ES2874753T3 - Método mejorado de detección de secuencia de polinucleótidos - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico determinado, caracterizado por las etapas de: a. hibridar el analito con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla, que comprende un extremo 3' que es perfectamente complementario a la secuencia del polinucleótido diana, para crear un primer producto intermedio en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito; b. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito, en el que cuando A0 se hibrida erróneamente con una secuencia no diana, la reacción de pirofosforólisis se detiene ante cualquier emparejamiento erróneo, evitando que continúen las etapas posteriores del método; en el que la reacción de pirofosforólisis de (b) continúa hasta que A1 carece de complementariedad suficiente con el analito o una región diana en el mismo para formar un dúplex estable y se separa del mismo; c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B, en la que B está compuesto por una región oligonucleotídica complementaria al extremo 3' de A1 con una región oligonucleotídica flanqueante en su extremo 5' que no es sustancialmente complementario de A0; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C de sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2; en el que la ligación se realiza mediante la adición de un oligonucleótido D de puente adicional con el que A1 se hibrida antes de la ligación, en el que D comprende una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1 y una región complementaria al extremo 5' del oligonucleótido C o al extremo 5' de A1; d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2; y e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.

Description

DESCRIPCIÓN
Método mejorado de detección de secuencia de polinucleótidos
Esta invención se refiere a un método mejorado de detección de secuencias de polinucleótidos adecuado para probar la presencia de un gran número de marcadores de diagnóstico, incluidos los utilizados en la identificación de cáncer, enfermedades infecciosas y rechazo de órganos trasplantados. También es útil para pruebas de diagnóstico complementarias en las que se debe identificar un panel de marcadores de manera confiable y a bajo coste.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica bien conocida y poderosa para amplificar el ADN o ARN presente en muestras de laboratorio y de diagnóstico hasta un punto en el que pueden detectarse y/o cuantificarse de forma fiable. Sin embargo, cuando se aplica con el propósito de investigar muestras de analitos que contienen niveles bajos de tales moléculas, adolece de una serie de limitaciones. En primer lugar, aunque la técnica puede detectar tan solo una única molécula diana, es propensa a generar resultados falsos positivos debido a la amplificación no deseada de otras secuencias de ácido nucleico presentes en la muestra. Esto hace la elección de cebadores oligonucleotídicos usados para iniciar la reacción clave; lo que a su vez hace que el diseño de cebadores con el nivel requerido de especificidad sea relativamente complejo. Como consecuencia, muchas pruebas basadas en PCR disponibles en el mercado hoy en día tienen una especificidad limitada.
Un segundo inconveniente es que la multiplexación de métodos basados en PCR está limitada en la práctica a un máximo de decenas de secuencias diana (frecuentemente no más de 10) con la evitación de interacciones cebadorcebador dando como resultado la necesidad de ventanas operativas relativamente estrechas.
Otro problema es que, debido a que los ciclos de reacción de PCR de forma exponencial, la cuantificación de la diana es difícil; pequeñas variaciones en la eficiencia de la reacción que tienen un gran impacto en la cantidad de material detectable generado. Incluso con los controles y calibraciones adecuados en su lugar, la cuantificación generalmente se limita a una precisión dentro de un factor de alrededor de 3.
Finalmente, las mutaciones en la región destinada a la investigación mediante métodos de amplificación por PCR pueden tener efectos secundarios no deseados. Por ejemplo, ha habido casos en los que las pruebas aprobadas por la FDA tuvieron que retirarse porque el organismo diana sufrió una mutación en la región genética diana de los cebadores de prueba, lo que resultó en un gran número de falsos negativos. Por el contrario, si un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) específico se dirige para la amplificación, el método de PCR a menudo dará un falso positivo cuando la variante de tipo silvestre está presente. Evitar esto requiere un diseño de cebador muy cuidadoso y limita aún más la eficacia de la multiplexación. Esto es particularmente relevante cuando se buscan paneles de SNP, ya que es un requisito común en las pruebas/exámenes de detección del cáncer o en los diagnósticos complementarios.
El documento US2006/110765 A1 (Wang et al) enseña la escisión enzimática en un emparejamiento erróneo, que es típicamente una reacción ineficaz y no muy específica. Además, la hibridación fuera de la diana de las sondas como se divulgó en Wang et al con secuencias similares en una muestra daría como resultado resultados falsos positivos debido al uso de escisión en los emparejamientos erróneos. Tampoco sería posible distinguir entre dos variantes genéticas diferentes en las mismas posiciones o casi vecinas, ya que todas darían como resultado la escisión y amplificación de la misma sonda. Por lo tanto, las enseñanzas de Wang et al darían como resultado una baja sensibilidad y especificidad del esquema de reacción. Por el contrario, el efecto técnico del método divulgado por la presente invención proporciona un método rápido y eficaz con alta especificidad para el ADNcd, que puede bloquearse eficazmente mediante un emparejamiento erróneo. Además, el método de la presente invención es extremadamente específico para la variante genética diana, lo que permite la discriminación entre diferentes variantes en la misma posición o en posiciones próximas.
El documento US2009/239283 A1 (Liu et al) enseña el uso de extremos 3' no extensibles que se eliminan mediante pirofosforólisis, lo que requiere la ingeniería genética de polimerasas personalizadas capaces de eliminar la modificación de bloqueo 3'. Por el contrario, la presente invención utiliza la actividad pirofosforólisis natural inherente a las polimerasas existentes y no utiliza modificaciones de bloqueo 3'. El método divulgado en Liu et al también se basa en la eliminación de solo la base terminal de una fracción de la sonda para permitir la amplificación posterior, y está limitado a esta realización mediante el uso de la modificación de bloqueo 3'. Por el contrario, los métodos divulgados en la presente invención permiten realizaciones en las que se requiere la eliminación progresiva de múltiples bases de la sonda para desencadenar la reacción, haciéndola sustancialmente más robusta para la hibridación transitoria fuera de la diana, ya sea con el ADN de fondo o con otras sondas, lo que puede provocar la extracción no deseada de la base del terminal.
Resumen de la invención
Ahora hemos desarrollado un nuevo método que se basa en nuestra experiencia utilizando el método de pirofosforólisis empleado en nuestras patentes de secuenciación anteriores (véase, por ejemplo, el documento WO 2016012789) para superar muchas de estas limitaciones. Al hacerlo, aprovecha la especificidad de doble cadena de la pirofosforólisis; una reacción que no procederá eficazmente con sustratos de oligonucleótidos de cadena sencilla o sustratos de cadena doble que incluyen grupos bloqueantes o emparejamientos erróneos de nucleótidos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico dado, caracterizado por las etapas de:
a. hibridación del analito con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla, que comprende un extremo 3' que es perfectamente complementario a la secuencia del polinucleótido diana, para crear un primer producto intermedio en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. pirofosforilizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito, en el que cuando A0 se hibrida erróneamente con una secuencia no diana, la reacción de pirofosforólisis se detiene ante cualquier emparejamiento erróneo, evitando que continúen las etapas posteriores del método;
en el que la reacción de pirofosforólisis de (b) continúa hasta que A1 carece de complementariedad suficiente con el analito o una región diana en el mismo para formar un dúplex estable y se separa del mismo;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B, en la que B está comprendido por una región oligonucleotídica complementaria al extremo 3' de A1 con una región oligonucleotídica flanqueante en su extremo 5' que no es sustancialmente complementario de A0 ; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2;
en el que la ligación se realiza mediante la adición de un oligonucleótido D de puente adicional con el que A1 se hibrida antes de la ligación, en el que D comprende una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1 y una región complementaria al extremo 5' del oligonucleótido C o al extremo 5' de A1;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ellas la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
Los analitos a los que se puede aplicar el método de la invención son aquellos ácidos nucleicos, tales como moléculas de ADN o ARN naturales o sintéticas, que incluyen la secuencia o secuencias de polinucleótidos diana que se buscan. En una realización, el analito estará presente típicamente en una solución acuosa que lo contiene y otro material biológico y en una realización el analito estará presente junto con otras moléculas de ácido nucleico de trasfondo que no son de interés para los propósitos de la prueba. En algunas realizaciones, el analito estará presente en cantidades bajas en relación con estos otros componentes de ácido nucleico. Preferiblemente, por ejemplo, cuando el analito se deriva de una muestra biológica que contiene material celular, antes de realizar la etapa (a) del método, algunos o todos estos otros ácidos nucleicos y material biológico extraño se habrán eliminado utilizando técnicas de preparación de muestras tales como filtración, centrifugación, cromatografía o electroforesis. De manera adecuada, el analito se deriva de una muestra biológica tomada de un sujeto mamífero (especialmente un paciente humano) tal como sangre, plasma, esputo, orina, piel o una biopsia. En una realización, la muestra biológica se someterá a lisis para que el analito se libere al romper cualquier célula presente. En otras realizaciones, el analito ya puede estar presente en forma libre dentro de la propia muestra; por ejemplo, ADN libre de células que circula en sangre o plasma.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Imagen de electroforesis en gel de los productos de reacción del Ejemplo 1. Se puede ver que en presencia del oligonucleótido 2, el oligonucleótido 1 se degrada a la longitud a la que se funde del oligonucleótido 2, dejando un oligonucleótido acortado de aproximadamente 50 nucleótidos en longitud. Por el contrario, en presencia del oligonucleótido 3, no se observa pirofosforólisis debido al emparejamiento erróneo de un solo nucleótido en el extremo 3' del oligonucleótido 1. En presencia de los oligonucleótidos 4-6, la pirofosforólisis del oligonucleótido 1 avanza a la posición del emparejamiento erróneo de una sola base en cuyo punto se detiene, dejando un oligonucleótido acortado que no se degrada más.
Figura 2: Imagen de electroforesis en gel de los productos de reacción del Ejemplo 2. Se puede ver que el oligonucleótido acortado (oligonucleótido 1) se circulariza eficazmente mediante la reacción de ligación y sobrevive a la digestión posterior con exonucleasa, mientras que el oligonucleótido no acortado (oligonucleótido 2) no se circulariza y se digiere de manera eficiente.
Figura 3: Imagen de electroforesis en gel de los productos de reacción del Ejemplo 3. Puede verse que cuando el oligonucleótido acortado estaba presente y circularizado, en el Ejemplo 2 se produce una gran cantidad de producto mediante esta amplificación. Por el contrario, cuando el oligonucleótido no acortado estaba presente en el Ejemplo 2 y no tuvo lugar circularización, no hubo amplificación observable del ADN.
Figura 4: Trazas de fluorescencia medidas como se describe en el Ejemplo 4. Puede verse que la pirofosforólisis procede en presencia de pirofosfato o imidodifosfato, pero no en su ausencia. De manera similar, en un experimento comparativo en el que no había polimerasa presente, no se generó señal fluorescente. La pirofosforólisis en presencia de pirofosfato produce nucleótidos trifosfatos libres, mientras que la pirofosforólisis en presencia de imidodifosfato produce nucleótidos trifosfatos libres modificados con un grupo NH en lugar de O entre los fosfatos beta y gamma (2'-desoxinucleósido-5'-[(p, y)-imido]trifosfatos)
Figura 5: El pico de fusión da como resultado productos de amplificación producidos de la amplificación de círculo rodante, Ejemplo 5, usando cebadores para tres mutaciones diferentes que pueden ocurrir en el gen EGFR: (i) T790M (exón 20), (ii) C797S (exón 20) y (iii) L861Q (exón 21). La temperatura se elevó a 95 °C, con mediciones tomadas a intervalos de 0,5 °C. En (iv), la posición del pico de fusión puede usarse para identificar qué mutación, es decir, T790M, C797S o L861Q está presente.
Figura 6: La señal sobre tipo silvestre (WT) da como resultado la detección de 10 plex de un solo pocillo de mutaciones del Exon19 del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) al 0,1 % y al 0,5 % de frecuencia de alelos mutantes (MAF) como se describe en el Ejemplo 7.
Figura 7: La señal sobre el tipo silvestre da como resultado dos colores para la detección simultáneas e identificación de las mutaciones de EGFR de T790M (i) y C797S (ii) al 0,1 % y al 1 % en un solo pocillo como se describe en el Ejemplo 7.
Figura 8: (i) señal sobre el tipo silvestre observado en presencia de la mutación EGFR L858R de las sondas de ensayo y control como se describe en el Ejemplo 8 y (ii) el resultado de la sustracción de la señal de la sonda de control de la sonda de ensayo para cada muestra.
Figura 9: Una realización de las etapas a b del método de la invención. En la etapa a, un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla se hibrida con una secuencia de polinucleótidos diana para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia del polinucleótido diana. En esta realización simplificada de la invención, hay dos moléculas de A0 presentes y una secuencia de polinucleótidos diana, para ilustrar cómo A0 que no se ha hibridado con una diana no participa en las etapas posteriores del método. En este ejemplo ilustrativo de la etapa a, el extremo 3' de A0 se hibrida con la secuencia de polinucleótidos diana, mientras que el extremo 5' de A0 no lo hace. El extremo 5' de A0 comprende un grupo de bloqueo químico 5', una secuencia de cebado común y una región de código de barras. En la etapa b, el primer producto intermedio parcialmente de cadena doble se pirofosforiliza con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear una cadena A1 parcialmente digerida, el analito y la molécula A0 no digerida que lo hizo no recocido a una diana en la etapa a.
Figura 10: Una realización de las etapas c (i) y d del método de la invención. En la etapa c (i), A1 se hibrida con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y la cadena A1 se extiende en la dirección 5'-3' contra B para crear un oligonucleótido A2. En este ejemplo ilustrativo, el oligonucleótido desencadenante B tiene un bloque químico 5'. El A0 no digerido de la etapa b del método se hibrida con el oligonucleótido desencadenante B, sin embargo, no puede extenderse en la dirección 5'-3' contra B para generar secuencias que son la diana de los cebadores de amplificación de la etapa d. En la etapa d, se ceba A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
Figura 11: Una realización de las etapas c (ii) y d del método de la invención. En la etapa c (ii), A1 se hibrida con un oligonucleótido D de puente y luego se circulariza mediante ligación de sus extremos 3' y 5'. En la etapa d, el A2 ahora circularizado se ceba con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2. En este ejemplo ilustrativo, el oligonucleótido D de puente no puede extenderse contra A1 en virtud de una modificación 3' (química en esta ilustración) o mediante un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre el extremo 3' de D y la región correspondiente de A2.
En la etapa d, se ceba A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
Figura 12: Una realización de las etapas c (iii) y d del método de la invención. En la etapa c (iii), la región 3' de un oligonucleótido D del puente se hibrida con la región 3' de A1 mientras que la región 5' del oligonucleótido D de la puente se hibrida con la región 5' de una sonda de ligación C. Por lo tanto, se forma un segundo producto intermedio A2 comprendido de A1, C y, opcionalmente, una región intermedia formada por extensión de A1 en la dirección 5'-3' para encontrar el extremo 5' de C. En este ejemplo ilustrativo, la sonda de ligación C tiene un grupo de bloqueo químico 3' de modo que se pueda usar una exonucleasa 3'-5' para digerir cualquier A1 no ligado antes de la etapa de amplificación d.
En la etapa d, se ceba A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
Descripción de realizaciones.
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico dado caracterizado por las etapas de:
a. hibridar el analito con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C de sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2 ;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
Los analitos a los que se puede aplicar el método de la invención son aquellos ácidos nucleicos, tales como moléculas de ADN o ARN naturales o sintéticas, que incluyen la secuencia o secuencias de polinucleótidos diana que se buscan. En una realización, el analito estará presente típicamente en una solución acuosa que lo contiene y otro material biológico y en una realización el analito estará presente junto con otras moléculas de ácido nucleico de trasfondo que no son de interés para los propósitos de la prueba. En algunas realizaciones, el analito estará presente en cantidades bajas en relación con estos otros componentes de ácido nucleico. Preferiblemente, por ejemplo, cuando el analito se deriva de una muestra biológica que contiene material celular, antes de realizar la etapa (a) del método, algunos o todos estos otros ácidos nucleicos y material biológico extraño se habrán eliminado utilizando técnicas de preparación de muestras tales como filtración, centrifugación, cromatografía o electroforesis. De manera adecuada, el analito se deriva de una muestra biológica tomada de un sujeto mamífero (especialmente un paciente humano) tal como sangre, plasma, esputo, orina, piel o una biopsia. En una realización, la muestra biológica se someterá a lisis para que el analito se libere al romper cualquier célula presente. En otras realizaciones, el analito ya puede estar presente en forma libre dentro de la propia muestra; por ejemplo, ADN libre de células que circula en sangre o plasma.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos diana en el analito será un gen o región cromosómica dentro del ADN o ARN de una célula tumoral cancerosa y se caracterizará por la presencia de una o más mutaciones; por ejemplo, en forma de uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Por lo tanto, la invención será útil en la monitorización de la recurrencia de la enfermedad. Los pacientes que han sido declarados libres de enfermedad después del tratamiento pueden ser monitorizados a lo largo del tiempo para detectar la recurrencia de la enfermedad. Esto debe realizarse de forma no invasiva y requiere una detección sensible de las secuencias diana de las muestras de sangre. De manera similar, para algunos cánceres hay células cancerosas residuales que permanecen en un paciente después del tratamiento. La monitorización de los niveles de estas células (o ADN libre de células) presentes en la sangre del paciente, utilizando la presente invención, permite la detección de la recurrencia de la enfermedad o el fracaso de la terapia actual y la necesidad de cambiar a una alternativa.
En una realización, la detección de la secuencia de polinucleótidos diana permitirá el análisis repetido de muestras de pacientes durante el tratamiento de la enfermedad para permitir la detección temprana de la resistencia desarrollada a la terapia. Por ejemplo, los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), como gefitinib, erlotinib, se usan comúnmente como tratamientos de primera línea para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Durante el tratamiento, el tumor a menudo desarrollará mutaciones en el gen EGFR (por ejemplo, T790M, C797S) que confieren resistencia al tratamiento. La detección temprana de estas mutaciones permite transferir al paciente a terapias alternativas.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos diana en el analito será un gen o región cromosómica dentro del ADN o ARN de origen fetal y se caracterizará por la presencia de una o más mutaciones; por ejemplo, en forma de uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Por lo tanto, la invención puede usarse para detectar mutaciones en fracciones de alelos muy bajas, en una etapa más temprana del embarazo que otras técnicas de prueba disponibles.
En otra realización, la secuencia de polinucleótidos diana puede ser un gen o una región genómica derivada de un individuo por lo demás sano, pero la información genética obtenida puede ayudar a generar información de diagnóstico complementaria valiosa que permita extraer conclusiones médicas o terapéuticas a través de uno o más elementos grupos definidos dentro de la población humana.
En otra realización más, la secuencia de polinucleótidos diana puede ser característica de una enfermedad infecciosa; por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos característica de un gen o región cromosómica de una bacteria o un virus.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos diana puede ser característica del ADN del donante. Cuando el paciente rechaza un órgano trasplantado, el ADN de este órgano se vierte en el torrente sanguíneo del paciente. La detección temprana de este ADN permitiría la detección temprana del rechazo. Esto podría lograrse usando paneles personalizados de marcadores específicos del donante, o usando paneles de variantes que se sabe que son comunes en la población, algunas de las cuales estarán presentes en el donante y otras en el receptor. Por lo tanto, el método reivindicado permite la monitorización rutinaria de los receptores de órganos a lo largo del tiempo.
En otra realización más, se emplean en paralelo diversas versiones del método que utilizan diferentes combinaciones de sonda y oligonucleótidos desencadenantes (véase más adelante) de modo que el analito se puede cribar en paralelo para múltiples secuencias diana; por ejemplo, fuentes de cáncer, indicadores de cáncer o múltiples fuentes de infección. En este enfoque, los productos amplificados obtenidos en la etapa (d) mediante la aplicación paralela del método se ponen en contacto con un panel de detección comprendido por uno o más tintes de unión de oligonucleótidos o sondas moleculares específicas de secuencia como una baliza molecular, una sonda de horquilla o similares. Por lo tanto, en otro aspecto de la divulgación se proporciona el uso de al menos una sonda y opcionalmente un oligonucleótido desencadenante definido a continuación en combinación con una o más sondas químicas y biológicas selectivas para las secuencias polinucleotídicas diana o con el uso de secuenciación para identificar las regiones de sonda amplificadas.
La etapa (a) del método de la divulgación comprende hibridar el analito cuya presencia en una muestra dada se busca con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla. En una realización, este oligonucleótido comprende una región de cebado y un extremo 3' que es complementario a la secuencia de polinucleótidos diana a ser detectada. De esta manera se crea un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble. En una realización, esta etapa se lleva a cabo en presencia de un exceso de A0 y en un medio acuoso que contiene el analito y cualquier otra molécula de ácido nucleico.
En una realización, donde se van a utilizar sondas moleculares para la detección en la etapa (e), el oligonucleótido A0 de la sonda está configurado para incluir una región de identificación de oligonucleótidos en el lado 5' de la región complementaria a la secuencia diana, y las sondas moleculares empleadas están diseñadas para hibridar a esta región de identificación. En una realización, solo la región complementaria de A0 puede hibridar con la diana; es decir, cualquier otra región carece de complementariedad suficiente con el analito para que exista un dúplex estable a la temperatura a la que se lleva a cabo la etapa (b). Aquí y en todas partes, el término “complementariedad suficiente” significa que, en la medida en que una región dada tiene complementariedad con una región dada en el analito, la región de complementariedad tiene más de 10 nucleótidos de longitud.
En una realización preferible, el extremo 5' de A0 o un sitio interno en el lado 5' de la región de cebado se vuelve resistente a la exonucleólisis. Por este medio y después de la etapa (b), una exonucleasa que tiene actividad exonucleolítica 5'-3' se puede añadir opcionalmente al medio de reacción con el fin de digerir cualquier otra molécula de ácido nucleico presente mientras que deja A0 y cualquier material que comprenda la cadena parcialmente digerida. A1 intacta. De manera adecuada, esta resistencia a la exonucleólisis se logra introduciendo uno o más grupos bloqueantes en el oligonucleótido A0 en el punto requerido. En una realización, estos grupos bloqueantes pueden seleccionarse de enlaces fosforotioato y otras modificaciones de la cadena principal comúnmente utilizadas en la técnica, espaciadores C3, grupos fosfato, bases modificadas y similares. En otro más, A0 tiene un emparejamiento erróneo del colgajo de oligonucleótidos con respecto a uno o ambos extremos 3' y 5' del oligonucleótido desencadenante que se describe más adelante.
En una realización, la región de identificación comprenderá o se incluirá dentro de una región de código de barras que tiene una secuencia única y está adaptada para ser identificada indirectamente en la etapa (e) usando una sonda molecular específica de secuencia aplicada a los componentes amplificados A2 o directamente mediante la secuenciación de estos componentes. Los ejemplos de sondas moleculares que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, balizas moleculares, sondas TaqMan®, sondas Scorpion® y similares.
En la etapa (b) del método, la región de cadena doble del primer producto intermedio se pirofosforoliza en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de su cadena A0. Como consecuencia, la cadena A0 se digiere progresivamente para crear una cadena parcialmente digerida; en lo sucesivo denominado A1. Cuando el oligonucleótido de la sonda se hibrida erróneamente con una secuencia no diana, la reacción de pirofosforólisis se detendrá en cualquier emparejamiento erróneo, evitando que continúen las etapas posteriores del método. En otra realización, esta digestión continúa hasta que A1 carece de complementariedad suficiente con el analito o una región diana en el mismo para formar un dúplex estable. En este punto, las diversas cadenas se separan luego por fusión, produciendo así A1 en forma de cadena sencilla. En condiciones típicas de pirofosforólisis, esta separación se produce cuando hay entre 6 y 20 nucleótidos complementarios entre el analito y A0.
De forma adecuada, la etapa de pirofosforólisis (b) se lleva a cabo en el medio de reacción a una temperatura en el intervalo de 20 a 90 °C en presencia de una polimerasa que exhibe actividad de pirofosforólisis y una fuente de ion pirofosfato. Se puede encontrar más información sobre la reacción de pirofosforólisis aplicada a la digestión de polinucleótidos, por ejemplo, en J. Biol. Chem. 244 (1969) págs. 3019-3028 o nuestras solicitudes de patente anteriores.
En una realización, la etapa de pirofosforólisis (b) es impulsada por la presencia de una fuente de exceso de polipirofosfato, las fuentes adecuadas incluyen aquellos compuestos que contienen 3 o más átomos de fósforo.
En una realización, la etapa de pirofosforólisis (b) es impulsada por la presencia de una fuente de pirofosfato modificado en exceso. Los pirofosfatos modificados adecuados incluyen aquellos con otros átomos o grupos sustituidos en lugar del oxígeno puente, o pirofosfato (o polipirofosfato) con sustituciones o grupos modificadores en los otros oxígenos. La persona experta en la técnica comprenderá que existen muchos ejemplos de pirofosfato modificado que serían adecuados para su uso en la presente invención, una selección no limitante de los cuales son:
Figure imgf000007_0001
Sal de amonio de pirofosfato Pirofosfato de ácido dietilo PCP Acido tripol ¡fosfórico (PPPI} dey.y-dimetilalilo
Figure imgf000007_0002
Hexa hidrato de tripol ¡fosfato Pirofosfato deácidode
PNP PlOMí) P(OM)l
de pentasodio dimetilo CHj
En una realización preferida, la fuente de ion pirofosfato es PNP, PCP o ácido tripolifosfórico (PPPi).
Además, pero sin limitación, se pueden encontrar ejemplos de fuentes de iones pirofosfato para su uso en la etapa de pirofosforólisis (b) en los documentos WO2014/165210 y WO00/49180.
En una realización, la fuente de pirofosfato modificado en exceso se puede representar como YH en la que Y corresponde a la fórmula general (XO)2P(= B)-(Z-P(= B)(O-X))n en la que n es un número entero de 1 a 4; cada Z- se selecciona independientemente de -O-, -NH- o -CH2-; cada B es independientemente O o S; los grupos X se seleccionan independientemente de -H, -Na, -K, alquilo, alquenilo o un grupo heterocíclico con la condición de que cuando tanto Z como B corresponden a -O- y cuando n es 1, al menos un grupo X no es H
En una realización, Y corresponde a la fórmula general (XO)2P(= B)-(Z-P(= B)(O-X))n- en la que n es 1, 2, 3 o 4. En otra realización, el grupo Y corresponde a la fórmula general (X-O)2P(= O)-Z-P(= O)(O-H)- en la que uno de los grupos X es -H. En otra realización preferida más, Y corresponde a la fórmula general (X-O)2P(= O)-Z-P(= O)(O-X)- en la que al menos uno de los grupos X se selecciona entre metilo, etilo, alilo o dimetilalilo.
En una realización alternativa, Y corresponde a cualquiera de las fórmulas generales (X-O)2P(= O)-Z-P(= O)(O-H)-donde Z es -NH- o -CH2- o (X-O)2P(= O)-Z-P(= O)(O-X)- en la que los grupos X son todos -Na o -K y Z es -Nh - o -CH2-.
En otra realización, Y corresponde a la fórmula general (X-O)2P(= B)-O-P(= B)(O-H)- en la que cada grupo B es independientemente O o S, siendo al menos uno S.
Los ejemplos específicos de realizaciones preferidas de Y incluyen las de fórmula (X1-O)(HO)P(= O)-Z-P(= O)(O-X2) en la que Z es O, NH o CH2 y (a) X1 es Y,Y-dimetilalilo y X2 es -H; o (b) X1 y X2 son ambos metilo; o (c) X 1 y X2 son ambos etilo; o (d) X1 es metilo y X2 es etilo o viceversa.
En una realización, la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de una enzima fosfatasa para eliminar continuamente por hidrólisis los nucleósidos trifosfatos producidos por la reacción de pirofosforólisis. En otra realización, se añade una enzima pirofosfatasa después de la etapa (b) para hidrolizar cualquier ion pirofosfato residual, asegurando así que no pueda producirse más pirofosforólisis en las etapas posteriores. En otra realización, las etapas (a) y (b) se repiten de modo que se creen múltiples copias de A1 a partir de cada molécula diana. Esto puede ocurrir antes o mientras se llevan a cabo las etapas siguientes. Cuando se combina con la amplificación en la etapa (d), esta iteración conduce a una mejora adicional en la sensibilidad y confiabilidad del método y, al introducir una amplificación lineal inicial, permite una cuantificación más precisa del polinucleótido diana.
En una realización preferida, pero no esencial, al final de la etapa (b) o antes o después de la etapa (c) se introduce una etapa intermedia en el que se añade una exonucleasa que tiene actividad direccional 5'-3' para con el fin de asegurar que se destruya cualquier material de ácido nucleico residual presente, distinto del que comprende las cadenas A0 o A1 (en las que está presente el grupo de bloqueo 5'). En otra realización, esta exonucleasa se desactiva antes de que se lleve a cabo la etapa (d). En otra realización más, antes o mientras se lleva a cabo esta exonucleólisis, todo el material de ácido nucleico presente se fosforila en sus extremos 5' usando, por ejemplo, una quinasa y un donante de fosfato como ATP para producir un sitio final fosforilado requerido para iniciar la exonucleólisis por ciertos tipos de exonucleasas 5'-3'.
Después de la etapa (b), o cuando sea relevante la etapa intermedia mencionada anteriormente, A1, en una realización (i), se hibrida con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla para crear un segundo producto intermedio que también es parcialmente de cadena doble. En una realización, B está comprendido por una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1 con una región de oligonucleótidos flanqueante en su extremo 5' que no es sustancialmente complementaria a A0. Aquí y en todas partes, el término “no sustancialmente complementario de” o una redacción equivalente significa que en la medida en que una región flanqueante dada tiene complementariedad con una región dada en A0 , la región de complementariedad tiene menos de 10 nucleótidos de longitud. A continuación, en la etapa (c), la cadena A1 de este segundo producto intermedio se extiende en la dirección 5'-3' para crear un tercer producto intermedio, comprendido por B y la cadena A1 extendida (en lo sucesivo, A2).
En otra realización, B comprende (i) una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1; (ii) una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 5' de A1 y opcionalmente (iii) una región de oligonucleótidos intermedia entre estas dos regiones y en la que B es incapaz de experimentar extensión contra A1 a través de la presencia de uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos o una modificación química en su extremo 3'. En otra realización, B se modifica tanto en su extremo 3' como internamente para evitar que otros oligonucleótidos se extiendan contra éste.
En estas dos realizaciones, B está adecuadamente comprendido por regiones de oligonucleótidos que tienen cada una independientemente hasta 150 nucleótidos, típicamente de 5 a 100 nucleótidos y lo más preferiblemente de 10 a 75 nucleótidos de longitud. En una realización, todas las regiones de B tienen independientemente una longitud en el intervalo de 10 a 50 nucleótidos. En otra realización preferida, el extremo 5' de B o una región adyacente al mismo también está protegido con un grupo de bloqueo del tipo mencionado anteriormente para hacerlo resistente a la exonucleólisis. En algunas realizaciones, el extremo 5' de B se pliega sobre sí mismo para crear una región de horquilla de doble cadena. En otra realización más, tanto los extremos 3' como 5' de B tienen uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con respecto a los extremos de su cadena de contraparte A1.
En otra realización, la etapa (c) comprende alternativamente (ii) ligar los dos extremos de A1 juntos en presencia de una ligasa para crear un tercer producto intermedio en el que la cadena de A1 no se extiende sino que se circulariza. Esta ligación se lleva a cabo típicamente mediante la adición de un oligonucleótido D de puente, que tiene regiones complementarias a los extremos 3' y 5' de A1 de tal manera que, cuando se hibridan con D, los extremos 3' y 5' de A1 forman una muesca que puede ser ligado o un espacio que se puede llenar antes de la ligadura posterior. En esta realización, A1 circularizado se convierte de hecho en A2 con el propósito de las etapas posteriores. En otra realización, la cadena A1 todavía se extiende en la dirección 5'-3', usando una polimerasa que carece de exonucleasa 5'-3' y actividad de desplazamiento de cadena, y luego se circulariza para que este producto extendido y circularizado se convierta en efecto A2. En otra realización, los extremos 3' y 5' de A1, o A1 extendido, se unen mediante un grupo puente que puede no incluir necesariamente una región oligonucleotídica.
En el caso de que el tercer producto intermedio comprenda una cadena A2 que esté circularizada, es ventajoso tratar la mezcla de reacción generada en la etapa (c) con una exonucleasa o combinación de exonucleasas para digerir cualquier componente de ácido nucleico residual que no sea circularizado. Posteriormente, en otra realización, la exonucleasa se desactiva antes de que tenga lugar la etapa (d).
En otra realización (iii), la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de una sonda de ligación C que tiene una región 5' complementaria de al menos parte de una región de extremo 5' de un oligonucleótido D de puente o al oligonucleótido diana, una ligasa y, opcionalmente, una polimerasa que carece tanto de capacidad de desplazamiento de cadena como de actividad exonucleasa direccional 5'-3'. De este modo, se forma un segundo producto intermedio en el que la cadena A2 está comprendida por A1, C y opcionalmente una región intermedia formada por la extensión de A1 en la dirección 5'-3' para encontrar el extremo 5' de C. En tal realización, los cebadores empleados en la etapa (d) (véase más adelante) se eligen para amplificar al menos una región de A2 que incluye el sitio en el que se ha producido la ligadura de A1 a C. En esta realización, hemos descubierto que es ventajoso incluir un grupo de bloqueo 3' en C de modo que se pueda usar una exonucleasa 3'-5' para digerir cualquier A1 no ligado antes de la amplificación. Las polimerasas adecuadas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Hemo KlenTaq, Mako y Stoffel Fragment.
En una realización, cuando se emplean las etapas c (ii) o c (iii), A1 se extiende opcionalmente en la dirección 5'-3' antes de la ligación. En una realización, esta extensión opcional y la ligación se realizan contra el oligonucleótido diana, mientras que en otra realización se realizan mediante la adición de un oligonucleótido D de puente adicional con el que Ai se híbrida antes de la extensión y/o ligación. En una realización, D comprende una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1 y una región complementaria al extremo 5' del oligonucleótido C o al extremo 5' de A1. En otra realización, D es incapaz de extenderse contra A1 en virtud de una modificación del extremo 3 'o mediante un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre el extremo 3' de D y la región correspondiente de A1.
En la etapa posterior (d), se hace que la cadena A2 o una región deseada de la misma experimente amplificación de modo que se hagan múltiples, típicamente muchos millones, de copias. Esto se logra cebando una región de A2 y posteriormente cualquier amplicón derivado de la misma con oligonucleótidos cebadores de cadena sencillas, proporcionados, por ejemplo, en forma de un par directo / inverso o sentido / antisentido, que puede hibridarse con una región complementaria del mismo. La cadena cebada se convierte entonces en el punto de origen para la amplificación. Los métodos de amplificación incluyen, pero no se limitan a, ciclos térmicos y métodos isotérmicos tales como la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación de la polimerasa recombinasa y la amplificación del círculo rodante; el último de ellos es aplicable cuando se circulariza A2. Por cualquiera de estos medios, se pueden crear rápidamente muchas copias de amplicón de A2 y, en algunos casos, su complemento de secuencia. Las metodologías exactas para realizar cualquiera de estos métodos de amplificación serán bien conocidas por un experto en la materia y las condiciones exactas y los regímenes de temperatura empleados están fácilmente disponibles en la literatura general a la que se dirige el lector. Específicamente, en el caso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la metodología generalmente comprende extender el oligonucleótido cebador contra la cadena A2 en la dirección 5'-3' usando una polimerasa y se produce una fuente de diversos trifosfatos de un solo nucleósido hasta una cadena complementaria; deshibridar el producto de doble cadena producido para regenerar la cadena A2 y la cadena complementaria; volver a cebar la cadena A2 y cualquiera de sus amplicones y, a continuación, repetir estas etapas de extensión/deshibridación/volver a cebar varias veces para acumular una concentración de amplicones A2 a un nivel en el que puedan detectarse de forma fiable.
Finalmente, en la etapa (e) se detectan los amplicones y se usa la información obtenida para inferir si la secuencia diana de polinucleótidos está presente o ausente en el analito original y/o una propiedad asociada con el mismo. Por ejemplo, por este medio se puede detectar una secuencia diana característica de una célula tumoral cancerosa con referencia a los SNP específicos que se buscan. En otra realización, se puede detectar una secuencia diana característica del genoma de un virus de bacteria (incluidas nuevas mutaciones del mismo). Se pueden emplear muchos métodos de detección de amplicones o regiones de identificación, incluyendo, por ejemplo, un colorante de unión de oligonucleótidos, una sonda molecular específica de secuencia tal como una baliza molecular marcada con fluorescencia o una sonda de horquilla. Alternativamente, la secuenciación directa de los amplicones A2 se puede realizar usando uno de los métodos de secuenciación directa empleados o descritos en la técnica. Cuando se emplean tintes de unión a oligonucleótidos, balizas o sondas marcadas con fluorescencia, es conveniente detectar los amplicones utilizando una disposición que comprenda una fuente de radiación electromagnética estimulante (láser, LED, lámpara, etc.) y un fotodetector dispuesto para detectar la luz fluorescente emitida y generar de allí una señal que comprende un flujo de datos que puede ser analizado por un microprocesador o un ordenador usando algoritmos específicamente diseñados.
En una manifestación específica de la invención, se emplean múltiples sondas A0 , cada una de las cuales es selectiva para una secuencia diana diferente y cada una incluye una región de identificación. En una realización, la región amplificada en la etapa (d) incluye entonces esta región de identificación. En otra realización, los amplicones generados en la etapa (d) se infieren luego mediante la detección de la(s) región(es) de identificación. La identificación puede comprender entonces el uso de sondas moleculares o métodos de secuenciación, por ejemplo, secuenciación de Sanger, secuenciación de Illumina® o uno de los métodos que hemos descrito anteriormente. En otra manifestación, antes de la etapa (a), el analito se divide en múltiples volúmenes de reacción, teniendo cada volumen un oligonucleótido A0 de sonda diferente o una pluralidad del mismo diseñado para detectar diferentes secuencias diana. En otra realización preferida, las diferentes sondas A0 comprenden un sitio de cebado común que permite utilizar un único o único conjunto de cebadores para la etapa de amplificación (d).
En algunas realizaciones, la etapa de amplificación (d) puede llevarse a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) o mediante amplificación isotérmica tal como amplificación por círculo rodante (RCA). En algunas realizaciones, el RCA puede estar en forma de RCA exponencial, por ejemplo, RCA hiperramificado, que puede dar como resultado un ADN de cadena doble de una variedad de longitudes diferentes. En algunas realizaciones, puede ser deseable proporcionar diferentes sondas que puedan producir diferentes productos con diferentes longitudes.
En algunas realizaciones, la etapa (e) comprende además las etapas de:
i. marcar las múltiples copias de A2 , o una región de A2 usando uno o más tintes de unión fluorescentes de oligonucleótidos o sondas moleculares;
ii. medir la señal fluorescente de las múltiples copias;
iii. exponer las múltiples copias a un conjunto de condiciones desnaturalizantes; y
iv. identificar la secuencia diana del polinucleótido en el analito mediante el seguimiento de los cambios en la señal fluorescente de las múltiples copias durante la exposición a las condiciones de desnaturalización.
En algunas realizaciones, la etapa (e) puede tomar la forma de detección y análisis usando análisis de curva de fusión. El análisis de la curva de fusión puede ser una evaluación de las características de disociación del ADN de cadena doble durante el calentamiento. La temperatura a la que el 50 % del ADN de una muestra se desnaturaliza en dos grupos separados se conoce como temperatura de fusión (Tm). A medida que aumenta la temperatura, la doble cadena comienza a disociarse, con diferentes moléculas de ADN de doble cadena que se disocian a diferentes temperaturas según la composición (un emparejamiento de bases GC tiene 3 enlaces de hidrógeno en comparación con solo 2 entre A-T; por lo tanto, se requiere una temperatura más alta para separar un GC que un A-T), longitud (una longitud más larga de ADN de doble cadena con más enlaces de hidrógeno requerirá una temperatura más alta para disociarse completamente en dos cadenas simples separadas que una que es más corta) y complementariedad (una molécula de a Dn con un gran número de emparejamiento erróneos tendrá una Tm más baja por la naturaleza de contener menos enlaces de hidrógeno entre pares de bases coincidentes).
En algunas realizaciones, la etapa de amplificación (d) se puede llevar a cabo en presencia de un agente fluorescente intercalante. Por lo tanto, cuando se realiza el análisis de la curva de fusión, se monitorizan los cambios en la fluorescencia, lo que indica la Tm (y por lo tanto la identidad) del producto de reacción y, por lo tanto, la secuencia de polinucleótidos diana. Los cambios en la fluorescencia se pueden detectar utilizando una disposición que comprende una fuente de radiación electromagnética estimulante (láser, LED, lámpara, etc.) y un fotodetector dispuesto para detectar la luz fluorescente emitida y generar a partir de ella una señal que comprende un flujo de datos que puede ser analizado por un microprocesador o un ordenador que utilice algoritmos diseñados específicamente.
El agente fluorescente intercalante puede ser un colorante específico para ADN de cadena doble, como SYBR green, EvaGreen, LG Green, LC Green Plus, ResoLight, Chromofy o SYTO 9. El experto en la técnica apreciará que hay muchos agentes fluorescentes intercalantes que podrían usarse en la presente invención y la lista anterior no pretende limitar el alcance de la presente invención. El agente fluorescente intercalante puede ser una sonda de ADN marcada con fluorescencia. En una realización de la invención, se pueden usar sondas yuxtapuestas, una que comprende un fluoróforo y la otra un apagador adecuado, para determinar la complementariedad de la sonda de ADN con una secuencia diana amplificada.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para identificar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico dado caracterizado por las etapas de:
a. hibridar un analito de ácido nucleico con un oligonucleótido A0 sonda de cadena sencilla para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2.
e. marcar las múltiples copias de A2 , o una región de A2 usando uno o más tintes de unión fluorescentes de oligonucleótidos o sondas moleculares;
f. medir la señal fluorescente de las múltiples copias;
g. exponer las múltiples copias a un conjunto de condiciones desnaturalizantes; y
h. identificar la secuencia de polinucleótidos diana mediante la monitorización de un cambio en la señal fluorescente de las múltiples copias durante la exposición a las condiciones desnaturalizantes.
En algunas realizaciones, las condiciones de desnaturalización pueden proporcionarse variando la temperatura, por ejemplo, aumentando la temperatura hasta un punto en el que la doble cadena comienza a disociarse. Adicional o alternativamente, las condiciones de desnaturalización también pueden proporcionarse variando el pH de modo que las condiciones sean ácidas o alcalinas, o añadiendo aditivos o agentes tales como un ácido o base fuerte, una sal inorgánica concentrada o un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol.
En un aspecto adicional de la divulgación, que puede emplearse en asociación con el método del primer aspecto o de forma independiente, el analito en forma de cadena sencilla se puede preparar a partir de la muestra biológica mencionada anteriormente por una serie de etapas preliminares diseñadas para amplificar el analito y separarlo del ADN genómico de fondo que normalmente está presente en un exceso significativo. Este método es generalmente aplicable a la producción de analitos diana de cadena sencillas y, por lo tanto, es útil en situaciones distintas de cuando está integrado o comprende además parte del método del primer aspecto de la divulgación.
En consecuencia, se proporciona un método para preparar al menos un analito de cadena sencilla de un ácido nucleico comprendido por una región polinucleotídica diana caracterizada por las etapas de (i) producir amplicones del analito(s) sometiendo una muestra biológica comprendida por las correspondientes versiones de cadena dobles del analito(s) y, opcionalmente, ADN genómico de trasfondo para los ciclos de amplificación. En una realización preferida, la amplificación se lleva a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en presencia de una polimerasa, nucleósidos trifosfatos y al menos un par de cebadores correspondiente en el que uno de los cebadores incluye un grupo bloqueador de exonucleasa 5'-3' y (ii) opcionalmente digerir el producto de la etapa (i) con una exonucleasa que tiene actividad exonucleolítica 5'-3'. En una realización, el método puede comprender además (iii) hacer reaccionar el producto de la etapa (ii) con una proteinasa para destruir la polimerasa y luego (iv) desactivar la proteinasa calentando el producto de la etapa (iii) a una temperatura superior a 50 °C.
En una realización preferida, las etapas (i) a (iv) se llevan a cabo antes de la etapa (1) del método del primer aspecto de la divulgación para producir un método integrado de detección de secuencias diana derivadas de una muestra biológica. En otra realización, la muestra biológica se ha sometido a lisis celular antes de que se lleve a cabo la etapa (i).
En una realización de la etapa (i) los nucleósidos trifosfatos son una mezcla de los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos característicos del ADN de origen natural. En una realización preferida, la mezcla de desoxinucleósido trifosfato comprende desoxiuridina trifosfato (dUTP) en lugar de desoxitimidina trifosfato (dTTP) y la etapa (i) se lleva a cabo adicionalmente en presencia de la enzima dUTP-ADN glicolasa (UDG) para eliminar cualquier amplicón contaminante de ensayos anteriores. En otra realización más, se usa una polimerasa de alta fidelidad en la etapa (i), por ejemplo, una de las vendidas con el nombre comercial Phusion® o Q5.
En una realización, la etapa (i) se lleva a cabo usando una cantidad limitada de cebador y un exceso de ciclos de amplificación. De este modo se produce una cantidad fija de amplicones independientemente de la cantidad inicial de analito. Por lo tanto, se evita la necesidad de cuantificar el analito antes de las etapas posteriores. En otra realización de la etapa (i), que tiene la ventaja de obviar la necesidad de la etapa (ii), la amplificación se lleva a cabo en presencia de un par de cebadores donde uno de los dos cebadores está presente en exceso del otro, dando como resultado generación de amplicones de cadena sencillas una vez que se utiliza por completo un cebador.
En una realización preferida de la etapa (ii), el cebador 5 'se bloquea con un grupo bloqueador de exonucleasa seleccionado entre enlaces fosforotioato, bases invertidas, espaciadores de a Dn y otras modificaciones de oligonucleótidos comúnmente conocidas en la técnica. En otra realización, el otro cebador del par tiene un grupo fosfato en su extremo 5'.
En una realización, en la etapa (iii) la proteinasa empleada es proteinasa K y la etapa (iv) se lleva a cabo calentando a una temperatura de 80 a 95 °C durante hasta 30 minutos. En otra realización, en algún momento después de la etapa (ii) pero antes de la etapa (b), el medio de reacción se trata con apirasa u otra fosfatasa para eliminar cualquier nucleósido trifosfato residual que pueda estar presente.
En un aspecto adicional de la divulgación se proporciona una realización alternativa en la que la etapa de fosforolisis (b) se reemplaza con una etapa de digestión de exonucleasa usando una exonucleasa específica de doble cadena. El experto en la técnica comprenderá que las exonucleasas específicas de doble cadena incluyen las que se leen en la dirección 3'-5', como Exolll, y las que se leen en la dirección 5'-3', como Lambda Exo, entre muchos otros.
En una realización de este aspecto, la exonucleasa específica de doble cadena de la etapa (b) avanza en la dirección 3'-5 '. En tales realizaciones, el método de la divulgación se caracteriza por las etapas de:
a. hibridar el analito con un oligonucleótido A0 sonda de cadena sencilla para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. digerir el primer producto intermedio con una exonucleasa específica de doble cadena en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3 'y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
En una realización de este aspecto, la exonucleasa específica de doble cadena de la etapa (b) avanza en la dirección 5'-3'. En tal realización, el método de la divulgación se caracteriza por las etapas de:
a. hibridar el analito con un oligonucleótido Ao sonda de cadena sencilla para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 5' de Ao forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. digerir el primer producto intermedio con una exonucleasa específica de doble cadena en la dirección 5'-3' desde el extremo 5' de Ao para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 5' de A1 al extremo 3' de un oligonucleótido C sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
En realizaciones de la divulgación en las que la etapa (b) utiliza una exonucleasa 5'-3' específica de doble cadena, es el extremo 5' de Ao el que es complementario al analito diana y la secuencia de cebado común y el grupo de bloqueo son ubicados en el lado 3' de la región complementaria a la diana. En una realización adicional, donde se van a utilizar sondas moleculares para la detección en la etapa (e), el oligonucleótido Ao sonda está configurada para incluir una región de identificación de oligonucleótidos en el lado 3' de la región complementaria a la secuencia diana, y las sondas moleculares empleadas están diseñadas para hibridar a esta región de identificación.
En realizaciones de la divulgación en las que la etapa (b) utiliza una exonucleasa 5'-3' específica de doble cadena, se puede añadir opcionalmente una exonucleasa que tiene actividad exonucleolítica 3' a 5' a la mezcla de reacción, después de la etapa b. con el fin de digerir cualquier otra molécula de ácido nucleico presente mientras se deja intacta Ao y cualquier material que comprenda la cadena A1 parcialmente digerida. De manera adecuada, esta resistencia a la exonucleólisis se logra como se describió anteriormente. Se apreciará que los métodos de la divulgación se pueden aplicar a una mezcla de reacción que comprende una pluralidad de analitos diferentes usando múltiples componentes Ao y opcionalmente B, C o D diferentes, cada uno asociado con una sonda molecular diferente o similar. En tal método multiplexado, se habilita la detección de múltiples regiones diana características de un cáncer dado o una multiplicidad de enfermedades infecciosas, etc. En una realización, se prefiere que cada cadena A2 diferente generada tenga un sitio de cebador común pero una región de identificación diferente, lo que permite usar uno o un conjunto único de cebadores en la etapa de amplificación (d).
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona el uso de los métodos descritos anteriormente para cribar sujetos mamíferos, especialmente pacientes humanos, para detectar la presencia de enfermedades infecciosas, cáncer o con el fin de generar información de diagnóstico complementaria.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporcionan sondas de control para su uso en los métodos descritos anteriormente. Las realizaciones de la divulgación actual incluyen aquellas en las que la presencia de una secuencia o secuencias diana específicas se aclaran mediante la generación de una señal fluorescente.
En tales realizaciones, inevitablemente puede haber un nivel de señal generado a partir del ADN no diana presente en la muestra. Para una muestra determinada, esta señal de trasfondo tiene un inicio más tardío que la señal “verdadera”, pero este inicio puede variar entre muestras. La detección precisa de la presencia de bajas concentraciones de secuencia o secuencias diana, por lo tanto, se basa en el conocimiento de qué señal se espera en su ausencia. En el caso de muestras artificiales, se dispone de referencias, pero este no es el caso de muestras verdaderas “ciegas” de pacientes. Las sondas de control (Eo) se utilizan para determinar el perfil de señal de trasfondo esperado para cada sonda de ensayo. La sonda de control se dirige a una secuencia que no se espera que esté presente en la muestra y la señal generada a partir de esta sonda se puede usar para inferir la tasa esperada de generación de señal de la muestra en ausencia de la secuencia diana.
Por lo tanto, se proporciona un método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico dado caracterizado por las etapas de:
a. añadir un oligonucleótido Ao de sonda de cadena sencilla a una muestra para hibridar con un analito diana para crear un primer producto intermedio que sea al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forme un complejo de cadena doble con la secuencia del analito diana;
b. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ;
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias;
f. ya sea posteriormente o simultáneamente repitiendo las etapas (a) a (e) usando un segundo oligonucleótido de sonda de cadena sencilla E0 que tiene una región del extremo 3' que no coincide al menos parcialmente con la secuencia diana, ya sea usando una alícuota separada de la muestra o en la misma alícuota y usando un segundo canal de detección;
g. inferir del resultado de (f) la señal de trasfondo que se espera generar a partir de A0 en ausencia de cualquier analito diana en la muestra; y
h. mediante la comparación de la señal de trasfondo esperada inferida en (g) con la señal real observada en (e), infiriendo la presencia de ausencia de la secuencia polinucleotídica diana en el analito.
En algunas realizaciones, el método de la etapa (e) de acuerdo con la presente divulgación se produce mediante:
i. marcar las múltiples copias de A2, o una región de A2 usando uno o más tintes de unión fluorescentes de oligonucleótidos o sondas moleculares;
ii. medir la señal fluorescente de las múltiples copias producidas en la etapa (d);
iii. exponer las múltiples copias a un conjunto de condiciones desnaturalizantes; y
iv. detectar la presencia e identificar el producto amplificado monitorizando los cambios en la señal fluorescente de las múltiples copias durante la exposición a las condiciones de desnaturalización, en comparación con la misma medición realizada en el producto de la etapa (f).
En una realización, la sonda de control (E0) y A0 se agregan a porciones separadas de la muestra, mientras que en otra realización, E0 y A0 se agregan a la misma porción de la muestra y diferentes canales de detección (por ejemplo, diferentes tintes de color) utilizado para medir sus respectivas señales. La señal generada por E0 puede utilizarse entonces para inferir y corregir la señal de trasfondo que se espera que genere A0 en ausencia de la secuencia diana de polinucleótidos en la muestra. Por ejemplo, una corrección de la señal de trasfondo puede implicar la sustracción de la señal observada de E0 de la observada de A0 , o mediante la calibración de la señal observada de A0 usando una curva de calibración de las señales relativas generadas por A0 y E0 bajo condiciones variantes.
En una realización, se puede usar un solo E0 para calibrar todas las sondas de ensayo que se pueden producir.
En una realización, se puede usar un E0 separado para calibrar cada amplicón de la muestra de ADN generada en una etapa de amplificación inicial. Cada amplicón puede contener múltiples mutaciones/secuencias diana de interés, pero un solo E0 será suficiente para calibrar todas las sondas de ensayo contra un solo amplicón.
En una realización adicional, se puede usar un E0 separado para cada secuencia diana. Por ejemplo, si se apunta a una mutación C>T, se podría diseñar una E0 que se dirija a una mutación C>G en el mismo sitio que no se sabe que ocurra en los pacientes. El perfil de señal generado por E0 en diversas condiciones se puede evaluar en reacciones de calibración y estos datos se utilizan para inferir la señal esperada de la sonda de ensayo dirigida a la variante C>T cuando esta variante no está presente.
Una realización del método de la divulgación se puede ver en las Figuras 9 a 12. En la Figura 9, se ilustra una realización de las etapas a a b. En la etapa a, un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla se hibrida con una secuencia de polinucleótidos diana para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia del polinucleótido diana. En esta realización simplificada de la divulgación, hay dos moléculas de A0 presentes y una secuencia de polinucleótidos diana, con el fin de ilustrar cómo A0 que no se ha hibridado con una diana no participa en las etapas posteriores del método. En este ejemplo ilustrativo de la etapa a, el extremo 3' de Ao se híbrida con la secuencia de polinucleótidos diana, mientras que el extremo 5' de A0 no lo hace. El extremo 5' de A0 comprende un grupo de bloqueo químico 5', una secuencia de cebado común y una región de código de barras.
En la etapa b, el primer producto intermedio parcialmente de cadena doble se pirofosforiliza con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear una cadena A1 parcialmente digerida, el analito y la molécula de A0 no digerida que no se hibridaba con una diana en la etapa a.
En la Figura 10, se ilustra una realización de las etapas c (i) ad. En la etapa c (i), A1 se hibrida con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y la cadena A1 se extiende en la dirección 5'-3' contra B para crear un oligonucleótido A2. En este ejemplo ilustrativo, el oligonucleótido desencadenante B tiene un bloque químico 5'. El A0 no digerido de la etapa b del método se hibrida con el oligonucleótido desencadenante B, sin embargo, no puede extenderse en la dirección 5'-3' contra B para generar secuencias que son la diana de los cebadores de amplificación de la etapa d.
En la etapa d, se ceba A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
En la Figura 11, se ilustra una realización de las etapas c (ii) ad. En la etapa c (ii), A1 se hibrida con un oligonucleótido D de puente y luego se circulariza mediante ligación de sus extremos 3' y 5'. En la etapa d, el A2 ahora circularizado se ceba con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2, o una región de A2. En este ejemplo ilustrativo, el oligonucleótido D de puente no puede extenderse contra A1 en virtud de una modificación 3' (química en esta ilustración) o mediante un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre el extremo 3' de D y la región correspondiente de A2.
En la etapa d, se ceba A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
En la Figura 12, se ilustra una realización de las etapas c (iii) ad. En la etapa c (ii), A1 se hibrida con un oligonucleótido D de puente y luego se circulariza mediante ligación de sus extremos 3' y 5'. En la etapa d, el A2 ahora circularizado se ceba con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2, o una región de A2. En este ejemplo ilustrativo, el oligonucleótido D de puente no puede extenderse contra A1 en virtud de una modificación 3' (química en esta ilustración) o mediante un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre el extremo 3' de D y la región correspondiente de A2.
En la etapa d, A2 se ceba con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y se crean múltiples copias de A2 , o una región de A2.
La especificidad de los métodos de la divulgación actual puede mejorarse bloqueando al menos una porción del ADN de tipo silvestre, promoviendo la hibridación de A0 solo con las secuencias de polinucleótidos diana. Pueden usarse oligonucleótidos de bloqueo para mejorar la especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La técnica general utilizada es diseñar un oligonucleótido que se hibrida entre los cebadores de PCR y no puede ser desplazado o digerido por la polimerasa de PCR. El oligonucleótido está diseñado para hibridarse con la secuencia no diana (generalmente sana), mientras que hay un emparejamiento erróneo (a menudo por una sola base) con la secuencia diana (mutante). Este emparejamiento erróneo da como resultado una temperatura de fusión diferente frente a las dos secuencias, estando diseñado el oligonucleótido para que permanezca hibridado con la secuencia no diana a la temperatura de extensión de la PCR mientras se disocia de la secuencia diana.
Los oligonucleótidos de bloqueo a menudo pueden tener modificaciones para evitar su digestión por la actividad exonucleasa de la polimerasa de PCR, o para mejorar el diferencial de temperatura de fusión entre la secuencia diana y no diana.
La incorporación de un ácido nucleico bloqueado (LNA) u otra modificación que altere la temperatura de fusión en un oligonucleótido de bloqueo puede aumentar significativamente el diferencial en la temperatura de fusión del oligonucleótido frente a secuencias diana y no diana.
Por lo tanto, se proporciona una realización de la divulgación en la que se utilizan oligonucleótidos de bloqueo. Los oligonucleótidos de bloqueo deben ser resistentes a la reacción de pirofosforólisis (PPL) para garantizar que no se digieran ni se desplacen. Esto se puede lograr de varias formas diferentes, por ejemplo, mediante emparejamientos erróneos en sus extremos 3' o mediante modificaciones tales como enlaces o espaciadores de fosforotioato.
En tales realizaciones o en un aspecto de la presente invención donde se usan oligonucleótidos de bloqueo, el método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico dado se caracteriza por las etapas de:
a. hibridar de oligonucleótidos de bloqueo de cadena sencillas con al menos un subconjunto de secuencias de polinucleótidos no diana;
b. hibridar la secuencia diana del analito con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla para crear un primer producto intermedio que es al menos parcialmente de cadena doble y en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
c. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito;
d. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C de sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2 ;
e. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
f. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
En una realización, los oligonucleótidos de bloqueo se hacen resistentes a la reacción de pirofosforólisis mediante emparejamientos erróneos en sus extremos 3'. En otra realización, los oligonucleótidos bloqueantes se hacen resistentes mediante la presencia de un grupo bloqueador 3'. En otra realización, los oligonucleótidos de bloqueo se hacen resistentes mediante la presencia de espaciadores u otras modificaciones internas. En una realización adicional, los oligonucleótidos de bloqueo incluyen tanto una modificación que aumenta la temperatura de fusión como una base de nucleótidos modificada y se vuelven resistentes a la pirofosforólisis.
La invención se ilustra ahora con referencia a los siguientes datos experimentales.
Ejemplo 1: Especificidad de la pirofosforólisis contra emparejamiento erróneo de un solo nucleótido
Se preparó un primer oligonucleótido 1 de cadena sencilla (SEQ ID NO: 1), que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
5'-
CGCTCGATGTATACGCTCGGACCACTCGTACCTCGAACTGTCGTTAGTAI I I I IATATGTAGTTTCTGAAGTA
GATATGGCAGCACATAATGAC-3'
en la que A, C, G y T representan nucleótidos que llevan la nucleobase característica relevante de ADN.
También se preparó un conjunto de oligonucleótidos de cadena sencillas 2-6 (SEQ ID NO: 2-6), que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos en la dirección 5' a 3':
2: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG 3: AGTACAAATATCTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG 4: AGTACAAATATGTCATTATGAGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG 5: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATAACTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG 6: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGTAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG
En las que el oligonucleótido 2 incluye una región de 52 bases complementarias a las 52 bases en el extremo 3' del oligonucleótido 1 y los oligonucleótidos 3-6 incluyen la misma región con emparejamientos erróneos de nucleótido único, en las posiciones 1, 10, 20 y 30 respectivamente.
A continuación, se preparó una mezcla de reacción, que tenía una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
20 ul 5x tampón pH 8.0
oligonucleótido 110 ul, 3000 nM
oligonucleótidos 2, 3, 4, 5 o 6, 10 ul 3000 nM
Mako ADN polimerasa 2.5 U (por ejemplo, Qiagen Beverly)
pirofosfato inorgánico 10 ul, 6 mM
0.04 U Apyrase
Agua hasta 100 ul
en el que el tampón 5x comprendía la siguiente mezcla:
50 ul de acetato de Trizma, 1 M, pH 8.0
25 ul de acetato de magnesio acuoso, 1 M
25 ul de acetato de potasio acuoso, 5 M
50 ul de tensioactivo Triton X-100 (10 %)
Agua hasta 1 ml
A continuación, se llevó a cabo la pirofosforólisis del oligonucleótido 1 incubando la mezcla a 37 °C durante 120 minutos y el producto de reacción resultante se analizó mediante electroforesis en gel.
Los resultados de este análisis se muestran en la figura 1, donde se puede observar que en presencia del oligonucleótido 2, el oligonucleótido 1 se degrada a la longitud a la que se funde del oligonucleótido 2, dejando un oligonucleótido acortado de aproximadamente 50 nucleótidos en longitud. Por el contrario, en presencia del oligonucleótido 3, no se observa pirofosforólisis debido al emparejamiento erróneo de un solo nucleótido en el extremo 3' del oligonucleótido 1. En presencia de los oligonucleótidos 4-6, la pirofosforólisis del oligonucleótido 1 avanza a la posición del emparejamiento erróneo de una sola base en cuyo punto se detiene, dejando un oligonucleótido acortado que no se degrada más.
Ejemplo 2: circularización de sonda degradada y digestión exonucleolítica de ADN no circularizado
Se prepararon los primeros oligonucleótidos de cadena sencillas 1 (SEQ ID NO: 7) y 2 (SEQ ID NO: 8), que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos:
1:
5'-
PCGCTCGATGTATACGCTCGGACCACTCGTACCTCGAACTGTCGTTAGTATTTTTATATGTAGTTTCTGAAGT
AGATATGGCAGCACATAATGAC-3'
2 :
5'-
PATGTTCGATGAGGCACGATATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGA
TATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAATAACCTCGTTTTTTATATGTAGTT-3'
En las que A, C, G y T representan nucleótidos que llevan la nucleobase característica relevante de ADN y P representa un grupo fosfato 5', y en los que el oligonucleótido 1 comprende un oligonucleótido 2 acortado como se obtendría mediante pirofosforólisis del oligonucleótido 2 contra un oligonucleótido diana adecuado.
También se preparó un tercer oligonucleótido 3 de cadena sencilla (SEQ ID NO: 9), que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
TATCGTGCCTCATCGAACATAACTACATATAAAAAACGAGGTTATTGGTTTGTGGC / 3ddC / en la que / 3ddC / representa un nucleótido de didesoxicitosina 3', y en la que el oligonucleótido 3 tiene un extremo 5' complementario al extremo 3' del oligonucleótido 1 y una región interna del oligonucleótido 2, y el extremo 3' complementario a los extremos 5' de los oligonucleótidos 1 y 2.
A continuación, se preparó una mezcla de reacción, que tenía una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
20 ul 5x tampón pH 8.0
oligonucleótido 10 ul 1 o 2, 3000 nM
oligonucleótido 10 ul 3, 3000 nM
ligasa de E. Coli 7U
agua hasta 100 ul
en el que el tampón 5x comprendía la siguiente mezcla:
acetato de Trizma 50 UL, 1 M, pH 8.0
25 ul de acetato de magnesio acuoso, 1 M
25 ul de acetato de potasio acuoso, 5 M
50 ul de tensioactivo Triton X-100 (10 %)
agua hasta 1 ml
A continuación, se llevó a cabo la ligación de oligonucleótidos incubando la mezcla a 37 °C durante 30 minutos.
Luego se preparó una segunda mezcla de reacción, que tiene una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
20 ul tampón 5x pH 8.0
exonucleasa III 125U o volumen de agua equivalente
agua hasta 100 ul
en el que el tampón 5x comprendía la siguiente mezcla:
acetato de Trizma 50 UL, 1 M, pH 8.0
25 ul de acetato de magnesio acuoso, 1 M
25 ul de acetato de potasio acuoso, 5 M
50 ul de tensioactivo Triton X-100 (10 %)
agua hasta 1 ml
A continuación, se combinaron la primera y la segunda mezclas de reacción y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 30 minutos para permitir la digestión exonucleolítica de cualquier ADN no circularizado. A continuación, la solución resultante se analizó mediante electroforesis en gel.
Los resultados de este análisis se muestran en la figura 2, donde se puede ver que el oligonucleótido acortado (oligonucleótido 1) se circulariza eficazmente mediante la reacción de ligación y sobrevive a la posterior digestión con exonucleasa, mientras que el oligonucleótido no acortado (oligonucleótido 2) no se circulariza y se digiere de manera eficiente.
Ejemplo 3: Amplificación de sonda circularizada
Se prepararon un par de cebadores oligonucleotídicos 1 (SEQ ID NO: 10) y 2 (SEQ ID NO: 11) de cadena sencilla, que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos:
1 :TGCTCAAGTATTGTCAAAGC
2: CGGCAGATATAGGATGTTGC
donde A, C, G y T representan nucleótidos que llevan la base nucleotídica característica relevante del ADN.
A continuación, se preparó una mezcla de reacción, que tenía una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
Tampón de reacción 20 ul 5x Phusion Flex HF
0.1 ul de mezcla de reacción final del ejemplo 2
Agua hasta 100 ul
También se preparó una segunda mezcla de reacción, que tiene una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
Tampón de reacción 20 ul 5x Phusion Flex HF
betaína 10 ul, 2.5 M
oligonucleótido 10 ul 1, 3000 nM
oligonucleótido 10 ul 2, 3000 nM
dNTP 10 ul, 2 mM
ADN polimerasa 2U Phusion Hot Start Flex
Agua hasta 100 ul
La segunda mezcla de reacción se combinó luego con 0.1 ul de la primera mezcla de reacción y la mezcla resultante se incubó a 98 °C durante 1 minuto seguido de 30 ciclos de (98 °C x 20 segundos; 55 °C x 30 segundos; 68 °C x 30 s) para permitir que tenga lugar la amplificación exponencial mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
El producto de reacción resultante se analizó luego mediante electroforesis en gel, cuyos resultados se muestran en la figura 3. A partir de este análisis puede verse que cuando el oligonucleótido acortado estaba presente en el Ejemplo 2 y se circularizó, se produce una gran cantidad de producto mediante esta amplificación. Por el contrario, cuando el oligonucleótido no acortado estaba presente en el Ejemplo 2 y no tuvo lugar ninguna circularización, no hubo amplificación observable del ADN.
Ejemplo 4: Pirofosforólisis utilizando análogos de pirofosfato
Se preparó un primer oligonucleótido 1 de cadena sencilla (SEQ ID NO: 12), que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
5'-ATGACCTCGTAAGCCAGTGTCAGAGFFTTQTTCCAGCCGT-3'
en la que A, C, G y T representan nucleótidos que llevan la nucleobase característica relevante de ADN; F representa un nucleótido de desoxitimidina (T) marcado con colorante Atto 594 usando química de unión de amina convencional y Q representa un nucleótido de desoxitimidina marcado con un apagador BHQ-2.
También se preparó otro oligonucleótido 2 de cadena sencilla (SEQ ID NO: 13), que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
5 '-TTCACACGGCTGGAAAAAAACTCTGACACTGGCTTACGAGGTCATTAGATX-3'
En la que X representa un nucleótido 3' dT invertido, de modo que cuando el oligonucleótido 2 se híbrida con el oligonucleótido 1, el extremo 3' del oligonucleótido 1 está rebajado, lo que lo convierte en una diana para la pirofosforólisis, mientras que el extremo 3' del oligonucleótido 2 está protegido de la pirofosforólisis por la presencia del nucleótido invertido terminal.
A continuación, se preparó una mezcla de reacción, que tenía una composición correspondiente a la derivada de la siguiente formulación:
5x tampón 20 ul pH 8.0
oligonucleótido 110 ul, 1000 nM
oligonucleótido 2 10 ul, 1000 nM
ADN polimerasa Mako 2.5 U (por ejemplo, Qiagen Beverly)
pirofosfato inorgánico 10 ul de, 6 mM O imidodifosfato, 10 mM O agua
Agua hasta 100 ul
en el que el tampón 5x comprendía la siguiente mezcla:
Acetato de Trizma SOuL, 1 M, pH 8.0
25 ul de acetato de magnesio acuoso, 1 M
25 ul de acetato de potasio acuoso, 5 M
50 ul de tensioactivo Triton X-100 (10 %)
Agua hasta 1 ml
A continuación, se llevó a cabo la pirofosforólisis del oligonucleótido 1 incubando la mezcla a 37 °C durante 75 minutos. A medida que el oligonucleótido 1 fue pirofosforolizado progresivamente, las moléculas de colorante fluorescente se separaron de los apagadores y luego fueron capaces de generar una señal fluorescente. El crecimiento de esta fluorescencia durante la incubación se monitorizó utilizando un lector de microplacas CLARIOStar (ejemplo, BMG Labtech) y se usó para inferir la velocidad de pirofosforólisis del oligonucleótido en presencia de pirofosfato inorgánico, imidodifosfato o agua.
Los resultados de este experimento se muestran gráficamente en la figura 4. De esto se puede ver que la pirofosforólisis procede en presencia de pirofosfato o imidodifosfato, pero no en su ausencia. De manera similar, en un experimento comparativo en el que no había polimerasa presente, no se generó señal fluorescente. La pirofosforólisis en presencia de pirofosfato produce nucleótidos trifosfatos libres, mientras que la pirofosforólisis en presencia de imidodifosfato produce nucleótidos trifosfatos libres modificados con un grupo NH en lugar de O entre los fosfatos beta y gamma (2-desoxinucleósido-5'-[(p, Y)-imido]trifosfatos).
Ejemplo 5: Análisis de la curva de fusión
Los métodos de la presente invención se realizaron para detectar la presencia de, e identificar, tres mutaciones diferentes que pueden ocurrir en el gen EGFR humano: T790M (exón 20), C797S (exón 20) y L861Q (exón 21). Se prepararon seis muestras que contenían ADN genómico de tipo silvestre. A tres de estas muestras se les añadió una única secuencia mutante sintética para cada una de las tres mutaciones de interés, de modo que la fracción final del alelo mutante en estas muestras fue del 1 %. A cada muestra se le añadió una sonda oligo A0 diseñada para la detección de una única mutación diferente:
T790M (SEQ ID NO 14): 5’-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAGCACGGCAGATATAGGATGTTGCGAAGGGCATGAGCTGCAT GATGAGCTG -3'
C797S (SEQ ID NO 15): 5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAAGCTCGCAGATATAGGATGTTGCGATAGTCCAGGAGGCTGC-3'
L861Q(SEQID NO 16): 5'-
PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGATCCGCACCCAGCTGTTTG
GC-3'
Las muestras se sometieron a pirofosforólisis mediante la adición de ion pirofosfato inorgánico y ADN polimerasa Mako e incubación a 41 °C. Después de la pirofosforólisis de los oligos de sonda, se realizó la ligación mediante la adición de E. Coli Ligase y oligos de puente con las siguientes secuencias:
T790M (SEQ ID NO: 17): 5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATGCCCTTCGCAACATCT-3'
C797S (SEQ ID NO: 18): 5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATTCCTGGACTATCGCAT-3'
L861Q (SEQ ID NO: 19): 5'-AGCTCATCGAACATCTGGGTGCGGATCGCAACAA-3'
Después de la ligación, las muestras se sometieron a amplificación por círculo rodante hiperramificado mediante la adición de dNTP, ADN polimerasa BstLF, colorante intercalante Sybr Green, un cebador directo específico de mutación y un cebador inverso universal que tiene las secuencias siguientes, seguido de incubación a 60 °C. durante 70 minutos.
T790M (SEQ ID NO: 20): 5-ACATCCTATATCTGCCGT-3'
C797S (SEQ ID NO: 21): 5'-CATCGAACATTCCTGGACTA-3'
L861Q (SEQ ID NO: 22): 5'-TCATCGAACATCTGGGTGCG-3'
Cebador inverso universal (SEQ ID NO: 23): 5'-ATGTTCGATGAGCTTTGACA-3'
A continuación, se aumentó la temperatura de las muestras de 70 °C a 95 °C y se tomó una medición de fluorescencia cada 0.5 °C. Las curvas de datos resultantes se diferenciaron para producir picos de fusión, cuyos resultados se muestran en la figura 5. Se puede ver que la presencia de un pico de fusión significativo puede, por lo tanto, usarse para inferir la presencia de la mutación dirigida por una sonda determinada, mientras que la posición de este pico puede usarse para identificar la naturaleza de la mutación.
Ejemplo 6: Aplicaciones y usos
Las siguientes aplicaciones descritas a continuación proporcionan algunos ejemplos de cómo se pueden aplicar los métodos de la presente invención.
Diagnósticos complementarios
Los métodos de la presente invención pueden usarse para detectar marcadores genéticos específicos en una muestra que puede usarse para ayudar a guiar la selección de la terapia apropiada. Estos marcadores pueden ser mutaciones específicas de tumores, o pueden ser secuencias genómicas de tipo silvestre, y pueden detectarse usando tejido, sangre o cualquier otro tipo de muestra del paciente.
Monitorización de resistencia
Las pruebas repetidas de muestras de pacientes durante el tratamiento de la enfermedad pueden permitir la detección temprana de la resistencia desarrollada a la terapia. Un ejemplo de esta aplicación es el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en el que los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, gefitinib, erlotinib) se utilizan comúnmente como tratamientos de primera línea. Durante el tratamiento, el tumor a menudo puede desarrollar mutaciones en el gen EGFR (por ejemplo, T790M, C797S) que confieren resistencia al fármaco. La detección temprana de estas mutaciones puede permitir la transferencia del paciente a terapias alternativas (por ejemplo, Tagrisso).
Normalmente, los pacientes a los que se monitoriza el inicio de la resistencia pueden estar demasiado enfermos para que se lleve a cabo una biopsia de tejido repetida. La biopsia de tejido repetida también puede ser costosa, invasiva y conlleva riesgos asociados. Es preferible realizar la prueba a partir de sangre, pero puede haber un número muy bajo de copias de las mutaciones de interés en una muestra de sangre razonable. Por lo tanto, la monitorización requiere pruebas sensibles a partir de muestras de sangre utilizando un método de la presente invención en el que el método es sencillo y rentable de llevar a cabo de manera que se pueda realizar con regularidad.
Monitorización de recurrencia
En este ejemplo de aplicación, los pacientes que han sido declarados libres de enfermedad después del tratamiento pueden ser monitorizados a lo largo del tiempo para detectar la recurrencia de la enfermedad. Esto debe realizarse de forma no invasiva y requiere una detección sensible de las secuencias diana de las muestras de sangre. Al usar el método de la presente invención, proporciona un método simple y de bajo coste que se puede realizar con regularidad. Las secuencias dirigidas pueden ser mutaciones genéricas conocidas por ser comunes en la enfermedad de interés, o pueden ser paneles personalizados de dianas diseñados para un paciente específico basándose en la detección de variantes en el tejido tumoral antes de la remisión.
Monitorización de Enfermedad Mínima Residual (MRD)
Para algunos cánceres, hay células cancerosas residuales que permanecen en un paciente después del tratamiento, es una causa principal de recaída en el cáncer y la leucemia. La monitorización y las pruebas de ERM tienen varias funciones importantes: determinar si el tratamiento ha erradicado el cáncer o si quedan rastros, comparar la eficacia de diferentes tratamientos, monitorizar el estado de remisión del paciente, así como detectar la recurrencia de la leucemia y elegir el tratamiento que mejor cubra esas necesidades.
Cribado
El cribado poblacional para la detección temprana de enfermedades ha sido una meta de larga data, particularmente en el diagnóstico del cáncer. El desafío es doble: la identificación de paneles de marcadores que permitan una detección segura de la enfermedad sin demasiados falsos negativos, y el desarrollo de un método con suficiente sensibilidad y coste lo suficientemente bajo. Los métodos de la presente invención podrían usarse para abordar paneles de mutaciones más grandes que las pruebas basadas en PCR, pero con un flujo de trabajo mucho más simple y menor coste que los diagnósticos basados en secuenciación.
Rechazo de trasplante de órganos
Cuando el receptor rechaza un órgano trasplantado, el ADN de este órgano se vierte en el torrente sanguíneo del receptor. La detección temprana de este ADN permitiría la detección temprana del rechazo. Esto podría lograrse usando paneles personalizados de marcadores específicos del donante, o usando paneles de variantes que se sabe que son comunes en la población, algunas de las cuales estarán presentes en el donante y otras en el receptor. La monitorización de rutina de los receptores de órganos a lo largo del tiempo podría ser posible mediante el bajo coste y el flujo de trabajo simple de la presente invención divulgada en el presente documento.
Prueba prenatal no invasiva (NIPT)
Se sabe desde hace mucho tiempo que el ADN fetal está presente en la sangre materna, y el mercado de NIPT está ahora bastante saturado de empresas que utilizan la secuenciación para identificar mutaciones y contar el número de copias de cromosomas específicos para permitir la detección de anomalías fetales. Los métodos de la presente invención, tal como se divulgan en el presente documento, tienen la capacidad de detectar mutaciones en fracciones de alelos muy bajas, permitiendo potencialmente una detección más temprana del ADN fetal. La identificación de mutaciones comunes en una población determinada permitiría desarrollar ensayos que se dirijan a mutaciones diana que pueden estar presentes en el ADN materno o fetal o para permitir la detección de anomalías en una etapa más temprana del embarazo.
Ejemplo 7: Técnicas de multiplexación de un solo pocillo
En algunos casos, existen grupos de mutaciones o secuencias diana para las que debe identificarse la presencia pero no la identidad de cualquiera de las dianas. En otros, se requiere información tanto sobre la presencia como sobre la identidad de la mutación o secuencias. En ambos casos, es beneficioso multiplexar la reacción de manera que se analicen múltiples dianas en un solo volumen de reacción. Esto conduce a una mayor eficiencia del proceso, aumentando el número de muestras que se pueden procesar a la vez o el tamaño del panel de la diana que se pueden analizar. Cuando se requiere la presencia, pero no la identidad de una secuencia diana, la multiplexación puede ser tan simple como combinar las sondas para múltiples dianas en un solo volumen de reacción. Una ventaja clave de los métodos de la presente invención sobre la PCR estándar es que se puede usar un solo conjunto de cebadores para amplificar todas las sondas “activadas” (A2) en la etapa final de la reacción.
Usando deleciones de Exon19 en el gen EGFR, los inventores han demostrado una detección multiplexada de 10 veces a una frecuencia de alelos mutantes (MAF) del 0.1 % en una única reacción.
Se prepararon 20 muestras, cada una de las cuales comprendía ADN de tipo silvestre (WT) enriquecido con un 0.1 % o un 0.5% de una de las 10 deleciones de Exon19 diferentes. Se usó como control una muestra adicional que comprendía solo ADN de WT. Se agregaron sondas para la detección de las 10 mutaciones diferentes de Exon19 a cada muestra y la reacción se realizó usando condiciones estándar. Los resultados (véase la Figura 6) muestran una detección clara de cada mutación tanto al 0.5 % como al 0.1 % de MAF.
La detección se puede realizar usando técnicas estándar: colorante intercalante, sondas marcadas (Taqman, Scorpion, cebadores de tallo-bucle), balizas moleculares o cualquiera de las otras técnicas estándar que conocerá el experto en la técnica.
Cuando se requiere la identidad de la diana, lo más probable es que se utilice un sistema multicolor para identificar qué sonda se ha activado (A2). Esto naturalmente requiere un diseño de sonda en el que haya diferentes secuencias de “códigos de barras” en las sondas para diferentes dianas, que luego se utilizan para la identificación. Luego, la identificación se puede realizar como se discutió anteriormente.
Además de la detección multiplexada de 10 plex usando 1 color, los inventores también han demostrado la detección de dos colores en un solo pocillo en las implementaciones de amplificación lineal y de círculo rodante de los métodos actuales (el primero usando sondas Taqman, el último utilizando cebadores de tallo-bucle). En este ejemplo, se prepararon muestras que contenían la mutación T790M o la mutación C797S en fracciones alélicas de 0 %, 0.1 % y 0.5 %. Después de la pirofosforólisis y la ligación posterior, las muestras se sometieron a un círculo rodante o amplificación por PCR lineal utilizando cebadores o sondas específicas para las sondas de selección de mutaciones A0 marcadas con diferentes fluoróforos. Los resultados de la amplificación del círculo rodante utilizando cebadores de tallo-bucle marcados se muestran en la figura 7 en la que se puede ver que la señal se genera en el canal de detección Cy5 en presencia de la mutación T790M, mientras que la señal se observa en el canal TexasRed en muestras que contienen la mutación C797S.
Ejemplo 8: uso de sondas de control para la calibración de la señal de trasfondo
Se prepararon tres muestras 1-3, cada una de las cuales comprendía una concentración final 100 nM de un oligonucleótido sintético 1 (SEQ ID NO: 24) que comprende la secuencia de tipo silvestre de la región de mutación L858R del exón 21 del gen EGFR humano:
5'-
CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG
CAGAAGGAGG-3'
Se preparó un oligonucleótido 2 “mutante' sintético (SEQ ID NO: 25), que tiene la siguiente secuencia derivada de la misma región del gen EGFR y que además comprende la mutación L858R:
5'-
CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG
CAGAAGGAGG-3'
Se añadió el oligonucleótido 2 a las muestras 2 y 3 a concentraciones finales de 100 pM y 1 nM, respectivamente, de modo que el 0.1 % de las moléculas que comprenden el sitio de mutación L858R en la muestra 2 y el 1 % de las de la muestra 3 incluían esta mutación. Luego, cada muestra se dividió en dos volúmenes de reacción. Al primer volumen de reacción se le añadió una sonda de ensayo de oligonucleótido 3 (SEQ ID NO: 26) a una concentración final de 10 nM que comprendía un extremo 3' que coincidía perfectamente con la región de secuencia de L858R mutada, mientras que al segundo volumen se añadió una sonda de control de oligonucleótido 4 (SEQ ID NO: 27) a la misma concentración que comprendía la misma secuencia distinta de la región de mutación L858R en la que comprendía una secuencia que no coincidía con los alelos mutantes y de tipo silvestre:
Oligonucleótido 3:
5'-
PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGACAGTTTGGCCCGCCCAA
A-3'
Oligonucleótido 4:
5'-
PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGACAGTTTGGCCGGCCCAA
A-3'
A continuación, los volúmenes de reacción se sometieron a pirofosforólisis mediante la adición de ion pirofosfato 0.6 mM y ADN polimerasa de Mako 37.5 U/ml y se calentaron a 41 °C durante 30 minutos. Después de esta reacción, se añadió un oligonucleótido de puente 5 (SEQ ID NO: 28) a cada volumen de reacción a una concentración final de 10 nM junto con 50 U/ml de pirofosfatasa inorgánica termoestable y 100 U/ml de ligasa de E. coli y todas las sondas

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una secuencia de polinucleótidos diana en un analito de ácido nucleico determinado, caracterizado por las etapas de:
a. hibridar el analito con un oligonucleótido A0 de sonda de cadena sencilla, que comprende un extremo 3' que es perfectamente complementario a la secuencia del polinucleótido diana, para crear un primer producto intermedio en el que el extremo 3' de A0 forma un complejo de cadena doble con la secuencia diana del analito;
b. pirofosforolizar el primer producto intermedio con una enzima pirofosforolizante en la dirección 3'-5' desde el extremo 3' de A0 para crear la cadena A1 parcialmente digerida y el analito, en el que cuando A0 se hibrida erróneamente con una secuencia no diana, la reacción de pirofosforólisis se detiene ante cualquier emparejamiento erróneo, evitando que continúen las etapas posteriores del método;
en el que la reacción de pirofosforólisis de (b) continúa hasta que A1 carece de complementariedad suficiente con el analito o una región diana en el mismo para formar un dúplex estable y se separa del mismo;
c. (i) hibridar A1 con un oligonucleótido desencadenante B de cadena sencilla y extender la cadena A1 en la dirección 5'-3' contra B, en la que B está compuesto por una región oligonucleotídica complementaria al extremo 3' de A1 con una región oligonucleotídica flanqueante en su extremo 5' que no es sustancialmente complementario de A0 ; o (ii) circularizar A1 mediante ligación de sus extremos 3' y 5'; o (iii) ligar el extremo 3' de A1 al extremo 5' de un oligonucleótido C de sonda de ligación; en cada caso para crear un oligonucleótido A2 ;
en el que la ligación se realiza mediante la adición de un oligonucleótido D de puente adicional con el que A1 se hibrida antes de la ligación, en el que D comprende una región de oligonucleótidos complementaria al extremo 3' de A1 y una región complementaria al extremo 5' del oligonucleótido C o al extremo 5' de A1;
d. cebar A2 con al menos un oligonucleótido cebador de cadena sencilla y crear múltiples copias de A2, o una región de A2 ; y
e. detectar una señal derivada de las múltiples copias e inferir a partir de ella la presencia o ausencia de la secuencia diana del polinucleótido en el analito.
2. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1 en el que se emplea c (ii) o c (iii), caracterizado porque Ai se extiende primero en la dirección 5'-3' antes de la ligación.
3. Un método como se reivindicó en la reivindicación 2 caracterizado porque el oligonucleótido D es incapaz de experimentar extensión contra Ai en virtud de una modificación 3' o por un desajuste entre el extremo 3' de D y la región correspondiente de Ai.
4. Un método como se reivindicó en las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado además porque la mezcla de reacción se trata con una exonucleasa después de la etapa (c) para digerir sustancialmente cualquier material de ácido nucleico no ligado y en el que si c (iii) se emplea, el oligonucleótido C además comprende una modificación 3' o interna que la protege de la digestión con exonucleasa 3'-5'.
5. Un método como se reivindicó en la reivindicación 4 caracterizado además porque la exonucleasa se desactiva antes de la etapa (d).
6. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1 en el que se emplea c (i), caracterizado porque B comprende (i) una región oligonucleotídica complementaria al extremo 3' de A1 y (ii) una región oligonucleotídica flanqueante en su extremo 5' que no es sustancialmente complementario a A0 o la secuencia diana y porque uno de los oligonucleótidos cebadores usados en la etapa (d) se hibrida con la región extendida de A2.
7. Un método como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque el oligonucleótido A0 de sonda tiene un extremo 5' que es resistente a la exonucleólisis y porque después de las etapas (a) y (b) el medio de reacción producido a partir del mismo se trata con una exonucleasa 5'-3' para eliminar sustancialmente cualquier molécula de ácido nucleico que no se vuelva resistente a esta exonucleólisis.
8. Un método como se reivindicó en la reivindicación 7 caracterizado porque la exonucleasa utilizada tiene una actividad dependiente al menos en parte de la presencia de un grupo fosfato 5' y porque la digestión se lleva a cabo en presencia de una quinasa y un donante de fosfato.
9. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de una fosfatasa.
10. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado además porque las etapas (a) y (b) se repiten para crear múltiples copias de la sonda A1 parcialmente digerida a partir del analito.
11. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque la reacción de pirofosforólisis se detiene después de la etapa (b) mediante la adición de una pirofosfatasa.
12. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque la etapa (e) comprende detectar una señal derivada de las múltiples copias usando uno o más tintes de unión de oligonucleótidos o sondas moleculares.
13. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque las etapas (d) y (e) se realizan simultáneamente; y caracterizado además porque el aumento de la señal a lo largo del tiempo resultante de la generación de amplicones en la etapa (d) se usa para inferir la concentración de la secuencia diana en el analito.
14. Un método como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque antes de la etapa (a) el analito de cadena sencilla se deriva de una muestra biológica mediante las etapas de (i) producir amplicones del analito sometiendo una muestra biológica comprendida del analito y opcionalmente ADN genómico de trasfondo a ciclos de amplificación y (ii) digerir el producto de la etapa (i) con una exonucleasa que tiene actividad exonucleolítica 5'-3', en el que uno de los cebadores empleados incluye un grupo bloqueador de exonucleasa;
15. Un método como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 caracterizado porque antes de la etapa (a) el analito de cadena sencilla se deriva de una muestra biológica mediante las etapas de (i) producir amplicones del analito sometiendo una muestra biológica comprendida del analito y opcionalmente del ADN genómico de trasfondo a ciclos de amplificación, en los que uno de los cebadores empleados se introduce en exceso sobre el otro o los otros;
16. Un método como se reivindicó en las reivindicaciones 14 o 15 caracterizado porque el método de amplificación usado en la etapa (i) emplea una polimerasa que exhibe actividad exonucleasa 3'-5' y en el que después de la etapa (i) el producto reacciona con una proteinasa para destruir la polimerasa, y en la que la proteinasa se destruye luego calentando el producto de esta reacción.
17. Un método como se reivindicó en las reivindicaciones 14 a 16 caracterizado porque la etapa (i) se lleva a cabo usando trifosfato de desoxiuridina en lugar de trifosfato de desoxitimidina y en presencia de UTP-ADN glicolasa.
18. Un método como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque se emplean múltiples sondas A0 , cada una selectiva para una secuencia diana diferente y cada una incluye una región de identificación, y además se caracteriza porque la región amplificada en la etapa (d) incluye esta región de identificación; y caracterizado además porque la(s) sonda(s) A0 de la que se derivan los amplicones generados en la etapa (d), y por lo tanto la secuencia diana presente en el analito, se infieren mediante la detección de la(s) región(es) de identificación usando sondas moleculares o mediante secuenciación.
19. Un método como se reivindicó en la reivindicación 18 en el que (e) comprende además las etapas de:
i. marcar las múltiples copias de A2, o una región de A2 usando uno o más tintes de unión fluorescentes de oligonucleótidos o sondas moleculares;
ii. medir la señal fluorescente de las múltiples copias;
iii. exponer las múltiples copias a un conjunto de condiciones desnaturalizantes; y
iv. identificar la secuencia diana del polinucleótido en el analito al monitorizar los cambios en la señal fluorescente de las múltiples copias durante la exposición a las condiciones de desnaturalización.
20. Un método como se reivindicó en las reivindicaciones 1 a 17 caracterizado porque antes de la etapa (a) el analito se divide en múltiples volúmenes de reacción, cada volumen tiene un oligonucleótido Ao de sonda diferente introducido para detectar una secuencia diana diferente.
21. Un método como se reivindicó en las reivindicaciones 18 a 20 caracterizado porque las diferentes sondas Ao comprenden un sitio de cebado común, lo que permite usar un único o único conjunto de cebadores para la amplificación en la etapa (d).
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