72℃ 15초
6. 최종 신장 72℃ 5분
7. 4℃ 유지 냉각
- 단계 3 내지 5를 12x 반복
8. dPCR 정량화
- 단계 7로부터의 예비증폭을 완료한 후, 하기를 포함하는 반응물에 2μL의 단계 7로부터의 혼합물을 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 2 또는 3 0.2μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
에바그린 염료 2x
Alexa Fluor 700 염료 0.0003 μg/μL
TWEEN20 0.2%
총 부피: 12μL
프라이머 믹스 2는 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 18):
5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATTGTCTTTGTGTTCCCGGAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 19):
5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCATCTGCCTCACCTCCACCG-3'
프라이머 믹스 3은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 20): 5'-ACGTACTGGTGAAAACACCGCAG-3'
역방향 프라이머(서열번호 21): 5'-GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3'
- 105℃의 뚜껑이 있는 QIAcuity 디지털 PCR 시스템에 샘플을 놓는다
1. Int. 변성 98℃ 1분
2. 변성 98℃ 10초
3. 어닐링 63℃ 15초
4. 신장 72℃ 15초
5. 최종 신장 72℃ 5분
6. 냉각 35℃ 1분
- 단계 2 내지 4를 30회 반복하였다
- 노출 지속 시간이 각각 600 및 700 ms인 녹색 및 노란색 채널의 파티션 사진을 찍고 각각 6 및 8을 얻는다. 이러한 실험으로부터 얻어진 데이터는 도 5에 도시되어 있다.
실시예 4: 상이한 변이체 대립유전자 분획(VAF)에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출
1. 비드 제조
비드 차단 단계
- 샘플당 1μL의 비드를 취하고, 1.5mL eppendorf 튜브(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin C1 cat. 65001)에 넣는다. 최대 100μL의 비드를 1mL의 차단 용액으로 차단할 수 있다.
- 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고, 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 저장 완충제를 제거한다.
- 비드가 있는 튜브에 1mL 차단 완충제(1xPBS, 0.1% Tween-20, 1 μg/mL t-RNA)를 첨가한다.
- 실온에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
완충제 교환
- 비드를 회전시키고, 이를 자석에 놓는다. 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 차단 용액을 제거한다.
- 1μL의 비드당 10μL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 첨가한다.
- 5초 동안 와동시킴으로써 비드를 혼합한다.
2. 올리고뉴클레오타이드 혼성화
- 1x SSC 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS)에서 올리고뉴클레오타이드의 희석액을 제조한다
프로브 올리고뉴클레오타이드 2 pM
WT 0-200fM
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 0.2 내지 100 fM
- 비드 1μL당 50μL의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다.
- 95℃에서 5분 및 60℃에서 72시간 동안 인큐베이션한다.
프로브 올리고뉴클레오타이드(서열번호 13):
WT 올리고뉴클레오타이드(서열번호 14):
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드(서열번호 15):
여기서, /5Biosg/는 5' 말단의 바이오틴을 나타낸다.
3. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
- 비드 및 올리고뉴클레오타이드를 하기 비율로 혼합한다:
40μL의 2x 결합 완충제
단계 1로부터의 10μL의 비드.
단계 2로부터의 50μL의 올리고뉴클레오타이드.
- RT에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
4. 비드 세척
- 부착 단계를 완료한 후 - 샘플을 스핀 다운시키고, 이를 자석에 놓고 7분 동안 대기한다.
- 100μL 상청액 중 80μL를 제거하고, 100μL의 1x 세척 완충제(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)를 첨가한다.
- 10초 동안 샘플을 와동시키고 이들을 스핀 다운시킨다.
- 샘플을 자석에 놓고, 2분 동안 대기한다.
- 120μL 상청액 중 90μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석 상의 샘플 위치를 10회 변경하여 샘플을 혼합한다. 2분 동안 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고, 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석에서 샘플 위치를 10회 변경하여 혼합한다. 2분 동안 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 자석에서 샘플을 취하고 100μL 1x BFF6 완충제(Tris 아세테이트 pH=7.0 10mM, 포타슘 아세테이트 30mM, 마그네슘 아세테이트 17.125mM, TWEEN20 0.01%)를 첨가한다.
- 샘플을 스핀 다운시키고, 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
- 1x BFF6 버퍼를 제거한다.
5. PPL 반응
- 4℃에서 유지된 비드에 PPL 혼합물을 첨가한다. PPL은 하기 조성을 갖는다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
20 U/mL 클레나우(엑소-)
2 U/mL 아피라제
+/- 0.05mM PPi
총 부피: 20μL
- 40℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 휴지시킨다
6. TIPP 반응
- PPL 반응이 4℃에 도달하면, 하기를 갖는 5μL의 TIPP 혼합물을 첨가한다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
16 U/mL TIPP
20μL의 단계 5로부터의 혼합물.
총 부피: 25μL
- 37℃에서 5분, 60℃ 10분 인큐베이션하고, 60℃에서 휴지시킨다
7. 예비증폭
- 핫 플레이트 상에 유지된 자석 상에 단계 6으로부터의 샘플을 놓고 60℃까지 가열한다.
-비드를 분리한 후, 2μL의 상청액을 취하고, 하기 혼합물에 첨가한다:
1x Q5U 완충제
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 1 0.1μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
UDG 10 U/mL
총 부피: 12.5μL
Q5U 완충제:
프라이머 믹스 1은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 16): 5'-AGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 17): 5'-CTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCC-3'
- 샘플을 열순환기에 넣고 105℃에서 뚜껑을 덮고 인큐베이션한다
1. UDG 37℃ 1분
2. Int. 변성 98℃ 1분
3. 변성 98℃ 10초
4. 어닐링 63℃ 15초
5. 신장 72℃ 15초
6. 최종 신장 72℃ 5분
7. 냉각 4℃ 유지
- 단계 3 내지 5를 12x 반복하였다
8. dPCR 정량
- 단계 7로부터의 예비증폭을 완료한 후. 하기를 포함하는 반응에 2μL의 단계 7의 혼합물을 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 2 또는 3 0.2μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
에바그린 염료 2x
Alexa Fluor 700 염료 0.0003 μg/μL
TWEEN20 0.2%
총 부피: 12μL
프라이머 믹스 2는 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 18):
5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATTGTCTTTGTGTTCCCGGAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 19):
5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCATCTGCCTCACCTCCACCG-3'
프라이머 믹스 3은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 20): 5'-ACGTACTGGTGAAAACACCGCAG-3'
역방향 프라이머(서열번호 21): 5'-GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3'
- 105℃의 뚜껑이 있는 QIAcuity 디지털 PCR 시스템에 샘플을 놓는다
1. Int. 변성 98℃ 1분
2. 변성 98℃ 10초
3. 어닐링 63℃ 15초
4. 신장 72℃ 15초
5. 최종 신장 72℃ 5분
6. 냉각 35℃ 1분
- 단계 2 내지 4를 30회 반복하였다
- 노출 지속 시간이 각각 600 및 700 ms인 녹색 및 노란색 채널의 파티션 사진을 찍고 각각 6 및 8을 얻는다. 이러한 실험으로부터 수득된 데이터는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 5: 0.1% VAF에서 EGFR 엑손 20 T790M 변이체의 검출에 대한 혼성화 완충제 및 혼성화 시간의 효과.
1. 비드 제조
a. 비드 차단 단계
- 샘플당 1μL의 비드를 취하고 1.5mL eppendorf 튜브(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin C1 cat. 65001)에 넣는다. 최대 100μL의 비드를 1mL의 차단 용액으로 차단할 수 있다.
- 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고, 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 저장 완충제를 제거한다.
- 비드가 있는 튜브에 1mL 차단 완충제(1x PBS, 0.1% Tween-20, 1 μg/mL t-RNA)를 첨가한다.
- 실온에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
b. 완충제 교환
- 비드를 스핀 다운시키고, 이를 자석에 놓는다. 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 차단 용액을 제거한다.
- 1μL의 비드당 10μL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 첨가한다.
- 5초 동안 와동시킴으로써 비드를 혼합한다.
2. 올리고뉴클레오타이드 혼성화
- 하기에서 올리고뉴클레오타이드의 희석액을 제조한다:
완충제 1: 1xSSC 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS) 또는
완충제 2: ULTRAhyb™ 초민감성 혼성화 완충제(카탈로그 번호 AM8670) 또는
완충제 3: 1xSSC+DS 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS, 5% 덱스트란 설페이트)
프로브 올리고뉴클레오타이드 2 pM
WT 올리고뉴클레오타이드 믹스 198 fM
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 믹스 2 fM
게놈 DNA 380 ng
- 비드 1μL당 50μL의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다
- 95℃에서 5분 동안 및 60℃에서 1/3시간 동안 인큐베이션한다.
프로브 올리고뉴클레오타이드(서열번호 12):
여기서, /5Biosg/는 5' 말단의 바이오틴을 나타낸다.
WT 올리고뉴클레오타이드 혼합물은 하기를 갖는다:
정방향 가닥 1(서열번호 22):
역방향 가닥 2(서열번호 23):
정방향 가닥 2(서열번호 24):
역방향 가닥 2(서열번호 25):
정방향 가닥 3(서열번호 26):
역방향 가닥 3(서열번호 27):
정방향 가닥 4(서열번호 28):
역방향 가닥 4(서열번호 29):
정방향 가닥 5(서열번호 30):
역방향 가닥 5(서열번호 31):
정방향 가닥 6(서열번호 32):
역방향 가닥 6(서열번호 33):
정방향 가닥 7(서열번호 34):
역방향 가닥 7(서열번호 35):
정방향 가닥 8(서열번호 36):
역방향 가닥 8(서열번호 37):
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 혼합물은 하기를 갖는다:
정방향 가닥 1(서열번호 38):
역방향 가닥 1(서열번호 39):
정방향 가닥 2(서열번호 40):
역방향 가닥 2(서열번호 41):
정방향 가닥 3(서열번호 42):
역방향 가닥 3(서열번호 43):
정방향 가닥 4(서열번호 44):
역방향 가닥 4(서열번호 45):
정방향 가닥 5(서열번호 46):
역방향 가닥 5(서열번호 47):
정방향 가닥 6(서열번호 48):
역방향 가닥 6(서열번호 49):
정방향 가닥 7(서열번호 50):
역방향 가닥 7(서열번호 51):
정방향 가닥 8(서열번호 52):
역방향 가닥 8(서열번호 53):
3. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
- 비드 및 올리고뉴클레오타이드를 하기 비율로 혼합한다:
40μL의 2x 결합 완충제
10μL의 단계 1로부터의 비드.
50μL의 단계 2로부터의 올리고뉴클레오타이드.
- RT에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
4. 비드 세척
- 부착 단계를 완료한 후, 샘플을 스핀 다운시키고, 이를 자석에 놓고 7분 동안 대기한다.
- 100μL 상청액 중 80μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충제(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)를 첨가한다.
- 10초 동안 샘플을 와동시키고 이들을 스핀 다운시킨다.
- 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
- 120μL 상청액 중 90μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석 상의 샘플 위치를 10회 변경하여 샘플을 혼합한다. 2분을 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석에서 샘플 위치를 10회 변경하여 혼합한다. 2분을 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 자석에서 샘플을 취하고 100μL 1xBFF6 완충제(Tris 아세테이트 pH=7.0 10mM, 포타슘 아세테이트 30mM, 마그네슘 아세테이트 17.125mM, TWEEN20 0.01%)를 첨가한다.
- 샘플을 스핀 다운시키고 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
-1xBFF6 완충제를 제거한다
5. PPL 반응
- 4℃에서 유지된 비드에 PPL 혼합물을 첨가한다. PPL은 하기 조성으로 구성된다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
20 U/mL 클레나우(엑소-)
2 U/mL 아피라제
0.05mM PPi
총 부피: 20μL
- 40℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 휴지시킨다
6. TIPP 반응
- PPL 반응이 4℃에 도달하면, 5μL의 하기를 갖는 TIPP 혼합물을 첨가한다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
16 U/mL TIPP
20μL의 단계 5로부터의 혼합물.
총 부피: 25μL
- 37℃에서 5분, 60℃ 10분 동안 인큐베이션하고, 60℃에서 휴지시킨다
7. 예비증폭
- 핫 플레이트 상에 유지된 자석 상에 단계 6으로부터의 샘플을 놓고 60℃까지 가열한다.
-비드를 분리한 후, 2μL의 상청액을 취하고 하기 혼합물에 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 4 0.1μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
UDG 10 U/mL
총 부피: 12.5μL
Q5U 완충제:
프라이머 믹스 4는 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 54): 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 55): 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'
- 샘플을 열순환기에 넣고 105℃에서 뚜껑을 덮고 인큐베이션한다
1. UDG 37℃ 1분
2. Int. 변성 98℃ 1분
3. 변성 98℃ 10초
4. 어닐링 63℃ 15초
5. 신장 72℃ 15초
6. 최종 신장 72℃ 5분
7. 냉각 4℃ 유지
- 단계 3 내지 5를 12x 반복하였다
8. dPCR 정량화
단계 7로부터의 예비증폭을 완료한 후. 하기를 포함하는 반응에 2μL의 단계 7로부터의 혼합물을 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 5 또는 6 0.2μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
에바그린 염료 2x
Alexa Fluor 700 염료 0.0003 μg/μL
TWEEN20 0.2%
총 부피: 12μL
프라이머 믹스 5는 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 56): 5'-TGGTAATTACCGACGAAAACGGC-3'
역방향 프라이머(서열번호 57): 5'-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3'
프라이머 믹스 6은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 58): 5'-TGATTTCCGTGCGTCTGAATGC-3'
역방향 프라이머(서열번호 59): 5'-ATGCTGCCGTAGCGTGTTTCG-3'
- 105℃의 뚜껑이 있는 QIAcuity 디지털 PCR 시스템에 샘플을 놓는다
1. Int. 변성 98℃ 1분
2. 변성 98℃ 10초
3. 어닐링 63℃ 15초
4. 신장 72℃ 15초
5. 최종 신장 72℃ 5분
6. 냉각 35℃ 1분
- 단계 2 내지 4를 30회 반복하였다
- 노출 지속 시간이 각각 600 및 700 ms인 녹색 및 노란색 채널의 파티션 사진을 찍고 각각 6 및 8을 얻는다. 이러한 실험으로부터 수득된 데이터는 도 7에 도시되어 있다.
실시예 6: EGFR 엑손 20 T790M 변이체에 대한 농축 인자.
1. 비드 제조
a. 비드 차단 단계
- 샘플당 1μL의 비드를 취하고 1.5mL eppendorf 튜브(ThermoFisher Dynabeads MyOne Streptavidin C1 cat. 65001)에 넣는다. 최대 100μL의 비드를 1mL의 차단 용액으로 차단할 수 있다.
- 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고, 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 저장 완충제를 제거한다.
- 비드가 있는 튜브에 1mL 차단 완충제(1xPBS, 0.1% Tween-20, 1 μg/mL t-RNA)를 첨가한다.
- 실온에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
b. 완충제 교환
- 비드를 스핀 다운시키고, 이를 자석에 놓는다. 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 대기한다.
- 차단 용액을 제거한다.
- 1μL의 비드당 10μL의 2x 결합 완충제(TrisHCl pH=7.5 40mM, NaCl 1M, EDTA 2mM, TWEEN20 0.02%)를 첨가한다.
- 5초 동안 와동시킴으로써 비드를 혼합한다.
2. 올리고뉴클레오타이드 혼성화
- 올리고뉴클레오타이드의 희석액 제조
완충제 1: 1xSSC 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS) 또는
완충제 2: ULTRAhyb™ 초민감성 혼성화 완충제(Thermo Fisher 카탈로그 번호 AM8670) 또는
완충제 3: ULTRAhyb™-Oligo(Thermo Fisher 카탈로그 번호 AM8663) 또는
완충제 4: 1xSSC + 10% 포마이드 완충제(Formide buffer)(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS, 10% 포마이드) 또는
완충제 5: 1xSSC + 25% 포마이드 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS, 25% 포마이드) 또는
완충제 6: 1xSSC + 48% 포마이드 완충제(5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 5mM EDTA, 0.1% SDS, 48% 포마이드)
프로브 올리고뉴클레오타이드 2 pM
WT 올리고뉴클레오타이드 혼합물 198/199.8 fM
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 믹스 2/0.2 fM
게놈 DNA 380 ng
- 비드 1μL당 50μL의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다
- 95℃에서 5분 동안 및 60℃에서 1/3시간 동안 인큐베이션한다.
WT 올리고뉴클레오타이드 믹스는 서열번호 22 내지 37을 갖는다.
돌연변이체 올리고뉴클레오타이드 믹스는 서열번호 38 내지 53을 갖는다.
3. 비드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
- 비드 및 올리고뉴클레오타이드를 하기 비율로 혼합한다:
40μL의 2x 결합 완충제
10μL의 단계 1로부터의 비드.
50μL의 단계 2로부터의 올리고뉴클레오타이드.
- RT에서 15 rpm으로 30분 동안 회전시킨다.
4. 비드 세척
- 부착 단계를 완료한 후, 샘플을 스핀 다운시키고, 이를 자석에 놓고 7분 동안 대기한다.
- 100μL 상청액 중 80μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액(TrisHCl pH=7.5 20mM, NaCl 0.5M, EDTA 1mM, TWEEN20 0.1%)을 첨가한다.
- 10초 동안 샘플을 와동시키고 이들을 스핀 다운시킨다.
- 샘플을 자석에 놓고 2분 동안 대기한다.
- 120μL 상청액 중 90μL를 제거하고 100μL의 1x 세척 완충액을 첨가한다.
- 자석에서 샘플 위치를 10회 변경하여 샘플을 혼합한다. 2분을 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고, 100μL의 1x 세척 완충제를 첨가한다.
- 자석의 샘플 위치를 10회 변경하여 혼합한다. 2분 대기한다.
- 전체 상청액을 제거하고 자석에서 샘플을 꺼내고 100μL 1xBFF6 완충제(Tris 아세테이트 pH=7.0 10mM, 포타슘 아세테이트 30mM, 마그네슘 아세테이트 17.125mM, TWEEN20 0.01%)를 첨가한다.
- 샘플을 스핀 다운시키고, 자석에 샘플을 놓고 2분 동안 대기한다.
- 1xBFF6 완충제를 제거한다.
5. PPL 반응
- 4℃에서 유지된 비드에 PPL 혼합물을 첨가한다. PPL은 하기 조성으로 구성된다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
20 U/mL 클레나우(엑소-)
2 U/mL 아피라제
0.05mM PPi
총 부피: 20μL
- 40℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 휴지시킨다
6. TIPP 반응
- PPL 반응이 4℃에 도달하면, 다음을 갖는 5μL의 TIPP 혼합물을 첨가한다:
1xBFF6-0.1% Tween-20
16 U/mL TIPP
20μL의 단계 5로부터의 혼합물.
총 부피: 25μL
- 37℃에서 5분, 60℃ 10분 동안 인큐베이션시키고, 60℃에서 휴지시킨다
7. 예비증폭
- 핫 플레이트 상에 유지된 자석 상에 단계 6으로부터의 샘플을 놓고 60℃까지 가열한다.
- 비드를 분리시킨 후, 2μL의 상청액을 취하고 하기 혼합물에 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 4 0.1μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
UDG 10 U/mL
총 부피: 12.5μL
Q5U 완충제
프라이머 믹스 4는 하기로 구성된다:
정방향 프라이머(서열번호 54): 5'-AATGATAACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'
역방향 프라이머(서열번호 55): 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'
- 샘플을 열순환기에 넣고 105℃에서 뚜껑을 덮고 인큐베이션한다
1. UDG 37℃ 1분
2. Int. 변성 98℃ 1분
3. 변성 98℃ 10초
4. 어닐링 63℃ 15초
5. 신장 72℃ 15초
6. 최종 신장 72℃ 5분
7. 냉각 4℃ 유지
- 단계 3 내지 5를 12x 반복하였다
8. dPCR 정량
- 단계 7로부터의 예비증폭을 완료한 후. 하기를 포함하는 반응에 2μL의 단계 7으로부터의 혼합물을 첨가한다:
1x Q5U 버퍼
dNTP 0.4mM
프라이머 믹스 5 또는 6 0.2μM
Q5U 중합효소 20 U/mL
에바그린 염료 2x
Alexa Fluor 700 염료 0.0003 μg/μL
TWEEN20 0.2%
총 부피: 12μL
프라이머 믹스 5는 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 56): 5'-TGGTAATTACCGACGAAAACGGC-3'
역방향 프라이머(서열번호 57): 5'-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3'
프라이머 믹스 6은 하기를 갖는다:
정방향 프라이머(서열번호 58): 5'-TGATTTCCGTGCGTCTGAATGC-3'
역방향 프라이머(서열번호 59): 5'-ATGCTGCCGTAGCGTGTTTCG-3'
- 105℃의 뚜껑이 있는 QIAcuity 디지털 PCR 시스템에 샘플을 놓는다
1. Int. 변성 98℃ 1분
2. 변성 98℃ 10초
3. 어닐링 63℃ 15초
4. 신장 72℃ 15초
5. 최종 신장 72℃ 5분
6. 냉각 35℃ 1분
- 단계 2 내지 4를 30회 반복하였다
- 노출 지속 시간이 각각 600 및 700 ms인 녹색 및 노란색 채널의 파티션 사진을 찍고 각각 6 및 8을 얻는다. 이러한 실험으로부터 수득된 데이터는 도 8에 도시되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> BIOFIDELITY
<120> NUCLEIC ACID ENRICHMENT AND DETECTION
<130> BIOFI-40018.601
<150> GB 2105405.1
<151> 2021-04-15
<150> GB 2105388.9
<151> 2021-04-15
<150> GB 2111381.6
<151> 2021-08-06
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
tttttttttt ttttttttac cttatacacc gtgccgaacg caccggagcc cagcactttg 60
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
gcctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
cccaaccaag ctctcttgag gatcttg 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
gggaccttac cttatacacc gtgccg 26
<210> 6
<211> 89
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
catctgcctc acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct 60
ggactatgtc cgggaacaca aagacaata 89
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
cgtactggtg aaaacaccgc aggctcatca tgcagctcat gcccttcggc tgcctcctgg 60
actggaagag aaagaatacc atgcagaagg 90
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
tttttttttt tttttttttt tccaggaggc agccgaaggg catgagctgc atgatg 56
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 9
gcctccctcg cgccatcagc atctgcctca cctccaccg 39
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 10
gccttgccag cccgctcaga tattgtcttt gtgttcccgg a 41
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 11
acgtactggt gaaaacaccg cag 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 12
gcctccttct gcatggtatt cttt 24
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 13
tttttttttt tttttttttt tccaggaggc agccgaaggg catgagctgc atgatg 56
<210> 14
<211> 145
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ctggtccctc attgcactgt actcccatct gcctcacctc caccgtgcag ctcatcacgc 60
agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac aatatgtgtc 120
gagaatatcc aagagacagg tttct 145
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ctggtccctc attgcactgt actccacgta ctggtgaaaa caccgcaggc tcatcatgca 60
gctcatgccc ttcggctgcc tcctggactg gaagagaaag aataccatgc agaaggaggc 120
gtgtcgagaa tatccaagag acaggtttct 150
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 16
agaaacctgt ctcttggata ttctcgacac 30
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 17
ctggtccctc attgcactgt actcc 25
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 18
gccttgccag cccgctcaga tattgtcttt gtgttcccgg ac 42
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 19
gcctccctcg cgccatcagc atctgcctca cctccaccg 39
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 20
acgtactggt gaaaacaccg cag 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 21
gcctccttct gcatggtatt cttt 24
<210> 22
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggtaattacc gacgaaaacg gcccgtgcag 60
ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga accgcaagac 120
tgtaaccacg cgtatctcgt atgccgtctt ctgcttg 157
<210> 23
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
caagcagaag acggcatacg agatacgcgt ggttacagtc ttgcggttcc cggacatagt 60
ccaggaggca gccgaagggc atgagctgcg tgatgagctg cacgggccgt tttcgtcggt 120
aattaccagt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 157
<210> 24
<211> 160
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgaaagctgg ctacaggaag gctcaaaaag 60
atcaaagtgc tgggctccgg tgcgttcggc acggtgtata aggtaaggtc ccaatattga 120
aacccacggc atggtgatct cgtatgccgt cttctgcttg 160
<210> 25
<211> 160
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
caagcagaag acggcatacg agatcaccat gccgtgggtt tcaatattgg gaccttacct 60
tatacaccgt gccgaacgca ccggagccca gcactttgat ctttttgagc cttcctgtag 120
ccagctttca tgtgtagatc tcggtggtcg ccgtatcatt 160
<210> 26
<211> 146
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc agccgccgcg gtaagatcac agattttggg 60
ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa gaataccatg cagagaattg gcgggggagc 120
acatctcgta tgccgtcttc tgcttg 146
<210> 27
<211> 146
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
caagcagaag acggcatacg agatgtgctc ccccgccaat tctctgcatg gtattctttc 60
tcttccgcac ccagcagttt ggccagccca aaatctgtga tcttaccgcg gcggctggtg 120
tagatctcgg tggtcgccgt atcatt 146
<210> 28
<211> 160
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg gaagtgaaaa gtcgtaacaa ggcatgattt 60
tggtctagct acagtgaaat ctcgatggag tgggtcccat cagtttgaac agttctgcat 120
cgatgaagaa cgcagcatct cgtatgccgt cttctgcttg 160
<210> 29
<211> 160
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
caagcagaag acggcatacg agatgctgcg ttcttcatcg atgcagaact gttcaaactg 60
atgggaccca ctccatcgag atttcactgt agctagacca aaatcatgcc ttgttacgac 120
ttttcacttc cgtgtagatc tcggtggtcg ccgtatcatt 160
<210> 30
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggcgctgttt ggtctcttag ccaggaagca 60
tacgtgatgg ctggtgtggg ctccccatat gtctcccgcc ttctgggcat caggaatcat 120
tagcggtagc gaatctcgta tgccgtcttc tgcttg 156
<210> 31
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
caagcagaag acggcatacg agattcgcta ccgctaatga ttcctgatgc ccagaaggcg 60
ggagacatat ggggagccca caccagccat cacgtatgct tcctggctaa gagaccaaac 120
agcgcctgtg tagatctcgg tggtcgccgt atcatt 156
<210> 32
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg agccggtagt gttgaaagga ggtccatcat 60
ctctgcggtg gttggcattc tgctggtcgt ggtcttgggg gtggtctttg gctttgcctg 120
cactcattga aggatctcgt atgccgtctt ctgcttg 157
<210> 33
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
caagcagaag acggcatacg agatccttca atgagtgcag gcaaagccaa agaccacccc 60
caagaccacg accagcagaa tgccaaccac cgcagagatg atggacctcc tttcaacact 120
accggctcgt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 157
<210> 34
<211> 155
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggctcaggaa gaacgcagtt gtggtagttg 60
gagctggtgg cgtaggcaag agtgccttga cgatacagct aattcagatg gagcatgtgg 120
tttaattgcg aatctcgtat gccgtcttct gcttg 155
<210> 35
<211> 155
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
caagcagaag acggcatacg agattcgcaa ttaaaccaca tgctccatct gaattagctg 60
tatcgtcaag gcactcttgc ctacgccacc agctccaact accacaactg cgttcttcct 120
gagccagtgt agatctcggt ggtcgccgta tcatt 155
<210> 36
<211> 170
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc cttggtcatt tagaggaagt ggctactggt 60
ccctcattgc actgtactcc tcttgacctg ctgtgtcgag aatatccaag agacaggttt 120
ctccatgcat cgatgaagaa cgcagcatct cgtatgccgt cttctgcttg 170
<210> 37
<211> 170
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
caagcagaag acggcatacg agatgctgcg ttcttcatcg atgcatggag aaacctgtct 60
cttggatatt ctcgacacag caggtcaaga ggagtacagt gcaatgaggg accagtagcc 120
acttcctcta aatgaccaag ggtgtagatc tcggtggtcg ccgtatcatt 170
<210> 38
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gatttccgtg cgtctgaatg cccgtgcagc 60
tcatcatgca gctcatgccc ttcggctgcc tcctggacta tgtccgggaa ccgaaacacg 120
ctacggcagc atatctcgta tgccgtcttc tgcttg 156
<210> 39
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
caagcagaag acggcatacg agatatgctg ccgtagcgtg tttcggttcc cggacatagt 60
ccaggaggca gccgaagggc atgagctgca tgatgagctg cacgggcatt cagacgcacg 120
gaaatcagtg tagatctcgg tggtcgccgt atcatt 156
<210> 40
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttgaaaatgg tctgctgctg ttcaaaaaga 60
tcaaagtgct ggcctccggt gcgttcggca cggtgtataa ggtaaggtcc ctctgtggtg 120
gatgaagcca ataatctcgt atgccgtctt ctgcttg 157
<210> 41
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
caagcagaag acggcatacg agattattgg cttcatccac cacagaggga ccttacctta 60
tacaccgtgc cgaacgcacc ggaggccagc actttgatct ttttgaacag cagcagacca 120
ttttcaacgt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 157
<210> 42
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cggtaattcc agctccaagt gatcacagat 60
tttgggcgtg ccaaactgct gggtgcggaa gagaaagaat accatgcaga gagaggtgca 120
aattctggga tctatctcgt atgccgtctt ctgcttg 157
<210> 43
<211> 157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
caagcagaag acggcatacg agatagatcc cagaatttgc acctctctct gcatggtatt 60
ctttctcttc cgcacccagc agtttggcac gcccaaaatc tgtgatcact tggagctgga 120
attaccgcgt gtagatctcg gtggtcgccg tatcatt 157
<210> 44
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg catcgatgaa gaacgcagct gattttggtc 60
tagctacaga gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg tcgcatatca 120
ataagcggag gaatctcgta tgccgtcttc tgcttg 156
<210> 45
<211> 156
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
caagcagaag acggcatacg agattcctcc gcttattgat atgcgacaac tgttcaaact 60
gatgggaccc actccatcga gatttctctg tagctagacc aaaatcagct gcgttcttca 120
tcgatgcgtg tagatctcgg tggtcgccgt atcatt 156
<210> 46
<211> 155
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggctagtggc attctgatgc ggaagcatac 60
gtgatggctg tgtgtgtggg ctccccatat gtctcccgcc ttctgggcat gcaagggcgg 120
ctaaagtatc aatctcgtat gccgtcttct gcttg 155
<210> 47
<211> 155
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
caagcagaag acggcatacg agattgatac tttagccgcc cttgcatgcc cagaaggcgg 60
gagacatatg gggagcccac acacacagcc atcacgtatg cttccgcatc agaatgccac 120
tagccagtgt agatctcggt ggtcgccgta tcatt 155
<210> 48
<211> 159
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gcaatgagga ccggtatatc tctgtccatc 60
atctctgcgg tggaaggcat tctgctggtc gtggtcttgg gggtggtctt tggtggaata 120
ttaacacggg cgtgcatctc gtatgccgtc ttctgcttg 159
<210> 49
<211> 159
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
caagcagaag acggcatacg agatgcacgc ccgtgttaat attccaccaa agaccacccc 60
caagaccacg accagcagaa tgccttccac cgcagagatg atggacagag atataccggt 120
cctcattgca gtgtagatct cggtggtcgc cgtatcatt 159
<210> 50
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg aggacaggat tagatacccg gttgtggtag 60
ttggagcttg tggcgtaggc aagagtgcct tgacgataca gctaattcag aggaaggtgg 120
ggatgacgta tctcgtatgc cgtcttctgc ttg 153
<210> 51
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
caagcagaag acggcatacg agatacgtca tccccacctt cctctgaatt agctgtatcg 60
tcaaggcact cttgcctacg ccacaagctc caactaccac aaccgggtat ctaatcctgt 120
cctcgtgtag atctcggtgg tcgccgtatc att 153
<210> 52
<211> 165
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ctcaggaaga acgctggtac tggtccctca 60
ttgcactgta ctcctcgtga cctgctgtgt cgagaatatc caagagacag gtttctccat 120
cgaagtacat gtgtagcggt gatctcgtat gccgtcttct gcttg 165
<210> 53
<211> 165
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
caagcagaag acggcatacg agatcaccgc tacacatgta cttcgatgga gaaacctgtc 60
tcttggatat tctcgacaca gcaggtcacg aggagtacag tgcaatgagg gaccagtacc 120
agcgttcttc ctgagcgtgt agatctcggt ggtcgccgta tcatt 165
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 54
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 55
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 56
tggtaattac cgacgaaaac ggc 23
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 57
acgcgtggtt acagtcttgc g 21
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 58
tgatttccgt gcgtctgaat gc 22
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
atgctgccgt agcgtgtttc g 21
Claims (82)
- 방법으로서, 샘플을 프로브 및 가피로인산분해(pyrophosphorolysis) 반응 시약과 접촉시키는 단계; 및 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자에 대한 상기 프로브의 차등 상보성(differential complementarity)에 기반하여 제2 핵산 분자에 비해 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 방법으로서, 샘플에서 제2 핵산 분자에 비해 제1 핵산 분자의 표적 영역과 상보적으로 상이한 프로브와 상기 샘플을 접촉시키고; 가피로인산분해 반응을 수행하고; 상기 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시킴으로써 핵산 분자들의 혼합물을 포함하는 샘플에서 제1 핵산 분자를 농축시키거나 고갈시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키는 방법으로서, a) 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하는 샘플을, 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열과 상보적으로 상이한 프로브에 노출시키는 단계; b) 가피로인산분해 반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 제2 핵산 서열에 비해 상기 제1 핵산 서열을 농축시키거나 고갈시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 샘플은 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하며, 상기 방법은
a. 하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0를 포함하는 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, 상기 프로브는 상기 제1 서열 또는 제2 서열 중 하나와 더 큰 상보성 및 다른 하나와 더 작은 상보성을 갖는, 상기 샘플을 도입하는 단계;
b. 단계 (a)에 의해 생성된 반응 혼합물을,
i. 가피로인산분해 효소; 및
ii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제2 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, A0은 적어도 부분적으로 이중-가닥 중간 생성물을 생성하기 위해 상기 핵산 서열들 중 적어도 하나에 더 잘 어닐링되되, A0은 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하며, A0은 이의 3'-말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되며, 다른 서열에 대해 더 적은 정도로 어닐링된 임의의 A0은 더 적은 정도로 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되는, 상기 반응 혼합물을 도입하는 단계;
c. 하기에 의해 어닐링된 임의의 A0 서열 복합체들을 분리시키는 단계:
i. 상기 복합체의 가닥들을 상기 가피로인산분해 반응의 결과로서 분리시키는 것; 또는
ii. 상기 반응 혼합물을 상기 복합체의 가닥들이 분리하기에 충분하지만 더 적은 정도로 어닐링된 임의의 A0의 가닥들이 분리하기에 필요한 온도 미만인 온도로 가열하는 것; 및
d. A0에 어닐링되지 않은 임의의 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 핵산 서열을 분리시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제4항에 있어서, 상기 제1 반응 혼합물과 상기 제2 반응 혼합물이 배합되어, 단계 (a)의 상기 제1 반응 혼합물이 가피로인산분해 효소 및 피로포스페이트 이온의 공급원을 추가로 포함하게 하는, 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (d)에서의 상기 분리는 단계 (a) 전 또는 후에 고체 지지체 상으로의 A0의 포획을 통해 수행되는, 방법.
- 제6항에 있어서, A0은 상기 서열들 중 어느 하나와 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 추가로 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 고체 지지체 상으로의 포획이, A0의 5' 꼬리 영역을, A0에 대한 혼성화 전 또는 후에 상기 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 포함하는 또 다른 올리고 C0에 혼성화함으로써 수행되는, 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, A0은 상기 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 바이오틴이며, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함하는, 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 비드는 자성 또는 상자성 비드인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세척 단계가 상기 단계들 중 하나 이상 사이에서 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 핵산 분석물의 어댑터 태깅된 라이브러리인, 방법.
- 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d) 후에, A0에 어닐링된 채로 남아 있는 핵산, 또는 A0에 어닐링되지 않은 핵산이 확인되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 서열은 증폭에 의해 확인되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 서열은 마이크로어레이 분석에 의해 확인되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 서열은 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 서열은 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)(NGS)에 의해 확인되는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각이 상이한 표적 서열에 어닐링하도록 설계된 상이한 서열을 갖는 다수의 상이한 프로브 올리고뉴클레오타이드가 사용되며, 다수의 표적 서열의 농도가 비-표적 서열에 비해 동시에 증가하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 상이한 프로브 올리고뉴클레오타이드는 인간 건강의 진단, 치료 또는 모니터링과 관련된 유전적 변이체를 포함하는 인간 게놈의 서열에 어닐링되는 서열을 갖는, 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 (d) 후, 상기 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재가 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출되거나 이에 의해 보유된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 이에 의해 질환 또는 병태의 존재 또는 부재가 추론되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 (d) 후, 상기 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재가 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출되거나 이에 의해 보유된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 이에 의해 질환 또는 병태에 대한 적절한 치료가 추론되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 (d) 후, 상기 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재가 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출되거나 이에 의해 보유된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 이에 의해 특정 질환 또는 병태 치료에 대한 환자의 반응이 추론되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 (d) 후, 상기 샘플 분석물에서 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재가 A0에 어닐링되고 후속하여 이로부터 방출되거나 이에 의해 보유된 핵산 서열의 확인을 통해 추론되며, 하나 이상의 환자 치료 결정이 상기 유전적 변이체의 존재 또는 부재에 기반하여 이루어지는, 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간 혈액 또는 조직 샘플인, 방법.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 암인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 암이 폐암, 결장암, 위암, 자궁내막암, 난소암, 간담도암, 요로암, 뇌암, 및 피부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 키트로서,
a) 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 A0으로서, 공지된 제2 서열보다 공지된 제1 서열에 대해 더 큰 상보성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 올리고뉴클레오타이드 A0;
b) 하나 이상의 가피로인산분해 효소; 및
c) 피로포스페이트 이온의 하나 이상의 공급원
을 포함하는, 키트. - 제29항에 있어서, 가피로인산분해 반응 후 상기 프로브에 대해 더 적은 상보성을 갖는 핵산 분자로부터 상기 프로브에 대해 더 큰 상보성을 갖는 표적 핵산 분자를 분리시키는 표적 핵산 단리 성분을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항에 있어서, 하나 이상의 고체 지지체를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 완충제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, A0이 공지된 제1 서열 또는 공지된 제2 서열과 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, A0이 포획 모이어티를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 포획 모이어티를 포함하는 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오타이드 C0을 추가로 포함하고, A0의 5' 꼬리 영역이 C0의 영역과 상보적인, 키트.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 바이오틴이며, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함하는, 키트.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 포획 올리고뉴클레오타이드 C0를 포함하며, A0의 5' 꼬리 영역이 C0의 영역과 상보적인, 키트.
- 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드인, 키트.
- 제38항에 있어서, 상기 비드는 자성 또는 상자성 비드인, 키트.
- 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 후성적 변형 민감성 또는 의존성 제한 효소를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 트랜스포솜을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 Cas9를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 트랜스포사제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 리가제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 키트.
- 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 차단 올리고뉴클레오타이드는 가피로인산분해에 내성인, 키트.
- 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 차세대 시퀀싱(NGS) 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 키트가 DNA 라이브러리 제조 키트를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분자 프로브를 추가로 포함하는, 키트.
- 제51항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 프로브는 형광 표지된, 키트.
- 제29항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 크라우딩제(crowding agent)를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 세제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 용매를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포하이드롤라제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 피로포스파타제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, A0은 인간 게놈의 야생형 서열과 상보적이고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자와 상보적이지 않은 서열을 갖는, 키트.
- 제29항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, A0은 인간 게놈의 야생형 서열과 상보적이지 않고 상기 야생형 서열의 돌연변이체 대립유전자와 상보적인 서열을 갖는, 키트.
- 제29항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 cDNA로의 전사를 위한 성분을 추가로 포함하는, 키트.
- 제29항 내지 제60항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
- 샘플에서 표적 핵산의 농축 또는 고갈을 위한, 제29항 내지 제60항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
- 반응 혼합물로서,
a) 샘플;
b) 가피로인산분해 농도의 가피로인산분해 시약;
c) 프로브에 혼성화된 상기 샘플로부터의 제1 핵산 분자로서, 상기 프로브는 제2 핵산보다 제1 핵산 분자에 대해 더 큰 상보성을 갖는, 상기 제1 핵산 분자; 및
d) 상기 프로브에 혼성화된 상기 샘플로부터의 제2 핵산 분자
를 포함하는, 반응 혼합물. - 반응 혼합물로서,
a) 샘플;
b) 가피로인산분해 농도의 가피로인산분해 시약; 및
c) 상기 반응 혼합물의 제1 영역에 있는 제1 핵산 분자로서, 상기 샘플에서 상기 제1 핵산의 농도보다 상기 제1 영역에서 더 높은 농도를 갖는, 상기 제1 핵산 분자
를 포함하는, 반응 혼합물. - 반응 혼합물로서,
a) 샘플;
b) 가피로인산분해 농도의 가피로인산분해 시약; 및
c) 상기 반응 혼합물의 제1 영역에 있는 제1 핵산 분자로서, 상기 샘플에서 상기 제1 핵산의 농도보다 상기 제1 영역에서 더 낮은 농도를 갖는, 상기 제1 핵산 분자
를 포함하는, 반응 혼합물. - 샘플에서 제2 핵산 서열에 대한 제1 핵산 서열의 비율을 변경시키기 위한 방법으로서, 상기 샘플은 적어도 제1 서열 및 제2 서열을 포함하며, 상기 방법은
a. 하나 이상의 핵산 분석물을 포함하는 샘플을,
i. 프로브가 상기 제1 서열 및 제2 서열 중 하나에 대해서 다른 하나에 비하여 더 큰 상보성을 갖는, 단일-가닥 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0,
ii. 가피로인산분해 효소, 및
iii. 피로포스페이트 이온의 공급원
을 포함하는 제1 반응 혼합물에 도입하는 단계로서, A0은 적어도 부분적으로 이중 가닥 중간 생성물을 생성하되, A0의 3' 말단은 상기 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하며, A0은 3' 말단으로부터 3'-5' 방향으로 가피로인산분해되며, 상기 제2 서열에 덜 어닐링된 임의의 A0은 3'-5' 방향으로 더 적은 정도로 가피로인산분해되는, 상기 샘플을 도입하는 단계;
b. 상기 제1 서열에 어닐링된 임의의 단축된 A0 서열 복합체를 선택적으로 변성시키는 단계; 및
c. A0에 어닐링되지 않은 제1 핵산 서열로부터, A0, 및 이에 의해 그에 어닐링된 채로 남아 있는 임의의 제2 핵산 서열을 분리시킴으로써, 상기 제2 핵산 서열에 대한 상기 제1 핵산 서열의 비율을 변경시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제66항에 있어서, 이중-가닥 복합체를 형성하기 위해 상기 제1 핵산 서열에 어닐링되는 A0은 A0와 상기 제1 핵산 서열 간에 안정한 이중체(duplex)가 존재하기에 불충분한 상보성이 남아 있는 정도로 가피로인산분해되되, A0 및 핵산 서열은 변성되는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 선택적 변성이 상기 반응 혼합물을 가열하는 것을 포함하는, 방법.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 변성이 상기 반응의 pH를 상승시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성은 상기 반응 혼합물의 염 농도를 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체 상으로의 A0의 포획은 단계 (a) 전에 일어나는, 방법.
- 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체 상으로의 A0의 포획은 단계 (a) 후에 일어나는, 방법.
- 제66항에 있어서, A0이 상기 서열들 중 어느 하나와 상보적이지 않은 5' 꼬리 영역을 추가로 포함하는, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 고체 지지체 상으로의 포획은, A0의 5' 꼬리 영역을, A0에 대한 혼성화 전 또는 후에 상기 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 포함하는 또 다른 올리고 C0에 혼성화함으로써 수행되는, 방법.
- 제74항에 있어서, A0은 상기 고체 지지체에 결합되는 포획 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
- 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 바이오틴이며, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함하는, 방법.
- 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드인, 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 비드는 자성 또는 상자성 비드인, 방법.
- 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 핵산 분석물의 라이브러리인, 방법.
- 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후, A0에 어닐링된 채로 남아 있는 핵산이 확인되는, 방법.
- 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후, A0에 어닐링되지 않은 핵산이 확인되는, 방법.
- 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 각각이 상이한 표적 서열에 어닐링하도록 설계된 상이한 서열을 갖는 다수의 상이한 프로브 올리고뉴클레오타이드 A0이 사용되며, 다수의 표적 서열의 농도가 비-표적 서열에 비해 동시에 증가되거나 감소되는, 방법.
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