TW202208624A - 檢測egfr變異體iii的套組及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於檢測上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII）的套組。該套組包含一組EGFRvIII突變專一性引子對及一組EGFRvIII突變專一性探針。本發明亦提供一種用於檢測EGFRvIII突變的方法，包含產生擴增的標靶cDNA以便在單一反應中與該組EGFRvIII突變專一性探針雜合，以及檢測探針結合產物以識別一生物樣品中所有可能的EGFRvIII突變。
Description
本申請案主張2019年8月28日提出的美國臨時申請案第62/893,152號的優先權，其全部內容通過引用併入本文。
本發明係關於用於分子診斷及基因體學的套組（kit）及方法。具體而言，本發明係關於一種用於分子診斷和癌症基因體學的套組及方法。
EGFR基因主要編譯上皮細胞生長因子接受器，它是一種酪氨酸激酶受體。當該受體與其配體結合後，其會形成二聚體並啟動下游路徑／訊息分子，例如Ras/Raf/MAPK路徑、PI3K路徑、磷脂酶C或STAT。這些分子和路徑的啟動則會促進細胞的生存、生長和增生。
EGFR的基因組改變可能導致其下游訊息路徑的過度表達或常續性啟動（constitutive activation），最終導致產生癌症。在EGFR突變中，上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII）似乎是目前發現的最常見的缺失／刪除突變（deletion mutation）。EGFRvIII是指外顯子2（exon 2）至外顯子7的缺失，導致EGFR基因中的外顯子1和外顯子8融合，其常見於17%的膠質瘤（gliboastoma；GBM）中，以及肺癌、乳腺癌和頭頸癌。這種刪除突變會導致EGFR蛋白發生突變，該蛋白被構成性啟動，而無法與任何配體結合。
現今已經開發了幾種針對EGFR的治療方法，包括第一代、第二代和第三代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）和EGFR抗體療法。許多EGFR突變的癌症患者對這些療法產生反應。然而，具有EGFRvIII的患者則對上述療法有抗藥性。具有EGFRvIII的患者通常對EGFR靶向治療藥物具有抗藥性，例如：吉非替尼（gefitinib）、阿法替尼（afatinib）、厄洛替尼（erlotinib）、達克米替尼（dacomitinib）和西妥昔單抗（cetuximab）。因此，開發一種具有高靈敏度和專一性的檢測EGFRvIII的方法，以識別可能會對EGFR靶向治療產生抗藥性而需要另尋替代療法的患者是非常重要的。
本揭露係關於一種用於檢測上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII）的方法。該方法包含以下步驟：
（a）自一生物樣品中獲得核糖核酸（RNA）；
（b）對該RNA進行反轉錄以獲得互補去氧核糖核酸（cDNA）；
（c）使用一EGFRvIII融合專一性正向引子和一EGFRvIII融合專一性反向引子擴增該cDNA以獲得一擴增產物；
（d）將該擴增產物與一探針混合以獲得一探針結合產物，其中各該探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列；以及
（e）檢測該探針結合產物以判定EGFRvIII的存在。
為了確保擴增的產物是足夠的，可於前述步驟（c）中使用一對通用引子進行額外的一輪DNA擴增。因此，在一些較佳的實施例中，在步驟(c)中，首先使用該EGFRvIII融合專一性正向引子和該EGFRvIII融合專一性反向引子及其後使用一通用正向引子與一通用反向引子擴增該cDNA，以獲得該擴增產物。在這種情況下，該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有該通用引子對中的該通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有該通用引子對中的該通用反向引子的核苷酸序列。
另一方面，本文亦提供一種依據前述方法用於檢測上皮細胞生長因子接受器突變III型的套組。 該套組包含：一EGFRvIII融合專一性正向引子和一EGFRvIII融合專一性反向引子；以及一種探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列。
在一些較佳實施例中，該套組進一步包含一通用引子對，其中該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有該通用引子對中的一通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有該通用引子對中的一通用反向引子的核苷酸序列。
在一些較佳實施例中，該套組進一步包含一反轉錄酶（reverse transcriptase），係用於對分離自生物樣品中的RNA進行反轉錄，以及包含一DNA聚合酶（DNA polymerase），係用於擴增由反轉錄所產生的cDNA。
前述方法及套組中使用的探針可專一性地辨識上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII），以確證生物樣本中的EGFRvIII被準確地檢測出。此外，同時使用EGFRvIII融合專一性引子對和通用引子對進行DNA擴增，可以提高特定擴增產物的產量。因此，該方法和套組可以減少在EGFRvIII檢測中需要大量樣本量之條件。
除非另有定義，本文中使用的所有技術及科學術語具有與本揭露所屬技術領域中熟習技藝者通常理解的相同含義。定義
除非上下文另有明確指示，本文中所使用的單數形式「一」、「一個」及「該」包含複數指稱。
「EGFRvIII」是指EGFR基因有801個核苷酸的框內缺失（in-frame deletion），其對應位子為外顯子2至外顯子7，而導致EGFR基因的外顯子1和外顯子8融合的現象。這種EGFR突變將會導致EGFR蛋白的胞外區域中6～273個氨基酸的缺失／刪除，並在融合位點增加一個甘氨酸。因此，術語「EGFRvIII」和「EGFRvIII融合」在此可交替使用。EGFRvIII基因具有一個 「融合接點（fusion junction）」，此處為EGFR外顯子1（也稱為5’夥伴（5’ partner））與EGFR外顯子8(也稱為3’夥伴（3’ partner））融合的部位。融合接點位於由融合序列（也稱為融合接點序列）所定義的融合區域，該融合區域包括來自EGFR外顯子1的序列和來自EGFR外顯子8的序列。
EGFRvIII可藉由辨識DNA中或由該DNA所轉譯出的RNA中的融合區域來進行檢測。在本揭露中，待辨識的融合區域存在於RNA轉錄物中。
術語「引子（primer）」係指一合成的單股寡核苷酸，其可用於擴增具有特定長度的一標靶核酸。本文中所用術語「上皮細胞生長因子接受器突變III型專一性引子（EGFRvIII fusion-specific primer）」及「融合專一性引子（fusion specific primer）」可互換使用，其係指被設計用於擴增一標靶cDNA的DNA引子，且該標靶cDNA包含來自一特定EGFRvIII基因的融合接點。該上皮細胞生長因子接受器突變III型專一性引子係成對使用，包含一能夠專一地結合至一標靶cDNA的5’端的一上皮細胞生長因子接受器突變III型專一性正向引子（EGFRvIII fusion-specific forward primer），以及能夠專一地結合至所述標靶cDNA的3’端的一上皮細胞生長因子接受器突變III型專一性反向引子（EGFRvIII fusion-specific reverse primer）。
本文中所用術語「通用引子（universal primer）」係指被設計用於擴增包含通用引子的核苷酸序列的任何DNA的DNA引子。該通用引子係成對使用，包含一通用正向引子（universal forward primer）及一通用反向引子（universal reverse primer）。
除非另有定義，術語「探針（probe）」或「EGFRvIII融合專一性探針（EGFRvIII fusion-specific probe）」係指一合成的單股DNA寡核苷酸，其能夠與源自一種特定EGFRvIII基因的一融合區雜合。
本文中所用「連結件（connector）」或「接頭（linker）」係指一分子的一部分或由複數分子所構成複合物的一部分，其將一個分子連接至另一個分子。該連結件或接頭可以透過共價鍵、核酸雜合、或一對分子間的非共價交互作用，例如生物素-鏈親和素（biotin-streptavidin）交互作用等方式發揮作用。在本文中，「連結件」係用於連接一引子與一可偵測分子，例如一螢光分子；「接頭」係用於連接一探針及一可偵測分子或一獨有識別元件（unique identifier），例如一條碼磁珠（barcoded magnetic bead，BMB）。
本揭露提供一種用於檢測EGFRvIII的方法。該方法包括以下步驟：
（a）自一生物樣品中獲得核糖核酸(RNA)；
（b）對該RNA進行反轉錄以獲得互補去氧核糖核酸(cDNA)；
（c）使用一EGFRvIII融合專一性正向引子和一EGFRvIII融合專一性反向引子擴增該cDNA以獲得一擴增產物；
（d）將該擴增產物與一探針混合以獲得一探針結合產物，其中各該探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列；以及
（e）檢測該探針結合產物以判定上皮細胞生長因子接受器突變III型的存在。
在本方法的步驟（a）中，RNA係由一生物樣品製備。該生物樣品可以是從一動物或一人類受試者獲得的任何樣品。該生物樣品的實例包括一福馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）組織切片、血液、血漿或細胞。在一些實施例中，該生物樣品係源自一癌症患者。在一些實施例中，該生物樣品係源自一固體腫瘤、軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma）、或血液腫瘤。在一些實施例中，該生物樣品係源自患有多形性膠質母細胞瘤、肺癌、乳癌、或頭頸癌的一患者。
由生物樣品製備總RNA(total RNA)可以藉由本技術領域已知的各種方法進行。一種典型的步驟是使用有機溶劑（例如苯酚／氯仿）萃取RNA並且透過離心將其沉澱。市面上亦可取得用於分離或純化RNA的套組。獲得RNA後，將反轉錄酶與四種去氧核糖核苷三磷酸酯（deoxyribonucleoside triphosphates （dNTP），包括dATP，dCTP，dTTP及dGTP）一起使用，以從模板RNA生成cDNA，此一過程稱為反轉錄。反轉錄之進行可以使用SuperScript cDNA合成套組（SuperScript cDNA synthesis kit；貨號：11754050，Invitrogen）。
在本文所揭露方法的步驟（c）中，使用DNA聚合酶及一對EGFRvIII融合專一性引子擴增該cDNA，以獲得將用於探針檢測的擴增產物。擴增之執行可以使用包含DNA聚合酶的多重PCR套組(multiplex PCR kit；貨號：206143，Qiagen)。該EGFRvIII融合專一性引子可以在使用前作為一種試劑提供。
在一些較佳實施例中，在步驟（c）中首先使用EGFRvIII融合專一性正向引子與EGFRvIII融合專一性反向引子，及隨後使用通用正向引子與通用反向引子擴增該cDNA，以獲得該擴增產物。當在本文所揭露的方法中使用該通用引子對時，該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有一通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有一通用反向引子的核苷酸序列。
在本文所揭露方法的步驟（d）中，該擴增產物與探針相混合，使得一探針結合產物得以藉由核酸雜合而形成。由於該些探針是基於每種EGFRvIII融合類型的融合序列而特別設計，故藉由檢測特定的探針結合產物，將可判EGFRvIII融合的確切類型。
表1列出了用於檢測所示EGFRvIII融合而特別設計的探針。這些探針各自都已被證明對EGFRvIII融合類型具有專一性，並且不會與其他融合類型發生交叉反應，因此可以準確測定特定的EGFRvIII融合類型。 在一些實施例中，為檢測一種特定的EGFRvIII融合，會同時使用具有SEQ ID NO：1序列的探針以及具有一互補序列的探針，以增強檢測效率。
表1
| 融合編號 | 5’基因 | 3’基因 | 探針序列 (由 5’端 至3’端) | SEQ ID NO |
| EGFRvIII | EGFR exon 1 | EGFR exon 8 | AAAGAAAGTTGTGGTGA | 1 |
| TCACCACAACTTTCTTT | 2 |
在一些實施例中，一種標靶cDNA被擴增並且以探針探測後，會檢測出一種EGFRvIII融合類型。在其他實施例中，具有不同序列的二個或更多個標靶cDNA在一個反應中被擴增（稱為一多重擴增反應）及/或在一個反應中被探測（稱為一多重雜合反應）之後，可同時檢測多種EGFRvIII融合類型。當本揭露的方法於多重擴增反應下進行時，將使用至少兩個探針，即一個探針用於檢測EGFRvIII，另一個探針用於檢測其它基因組突變。
通常，探針及擴增產物係在一特定溫度下混合以促進探針雜合（probe hybridization）。在一些實施例中，用於雜合的溫度係介於35-50℃、40-50℃、40-45℃或45-50℃之間。在一些實施例中，該雜合係在介於700-1000 rpm、750-1000 rpm、800-1000 rpm、900-1000 rpm、700-750 rpm、700-800 rpm、750-800或800-900 rpm的轉速下藉由使用熱混合器以進行。
探針結合產物之檢測可以藉由檢測所述產物中的EGFRvIII融合專一性引子、通用引子、或探針來達成。因此，引子或探針通常被修飾為可以被偵測。透過將它們直接或間接地與一可偵測分子相連，引子或探針可以被修飾為具有螢光或化學發光活性，或者成為可呈色或可比色。在一些實施例中，引子對中的一個或兩個引子係連接生物素或者其他能夠與一綴合鏈親和素的可偵測分子（streptavidin-conjugated detectable molecule）相結合的化合物。該可偵測分子可以是一染劑、一螢光分子，例如：藻紅素（phycoerythrin，PE）或花青類染劑（cyanines），或者用於一呈色反應的一酵素，例如鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）或山葵過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）。呈色反應中使用的酵素在一呈色底物存在時，會催化有色化合物的生成。
在一些實施例中，用於檢測一種特定EGFRvIII融合類型的探針係與一獨有識別元件相接，使得多種EGFRvIII融合類型能被同時檢測並且可彼此區別。該獨有識別元件可以是一具有獨有序列的寡核苷酸，也可以是包含一獨有條碼（barcode）於表面的微珠或奈米粒子。該條碼可以是可被一具有明視野成像系統的光學掃描儀讀取的幾何圖案。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子是一磁性粒子。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子係由合成聚合物製成。
該獨有識別元件可以直接或者經由一接頭（linker）與探針相連。在一些實施例中，該獨有識別元件係藉由直接的化學偶聯連接至探針，故在獨有識別元件與探針間形成一共價鍵。在一些實施例中，該獨有識別元件係透過一聚合物接頭連接至探針。在一些實施例中，該獨有識別元件係透過互補核苷酸序列之間的雜合連接至探針。
本文揭露的方法可以在能夠進行多重反應的數種技術平台上執行，例如一微陣列板（microarray plate）、一基因晶片（gene chip）、微珠、奈米粒子、一膜片（membrane）或一微流體裝置（microfluidic device）。在一些實施例中，探針係固著於一微陣列板，一基因晶片或一膜片上的不同位置，例如以一點陣列的形式存在，每個點包含複數量的一種探針。在其他實施例中，探針係與微珠（例如磁性微珠）相連接。在其他實施方式中，探針係塗覆於一微流體裝置的一基板上，其中不同探針係位於該基板的不同區域內。
當探針係固著於一DNA微陣列板上，該微陣列板可進一步包含一組對照點，每個對照點包含複數量的一種對照探針（control probe）。該對照探針會與持家基因（housekeeping gene）（例如β-肌動蛋白（beta-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、及β2-微球蛋白（beta 2-microglobulin））的cDNA結合。因此，該對照點可以作為內部對照組以檢查試驗的效能。此外，該微陣列板可以進一步包含一組錨定點，每個錨定點包含複數量的一種錨定探針（anchor probe）。該錨定探針被設計為可無關於擴增產物而被檢測。因此，該錨定點可以用作該微陣列板上附近的點的一位置指標。
本文中亦提供一種依據本文揭露的方法檢測EGFRvIII的套組。該套組包含：一EGFRvIII融合專一性正向引子、一EGFRvIII融合專一性反向引子、及一探針，各該探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列。
在一些較佳實施例中，該套組進一步包含一通用引子對。當EGFRvIII融合專一性引子對與通用引子對係組合使用時，該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有一通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有一通用反向引子的核苷酸序列。
在一些實施例中，該套組進一步包含一內部對照組。該內部對照組可以是帶有EGFRvIII融合的一陽性對照樣品，或者可以是不具有EGFRvIII融合的一陰性對照樣品。在一些實施例中，該內部對照組係為一FFPE組織切片、血液、血漿、細胞、核酸或寡核苷酸。
在一些實施例中，當在來自癌症患者的一生物樣品中檢測到EGFRvIII融合時，該患者被預期為對酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）和／或EGFR抗體療法有抗性。該酪氨酸激酶抑制劑可為EGFR抑制劑，例如例如：吉非替尼、阿法替尼、厄洛替尼、達克米替尼。該EGFR抗體為西妥昔單抗。
實施例
實施例1：以單次擴增標靶-探針-BMB雜合試驗檢測EGFRvIII
單次擴增標靶-探針-條碼磁珠（BMB）雜合試驗可以在單一反應中同時檢測EGFRvIII。圖1顯示該試驗的整個過程，其包括以下步驟：從一生物樣品中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用EGFRvIII融合專一性引子對藉由聚合酶連鎖反應（PCR）擴增該cDNA的EGFRvIII融合區（即標靶cDNA）以獲得該標靶cDNA的一擴增產物，使用BMB偶聯探針（BMB-coupled probes）與被擴增的標靶cDNA雜合以及檢測探針結合產物。以下是該試驗的一個例子。
EGFRvIII融合專一性探針之製備
進行檢驗前，基於EGFRvIII融合基因（表2）的RNA轉錄物中的融合區的核苷酸序列，設計了一種EGFRvIII融合專一性探針。表2中所有序列的前20個鹼基對和後20個鹼基對分別來自EGFR基因的外顯子1和外顯子8。為了在表2中標示底線的位置進行雜合，將每種探針設計為具有表3所列的序列。該些探針係由IDT公司(Integrated DNA Technologies, Inc.，Coralville，愛荷華州)合成並且在5’端被賦予一個胺基修飾。隨後，該融合專一性探針透過胺基-羧基鍵結與具有識別碼的BMB相偶聯以形成「探針-BMB聚體」（probe-BMB complex）。
表2
| 融合編號 | 5’基因 | 3’基因 | 融合區序列 (由 5’端 至3’端) | SEQ ID NO |
| EGFRvIII | EGFR exon 1 | EGFR exon 8 | GCTCTGGAGGAAAAGAAAGT TGTGGTGA CAGATCACGGCT | 3 |
表3
| 融合編號 | 探針序列 (由 5’端 至3’端) | BMB ID |
| EGFRvIII | TCACCACAACTTTCTTT (SEQ ID NO:2) | 92 |
使用EGFRvIII融合專一性引子對進行PCR擴增
為了替代具有EGFRvIII融合的臨床樣品，由IDT公司合成了具有SEQ ID NO：3的序列的寡核苷酸（稱為EGFRvIII融合寡聚物（oligo）），用作陽性對照組模板。使用表4所示的EGFRvIII融合專一性引子對藉多重聚合酶連鎖反應（multiplex PCR）擴增該EGFRvIII融合寡聚物。這些能夠結合EGFRvIII融合寡聚物的5'端和3'端的每一引子對係由IDT公司合成。每一引子對中的反向引子的5’端被生物素修飾，以便後續與鏈親和素-藻紅素（streptavidin-phycoerythrin，SA-PE）綴合物（Thermo Fisher Scientific）產生交互作用。PCR係依據製造商說明書使用高保真度Platinum Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific）在Veriti™ 96孔熱循環儀（Thermo Fisher Scientific）上進行30個熱循環。
表4
| 融合編號 | 融合專一性引子對的序列 (由 5’端 至3’端) | SEQ ID NO | |
| EGFRvIII | 正向 | GGGCTCTGGAGGAAAAGAA | 4 |
| 反向 | TCCATCTCATAGCTGTCGG | 5 |
探針雜合及訊號檢測
將EGFRvIII融合寡聚物的擴增產物與探針-BMB在96孔盤的同一孔洞中混合以進行雜合。該雜合係在40℃及約700 rpm的搖動下進行10-30分鐘。雜合後，將SA-PE的螢光綴合物添加至該孔洞以便與擴增產物的生物素相結合，並且清洗該探針-BMB以去除未結合的物質。此外，向該孔洞中添加未攜帶探針的另外的BMB（識別碼為0）以作為陰性對照組。最後，利用配備了能夠同時進行明視野與螢光成像的相機的BioCode 2500分析儀（Applied BioCode Inc.，台北，台灣）去讀取BMB的條碼及檢測BMB的螢光訊號。
表5顯示BMB92及BMB0的螢光強度。依據表5，BMB92的螢光強度（其代表標靶-探針雜合，即存在EGFRvIII融合）明顯高於BMB0（代表沒有EGFRvIII融合）。此結果說明單次擴增標靶-探針-BMB試驗可用於檢測EGFRvIII融合的有無。
表5
| BMB ID 寡聚物ID | 0 | 92 |
| SEQ ID NO:3 | 3 | 4071 |
實施例2：以二次擴增標靶-探針雜合試驗檢測EGFRvIII融合
二次擴增標靶-探針雜合試驗係為了在單一反應中同時檢測多種可能的EGFRvIII融合所設計的另一種方法。圖2顯示該試驗的整個過程，其包括以下步驟：從一生物樣品中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用EGFRvIII融合專一性引子對透過聚合酶連鎖反應（PCR）擴增該cDNA的EGFRvIII融合區（即標靶cDNA）以獲得該標靶cDNA的第一擴增產物，使用一通用引子對透過PCR擴增該第一擴增產物以獲得該標靶cDNA的第二擴增產物，將被擴增的標靶cDNA用於探針雜合以及檢測探針結合產物。以下是該試驗的一個例子。
RNA萃取及反轉錄
依據製造商說明書利用RecoverAll總核酸分離套組（貨號：AM1975，Ambient Technologies）從癌症患者的FFPE組織樣本中萃取DNA和RNA。使用SuperScript cDNA合成套組（貨號：11754050，Invitrogen）及隨機六核苷酸引子（random hexanucleotide primers）在42°C對100 ng總RNA進行反轉錄30至60分鐘。此步驟生成10 μL的cDNA產物。
使用EGFRvIII融合專一性引子對進行PCR擴增
用於本試驗的EGFRvIII融合專一性引子對中的每個引子被設計為具有二個片段。一個片段被稱為融合專一性片段，係用於結合一種特定EGFRvIII融合序列的5’端或3’端。該融合專一性片段具有SEQ ID NO：4或5的序列（表4）。另一個片段被稱為通用片段，其具有在第二次PCR中所使用通用引子的核苷酸序列。該通用片段相對於該融合專一性片段始終位於上游或5’位置（圖2）。該通用引子可以是表6所列引子的任一者，表6中的每個通用引子都可以用作通用正向引子或通用反向引子。
表6
| 通用引子編號 | 引子序列 (由 5’端 至3’端) | SEQ ID NO |
| U01 | GTTTTCCCAGTCACGACGT | 6 |
| U02 | GCAAATGGCATTCTGACATCC | 7 |
| U03 | GCGGATAACAATTTCACACAGG | 8 |
| U04 | CGTCCATGCCGAGAGTG | 9 |
| U05 | CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA | 10 |
| U06 | GACTGGTTCCAATTGACAAGC | 11 |
| U07 | GCGTGAATGTAAGCGTGAC | 12 |
| U08 | TGTAAAACGACGGCCAGT | 13 |
| U09 | AAGGGTCTTGCGAAGGATAG | 14 |
| U10 | GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG | 15 |
進行融合專一性PCR時，依據製造商說明書使用多重PCR套組（貨號：206143，Qiagen）在Veriti™96孔熱循環儀（Thermo Fisher Scientific）上對10μL的cDNA進行擴增25個熱循環，由此生成10 μL的第一擴增產物。
使用通用引子對進行PCR擴增
由於每個融合專一性引子在5’端包含一通用引子的核苷酸序列，藉由使用通用引子對的PCR能夠進一步擴增該第一擴增產物。該通用引子對包含具有選自SEQ ID NO：6-15之序列的一通用正向引子，以及具有選自SEQ ID NO：6-15之序列的一通用反向引子。該通用反向引子被生物素修飾。進行第二次PCR時，將前述第一擴增產物稀釋100倍於最終反應混合物中，並且依據製造商說明書使用Platinum SuperFi II PCR預混液（Cat No：12368010，Invitrogen）在Veriti™96孔熱循環儀（Thermo Fisher Scientific）上對第一擴增產物進行擴增15-30個熱循環，由此得到10 μL的第二擴增產物。
探針雜合及訊號檢測
將前述第二擴增產物置於96孔PCR盤（貨號：P46-4TI-1000 /C，4titude）。該第二擴增產物在96°C變性5分鐘，再移入經預阻斷處理的孔洞（pre-blocked wells），各孔洞中預先印製一個探針點陣列，包括：EGFRvIII融合專一性探針的點、對照探針的點、及錨定探針的點。標靶-探針雜合係在50°C伴隨振盪進行15分鐘。雜合後，將孔洞冷卻並清洗二次。隨後，將含有鏈親和素-鹼性磷酸酶綴合物的緩衝液添加到該孔洞中，使生物素-鏈親和素得以交互作用，然後加入鹼性磷酸酶的受質，以便有色產物在探針-標靶雜合體所在的位置生成。透過使用照相機對孔洞拍照以及識別有色斑點在該孔洞中的位置，可判定指示一種特定EGFRvIII存在的特定雜合。有色斑點位置的分析可以由電腦進行。
本技術領域之熟習技藝者憑藉以下對較佳實施方式的詳細說明並配合所附圖式將清楚理解本發明，在該圖式中：
圖1是依據本發明的一個實施例的EGFRvIII檢測方法的示意圖；該檢測係基於單次擴增標靶-探針-條碼磁珠（BMB）雜合試驗（single-amplified target-probe-barcoded magnetic bead（BMB）hybridization assay）；以及
圖2是依據本發明的一個實施例的檢測EGFRvIII的方法的示意圖；該檢測係基於二次擴增標靶-探針雜合試驗（double-amplified target-probe hybridization assay）。
Claims (19)
- 一種用於檢測上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII）的套組，包含：一EGFRvIII融合專一性正向引子和一EGFRvIII融合專一性反向引子；以及 一種探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列。
- 如請求項1所述之套組，進一步包含一通用引子對，其中該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有該通用引子對中的一通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有該通用引子對中的一通用反向引子的核苷酸序列。
- 如請求項1所述之套組，其中該EGFRvIII融合專一性正向引子或該EGFRvIII融合專一性反向引子係與一可偵測分子相結合。
- 如請求項3所述之套組，其中該可偵測分子係為一螢光分子或用於一呈色反應的一酵素。
- 如請求項2所述之套組，其中該通用正向引子或該通用反向引子係與一可偵測分子相結合。
- 如請求項5所述之套組，其中該可偵測分子係為一螢光分子或用於一呈色反應的一酵素。
- 如請求項1所述之套組，其中該探針係固著於一微陣列板上。
- 如請求項7所述之套組，其中該微陣列板包含一位置指標。
- 如請求項1所述之套組，進一步包含用於檢測一持家基因的一對照探針。
- 如請求項1所述之套組，進一步包含一反轉錄酶及一DNA聚合酶。
- 一種用於檢測上皮細胞生長因子接受器突變III型（EGFRvIII）的方法，包含以下步驟： （a）自一生物樣品中獲得核糖核酸（RNA）； （b）對該RNA進行反轉錄以獲得互補去氧核糖核酸（cDNA）； （c）使用一EGFRvIII融合專一性正向引子和一EGFRvIII融合專一性反向引子擴增該cDNA以獲得一擴增產物； （d）將該擴增產物與一探針混合以獲得一探針結合產物，其中各該探針具有SEQ ID NO：1及其互補序列的核苷酸序列；以及 （e）檢測該探針結合產物以判定EGFRvIII的存在。
- 如請求項11所述之方法，其中在步驟(c)中首先使用該EGFRvIII融合專一性正向引子和該EGFRvIII融合專一性反向引子及其後使用一通用正向引子與一通用反向引子擴增該cDNA，以獲得該擴增產物，其中該EGFRvIII融合專一性正向引子進一步具有該通用引子對中的該通用正向引子的核苷酸序列，並且該EGFRvIII融合專一性反向引子進一步具有該通用引子對中的該通用反向引子的核苷酸序列。
- 如請求項11所述之方法，其中各該EGFRvIII融合專一性正向引子或該EGFRvIII融合專一性反向引子與一可偵測分子相結合。
- 如請求項13所述之方法，其中該可偵測分子係為一螢光分子或用於一呈色反應的一酵素。
- 如請求項12所述之方法，其中該通用正向引子或該通用反向引子係與一可偵測分子相結合。
- 如請求項15所述之方法，其中該可偵測分子係為一螢光分子或用於一呈色反應的一酵素。
- 如請求項11所述之方法，其中在步驟(d)中該種探針與該擴增產物係在介於35-50°C的溫度混合。
- 如請求項11所述之方法，其中在步驟(d)中該探針與該擴增產物係在介於700-1000 rpm的轉速混合。
- 如請求項11所述之方法，其中該探針係固著於一微陣列板上。
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