KR20210033981A

KR20210033981A - 개선된 폴리뉴클레오티드 서열 탐지 방법

Info

Publication number: KR20210033981A
Application number: KR1020217001237A
Authority: KR
Inventors: 바나비 바름포르트; 카메론 프라이링; 아나 실바-웨테르리; 막달레나 스토라렉-야누스크지위츠
Original assignee: 바이오피델리티 엘티디
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-03-29
Also published as: EP3682030B1; CN116334190A; AU2019307835B2; CN112424379B; US20210180122A1; JP2021524287A; CN112424379A; EP3682030A1; KR102589502B1; JP6947464B2; CA3103754C; IL280222A; SG11202100163TA; US10961569B2; ES2874753T3; US20200354786A1; US11999996B2; AU2019307835A1; WO2020016590A1; CA3103754A1

Abstract

개선된 폴리뉴클레오티드 서열 탐지 방법
다음 단계를 특징으로 하는 주어진 핵산 분석 물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법:
a. 상기 분석물을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 3' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;
b. 상기 제 1 중간 산물을 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소를 이용하여 파이로인산첨가분해시켜 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁과 상기 분석물을 생성시키고;
c. (i) A₁을 단일-가닥으로 된 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링시키고, B에 대해 5'-3' 방향으로 A₁ 스트랜드를 연장시키고; 또는 (ii) 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰을 통하여 A₁을 원형화시키고; 또는 (iii) A₁의 3' 단부를 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부에 결찰시키고; 각 경우에 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성되며;
d. A₂를 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍시켜, A₂또는 A₂ 영역의 다수 복사체를 생성시키고; 그리고
e. 상기 다수 복사체로부터 유래된 신호를 탐지하고, 이로부터 당해 분석물 안에 당해 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추한다.

Description

개선된 폴리뉴클레오티드 서열 탐지 방법

본 발명은 암, 감염성 질환 및 이식 장기 거부의 식별에 이용되는 것들을 포함한, 다수의 진단 마커의 존재를 테스트하는데 적합한 개선된 폴리뉴클레오티드 서열 탐지 방법에 관한 것이다. 마커 패널을 신뢰할 수 있고, 저렴한 비용으로 식별해야 하는 동반 진단 테스트에도 또한 유용한다.

중합효소 쇄 반응 (PCR)은 실험실 샘플 및 진단 샘플에 존재하는 DNA 또는 RNA를 안정적으로 검출 및/또는 정량화할 수 있는 시점까지 이들을 증폭시키기 위하여 잘-알려진 강력한 기술이다. 그러나, 이러한 분자가 낮은-수준으로 포함된 분석물 샘플을 조사할 목적으로 적용할 경우, 여러 가지 한계가 있다. 첫째, 이 기술은 단일 표적 분자만 검출할 수 있지만, 샘플에 존재하는 다른 핵산 서열의 원치 않는 증폭으로 인해 위양성 결과를 생성하는 경향이 있다. 이것은 반응 키를 시작하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택하게 하는데; 이는 프라이머가 특이성 상대적 복합체의 필요한 수준을 갖도록 기획하게 만든다. 그 결과 오늘날 시중에 나와있는 많은 PCR-기반 검사는 특이성이 제한되어 있다.

두 번째 단점은 PCR-기반 방법의 다중화가 실제로 최대 10 개의 표적 서열 (대개 10 개를 넘지 않음)로 제한되며 프라이머-프라이머 상호 작용을 피하여 상대적으로 좁은 작동 창을 필요로 한다는 것이다.

또 다른 문제는 PCR 반응이 기하 급수적으로 순환하기 때문에, 표적의 정량화가 어렵고; 반응 효율의 작은 변화는 생성되는 검출가능한 물질의 양에 큰 영향을 미친다. 적절한 제어 및 교정이 있더라도 정량화는 일반적으로 약 3 배 이내의 정확도로 제한된다.

마지막으로, PCR 증폭 방법으로 조사 대상 영역의 돌연변이는 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 표적 유기체가 시험 프라이머에 의해 표적화된 유전자 영역에서 돌연변이를 일으켜 많은 수의 위음성이 발생하여 FDA-승인 테스트를 철회해야 하는 경우가 있었다. 반대로, 특이적 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 증폭을 위해 표적화되는 경우, PCR 방법은 야생형 변이체가 존재할 때 종종 위양성을 제공한다. 이를 방지하려면, 매우 신중한 프라이머 디자인이 필요하며, 멀티플렉싱의 효율성을 더욱 제한한다. 이것은 암 검사/검진 또는 동반 진단의 일반적인 요구 사항 인 SNPs 패널을 검색할 때 특히 관련있다.

발명의 요약

우리는 이러한 한계를 극복하기 위해 이전의 시퀀싱 특허 (예: WO 2016012789 참조)에 사용된 파이로인산첨가분해반응(pyrophosphorolysis) 방법을 사용한 경험을 바탕으로 새로운 방법을 개발했다. 그렇게 함으로써, 파이로인산첨가분해반응의 이중-가닥 특이성을 이용하고; 기들을 차단하거나 또는 뉴클레오티드 미스매치를 차단하는 것을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 기질 또는 이중-가닥 기질로는 효율적으로 진행되지 않는 반응이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 다음의 단계들에 의해 특징화된, 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 탐지하는 방법이 제공된다:

a. 상기 분석물을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 3' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;

b. 상기 제 1 중간 산물을 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소를 이용하여 파이로인산첨가분해시켜 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁과 상기 분석물을 생성시키고;

c. (i) A₁을 단일-가닥으로 된 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링시키고, B에 대해 5'-3' 방향으로 A₁ 스트랜드를 연장시키고; 또는 (ii) 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰을 통하여 A₁을 원형화시키고; 또는 (iii) A₁의 3' 단부를 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부에 결찰시키고; 각 경우에 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성되며;

d. A₂를 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍시켜, A₂또는 A₂ 영역의 다수 복사체를 생성시키고; 그리고

e. 상기 다수 복사체로부터 유래된 신호를 탐지하고, 이로부터 당해 분석물 안에 당해 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추한다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 분석물은 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 자연 발생 또는 합성 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 분석물은 전형적으로 이를 함유하는 수용액 및 다른 생물학적 물질에 존재할 것이고, 한 구체예에서 상기 분석물은 시험 목적에 관심 대상이 아닌 다른 배경 핵산 분자와 함께 존재할 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 분석물은 이들 다른 핵산 성분에 비해 적은 양으로 존재할 것이다. 바람직하게는, 예를 들면, 상기 분석물이 세포 물질을 포함하는 생물학적 표본으로부터 파생되는 경우, 당해 방법의 단계 (a)를 수행하기 전, 이러한 다른 핵산 및 외부 생물학적 물질의 일부 또는 전부는 샘플-준비 기술, 이를 테면, 여과, 원심 분리, 크로마토그래피 또는 전기영동을 사용하여 제거될 것이다. 적합하게는, 상기 분석물은 혈액, 혈장, 가래, 소변, 피부 또는 생검과 같은 포유동물 대상체 (특히, 인간 환자)로부터 채취된 생물학적 샘플에서 가려온다. 한 구체예에서, 상기 생물학적 샘플은 존재하는 임의의 세포를 파괴하여 당해 분석물이 방출되도록, 용해될 것이다. 다른 구체예들에서, 상기 분석물은 샘플 자체 내에 이미 자유 형태로 존재할 수 있는데; 예를 들어 혈액이나 혈장에서 순환하는 무-세포 DNA로 존재할 수 있다.

도 1: 실시예 1의 반응 산물의 겔 전기영동 이미지. 올리고뉴클레오티드 2의 존재 하에, 올리고뉴클레오티드 1이 올리고뉴클레오티드 2로부터 용융되는 길이로 분해되어, 약 50개의 뉴클레오티드 길이로 단축된 올리고뉴클레오티드가 남는 것을 알 수 있다. 반대로, 올리고뉴클레오티드 3의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부에서 단일 뉴클레오티드 미스매치(mismatch)로 인해 파이로인산첨가분해반응이 관찰되지 않는다. 올리고뉴클레오티드 4-6의 존재 하에, 올리고뉴클레오티드 1의 파이로인산첨가분해반응은 단일 염기 미스매치의 위치로 진행되며, 그 지점에서 중지되어 단축된 올리고뉴클레오티드가 남게 되며, 이는 더 이상 분해되지 않는다.
도 2: 실시예 2의 반응 산물의 겔 전기영동 이미지. 상기 단축된 올리고뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드 1)는 결찰 반응에 의해 효율적으로 원형화되고, 후속적인 엑소뉴클레아제 분해(digestion)에서 살아남는 반면, 단축-안된 올리고뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드 2)는 원형화되지 않고, 효과적으로 절단됨을 볼 수 있을 것이다.
도 3: 실시예 3의 반응 산물의 겔 전기영동 이미지. 상기 단축된 올리고뉴클레오티드가 존재하고, 원형화될 때, 실시예 2에서 다량의 산물이 이러한 증폭에 의해 생성될 수 있음을 알 수 있다. 역으로, 상기 단축-안된 올리고뉴클레오티드가 실시예 2에 존재하고, 원형화가 일어나지 않았을 때, 관찰가능한 DNA의 증폭은 없었다.
도 4: 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정된 형광 트레이스. 파이로인산첨가분해반응은 피로포스페이트 또는 이미도디포스페이트의 존재 하에서 진해오디지만, 그러나 이들의 부재하에서는 진행되지 않음을 볼 수 있다. 유사하게, 중합 효소가 존재하지 않는 비교 실험에서는 형광 신호가 생성되지 않았다. 피로포스페이트 존재하에서 파이로인산첨가분해반응으로 자유 뉴클레오티드 트리포스페이트가 생성되지만, 한편으로 이미도디포스페이트 존재 하에서 파이로인산첨가분해반응으로 베타 및 감마 포스페이트 (2'-데옥시뉴클레오시드-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트) 사이에 O 대신에 N-H기를 갖는 변형된 자유 뉴클레오티드 트리포스페이트가 생성된다.
도 5: EGFR 유전자에 발생될 수 있는 하기 상이한 3 가지 돌연변이에 대해 프라이머를 이용하여 실시예 5에서 롤링 서클 증폭으로부터 생성된 증푹 산물에 대한 용융 피크 결과: (i)T790M (엑손 20), (ii) C797S (엑손 20) 및 (iii) L861Q (엑손 21). 0.5℃ 간격으로 측정하여, 온도를 95℃로 올렸다. (iv)에서, 용융 피크의 위치를 사용하여 돌연변이 즉, T790M, C797S 또는 L861Q가 존재하는지 확인할 수 있다.
도 6: 실시예 7에 기재된 바와 같이, 0.1% 및 0.5% 돌연변이 대립 유전자 빈도 (MAF)에서 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 엑손19 돌연변이의 단일-웰 10-플렉스 검출에 대한 야생형 (WT)에 대한 신호 결과.
도 7: 야생형에 대한 신호는 실시 예 7에 기재된 바와 같이 단일 웰에서 0.1% 및 1%에서 T790M (i) 및 C797S (ii) EGFR 돌연변이의 동시 검출 및 식별을 위해 두 가지 색상을 생성한다.
도 8: (i) 실시예 8에 기재된 바와 같이, 검정 및 대조군 프로브로부터의 L858R EGFR 돌연변이의 존재 하에 관찰된 야생형에 대한 신호 및 (ii) 각 샘플에 대해 검정 프로브의 신호로부터 대조군 프로브 신호를 뺀 결과.
도 9: 본 발명의 방법의 단계 a 내지 b의 하나의 구체예. 단계 a에서, 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되어, 제 1 중간 산물이 생성되는데, 이의 적어도 부분적은 이중-가닥으로 되어 있고, 이때 A₀의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다. 본 발명의 이러한 단순화된 구체예에서, 표적에 어닐링되지 않은 어떻게 A₀가 당해 방법의 추가 단계에 참여하지 않는지를 설명하기 위해, 존재하는 A₀의 두 개 분자와 하나의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 있다. 단계 a의 이러한 예시적인 실시예에서, A₀의 3' 단부는 당해 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 반면, A₀의 5' 단부는 그렇지 않다. A₀의 5' 단부는 5' 화학적 차단 기, 공통 프라이밍 서열 및 바코드 영역을 포함한다.
단계 b에서, 상기 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물 은 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소에 의해 피로포스포릴화되어 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁, 분석물, 그리고 단계 a에서 표적에 어닐링되지 않은 분석물이 생성된다.
도 10: 본 발명의 방법의 단계 c(i) 및 d. 단계 c (i)에서, A₁은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐되며, A₁ 스트랜드는 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성된다. 이러한 예시적인 실시예에서, 트리거 올리고뉴클레오티드 B는 5' 화학적 블록을 갖는다. 방법의 단계 b에서 분해되지 않은 A₀는 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되지만, 단계 d의 증폭 프라이머에 대한 표적인 서열을 생성하기 위해 B에 대해 5'-3 '방향으로 연장될 수 없다.
단계 d에서, A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다.
도 11: 본 발명의 방법의 단계 c(ii) 및 d의 한 구체예. 단계 c(ii)에서, A₁은 스플린트(splint) 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링되고, 그 다음 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰에 의해 원형이 된다. 단계 d에서, 이제 원형화된 A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다. 이러한 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형 (이 예시에서 화학적)으로 인해, 또는 D의 3 '단부와 A₂의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치를 통해 A₁에 대해 연장될 수 없다.
단계 d에서, A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다.
도 12: 본 발명의 방법의 단계 c (iii) 및 d의 하나의 구체예 단계 c(iii에서), 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 3' 영역은 A₁의 3' 영역에 어닐링되고, 한편 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 영역은 결찰 프로브 C의 5' 영역에 어닐링된다. 따라서, A₁, C 그리고 C의 5' 단부를 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A₁의 연장에 의해 형성된 중간 영역을 임의선택적으로 포함하는 제 2 중간 산물 A₂가 형성된다. 이러한 예시적인 예에서, 상기 결찰 프로브 C는 3' 화학적 차단 기를 갖고, 3'-5' 엑소뉴클레아제는 증폭 단계 d에 앞서, 임의의 비-결찰된 A₁을 분해하는데 이용될 수 있다.
단계 d에서, A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다.

본 발명에 따르면, 다음 단계를 특징으로 하는 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공된다:

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 분석물은 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열 (들)을 포함하는 자연 발생 또는 합성 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 분석물은 전형적으로 이를 함유하는 수용액 및 다른 생물학적 물질에 존재할 것이고, 한 구체예에서 상기 분석물은 시험 목적에 관심 대상이 아닌 다른 배경 핵산 분자와 함께 존재할 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 분석물은 이들 다른 핵산 성분에 비해 적은 양으로 존재할 것이다. 바람직하게는, 예를 들면, 상기 분석물이 세포 물질을 포함하는 생물학적 표본으로부터 파생되는 경우, 당해 방법의 단계 (a)를 수행하기 전, 이러한 다른 핵산 및 외부 생물학적 물질의 일부 또는 전부는 샘플-준비 기술, 이를 테면, 여과, 원심 분리, 크로마토그래피 또는 전기영동을 사용하여 제거될 것이다. 적합하게는, 상기 분석물은 혈액, 혈장, 가래, 소변, 피부 또는 생검과 같은 포유동물 대상체 (특히, 인간 환자)로부터 채취된 생물학적 샘플에서 가려온다. 한 구체예에서, 상기 생물학적 샘플은 존재하는 임의의 세포를 파괴하여 당해 분석물이 방출되도록, 용해될 것이다. 다른 구체예들에서, 상기 분석물은 샘플 자체 내에 이미 자유 형태로 존재할 수 있는데; 예를 들어 혈액이나 혈장에서 순환하는 무-세포 DNA로 존재할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 암성 종양 세포의 DNA 또는 RNA 안에 있는 유전자 또는 염색체 영역이 되며, 이는 하나 또는 그 이상의 돌연변이; 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs) 형태로 존재하는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명은 질환의 재발을 모니터링하는데 유용할 것이다. 질병의 재발을 감지하기 위해 시간 경과에 따라 치료 후 질환이 없다고 선언된 환자를 모니터링할 수 있다. 이것은 비-침습적으로 수행되어야 하며, 혈액 샘플에서 표적 서열의 민감한 검출을 요한다. 마찬가지로, 일부 암의 경우, 치료 후 환자에게 남아있는 잔류 암세포가 있다. 본 발명을 사용하여 환자의 혈액에 존재하는 이러한 세포 (또는 무-세포 DNA)의 수준을 모니터링하면 질환의 재발 또는 현재 치료의 실패를 탐지하고, 대체 치료로 전환할 필요가 있다.

한 구체 예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 검출은 질환 치료 동안 환자 샘플의 반복적 테스트를 가능하게 하여 치료에 대해 발달된 내성을 조기에 검출할 수 있게 한다. 예를 들면, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 이를 테면 게피티닙(gefitinib), 에르로티닙(erlotinib)은 공통적으로 비-소 세포 폐암 (NSCLC)의 1선 치료제로 사용된다. 치료 중, 종양은 종종 EGFR 유전자 (예: T790M, C797S)에서 돌연변이를 발생시켜 치료에 대한 내성을 부여한다. 이러한 돌연변이를 조기에 발견하면, 환자를 대체 요법으로 전환시킬 수 있다.

한 구체예에서, 상기 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 태아 기원의 DNA 또는 RNA 안에 유전자 또는 염색체 영역 영역일 것이고, 하나 또는 그 이상의 돌연변이; 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs) 형태로 존재하는 것을 특징으로 할 것이다. 따라서, 본 발명은 다른 이용 가능한 시험 기술보다 임신 초기 단계에서 매우 낮은 대립 유전자 분획에서 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다.

또다른 구체예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 다른 건강한 개체로부터 유래된 유전자 또는 게놈 영역일 수 있지만, 획득된 유전 정보는 인간 집단 안에 하나 또는 그 이상의 특정 집단들에 걸쳐 의료 또는 치료적 결론이 도출 될 수 있도록 귀중한 동반 진단 정보를 생성하는 데 도움이 될 수 있다.

여전히 또다른 구체예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 감염성 질환; 예를 들면, 박테리아 또는 바이러스의 유전자 또는 염색체 영역의 폴리뉴클레오티드 서열 특징일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 공여자 DNA의 특징일 수 있다. 이식된 장기가 환자에 의해 거부되면, 이 장기의 DNA는 환자의 혈류로 흘러 들어간다. 이 DNA를 조기에 발견하면, 거부 반응을 조기에 발견 할 수 있다. 이는 기증자 특이적 마커의 맞춤형 패널을 사용하거나 또는 집단에서 공통적인 것으로 알려진 변이체 패널을 사용하여 달성할 수 있으며, 그중 일부는 기증자에게, 일부는 수혜자에게 존재할 것이다. 따라서, 시간 경과에 따라 장기(organ) 수용자의 일상적인 모니터링은 청구된 방법에 의해 가능하다.

여전히 또다른 구체예에서, 프로브와 트리거 올리고뉴클레오티드의 상이한 조합 (아래 참고)을 이용한 이 방법의 다양한 형태를 나란히 이용하여, 당해 분석물은 다수 표적 서열, 예를 들면, 암 공급원, 암 지표들 또는 다수 감염 공급원에 대해 당해 분석물이 동시에 스크리닝될 수 있다. 이 접근법에서, 이 방법의 병렬 적용에 의해 단계 (d)에서 수득된 증폭된 생성물은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 결합 염료 또는 서열 특이적 분자 프로브, 이를 테면, 분자 비콘(beacon), 헤어핀 프로브 또는 이와 유사한 것들로 구성된 검출 패널과 접촉된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 선택적인 하나 또는 그 이상의 화학적 및 생물학적 프로브와 조합된 적어도 하나의 프로브와 하기에서 정의된 임의선택적으로 하나의 트리거 올리고뉴클레오티드의 용도, 또는 증폭된 프로브 영역을 식별하기 위한 시퀸싱 용도가 제공된다.

본 발명의 방법의 단계 (a)는 주어진 샘플 안에 분석물의 존재를 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀로 찾는, 당해 분석물의 어닐링을 포함한다. 한 구체예에서, 이 올리고뉴클레오티드는 프라이밍 영역과 그리고 탐지될 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 3' 말단을 포함한다. 이를 통해, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물이 생성된다. 한 구체예에서, 이 단계는 과량의 A₀ 존재 하에서, 그리고 상기 분석물과 임의의 다른 핵산 분자를 함유하는 수성 배지에서 실행된다.

분자 프로브가 단계 (e)에서 탐지용으로 이용되는 한 구체예에서, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀는 상기 표적 서열에 상보적인 영역의 5' 단부 상에 올리노뉴클레오티드 식별 영역을 포함하도록 구성되고, 이용된 분자 프로브는 이 식별 영역에 어닐링되도록 설계된다. 한 구체예에서, A₀의 상보적 영역 만이 표적에 어닐링할 수 있으며; 즉, 다른 영역은 단계 (b)가 수행되는 온도에서 안정한 듀플렉스(duplex)가 존재하도록 상기 분석물과의 충분한 상보성이 부족하다. 여기에서 그리고 전체적으로 '충분한 상보성('sufficient complementarity)'이라는 용어는 주어진 영역이 분석물에서 주어진 영역과 상보성을 갖는 한, 상보성 영역은 10 개 이상의 뉴클레오티드 길이를 의미한다.

하나의 바람직한 구체예에서, A₀의 5' 단부 또는 프라이밍 영역의 5'측에 있는 내부 부위는 외핵분해(exonucleolysis)에 대해 내성이 부여된다. 이러한 수단에 의해 그리고 단계 (b) 후에, 5'-3' 외핵분해 활성을 갖는 엑소뉴클레아제는 A₀ 및 부분적으로 분해된 가닥 A₁을 포함하는 임의의 물질은 무손상으로 남기면서, 존재하는 임의의 다른 핵산 분자를 분해할 목적으로 선택적으로 반응 배지에 첨가될 수 있다. 적합하게는, 외핵분해에 대한 이러한 내성은 하나 또는 그이상의 차단기를 필요한 지점에서 올리고뉴클레오티드 A₀에 도입함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 이러한 차단기는 포스포로티오에이트 링키지 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 기타 백본(backbone) 변형, C3 스페이서, 포스페이트 기, 변형된 염기 및 이와 유사한 것으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, A₀는 아래에 추가로 설명되는 트리거 올리고뉴클레오티드의 3 '및 5' 단부 중 하나 또는 둘 모두에 대해 올리고뉴클레오티드 플랩(flap) 미스매치를 갖는다.

한 구체예에서, 상기 식별 영역은 고유한 서열을 갖고 증폭 된 성분 A₂에 적용되는 서열-특이적 분자 프로브를 사용하여 단계 (e)에서 간접적으로 식별되도록 적응되는, 또는 이러한 구성 요소의 시퀀싱에 의해 직접적으로 식별되는 바코드 영역을 포함하거나, 또는 그 안에 내장될 것이다. 사용될 수 있는 분자 프로브의 예는 분자 비콘, TaqMan®프로브, Scorpion®프로브 등을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.

상기 방법의 단계 (b)에서, 제 1 중간 산물의 이중-가닥으로 된 영역은 이의의 A₀ 스트랜드의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로포스포릴화된다. 결과적으로, A₀ 가닥은 부분적으로 절단된 가닥을 만들기 위해 점진적으로 분해되며, 이하에서 A₁이라고 한다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드가 비-표적 서열과 잘못 혼성화하는 경우, 파이로인산첨가분해 반응은 임의의 미스매치에서 중단되어, 이 방법의 후속 단계가 진행되는 것을 방지한다. 또다른 구체예에서, 이 분해는 A₁이 안정한 듀플렉스를 형성하기 위해 분석물 또는 그 안의 표적 영역과 충분한 상보성이 부족할 때까지 계속된다. 이 시점에서, 그 다음 다양한 스트랜드들이 용융에 의해 분리되고, 따라서 단일-가닥 형태의 A₁이 생성된다. 전형적인 파이로인산첨가분해반응 조건 하에서, 이러한 분리는 상기 분석물과 A₀ 간의 6개 내지 20개 상보성 뉴클레오티드가 있을 때 일어난다.

적합하게는, 파이로인산첨가분해반응 단계 (b)는 20 내지 90⁰C 범위의 온도에서 파이로인산첨가분해반응 활성을 나타내는 중합 효소 및 피로포스페이트 이온 공급원의 존재 하에서 반응 배지에서 실행된다. 폴리뉴클레오티드의 분해에 적용되는 파이로인산첨가분해반응에 대한 추가 정보는 예를 들면, J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028 또는 우리의 앞선 특허 출원에서 찾아볼 수 있다.

한 구체예에서, 상기 파이로인산첨가분해반응 단계 (b)는 과량의 폴리피로포스페이트 공급원 존재에 의해 구동되며, 적합한 공급원에는 3개 또는 그 이상의 인 원자를 함유하는 화합물이 내포된다.

한 구체예에서, 상기 파이로인산첨가분해반응 단계 (b)는 과량의 변형된 피로포스페이트의 공급원 존재하에서 구동된다. 적합한 변형된 피로포스페이트에는 가교 산소 대신 치환된 다른 원자 또는 기를 갖는 것들, 또는 다른 산소 상에 치횐 또는 변형 기들을 갖는 피로포스페이트 (또는 폴리-피로포스페이트)를 포함한다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 변형된 피로포스페이트의 많은 예가 있고, 그중 그 비-제한적인 선택은 다음과 같다는 것을 이해할 것이다:

하나의 바람직한 구체예에서, 피로포스페이트 이온의 공급원은 PNP, PCP 또는 트리폴리포스포리산(PPPi)이다.

더욱이, 파이로인산첨가분해반응 단계 (b)에 사용되는 피로포스페이트 이온 공급원의 예들은 WO2014/165210 및 WO00/49180에서 찾아볼 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.

한 구체예에서, 과량의 변형된 피로포스페이트의 공급원은 Y-H 로 나타낼 수 있고, 여기에서 Y는 일반식 (X-O)₂P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))_n-에 대응되며, 이때 n은 1 내지 4의 정수이며; 각 Z-는 독립적으로 -O-, -NH- 또는 -CH₂-로부터 선택되며; 각 B는 독립적으로 O 또는 S이며; X 기들은 독립적으로 -H, -Na, -K, 알킬, 알케닐, 또는 헤테로사이클기로부터 선택되며, 단서조항으로 Z 및 B 모두가 -O-이며, n이 1인 경우, 적어도 하나의 X 기는 H이 아니다.

한 구체예에서, Y는 일반식 (X-O)₂P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))_n-에 대응하며, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이다. 다른 구체 예에서, Y 기는 일반식 (XO)₂P(=O)-ZP(=O)(OH)-에 상응하며, 여기서 X기들중 적어도 하나는 -H이다. 또 다른 바람직한 구체 예에서, Y는 일반 식 (X-O)₂P(=O)-Z-P(=O)(O-X)-에 상응하며, 여기서 X기들 중 적어도 하나는 메틸, 에틸, 알릴 또는 디메틸알릴로부터 선택된다.

대안적인 구체예에서, Y는 일반식 (H-O)₂P(=O)-Z-P(=O)(O-H)-, 여기서 Z는 -NH- 또는 -CH₂-이거나, 또는 (X-O)₂P(=O)-Z-P(=O)(O-X)이고, 여기서 X 그룹은 모두-Na 또는 -K이고, Z는 -NH- 또는 -CH2-이다.

또다른 구체예에서, Y는 일반식 (H-O)₂P(=B)-O-P(=B)(O-H)-에 상응하며, 여기서 각 B 기는 독립적으로 O 또는 S이고, 적어도 하나는 S이다.

Y의 바람직한 구체예의 특정 예는 화학식 (X1-O)(HO)P(=O)-Z-P(=O)(O-X2)의 것들을 포함하며, 여기서 Z는 O, NH 또는 CH₂이고, (a) X1은 γ,γ-디메틸알릴이고, X2는 -H이고; 또는 (b) X1 및 X2는 둘 다 메틸이고; 또는 (c) X1 및 X2는 둘 다 에틸이고; 또는 (d) X1은 메틸이고, X2는 에틸이거나 또는 그 반대의 경우도 된다.

한 구체예에서, 단계 (b)는 포스파타제 효소의 존재 하에 수행되어 파이로인산첨가분해반응 반응에 의해 생성된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 가수 분해에 의해 지속적으로 제거한다. 또다른 구체예에서, 피로포스파타제 효소는 단계 (b) 이후에 첨가되어 임의의 잔류 피로포스페이트 이온을 가수분해하고, 이로써 파이로인산첨가분해반응이 이후 단계에서 더 이상 일어나지 않도록 한다. 또다른 구체예에서, 단계 (a) 및 (b)가 반복되어, 각 표적 분자로부터 A₁ 다중 복사체가 생성된다. 이것은 후속 단계가 수행되기 전이나 또는 수행되는 동안 발생할 수 있다. 단계 (d)의 증폭과 결합될 때, 이러한 반복은 방법의 감도 및 신뢰성을 더욱 향상시키고, 초기 직선형 증폭을 도입함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의보다 정확한 정량화를 가능하게 한다.

하나의 바람직하지만 필수적이지 않은 구체 예에서, 단계 (b)의 끝에서 또는 단계 (c) 전 또는 후에 중간 단계가 도입되며, 여기서 A₀ 또는 A₁ 가닥 (5'차단기가 존재함)으로 구성된 것 이외의 존재하는 잔류 핵산 물질이 파괴되도록 하는 목적으로 5'-3' 방향 활성을 갖는 엑소뉴클레아제가 첨가된다. 또다른 구체예에서, 이 엑소뉴클레아제는 단계 (d)가 수행되기 전, 비활성화된다. 여전히 또다른 구체예에서, 이러한 외핵분해를 실행하기 전 또는 수행되는 동안, 존재하는 모든 핵산 물질은 예를 들면, 키나제 및 포스페이트 공여자, 이를 테면 ATP를 이용하여 이의 5' 단부에서 포스포릴화되어, 특정 유형의 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의한 외핵분해를 개시하는데 요구되는 포스포릴화 단부 부위를 만든다.

단계 (b) 이후, 또는 상기 언급된 중간 단계에서, 한 구체예에서 (i), A₁은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되어, 제 2 중간 산물이 생성되는데, 이 또한 부분적으로 이중-가닥으로 되어 있다. 한 구체예에서, B는 A₀에 실질적으로 상보적이지 않은 5' 단부에서 측면 올리고뉴클레오티드 영역을 갖고, A₁의 3'단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역으로 구성된다. 여기에서 그리고 전체적으로, 용어 '실질적으로 상보적이지 않다' 또는 이와 동등한 표현은 주어진 측면 영역이 A₀상의 주어진 영역과 상보성을 갖는 정도로, 상보성 영역은 길이가 10 개 미만의 뉴클레오티드라는 것을 의미한다. 그 후, 단계 (c)에서 제 2 중간 산물의 A₁ 스트랜드는 5'-3' 방향으로 연장되어, 제 3 중간 산물이 생성되는데, 이는 B와 연장된 A₁ 스트랜드 (이후 A₂로 지칭됨)을 포함한다.

또다른 구체예에서, B는 (i) A₁의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역; (ii) A₁의 5' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역, 그리고 임의선택적으로 (iii) 이들 두 영역 사이의 중간 올리고뉴클레오티드 영역을 포함하고, 여기서 B는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 미스매치의 존재 또는 이의 3' 단부에 화학적 변형의 존재를 통하여 A₁에 대해 연장을 할 수 없다. 또다른 구체예에서, B는 다른 올리고뉴클레오티드가 이에 대해 연장되는 것을 방지하기 위해, 이의 3' 단부 및 내부 모두에서 변형된다.

이들 두 구체예들에서, B는 적절하게는 각각 독립적으로 최대 150 개 뉴클레오티드, 전형적으로 5 개 내지 100 개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 10 개 내지 75 개 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 영역으로 구성된다. 한 구체예에서, B의 모든 영역은 독립적으로 10 개 내지 50 개 길이의 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, B의 5' 단부 또는 그에 인접한 영역은 또한 상기 언급된 유형의 차단기로 보호되어, 그것이 외핵분해에 저항하도록 만든다. 일부 구체예들에서, B의 5' 단부는 자체에서 역으로 폴딩되어, 이중-가닥으로 된 헤어핀 영역이 생성된다. 여전히 또다른 구체예에서, B의 3' 단부와 5' 단부는 모두 이의 A₁ 대응부(counterpart) 스트랜드의 단부에 대해 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 갖는다.

또다른 구체예에서, 단계 (c)는 대안적으로 (ii) 리게이즈 존재 하에 A₁의 두 단부가 결찰되어 제 3 중간 산물이 생성되는데, 이때 A₁스트랜드는 연장되지 않고, 원형화된다. 이 결찰은 일반적으로 A₁의 3' 단부 및 5' 단부에 상보적인 영역을 갖는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 추가를 통해 수행되어, D에 어닐링될 때 A₁의 3' 단부 및 5' 단부가 닉(nick)을 형성할 수 있고, 이것은 결찰되거나, 또는 후속 결찰 단계 전에 채워질 수 있는 갭일 수 있다. 이 구체예에서, 원형화된 A₁은 사실상 후속 단계를 위해 A₂가 된다. 또다른 구체예에서, A₁ 스트랜드는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 스트랜드-대체 활성이 결여된 중합 효소를 이용하여 5'-3' 방향으로 여전히 연정되며, 그 다음 원형화되어, 이러한 연장된 그리고 원형화된 산물은 사실상 A₂가 된다. 또다른 구체예에서, A₁,의 3' 단부 및 5' 단부 또는 연장된 A₁ 은 반드시 올리고뉴클레오티드 영역을 포함할 필요가 없는 가교-기(bridging-group)에 의해 함께 연결된다.

제 3 중간 생성물이 원형화된 A₂ 스트랜드를 포함하는 경우, 단계 (c)에서 생성된 반응 혼합물을 엑소뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 조합으로 처리하여, 원형화되지 않은 임의의 잔류 핵산 성분을 분해하는 것이 유리하다. 그 후, 또다른 구체예에서, 상기 엑소뉴클레아제는 단계 (d)가 일어나기 전, 비활성화된다.

또다른 구체예에서 (iii), 단계 (c)는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 단부 영역의 적어도 일부분에 상보적이거나 또는 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 5' 영역을 갖는 결찰 프로브, 리게이즈, 그리고 임의선택적으로 스트랜드 대체 능력 및 5'-3' 방향 엑소뉴클레아제 활성 모두가 결여된 중합 효소 존재 하에서 실행된다. 이러한 수단에 의해, 제 2 중간 산물이 형성되는데, 이때 A₂ 스트랜드는 A₁, C 그리고 임의선택적으로 C의 5' 단부와 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A₁의 연장에 의해 형성된 중간 영역으로 구성된다. 이러한 구체예에서, 단계 (d) (아래 참조)에서 사용되는 프라이머는 A₁에서 C로의 결찰이 발생한 부위를 포함하는 A₂의 영역이 적어도 증폭되도록 선택된다. 이 구체 예에서, 우리는 증폭 전에 3'-5' 엑소뉴클레아제가 임의의 결찰되지-않은 A₁을 분해하는데 사용될 수 있도록 C 상에 3' 차단기를 포함하는 것이 유리하다는 것을 발견했다. 사용될 수 있는 적합한 중합 효소에는 Hemo KlenTaq, Mako 및 Stoffel Fragment가 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다.

한 구체예에서, 단계 c(ii) 또는 c(iii)가 이용되는 경우, A₁은 결찰 전, 임의선택적으로 5'-3' 방향으로 연장된다. 한 구체예에서 이러한 선택적 연장 및 결찰은 표적 올리고뉴클레오티드에 대해 수행되는 반면, 또 다른 실시 양태에서 이들은 연장 및/또는 결찰 전, A₁이 어닐링되는 추가 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 첨가를 통해 수행된다. 한 구체예에서, D는 A₁의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역, 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부에 상보적인 영역 또는 A₁의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함한다. 또다른 구체예에서, D는 3'-단부 변형, 또는 D의 3' 단부와 A₁의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치를 통해 A₁에 대해 연장하는 것은 불가능하다.

후속 단계 (d)에서, A₂ 스트랜드 또는 이의 원하는 영역이 증폭됨으로써, 다수의, 전형적인으로는 수백반개의 복사체가 만들어진다. 이것은 A₂의 영역과 그로부터 유래된 임의의 앰플리콘을 예를 들어 상보적 영역에 어닐링할 수 있는 순방향/역방향 또는 센스/안티센스 쌍의 형태로 제공되는 단일-가닥으로된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍함으로써 이루어진다. 그 다음 프라이밍된 스트랜드는 증폭을 위한 원점이 된다. 증폭 방법은 열 순환 및 등온 방법, 이를 테면, 중합 효소 연쇄 반응, 재조합 효소 중합 효소 증폭 그리고 롤링 서클 증폭을 포함하지만 이에 국한되지 않으며; 이들 중 마지막 방법은 A₂가 원형화될 때, 적용된다. 이러한 임의의 수단을 통해, A₂의 많은 앰플리콘 복사체, 일부 경우에는 그 서열 보체들이 빠르게 생성될 수 있다. 이러한 증폭 방법 중 임의의 것을 수행하기 위한 정확한 방법론은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이며, 사용된 정확한 조건 및 온도 체계는 독자가 따르는 일반 문헌에서 쉽게 이용할 수 있다. 구체적으로, 중합효소 쇄 반응 (PCR)의 경우, 이 방법론은 일반적으로 중합효소 및 다양한 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트의 공급원을 이용하여 5'-3' 방향으로 A₂ 스트랜드에 대해 프라이머 올리고뉴클레오티드를 상보적인 스트랜드가 생성될 때 까지 연장시키고; 생성된 이중-가닥으로 된 산물을 탈혼성화시켜 A₂스트랜드 및 상보적 스트랜드를 재생시키고; A₂ 스트랜드 및 이의 임의의 앰플리콘을 재-프라이밍시키고, 그 다음 이러한 연장/탈혼성화/재프라이밍 단계를 다수 반복하여 A₂ 앰플리콘의 농도가 안정적으로 탐지되는 수준까지 축적되도록 한다.

마지막으로, 단계 (e)에서, 앰플리콘을 검출하고, 얻은 정보를 사용하여 폴리뉴클레오티드 표적 서열이 원래 분석물 및/또는 이와 관련된 특성에 존재하는지 여부를 추론한다. 예를 들면, 이 수단을 통해, 암성 종양 세포의 표적 서열은 찾고자 하는 특이적 SNPs를 참고하여 탐지될 수 있다. 또다른 구체예에서, 바이러스 또는 박테리아 게놈(이의 새로운 돌연변이 포함)의 특징적인 표적 서열이 검출될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 결합 염료, 서열-특이적 분자 프로브 이를 테면, 형광-라벨된 분자 비콘 또는 헤어핀 프로브를 비롯한 앰플리콘 또는 식별 영역을 탐지하는 많은 방법이 이용될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 사용되거나 또는 보고된 직접 시퀀싱 방법 중 하나를 사용하여 A₂ 앰플리콘의 직접적인 시퀸싱이 실행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 결합 염료, 형광 라벨된 비콘 또는 프로브가 사용되는 경우, 자극 전자기 방사선 소스 (레이저, LED, 램프 등) 및 방출된 형광을 검출하고, 특별히 설계된 알고리즘을 사용하여 마이크로프로세서 또는 컴퓨터에 의해 분석될 수 있는 데이터 스트림을 포함하는 신호를 이로부터 생성시키기 위해, 배열된 광 검출기로 구성된 배열을 사용하여 앰플리콘을 검출하는 것이 편리하다.

본 발명의 한 가지 특징적인 현시에서, 상이한 표적 서열에 선택적이며, 각각 식별 영역을 포함하는 다수 A₀ 프로브가 사용된다. 한 구체예에서, 단계(d)에서 증폭된 영역은 이러한 식별 영역을 포함한다. 또다른 구체예에서, 그 다음 단계 (d)에서 생성된 앰플리콘은 식별 영역(들)의 검출을 통해 추론된다. 식별은 분자 프로브 또는 시퀀싱 방법, 예를 들어 Sanger 시퀀싱, Illumina®시퀀싱 또는 이전에 설명한 방법 중 하나를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또다른 현시서, 단계 (a) 전에 분석 물은 다수의 반응 부피로 분할시키는데, 각 부피는 상이한 표적 서열 (들)을 검출하도록 설계된 상이한 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀ 또는 이의 다수를 갖는다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상이한 프로브 A₀는 단일 프라이머 또는 단일 프라이머 세트가 증폭 단계 (d)에 사용되도록 하는 공동 프라이밍 부위를 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 증폭 단계 (d)는 표준 중합효소 쇄 반응 (PCR) 또는 등온 증폭 이를 테면, 롤링 서클 증폭 (RCA)을 통하여 수행될 수 있다. 일부 구체예들에서, RCA는 지수형 RCA, 예를 들어, 과다-분지형 RCA의 형태일 수 있으며, 이는 다양한 상이한 길이의 이중 가닥 DNA를 생성할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상이한 길이를 갖는 상이한 생성물을 생성할 수 있는 상이한 프로브를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

일부 구체예들에서, 단계 (e)는 다음 단계들을 더 포함한다:

i. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 A₂의 다중 복사체 또는 A₂ 영역을 라벨시키는 단계;

ii. 상기 다수 복사체의 형광 신호를 측정하는 단계;

iii. 상기 다수 복사체를 변성 조건에 노출시키는 단계; 그리고

iv. 변성 조건에 노출되는 동안 여러 복사체의 형광 신호 변화를 모니터링하여, 당해 분석물에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별해내는 단계.

일부 구체예들에서, 단계 (e)는 용융 곡선 분석을 사용한 검출 및 분석의 형태를 취할 수 있다. 용융 곡선 분석은 가열 중 이중 가닥 DNA의 해리 특성의 평가가 될 수 있다. 샘플에서 DNA의 50%가 두 개의 개별 스탠드로 변성되는 온도를 용융 온도 (Tm)라고 한다. 온도가 상승함에 따라, 이중 스트랜드는 해리되기 시작하고, 조성 (A-T 간에 2개의 수소 결합이 있는 것과 비교하여 G-C 염기쌍은 3개의 수소결합을 갖고, - 따라서 A-T 분리 경우와 비교하여 G-C를 분리하는데 더 높은 온도가 요구되며), 길이 (길이가 더 긴 이중 스트랜드 DNA는 더 많은 수소 결합을 가지고 있어, 더 짧은 경우와 비교하였을 때 두 개의 별도 단일 스트랜드로 완전하게 분리시키기 위해 더 높은 온도를 요구하며), 그리고 상보성 (더 많은 수의 미스매치를 갖는 DNA 분자는 매칭되는 염기쌍 간에 수소 결합이 더 적게 함유되어 있음으로 더 낮은 Tm을 갖게 될 것임)에 기반하여 상이한 온도에서 이중-가닥으로 된 DNA의 상이한 분자들이 해리된다.

일부 구체예들에서, 증폭 단계 (d)는 인터칼레이팅 형광 제의 존재 하에 수행될 수 있다. 따라서, 용융 곡선 분석이 수행될 때, 형광의 변화가 모니터링되고, 반응 산물의 Tm (및 동일성) 및 따라서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 형광의 변화는 자극 전자기 방사선 (레이저, LED, 램프 등)의 소스, 방출된 형광을 감지하고, 그로부터 특별히-설계된 알고리즘을 사용하는 마이크로 프로세서 또는 컴퓨터에 의해 분석될 데이터 스트림을 포함하는 신호를 생성하도록 배열된 광 검출기를 포함하는 배열을 사용하여 감지할 수 있다.

인터칼레이팅(intercalating) 형광 제제는 SYBR green, EvaGreen, LG Green, LC Green Plus, ResoLight, Chromofy 또는 SYTO 9와 같은 이중-가닥 DNA에 특이적인 염료일 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용될 수 있는 많은 인터칼레이팅 형광 제제가 있음을 인식할 것이며, 상기 목록은 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 인터칼레이팅 형광 제제는 형광 표지된 DNA 프로브일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 병치된 프로브-그중 하나는 형광단을 포함하고, 다른 하나는 적합한 소광제를 포함-를 사용하여 표적 증폭 서열에 대한 DNA 프로브의 상보성을 결정할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에서, 다음 단계를 특징으로 하는, 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법이 제공된다:

a. 상기 핵산 분석물을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 3' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;

d. A₂를 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍시켜, A₂또는 A₂ 영역의 다수 복사체를 생성시키고;

e. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 A₂의 다중 복사체 또는 A₂ 영역을 라벨시키는 단계;

f. 상기 다수 복사체의 형광 신호를 측정하는 단계;

g. 상기 다수 복사체를 변성 조건에 노출시키는 단계; 그리고

h. 변성 조건에 노출되는 동안 여러 복사체의 형광 신호 변화를 모니터링하여, 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별해내는 단계.

일부 구체예들에서, 변성 조건은 예를 들어 이중 스트랜드가 해리되기 시작하는 지점까지 온도를 증가시킴으로써 온도를 변화시킴으로써 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안 적으로, 변성 조건은 또한 조건이 산성 또는 알칼리성이 되도록 pH를 변화시키거나, 강산 또는 염기, 농축 무기 염 또는 유기 용매 (예: 알코올)와 같은 첨가제 또는 제제를 첨가함으로써 제공될 수 있다.

본 발명의 추가 측면에서, 첫 번째 측면의 방법과 관련하여 또는 독립형-기반으로, 단일-스트랜드 형태의 분석물은 분석 물을 증폭시키고, 일반적으로 상당한 과량으로 존재하는 배경 게놈 DNA로부터 분리되도록 설계된 일련의 예비 단계에 의해 상기 언급된 생물학적 샘플로부터 준비될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 단일-가닥으로 된 표적 분석물의 생산에 적용할 수 있으며, 따라서 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 통합되거나 또는 추가로 포함되는 경우 이외의 상황에서 유용하다. 따라서, 표적 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 핵산의 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 분석물을 제공하는 방법에 제시되는데, 이 방법은 (i) 대응하는 이중-가닥으로 된 형태의 분석물(들)과 임의선택적으로 배경 게놈 DNA를 포함하는 생물학적 샘플을 증폭 사이클을 거치게 함으로써, 분석물(들)의 앰플리콘을 생산하는 것을 특징으로 한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 증폭은 중합효소, 뉴클레오시드 트리포스페이트와 적어도 하나의 대응하는 프라이머 쌍 존재하에서 중합효소 쇄 반응 (PCR)을 이용하여 실행되며, 여기서 상기 프라이머중 하나는 5'-3' 엑소뉴클레아제 차단 기를 포함하고, (ii) 임의선택적으로 단계 (i)의 산물은 5'-3' 외핵분해 활성을 갖는 엑소뉴클레아제로 절단시킨다. 한 구체예에서, 상기 방법은 (iii) 단계 (ii)의 산물을 단백질분해효소로 반응시켜, 상기 중합효소를 파괴하고, 그 다음 (iv) 상기 단백질분해효소는 단계(iii)의 산물을 50⁰C이상의 온도로 가열시킴으로써 비활성화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

하나의 바람직한 구체예에서, 단계(i) 내지 (iv)는 생물학적 샘플로부터 유래된 표적 서열을 검출하는 통합 방법을 생성하기 위해, 본 발명의 제 1 측면의 방법의 단계 (1) 전에 수행된다. 또다른 구체예에서, 상기 생물학적 샘플은 단계 (i)가 수행되기 전, 세포 용해를 겪었다.

단계 (i)의 한 구체예에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트는 자연 발생적 DNA의 특징은 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물이다. 바람직한 구체예에서, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물은 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 대신 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP)를 포함하고, 단계 (i)은 효소 dUTP-DNA 글리콜라제 (UDG)의 존재 하에 추가로 수행되어, 이전 분석으로부터 오염된 임의의 앰플리콘을 제거한다. 여전히 또다른 구체예에서, 고-충실도 중합 효소가 단계 (i)에서 사용되며, 예를 들어, 상품명 Phusion®또는 Q5로 판매되는 것 중 하나가 사용된다.

한 구체예에서, 단계 (i)는 제한된 양의 프라이머와 다수의 증폭 주기를 사용하여 수행된다. 즉, 분석물의 초기 양에 관계없이 고정된 양의 앰플리콘이 생성된다. 따라서 후속 단계 이전에 분석물 정량화가 필요하지 않다. 단계 (ii)의 필요성을 제거하는 이점이 있는 단계 (i)의 또다른 구체예에서, 증폭은 두 프라이머 중 하나가 다른 프라이머보다 과도하게 존재하는 프라이머 쌍의 존재 하에 수행되어, 결과적으로 하나의 프라이머가 완전히 활용되면 단일-가닥으로된 앰플리콘이 생성되게 된다.

단계 (ii)의 하나의 바람직한 구체예에서, 5' 프라이머는 포스포로티오에이트 링키지, 역전된 염기, DNA 스페이서 및 당업계에 통상적으로 공지된 다른 올리고뉴클레오티드 변형으로부터 선택된 엑소뉴클레아제 차단기에 의해 차단된다. 또다른 구체예에서, 쌍의 프라이머에서 나머지 프라이머는 이의 5' 단부에 포스페이트기를 갖는다.

한 구체예에서, 단계 (iii)에서, 이용된 단백질분해효소는 단백질분해효소 K이며, 단계 (iv)는 80 내지 95⁰C의 온도로 최대 30분간 가열하여 실행된다. 또다른 구체예에서, 단계(ii) 이후 그러나 단계 (b) 전, 반응 배지는 아피라제(apyrase)또는 다른 포스파타제로 처리하여, 존재할 수 있는 임의의 잔류 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거한다.

본 발명의 추가 측면에서, 인산분해 단계 (b)를 이중-스트랜드 특이적 엑소뉴클레아제를 이용한 엑소뉴클레아제 분해 단계로 대체한 대안적인 구체예가 제공된다. 당업자는 이중-스트랜드 특이적 엑소뉴클레아제에 3'-5' 방향으로 판독하는 것들, 그중에서도 이를 테면 ExoIII, 그리고 5'-3' 방향으로 판독하는 것들, 그중에서도 이를 테면 Lambda Exo이 내포됨을 이해할 것이다.

이러한 측면의 한 구체예에서, 단계 (b)의 이중 스트랜드-특이적 엑소뉴클레아제는 3'-5' 방향으로 진행한다. 이러한 구체예들에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 특징으로 한다:

b. 제 1 중간 산물을 이중-스트랜드 특이적 엑소뉴클레아제를 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 절단시켜, 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁ 와 분석물을 생성시키고;

이러한 측면의 한 구체예에서, 단계 (b)의 이중 스트랜드-특이적 엑소뉴클레아제는 5'-3' 방향으로 진행한다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 특징으로 한다:

a. 상기 분석물을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 5' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;

b. 제 1 중간 산물을 이중-스트랜드 특이적 엑소뉴클레아제를 A₀의 5' 단부로부터 5'-3' 방향으로 절단시켜, 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁ 와 분석물을 생성시키고;

c. (i) A₁을 단일-가닥으로 된 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링시키고, B에 대해 5'-3' 방향으로 A₁ 스트랜드를 연장시키고; 또는 (ii) 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰을 통하여 A₁을 원형화시키고; 또는 (iii) A₁의 5' 단부를 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C의 3' 단부에 결찰시키고; 각 경우에 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성되며;

단계 (b)에서 이중 스트랜드-특이적 5'-3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 본 발명의 구체예들에서, 이것은 표적 분석물에 상보적인 A₀의 5'단부이며, 공통 프라이밍 서열 및 차단 기는 상보적인 영역의 3' 측면에 위치한다. 분자 프로브들이 단계 (e)에서 검출에 이용되는 추가 구체예에서, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀는 상기 표적 서열에 상보적인 영역의 3' 측면 상에 올리고뉴클레오티드 식별 영역을 포함하도록 구성되며, 그리고 이용된 분자 프로브는 이 식별 영역에 어닐링되도록 기획된다.

단계 (b)에서 이중 스트랜드-특이적 5'-3' 엑소뉴클레아제가 이용되는 본 발명의 구체예들에서, 3'에서 5'로 외핵분해성 활성을 갖는 엑소뉴클레아제는 A₀ 및 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁을 포함하는 임의의 물질은 그대로 유지시키면서, 한편으로 존재하는 임의의 기타 분자를 절단하는 목적으로 단계 b.이후, 임의선택적으로 반응 혼합물에 추가된다. 적합하게는, 외핵분해에 대한 이러한 내성은 전술 한 바와 같이 달성된다.

본 발명의 방법은 다수 상이한 A₀ 및 임의선택적으로 B, C 또는 D 성분들을 이용한 상이한 다수의 분석물을 포함하는 반응 혼합물에 적용시킬 수 있으며, 이때 이들 각각은 상이한 분자 프로브 또는 이와 유사한 것들과 연합되어 있음을 인지할 것이다. 이러한 다중화된(multiplexed) 방법에서, 주어진 암 또는 다수의 감염증 등의 특징적인 다중 표적 영역이 가능하다. 한 구체예에서, 생성된 모든 상이한 A₂ 스트랜드는 공통 프라이머 부위를 갖지만, 상이한 식별 영역을 가지는 것이 바람직하며, 이로써 하나의 또는 단일 세트 프라이머를 증폭 단계 (d)에 이용가능하게 한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 감염성 질환, 암의 존재 확인, 또는 동반 진단 정보를 생성하기 위한 목적으로 포유동물 대상체, 특히 인간 환자를 스크리닝하기 위한 상기 기재된 방법의 용도가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에서, 전술 한 방법에 사용하기 위한 대조 프로브가 제공된다. 본 발명의 구체예들은 특정 표적 서열 또는 서열의 존재는 형광 신호의 생성에 의해 확인되는 것을 포함한다.

그러한 구체예들서, 불가피하게 샘플에 존재하는 비-표적 DNA로부터 생성된 신호수준이 있을 수 있다. 주어진 샘플에 대해 이 배경 신호는 '참(true)' 신호보다 나중에 시작되지만, 이러한 시작(onset)은 샘플마다 다를 수 있다. 낮은 농도의 표적 서열 또는 서열의 존재를 정확하게 검출하려면 신호가 없을 때 예상되는 신호에 대한 지식이 필요하다. 연출된 참조 샘플도 이용 가능하지만, 환자로부터 실제 '블라인드(blind)' 샘플의 경우에는 그렇지 않다. 대조 프로브 (E₀)를 이용하여 각 검정 프로브에 대한 예상 배경 신호 프로파일을 결정한다. 대조 프로브는 샘플에 존재하지 않을 것으로 예상되는 서열을 표적으로 삼고, 이 프로브에서 생성된 신호를 사용하여 표적 서열이 없는 경우 샘플에서 예상되는 신호 생성율을 추론할 수 있다.

따라서, 다음 단계를 특징으로 하는 주어진 핵산 분석 물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공된다:

a. 표적 분석물과 어닐링시키기 위해 샘플에 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀를 추가하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 3' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;

e. 상기 다수 복사체로부터 유래된 신호를 탐지하고;

f. (e) 상기 표적 서열에 적어도 부분적으로 미스매치되는 3' 단부 영역을 갖는 제 2 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 E₀를 이용하거나, 또는 샘플의 별도 분획 또는 샘플 분획을 이용하고, 그리고 제 2 탐지 채널을 이용하여 단계 (a)에서 (e)를 후속적으로 또는 동시에 반복하고;

g. (f)의 결과로부터 샘플 안에 표적 분석물이 없는 경우, A⁰에서 생성될 것으로 예상되는 배경 신호를 추론하고; 그리고

h. (g)에서 추론된 예상 배경 신호와 (e)에서 관찰된 실제 신호를 비교하여, 분석물에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재를 유추한다.

일부 구체예들에서, 본 발명에 따르면, 단계 (e)의 방법은 다음에 의해 발생한다:

ii. 단계 (d)에서 생성된 상기 다수 복사체의 형광 신호를 측정하는 단계;

iv. 단계 (f)의 생성물에 대해 수행된 동일한 측정과 비교하여, 변성 조건에 노출되는 동안 다중 복사체의 형광 신호의 변화를 모니터링함으로써 증폭된 생성물의 존재 및 이를 식별하는 단계.

한 구체예에서, 대조군 프로브 (E₀) 및 A₀는 샘플의 개별 부분에 추가되는 반면, 또다른 구체예에서 E₀ 및 A₀는 샘플의 동일한 부분에 추가되고, 상이한 검출 채널 (예, 상이한 색 염료)이 이용된다. E₀에 의해 생성된 신호는 샘플에 폴리뉴클레오티드 표적 서열이 없는 경우 A₀에 의해 생성될 것으로 예상되는 배경 신호를 추론하고, 수정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 배경 신호의 보정은 A₀로부터 관찰된 신호에서 E₀에서 관찰된 신호를 빼거나, 또는 조건을 변화시키면서 A₀ 및 E₀ 에 의해 생성된 상대적 신호의 보정 곡선을 이용하여 A₀로부터 관찰된 신호 보정을 통한 것이 관련될 수 있다.

한 구체예에서, 단일 E₀를 이용하여 생성될 수 있는 모든 검정 프로브를 보정할 수 있다.

한 구체예에서, 별도 E₀를 이용하여 초기 증폭 단계에서 생성된 샘플 DNA의 각 앰플리콘을 보정할 수 있다. 각 앰플리콘에는 관심대상의 다수 돌연변이/표적 서열이 내포될 수 있지만, 단일 E₀는 단일 앰플리콘에 대한 모든 검정 프로므를 산출하기에 충분할 것이다.

추가 구체예에서, 각 표적 서열에 대해 별도 E₀를 이용할 수 있다. 예를 들면, C>T 돌연변이가 표적이되는 경우, 동일한 부위에서 환자에게 발생하는 것으로 알려지지 않는 C>G 돌연변이를 표적으로 하도록 E₀를 기획될 수 있다. 다양한 조건에서 E₀에 의해 생성된 신호 프로파일을 교정 반응에서 평가할 수 있고, 이러한 데이터는 이 변이체가 존재하지 않을 때, C> T 변이체를 표적으로 하는 분석 프로브에서 예상되는 신호를 추론하는 데 사용된다.

본 발명의 방법의 한 가지 구체예는 도 9 내지 12에서 볼 수 있다. 도 9에서, 단계 a 내지 b의 한 가지 구체예가 예시된다. 단계 a에서, 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되어, 제 1 중간 산물이 생성되는데, 이의 적어도 부분적은 이중-가닥으로 되어 있고, 이때 A₀의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다. 본 발명의 이러한 단순화된 구체예에서, 표적에 어닐링되지 않은 어떻게 A₀가 당해 방법의 추가 단계에 참여하지 않는지를 설명하기 위해, 존재하는 A₀의 두 개 분자와 하나의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 있다. 단계 a의 이러한 예시적인 실시예에서, A₀의 3' 단부는 당해 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 반면, A₀의 5' 단부는 그렇지 않다. A₀의 5' 단부는 5' 화학적 차단 기, 공통 프라이밍 서열 및 바코드 영역을 포함한다.

단계 b에서, 상기 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물 은 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소에 의해 피로포스포릴화되어 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁, 분석물, 그리고 단계 a에서 표적에 어닐링되지 않은 분석물이 생성된다.

도 10에서, 단계 c(i) 내지 d의 한 가지 구체예가 예시된다. 단계 c (i)에서, A₁은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐되며, A₁ 스트랜드는 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성된다. 이러한 예시적인 실시예에서, 트리거 올리고뉴클레오티드 B는 5' 화학적 블록을 갖는다. 방법의 단계 b에서 분해되지 않은 A₀는 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되지만, 단계 d의 증폭 프라이머에 대한 표적인 서열을 생성하기 위해 B에 대해 5'-3 '방향으로 연장될 수 없다.

단계 d에서, A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다.

도 11에서, 단계 c(ii) 내지 d의 한 가지 구체예가 예시된다. 단계 c(ii)에서, A₁은 스플린트(splint) 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링되고, 그 다음 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰에 의해 원형이 된다. 단계 d에서, 이제 원형화된 A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다. 이러한 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형 (이 예시에서 화학적)으로 인해, 또는 D의 3 '단부와 A₂의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치를 통해 A₁에 대해 연장될 수 없다.

도 12에서, 단계 c(iii) 내지 d의 한 가지 구체예가 예시된다. 단계 c(ii)에서, A₁은 스플린트(splint) 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링되고, 그 다음 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰에 의해 원형이 된다. 단계 d에서, 이제 원형화된 A₂는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A₂의 다수의 복사체 또는 A₂ 영역이 생성된다. 이러한 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형 (이 예시에서 화학적)으로 인해, 또는 D의 3 '단부와 A₂의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치를 통해 A₁에 대해 연장될 수 없다.

본 발명의 방법의 특이성은 야생형 DNA의 적어도 일부를 차단하고, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에만 A₀의 어닐링을 촉진함으로써 개선될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 특이성을 개선하기 위해, 올리고뉴클레오티드의 차단이 사용될 수 있다. 사용되는 일반적인 기술은 PCR 프라이머 사이에서 어닐링되고, PCR 중합 효소에 의해 대체되거나 또는 분해될 수 없는 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 비-표적 서열(일반적으로, 건강한)에 어닐링하도록 설계되는 반면, 표적 서열 (돌연변이)에 미스 매치된다(종종 단일 염기에 의해). 이러한 미스매치는 두 서열에 대해 다른 용융 온도를 결과하며, 올리고뉴클레오티드는 PCR 연장 온도에서 비-표적 서열에 어닐링된 상태를 유지되는 반면, 표적 서열로부터 해리되도록 설계된다.

상기 차단 올리고뉴클레오티드는 종종 PCR 중합 효소의 엑소뉴 클레아제 활성에 의한 분해를 방지하거나 또는 표적 서열과 비-표적 서열 사이의 차등적인 용융 온도 차이를 강화시키는 변형을 가질 수 있다.

잠긴 핵산 (LNA)의 혼입, 또는 다른 용융 온도 변경 변형을 차단 올리고뉴클레오티드로 통합시키면, 표적 서열과 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 용융 온도 차이를 상당히 증가시킬 수 있다.

따라서, 차단 올리고뉴클레오티드를 이용하는 본 발명의 구체예가 제공된다. 차단 올리고뉴클레오티드는 이들이 절단되거나 또는 대체되지 않도록 파이로인산첨가분해 (PPL) 반응에 저항성이 있어야 한다. 이것은 예를 들어, 3' 단부의 미스매치를 통해, 또는 포스포로티오에이트 결합 또는 스페이서와 같은 변형을 통해 다양한 방식으로 달성될 수 있다.

차단 올리고뉴클레오티드가 이용되는 본 발명의 이러한 구체예들 또는 본 발명의 측면들이 사용될 때, 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법은 다음 단계를 특징으로 한다:

a. 단일-가닥으로 된 차단 올리고뉴클레오티드를 비-표적 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 하위세트에 어닐링시키고;

b. 분석물 표적 서열을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물이 생성되며, 이때 A₀의 3' 단부는 분석물 표적 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;

c. 상기 제 1 중간 산물을 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소를 이용하여 파이로인산첨가분해시켜 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁과 상기 분석물을 생성시키고;

d. (i) A₁을 단일-가닥으로 된 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링시키고, B에 대해 5'-3' 방향으로 A₁ 스트랜드를 연장시키고; 또는 (ii) 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰을 통하여 A₁을 원형화시키고; 또는 (iii) A₁의 3' 단부를 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부에 결찰시키고; 각 경우에 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성되며;

e. A₂를 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍시켜, A₂또는 A₂ 영역의 다수 복사체를 생성시키고; 그리고

f. 상기 다수 복사체로부터 유래된 신호를 탐지하고, 이로부터 당해 분석물 안에 당해 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추한다.

한 구체예에서, 상기 차단 올리고뉴클레오티드는 이의 3' 단부에서 미스매치를 통해 파이로인산첨가분해 반응에 저항성을 갖도록 만든다. 또다른 구체예에서, 상기 차단 올리고뉴클레오티드는 3'-차단 기를 통해 파이로인산첨가분해 반응에 저항성을 갖도록 만든다. 또다른 구체예에서, 상기 차단 올리고뉴클레오티드는 스페이스 또는 기타 내부 변형의 존재를 통해 저항성을 갖도록 만든다. 추가 구체예에서, 상기 차단 올리고뉴클레오티드는 용융 온도 증가 변형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하고, 이는 파이로인산첨가분해반응에 대한 저항성을 부여한다.

본 발명은 이제 다음 실험 데이터를 참조하여 설명된다.

실시예 1: 단일 뉴클레오티드 미스매치에 대항하는 파이로인산첨가분해반응 특이성

다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 단일-가닥으로 된 제 1 올리고뉴클레오티드 1 (서열 식별 번호 1)을 준비하였다:

5'-CGCTCGATGTATACGCTCGGACCACTCGTACCTCGAACTGTCGTTAGTATTTTTATATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC-3'

여기서 A, C, G, 및 T는 DNA의 관련 특징적인 핵염기를 품고 있는 뉴클레오티드를 나타낸다.

5 '에서 3'방향으로 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 세트의 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 2-6 (서열 식별 번호 2-6)를 또한 준비하였다:

2: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG

3: AGTACAAATATCTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG

4: AGTACAAATATGTCATTATGAGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG

5: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATAACTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG

6: AGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGTAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGG

여기서 올리고뉴클레오티드 2는 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부에 52개 염기에 상보적인 52개 염기 영역을 포함하고, 올리고뉴클레오티드 3-6은 차례로 위치 1, 10, 20 및 30에서 단일 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 동일 영역을 포함한다.

이어서, 다음 제형으로부터 유래된 것에 상응하는 조성을 갖는 반응 혼합물을 준비하였다:

20uL 5x 완충제 pH 8.0

10uL 올리고뉴클레오티드 1, 3000 nM

10uL 올리고뉴클레오티드 2, 3, 4, 5 또는 6, 3000 nM

2.5U Mako DNA 중합효소 (예를 들면, Qiagen Beverly)

10uL 무기 피로포스페이트, 6mM

0.04U Apyrase

물로 100uL를 채움

여기서 5x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:

50uL Trizma 아세테이트, 1M, pH 8.0

25uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M

25uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M

50uL Triton X-100 계면활성제 (10%)

물로 1mL를 채움

올리고뉴클레오티드 1의 파이로인산첨가분해반응은 당해 혼합물을 37⁰C에서 120분 동안 항온처리하여 실행되며, 겔 전기영동에 의해 생성된 반응산물을 분석하였다.

이 분석의 결과는 도 1에 나타나 있으며, 여기에서 올리고뉴클레오티드 2의 존재 하에서, 올리고뉴클레오티드 1은 올리고뉴클레오티드 2로부터 용융되는 길이로 분해되고, 길이가 대략 50개 뉴클레오티드로 단축된 올리고뉴클레오티드는 남았음을 볼 수 있다. 역으로, 올리고뉴클레오티드 3 존재 하에서, 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부에서 단일 뉴클레오티드 미스매치로 인해 파이로인산첨가분해반응이 관찰되지 않는다. 올리고뉴클레오티드 4-6 존재 하에서, 올리고뉴클레오티드 1의 파이로인산첨가분해반응은 단일 염기 미스매치 위치로 진행되며, 단축된 올리고뉴클레오티드는 더 이상 분해되지 않고 남아있다.

실시예 2: 분해된 프로브의 원형화 및 원형화안된 DNA의 외핵분해성 분해

다음 뉴클레오티드 서열을 갖는, 단일-가닥으로 된 제 1 올리고뉴클레오티드 1 (서열 식별 번호 7) 및 2 (서열 식별 번호 8)를 준비하였다:

1:

5'-PCGCTCGATGTATACGCTCGGACCACTCGTACCTCGAACTGTCGTTAGTATTTTTATATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC-3'

2:

5'-PATGTTCGATGAGGCACGATATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGATATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAATAACCTCGTTTTTTATATGTAGTT-3'

여기서 A, C, G, 및 T는 DNA의 관련 특징적인 핵염기를 품고 있는 뉴클레오티드를 나타내고, P는 5' 포스페이트기를 나타내며, 여기서 올리고뉴클레오티드 1은 적합한 표적 올리고뉴클레오티드에 대항하여 올리고뉴클레오티드 2의 파이로인산첨가분해반응을 통하여 얻어지는 단축된 올리고뉴클레오티드 2를 포함한다.

다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 3의 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 3 (서열 식별 번호 9)이 또한 준비되었다:

TATCGTGCCTCATCGAACATAACTACATATAAAAAACGAGGTTATTGGTTTGTGGC/3ddC/

여기서 /3ddC/는 3' 디데옥시시토신 뉴클레오티드를 나타내고, 여기서 올리고뉴클레오티드 3은 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부에 상보적인 5' 단부, 올리고뉴클레오티드 2의 내부 영역, 그리고 올리고뉴클레오티드 1 및 2의 5' 단부에 상보적인 3' 단부를 갖는다.

20uL 5x 완충제 pH 8.0

10uL 올리고뉴클레오티드 1 또는 2, 3000 nM

10uL 올리고뉴클레오티드 3, 3000 nM

7U E. Coli 리게이즈

물로 100uL를 채움

여기서 5x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:

50uL Trizma 아세테이트, 1M, pH 8.0

25uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M

25uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M

50uL Triton X-100 계면활성제 (10%)

물로 1mL를 채움

올리고뉴클레오티드 결찰은 그 다음 이 혼합물을 37⁰C에서 30분 동안 항온처리함으로써 수행되었다.

그 다음, 다음 제형으로부터 유도된 것에 상응하는 조성을 갖는 제 2 반응 혼합물을 준비하였다:

20uL 5x 완충제 pH 8.0

125U 엑소뉴클레아제 III 또는 등가 부피의 물

물로 100uL를 채움

여기서 5x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:

50uL Trizma 아세테이트, 1M, pH 8.0

25uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M

25uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M

50uL Triton X-100 계면활성제 (10%)

물로 1mL를 채움

그런 다음, 첫 번째 및 두 번째 반응 혼합물을 복합시키고, 생성된 혼합물을 37⁰C에서 30분 동안 항온처리하여, 임의의 원형화안된 DNA의 외핵분해성 분해가 되도록 하였다. 이어서 생성된 용액을 겔 전기 영동으로 분석하였다.

이 분석 결과는 도 2에 나타내는데, 상기 단축된 올리고뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드 1)는 결찰 반응에 의해 효율적으로 원형화되며, 후속 엑소뉴클레아제 분해에도 살아남는 반면, 상기 단축-안된 올리고뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드 2)는 원형화되지 않고, 효과적으로 절단된다.

실시예 3: 원형화된 프로브의 증폭

다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 한 쌍의 단일 가닥으로된 올리고뉴클레오티드 프라이머 1 (서열 식별 번호 10) 및 2 (서열 식별 번호 11)를 준비하였다:

1: TGCTCAAGTATTGTCAAAGC

2: CGGCAGATATAGGATGTTGC

20uL 5x Phusion Flex HF 반응 완충제

실시예 2의 최종 반응 혼합물 0.1uL

물로 100uL를 채움

다음 제형으로부터 유도된 것에 상응하는 조성을 갖는 제 2 반응 혼합물도 또한 준비되었다:

20uL 5x Phusion Flex HF 반응 완충제

10uL 베타인, 2.5M

10uL 올리고뉴클레오티드 1, 3000 nM

10uL 올리고뉴클레오티드 2, 3000 nM

10uL dNTPs, 2mM

2U Phusion Hot Start Flex DNA 중합효소

물로 100uL를 채움

그 다음 제 2 반응 혼합물은 0.1uL의 제 1 반응 혼합물과 복합시키고, 생성된 혼합물은 98⁰C에서 1 분, 이어서 30회 (98^℃ x 20 초; 55^℃ x 30 초; 68^℃ x 30 초) 항온처리하여, 당해 중합효소 쇄 반응을 통하여 지수적 증폭이 일어나도록 한다.

생성 된 반응 생성물은 겔 전기 영동으로 분석되며, 그 결과는 도 3에 나와있다. 이 분석으로부터 단축된 올리고뉴클레오티드가 실시예 2에 존재하고 원형화되었을 때, 이 증폭에 의해 다량의 생성물이 생성됨을 알 수 있다. 반대로, 단축되지-않은 올리고뉴클레오티드가 실시예 2에 존재하고, 원형화가 일어나지 않았을 때, 관찰 가능한 DNA의 증폭은 없었다.

실시예 4: 피로포스페이트 유사체를 이용한 파이로인산첨가분해반응

다음 뉴클레오티드 서열을 갖는, 단일-가닥으로 된 제 1 올리고뉴클레오티드 1 (서열 식별 번호 12)을 준비하였다:

5'-ATGACCTCGTAAGCCAGTGTCAGAGFFTTQTTCCAGCCGT-3'

여기서 A, C, G, 및 T는 DNA의 관련 특징적인 핵염기를 품고 있는 뉴클레오티드를 나타내고; F는 통상적인 아민-부착 화학을 사용하여 Atto 594 염료로 라벨시킨 데옥시티미딘 뉴클레오티드 (T)를 나타내고, Q는 BHQ-2 소광제(quencher)로 라벨된 데옥시티미딘 뉴클레오티드를 나타낸다.

다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 또 다른 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 2 (서열 식별 번호 13)를 또한 준비하였다:

5'-TTCACACGGCTGGAAAAAAACTCTGACACTGGCTTACGAGGTCATTAGATX-3'

여기서 X는 역전된 3'dT 뉴클레오티드를 나타내며, 올리고뉴클레오티드 2가 올리고뉴클레오티드 1에 어닐링될 때, 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부가 오목하기 되어, 파이로인산첨가분해반응의 표적이 되고, 올리고뉴클레오티드 2의 3' 단부는 말단 역전된 뉴클레오티드의 존재로 인해 파이로인산첨가분해반응으로부터 보호된다.

20uL 5x 완충제 pH 8.0

10uL 올리고뉴클레오티드 1, 1000 nM

10uL 올리고뉴클레오티드 2, 1000 nM

2.5U Mako DNA 중합효소 (예를 들면, Qiagen Beverly)

10uL 무기 피로포스페이트, 6mM 또는 이미도디포스페이트, 10mM 또는 물

물로 100uL를 채움

여기서 5x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:

50uL Trizma 아세테이트, 1M, pH 8.0

25uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M

25uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M

50uL Triton X-100 계면활성제 (10%)

물로 1mL를 채움

그 다음, 올리고뉴클레오티드 1의 파이로인산첨가분해반응은 당해 혼합물을 37^℃에서 75 분 동안 항온처리함으로써 실행된다. 올리고뉴클레오티드 1이 점진적으로 피로포스포릴화되어, 형광 염료 분자가 소광제로부터 분리되어, 형광 신호를 생성 할 수 있었다. 항온처리 기간 동안 이 형광의 증가는 CLARIOStar 마이크로플레이트 판독기(가령, BMG Labtech)를 통하여 모니터링하고, 무기 피로포스페이트, 이미도디포스페이트 또는 물의 존재 하에서 당해 올리고뉴클레오티드의 파이로인산첨가분해반응 속도를 추론하는데 사용되었다.

이 실험의 결과는 도 4에서 그래프로 표시된다. 이것으로부터 파이로인산첨가분해반응은 피로포스페이트 또는 이미도디포스페이트의 존재 하에서 진행되며, 이의 부재 시 진행되지 않음을 알 수 있다. 유사하게, 중합 효소가 존재하지 않는 비교 실험에서는 형광 신호가 생성되지 않았다. 파이로인산첨가분해반응은 피로포스페이트 존재 하에서 자유 뉴클레오티드 트리포스페이트를 만들지만, 한편 파이로인산첨가분해반응은 이미도디포스페이트 존재 하에서 변형된 자유 뉴클레오티드 트리포스페이트를 만드는데, 이때 변형은 베타와 감마 포스페이트 사이에 O 대신 N-H기를 갖는다 (2'-데옥시뉴클레오시드-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트).

실시예 5: 용융 곡선 분석

본 발명의 방법은 인간 EGFR 유전자에서 발생할 수 있는 3 개의 상이한 돌연변이의 존재를 검출하고, 이를 확인하기 위해 수행되었다: T790M (엑손 20), C797S (엑손 20) 및 L861Q (엑손 21).

야생형 게놈 DNA를 함유하는 6개 샘플을 준비했다. 이들 샘플 중 3 개는 관심대상의 3 개의 돌연변이 각각에 대한 단일 합성 돌연변이 서열로 스파이킹되어, 이들 샘플의 최종 돌연변이 대립 유전자 분획이 1%가 되도록 하였다. 각 샘플에 상이한 단일 돌연변이 검출을 위해 기획된 프로브 올리고 A₀를 추가했다.

T790M (서열 식별 번호 14):

5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAGCACGGCAGATATAGGATGTTGCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTG -3'

C797S (서열 식별 번호 15):

5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAAGCTCGCAGATATAGGATGTTGCGATAGTCCAGGAGGCTGC-3'

L861Q (서열 식별 번호 16):

5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGATCCGCACCCAGCTGTTTGGC-3'

상기 샘플들은 무기 피로포스페이트 이온 및 Mako DNA 중합효소의 추가 및 41℃에서 항온처리를 통하여 파이로인산첨가분해반응을 겪게되었다. 상기 프로브 올리고의 파이로인산첨가분해반응에 이어, 결찰은 E. Coli 리게이즈 및 다음의 서열을 갖는 스플린트 올리고를 첨가하여 수행하였다:

T790M (서열 식별 번호 17):5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATGCCCTTCGCAACATCT-3'

C797S (서열 식별 번호 18):5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATTCCTGGACTATCGCAT-3'

L861Q (서열 식별 번호 19):5'-AGCTCATCGAACATCTGGGTGCGGATCGCAACAA-3'

결찰이후, 당해 샘플은 dNTPs, BstLF DNA 중합효소, Sybr Green 인터칼레이팅 염료, 하기 서열을 갖는 돌연변이-특이적 포워드 프라이머 및 범용 리버스 프라이머를 추가하여 과다분기형 롤링 서클 증폭을 수행하고, 이어서 60℃에서 70 분 동안 항온처리하였다.

T790M (서열 식별 번호 20):5'-ACATCCTATATCTGCCGT-3'

C797S (서열 식별 번호 21):5'-CATCGAACATTCCTGGACTA-3'

L861Q (서열 식별 번호 22):5'-TCATCGAACATCTGGGTGCG-3'

범용 리버스 프라이머 (서열 식별 번호 23): 5'-ATGTTCGATGAGCTTTGACA-3'

그런 다음, 샘플의 온도를 70℃에서 95℃로 높이고, 매 0.5℃ 마다 형광을 측정했다. 결과 데이터 곡선은 용융 피크를 생성하기 위해 차별화되었으며 그 결과는 도 5에 나와 있다. 따라서, 상당한 용융 피크의 존재는 주어진 프로브에 의해 표적화된 돌연변이의 존재를 추론하는 데 사용될 수 있는 반면, 이 피크의 위치는 돌연변이의 특성을 확인하는 데 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 응용 및 용도

아래에 설명된 다음 응용은 본 발명의 방법이 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 몇 가지 예를 제공한다.

동반 진단

본 발명의 방법은 적절한 치료법의 선택을 안내하는 데 사용될 수 있는 샘플에서 특정 유전자 마커를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 마커는 종양-특이적 돌연변이이거나 또는 야생형 게놈 서열일 수 있으며, 조직, 혈액 또는 기타 환자 샘플 유형을 사용하여 검출할 수 있다.

저항 모니터링

질병을 치료하는 동안 환자의 샘플을 반복적으로 검사하면 치료에 대한 내성을 조기에 발견할 수 있다. 이 적용의 예로는 비-소 세포 폐 암종 (NSCLC)에서 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제 (가령 게피티닙, 에르로티닙)가 공통적으로 제 1 선 치료에 이용된다. 치료 중 종양은 약물에 대한 내성을 부여하는 EGFR 유전자 (예: T790M, C797S)에서 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 이러한 돌연변이의 조기 발견은 환자를 대체 요법 (예, Tagrisso)으로 전환시키는 것을 허용할 수 있다.

일반적으로 저항성 발생에 대해 모니터링을 받는 환자는 반복적인 조직 생검을 수행하기에는 너무 아플 수 있다. 반복적인 조직 생검은 또한 비용이 많이 들고, 침습적이며 관련 위험을 수반할 수 있다. 혈액에서 검사하는 것이 바람직하지만, 적절한 혈액 채취 샘플에서 관심대상 돌연변이의 복사체가 매우 적을 수 있다. 따라서, 모니터링은 본 발명의 방법을 사용하여 혈액 샘플로부터의 민감한 테스트를 필요로 하며, 이 방법은 정기적으로 수행될 수 있도록 수행하는데 간단하고 비용 효율적인 방법이다.

재발 모니터링

이 적용 예에서, 치료 후 질환이 없다고 선언된 환자는 질환의 재발을 감지하기 위해, 시간 경과에 따라 모니터링 될 수 있다. 이것은 비-침습적으로 수행되어야 하며, 혈액 샘플에서 표적 서열의 민감한 검출을 요한다. 본 발명의 방법을 이용하여, 정기적으로 수행할 수 있는 간단하고 저렴한 방법을 제공한다. 표적화된 서열은 관심 질환에서 흔한 것으로 알려진 일반적인 돌연변이일 수 있거나, 또는 완화 이전에 종양 조직에서 변이체의 검출에 기초하여 특정 환자를 위해 설계된 표적의 맞춤형 패널일 수 있다.

최소 잔류 질환 (MRD) 모니터링

일부 암의 경우, 치료 후 환자에게 남아있는 잔여 암세포가 있으며, 이는 암 및 백혈병 재발의 주요 원인이다. MRD 모니터링 및 검사에는 다음을 결정하는데 몇 가지 중요한 역할을 한다: 치료를 통해 암이 박멸되었는지 결정할 때, 또는 다른 치료의 효능과 비교하여, 흔적이 남는지를 결정할 때, 환자의 완화 상태 모니터링 뿐만 아니라 백혈병 재발 감지에, 이러한 요구에 가장 적합한 치료법을 선택할 때.

스크리닝

질환의 조기 발견을 위한 집단 선별 검사는 특히 암 진단에서 오랜 목표였다. 도전은 두-가지다: 너무 많은 위음성 없이, 질환을 확실하게 검출할 수 있는 마커 패널 식별, 그리고 충분한 감도와 낮은 비용을 가진 방법의 개발. 본 발명의 방법은 PCR-기반 테스트보다 더 큰 돌연변이 패널을 처리하는데 사용될 수 있지만, 시퀀싱-기반 진단보다 훨씬 더 간단한 작업 흐름과 낮은 비용으로 사용할 수 있다.

장기 이식 거부

이식된 장기가 수혜자에 의해 거부되면, 이 장기의 DNA가 수혜자의 혈류로 흘러 들어간다. 이 DNA를 조기에 발견하면, 거부 반응을 조기에 발견 할 수 있다. 이는 기증자 특이적 마커의 맞춤형 패널을 사용하거나 또는 집단에서 공통적인 것으로 알려진 변이체 패널을 사용하여 달성할 수 있으며, 그중 일부는 기증자에게, 일부는 수혜자에게 존재할 것이다. 장기 수혜자의 일상적인 모니터링은 여기에 개시된 본 발명의 저비용 및 간단한 작업 흐름에 의해 가능해질 수 있다.

비 침습적 산전 검사 (NIPT)

태아 DNA가 모체 혈액에 존재한다는 것은 오랫동안 알려져 왔으며, NIPT 시장은 현재 태아 이상을 감지 할 수 있도록 특정 염색체의 돌연변이 식별 및 복제수를 확인하는 시퀀싱을 사용하는 회사로 포화 상태에 있다. 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법은 매우 낮은 대립 유전자 분획에서 돌연변이를 검출하는 능력을 가지며, 잠재적으로 태아 DNA의 조기 검출을 가능하게 한다. 주어진 집단에서 일반적인 돌연변이를 식별하면, 모체 또는 태아 DNA에 존재할 수 있는 돌연변이를 표적으로 삼거나 또는 임신 초기 단계에서 이상을 감지할 수 있는 분석법을 개발할 수 있다.

실시예 7: 단일 웰 멀티플렉싱 기법(Single Well Multiplexing Techniques)

일부 예에서, 표적 중 어느 하나에 대한 동일성이 아닌, 이의 존재가 확인되어야 하는 돌연변이 또는 표적 서열 그룹이 있다. 다른 경우에는 돌연변이 또는 서열의 존재와 정체성에 대한 정보가 필요하다. 두 경우 모두에서, 모두 단일 반응 부피에서 여러 표적이 분석되도록 반응을 다중화하는 것이 좋다. 이로 인해 한 번에 처리할 수 있는 샘플 수 또는 분석할 수 있는 표적 패널의 크기가 증가하여 프로세스의 효율성이 향상된다. 표적 서열의 존재는 알아야 하지만, 동일성에 관해서 요구되지 않는 경우, 다중 표적에 대한 프로브를 단일 반응 부피로 결합하는 것만큼 간단하게 다중화할 수 있다. 표준 PCR에 비해 본 발명의 방법의 한 가지 주요 이점은 하나의 단일 프라이머 세트를 사용하여 반응의 최종 단계에서 모든 '활성화된' 프로브 (A₂)를 증폭할 수 있다는 것이다.

EGFR 유전자에 대한 엑손19 결실을 사용하여, 본 발명자들은 단일 반응에서 0.1% 돌연변이 대립 유전자 빈도 (MAF)에서 10-배 다중 검출을 입증했다.

20 개의 샘플을 준비했고, 각 샘플은 10 개의 상이한 다른 엑손19 결실 중 하나를 0.1% 또는 0.5% 스파이킹한 야생형 (WT) DNA를 포함한다. WT DNA만을 포함하는 추가 샘플을 대조군으로 사용했다. 10 개의 상이한 엑손19 돌연변이를 모두 검출하기 위한 프로브를 모든 샘플에 추가하고, 표준 조건을 사용하여 반응을 수행했다. 결과 (도 6 참조)는 0.5% 및 0.1% MAF에서 각 돌연변이의 명확한 검출을 보여준다.

표준 기술을 이용하여 탐지할 수 있는데-인터칼레이팅 염료, 라벨된 프로브 (Taqman, Scorpion, 스템-루프 프라이머), 분자 비콘 또는 당업자에게 알려진 기타 표준 기술을 사용하여 탐지될 수 있다.

표적의 식별이 필요한 경우, 활성화된 프로브(A₂)를 식별하기 위해, 다색(multi-colour) 시스템이 사용되는 경우가 많다. 이것은 당연히 다른 표적에 대한 프로브에 다른 '바코드'서열이 있는 프로브 디자인을 필요로 하며, 그런 다음 식별에 사용된다. 그런 다음, 앞에서 설명한대로 식별을 수행할 수 있다.

본 발명자들은 1 색을 사용하는 10-플렉스 다중 검출 뿐만 아니라 현재 방법의 선형 및 롤링-원 증폭 구현 모두에서 단일 웰에서 2-색 검출을 시연했다 (전자는 Taqman 프로브를 사용하고, 후자는 스템-루프 프라이머를 사용). 이 예에서, 0%, 0.1% 및 0.5%의 대립 유전자 분획에서 T790M 돌연변이 또는 C797S 돌연변이를 포함하는 샘플을 준비했다. 파이로인산첨가분해반응 및 후속 결찰 후, 샘플을 상이한 형광단으로 라벨된 돌연변이 표적화 프로브 A₀에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 사용하여 롤링 서클 또는 선형 PCR 증폭을 수행하였다. 라벨된 스템-루프 프라이머를 사용한 롤링 서클 증폭의 결과는 도 7에 나와 있고, 여기에서 T790M 돌연변이 존재 하에 Cy5 검출 채널에서 신호가 생성되는 것을 볼 수 있는 반면, 신호는 C797S 돌연변이를 포함하는 샘플의 TexasRed 채널에서 관찰된다.

실시예 8: 백그라운드 신호 교정을 위한 대조군 프로브 사용

3 개의 샘플 1-3이 준비되었고, 각 샘플은 인간 EGFR 유전자의 엑손21의 L858R 돌연변이 영역의 야생형 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 1 (서열 식별 번호 24)의 최종 농도 100nM을 포함한다:

5'- CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGG-3'

EGFR 유전자의 동일한 영역에서 유래된 다음 서열을 갖고, L858R 돌연변이를 추가로 포함하는 합성 '돌연변이' 올리고뉴클레오티드 2 (서열 식별 번호 25)를 준비하였다:

5'- CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGG-3'

올리고뉴클레오티드 2를 샘플 2와 샘플 3에 각각 100pM 및 1nM의 최종 농도로 추가하여, 샘플 2에서 L858R 돌연변이를 포함하는 분자의 0.1% 및 샘플 3에서는 이들 분자가 1%가 되도록 하였다. 그런 다음, 각 샘플을 두 개의 반응 부피로 분할했다. 제 1 반응 부피에, 검정 프로브 올리고뉴클레오티드 3 (서열 식별 번호 26)을 10nM의 최종 농도로 추가하였고, 이는 돌연변이된 L858R 서열 영역에 완벽하게 매칭되는 3' 단부를 포함하는 한편, 제 2 부피에는 대조군 프로브 올리고뉴클레오티드 4 (서열 식별 번호 27)가 동일 농도로 추가되었는데, 이는 L858R 돌연변이 영역을 제외하고 동일한 서열을 포함하며, 여기에서 이것은 돌연변이와 야생형 대립유전자 모두에 미스매치되는 서열을 포함한다:

올리고뉴클레오티드 3:

5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGACAGTTTGGCCCGCCCAAA-3'

올리고뉴클레오티드 4:

5'-PATGTTCGATGAGCTTTGACAATACTTGATCGATGCAGATATAGGATGTTGCGACAGTTTGGCCGGCCCAAA-3'

그 다음 반응 부피는 0.6mM 피로포스페이트 이온 및 37.5U/mL Mako DNA 중합효소를 추가하고, 30분 동안 41℃로 가열하여, 파이로인산첨가분해반응을 겪도록 하였다. 이 반응에 이어, 스플린트 올리고뉴클레오티드 5 (서열 식별 번호 28)가 각 반응 부피에 10nM의 최종 농도로 추가되고, 이와 함께 50U/mL 열안정성 무기 피로포스파타제 및 100U/mL E. Coli 리게이즈가 추가되며, 피로포스포릴화된 프로브는 37℃에서 10 분 동안 항온처리됨으로써 원형화되었다. E. Coli 리게이즈는 그 다음 10 분 동안 95℃로 가열함으로써 비활성화되었다.

올리고뉴클레오티드 5:

5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATGCCAAACTGTCGCAAG-3'

이후, 당해 샘플에 엑소뉴클레아제 III 및 T5 엑소뉴클레아제를 추가하고, 5분 동안 30℃에서 항온처리하여 엑소뉴클레아제 분해를 실시한 다음, 5분 동안 95℃로 가열함으로써, 이 엑소뉴클레아제는 비활성화되었다.

그 다음 각 샘플에 200nm 최종 농도로 두 개의 프라이머 올리고뉴클레오티드 6 (서열 식별 번호 29) 및 7 (서열 식별 번호 30)를 추가하고, 0.4mM dNTPs, 320U/mL BstLF DNA 중합효소 및 0.5x 최종 농도 Sybr Green 인터칼레이팅 염료를 추가하였다.

올리고뉴클레오티드 6: 5'-TCGCAACATCCTATATCTGC-3'

올리고뉴클레오티드 7: 5'-TGAGCTTTGACAATACTTGA-3'

상기 샘플을 80분 동안 60℃에서 항온처리하였고, 각 샘플에서 분당 1회 Sybr Green 염료의 형광을 측정했다. 이 항온처리 결과는 도 8 (i)에 나와 있고; 분석 프로브가 있는 경우 형광 신호는 L858R 돌연변이의 존재에 따라 달라지지만, 대조 프로브에서 관찰된 신호는 이 돌연변이의 존재와 무관하며, 돌연변이가 없는 경우 프로브에서 관찰된 신호와 거의 일치함을 볼 수 있다. 도 8 (ii)에서는 세 개 샘플 각각에 대한 분석 프로브 신호에서 대조 프로브 신호를 뺀 결과를 보여준다. 따라서, 이 기술을 통해 참조 샘플을 사용하지 않고, L858R 돌연변이를 0.1% 대립 유전자 분획까지 정량적으로 검출 할 수 있다.

본 발명의 다양한 추가 측면 및 구체예들은 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 명백 할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 또는 포함하지 않는 2 개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 제시된 것처럼, (i) A, (ii) B 그리고 (iii) A와 B 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다.

문맥이 달리 지시하지 않는 한, 위에 설명된 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구체예로 제한되지 않으며, 설명된 모든 측면 및 구체예들에 동일하게 적용된다.

본 발명이 여러 구체예들을 참조하여 예로서 설명되었지만, 개시된 구체예들에 제한되지 않고, 대안적인 구체예들이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 첨부된 청구 범위에 정의된 발명의 구성 될 수 있다는 것이 당업자에 의해 더 이해 될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Biofidelity Limited <120> IMPROVED POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE DETECTION METHOD <130> P31404WO2 <150> EP18184575.1 <151> 2018-07-19 <150> PCT/EP2018/083227 <151> 2018-10-30 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 1 a single-stranded first oligonucleotide 1 <400> 1 cgctcgatgt atacgctcgg accactcgta cctcgaactg tcgttagtat ttttatatgt 60 agtttctgaa gtagatatgg cagcacataa tgac 94 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 1 a single-stranded oligonucleotide 2 <400> 2 agtacaaata tgtcattatg tgctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact 60 aactttaagg 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 1 a single-stranded oligonucleotide 3 <400> 3 agtacaaata tctcattatg tgctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact 60 aactttaagg 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 1 a single-stranded oligonucleotide 4 <400> 4 agtacaaata 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labelled with BHQ-2 quencher <222> 30 <400> 12 atgacctcgt aagccagtgt cagagtttttttc cagccgt 39 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 4 a single-stranded oligonucleotide 2 <220> <221> T at position 51 is an inverted 3'dT <222> 51 <400> 13 ttcacacggc tggaaaaaaa ctctgacact ggcttacgag gtcattagatt 51 <210> 14 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 5 T790M <220> <221> A at position 1 has a 5' phosphate group <222> 1 <400> 14 atgttcgatg agctttgaca atacttgagc acggcagata taggatgttg cgaagggcat 60 gagctgcatg atgagctg 78 <210> 15 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 5 C797S <220> <221> A at position 1 has a 5' phosphate group <222> 1 <400> 15 atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60 ggaggctgc 69 <210> 16 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example 5 L861Q <220> <221> A at position 1 has a 5' phosphate group <222> 1 <400> 16 atgttcgatg agctttgaca atacttgatc 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Claims

다음 단계를 특징으로 하는 주어진 핵산 분석 물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법:
a. 상기 분석물을 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀에 어닐링시켜, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 이때 기 위해 A₀의 3' 단부는 상기 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고;
b. 상기 제 1 중간 산물을 A₀의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 파이로인산첨가분해 효소를 이용하여 파이로인산첨가분해시켜 부분적으로 절단된 스트랜드 A₁과 상기 분석물을 생성시키고;
c. (i) A₁을 단일-가닥으로 된 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링시키고, B에 대해 5'-3' 방향으로 A₁ 스트랜드를 연장시키고; 또는 (ii) 이의 3' 단부와 5' 단부의 결찰을 통하여 A₁을 원형화시키고; 또는 (iii) A₁의 3' 단부를 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부에 결찰시키고; 각 경우에 올리고뉴클레오티드 A₂가 생성되며;
d. A₂를 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍시켜, A₂또는 A₂ 영역의 다수 복사체를 생성시키고; 그리고
e. 상기 다수 복사체로부터 유래된 신호를 탐지하고, 이로부터 당해 분석물 안에 당해 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추한다.
청구항 1에 있어서, 여기서 c(ii) 또는 c(iii)는 A₁이 결찰에 앞서 5'-3' 방향으로 우선 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 결찰 및 임의선택적으로 연장은 결찰 전, 추가 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 A₁에 추가를 통하여 실시하고, 여기서 D는 A₁의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역과 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A₁.의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 3에 있어서, 올리고뉴클레오티드 D는 3'-단부 변형, 또는 D의 3' 단부와 A₁의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치를 통해 A₁에 대해 연장하는 것이 불가능한, 방법.
청구항 1 내지 4에 있어서, 반응 혼합물은 단계 (c) 후에 엑소뉴클레아제로 처리되어, 실질적으노 임의의 비-결찰된 핵산을 분해하고, 여기서 c(ii)가 이용되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 C는 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 이를 보호하는 3' 또는 내부 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 5에 있어서, 엑소뉴클레아제는 단계 (d) 전에 비활성화되는 것을 추가 특징으로 하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 여기서 c(i)가 이용될 때, B는 (i) A₁의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역, (ii) 이의 5' 단부에 A₀ 또는 상기 표적 서열에 실질적으로 상보적이지 않는 측면 올리고뉴클레오티드 영역을 포함하며, 여기에서 단계 (d) 에 이용된 프라이머 올리고뉴클레오티드중 하나는 A₂의 연장된 영역에 어닐링되는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀는 외핵분해반응에 저항성이 있는 5' 단부를 갖고, 단계 (a) 및 (b) 이후, 이로부터 생성된 반응 배지는 5'-3' 엑소뉴클레아제로 처리하여, 이러한 외핵분해반응에 대해 저항성을 부여받지 않은 임의의 핵산 분자를 실질적으로 제거하는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 8에 있어서, 이용된 엑소뉴클레아제는 5' 포스페이트 기의 존재에 따라 부분적으로 활성을 갖고, 상기 분해는 키나제 및 포스페이트 공여자 존재 하에서 실행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 단계 (b)는 포스파타제 존재 하에 실행되는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 당해 분석물로부터 부분적으로 절단된 프로브 A₁ 의 다수의 복사체가 생성될 때까지 반복되는 것을 추가 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 파이로인산첨가분해반응 반응은 피로포스파타제의 추가에 의해 단계 (b) 이후에 중단되는 것을 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 단계 (e)는 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 결합 염료 또는 분자 프로브를 이용하여 다수의 복사체로부터 유래된 신호 탐지를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 단계 (d) 및 (e)는 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 14에 있어서, 단계 (d)에서 앰플리콘의 생성으로 인한 시간 경과에 따른 신호의 증가는 분석물에서 표적 서열의 농도를 추론하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 단계 (a) 전에, 단일-가닥으로 된 분석물은 (i) 분석물 및 임의선택적으로 배경 게놈 DNA로 구성된 생물학적 샘플을 증폭 사이클을 겪에 감으로써 당해 분석물의 앰플리콘을 만드는 단계, 그리고 (ii) 단계 (i)의 산물을 5'-3' 외핵분해성 활성을 갖는 엑소뉴클레아제로 절단시키는 단계에 의해 유래되고, 여기서 이용된 프라이머중 하나에는 엑소뉴클레아제 차단 기가 포함되는, 방법.
청구항 1 내지 15중 임의의 한 항에 있어서, 단계 (a) 전, 단일-가닥으로 된 분석물은 (i) 분석물 및 임의선택적으로 배경 게놈 DNA로 구성된 생물학적 샘플을 증폭 사이클을 겪에 감으로써 당해 분석물의 앰플리콘을 만드는 단계에 의해 유도되며, 여기서 이용된 프라이머중 하나는 다른 것(들)에 대해 과량으로 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 16 또는 17에 있어서, 단계 (i)에 이용된 증폭 방법은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소를 이용하고, 여기서 단계 (i) 이후 상기 산물을 단백질분해효소와 반응시켜, 당해 중합효소를 파괴시키고, 여기서 당해 단백질분해효소는 그 다음 이 반응 산물을 가열시킴으로써, 파괴되는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 16 내지 18에 있어서, 단계 (i)는 데옥시티미딘 트리포스페이트 대신 데옥시우리딘 트리포스페이트를 이용하고, UTP-DNA 글리콜라제 존재 하에서 실행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
전술한 항들중 임의의 항에 있어서, 다수 프로브 A₀이 이용되며, 각각은 상이한 표적 서열에 대해 선택성이며, 이들 각각은 식별 영역을 갖는 것을 특징으로 하고, 단계 (d)에서 증폭된 영역에는 이러한 식별 영역이 포함된 것을 추가 특징으로 하는, 방법.
청구항 20에 있어서, 단계 (d)에서 생성된 앰플리콘으로부터 프로브(들) A₀이 유래되며, 따라서 분석물에 존재하는 표적 서열이 식별 영역(들)의 탐지를 통해 추론되는 것을 특징으로하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 식별 영역(들)의 탐지는 분자 프로브의 사용 또는 시퀀싱을 통하여 실행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 22에 있어서, 여기서 (e)는 다음 단계들을 더 포함하는, 방법:
i. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 A₂의 다중 복사체 또는 A₂ 영역을 라벨시키는 단계;
ii. 상기 다수 복사체의 형광 신호를 측정하는 단계;
iii. 상기 다수 복사체를 변성 조건에 노출시키는 단계; 그리고
iv. 변성 조건에 노출되는 동안 여러 복사체의 형광 신호 변화를 모니터링하여, 당해 분석물에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별해내는 단계.
청구항 1 내지 19에 있어서, 단계 (a) 전에, 분석물이 다중 반응 부피로 분할되고, 각각의 부피는 상이한 표적 서열을 검출하기 위해 도입된 상이한 프로브 올리고뉴클레오티드 A₀를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 20 내지 24에 있어서, 상이한 프로브 A₀는 공통 프라이밍 부위를 포함하며, 단계 (d)에서 증폭에 사용되는 단일 또는 단일 프라이머 세트를 허용하는 것을 특징으로 하는, 방법.