CN101236193A - 胃癌的淋巴结转移的检测 - Google Patents

胃癌的淋巴结转移的检测 Download PDF

Info

Publication number
CN101236193A
CN101236193A CNA2007101282861A CN200710128286A CN101236193A CN 101236193 A CN101236193 A CN 101236193A CN A2007101282861 A CNA2007101282861 A CN A2007101282861A CN 200710128286 A CN200710128286 A CN 200710128286A CN 101236193 A CN101236193 A CN 101236193A
Authority
CN
China
Prior art keywords
label
gene
lymph node
pcr
level
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007101282861A
Other languages
English (en)
Inventor
S·W·曹
G·格林
J·琼斯
M·徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Diagnostics LLC
Original Assignee
Janssen Diagnostics LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Diagnostics LLC filed Critical Janssen Diagnostics LLC
Publication of CN101236193A publication Critical patent/CN101236193A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法、组分和制品，其对阴性淋巴结和具有胃癌转移的淋巴结进行区分，检测组织样品以确定胃癌阶段性状态。

Description

胃癌的淋巴结转移的检测
背景技术
全球每年约有876,000新发胃癌病例(Shibuya，Mathers等人，2002)。在美国，2005年胃癌的估计新发病例和死亡人数分别为21,860和11,550(Jemal，Murray等人，2005)。胃部恶性肿瘤是胃癌的最常见类型(90％至95％)，按照发病率次序其紧随淋巴瘤、类癌瘤和间质梭形细胞瘤之后(Kumar，Cotran等人2003)。
彻底的局部区域控制是挽救胃癌患者的主要治疗方法，其包括胃全切除术或胃次全切除术、标记淋巴结清除术、扩展淋巴结清除术和受转移影响的邻近组织切除例如脾切除术和胰腺切除术(Hartgrink和van de Velde 2005；Kitagawa，Fujii等人，2005)。在手术治疗后遭受复发的所有患者中，高达87.5％的是由局部复发或剩余局部淋巴结转移引起的(Songun，Bonenkamp等人，1996)。
在一项涵盖148个胃-食管连接部(GEJ)癌患者的调查研究中，人们得出的结论是局部淋巴结内微转移的存在是预后不良的关键指示(Heeren，Kelder等人，2005)。目前胃癌的淋巴结转移的普遍分期/诊断是通过触诊和手术中冰冻切片检查实现的。淋巴结的冰冻切片检查可以显示74％的灵敏度(Kitagawa，Fujii等人，2005)。
利用适当的基因标记物，基因表达分析和检测技术例如逆转录酶PCR(RT-PCR)或定量PCR可以提供一种可选择的用于胃癌的诊断或预后的方法。这些方法有可能提供更好的用于转移检测试验的灵敏度和精确度。先前报道的基因标记物包括CK19(Matsuda，Kitagawa等人，2004)、癌胚抗原(CAE)、细胞角蛋白-20(CK-20)、和MAGE-3(Okada，Fujiwara等人，2001)、CK18、MUC1、hTRT(Ajisaka和Miwa，2003)。不幸的是，如同公布的数据显示的，它们中的大部分在检测的所有肿瘤组织和肿瘤细胞系内不能一致表达。利用逆转录酶PCR不能在组织学检查确认的15％(CEA)到70％以上(MAGE-3)的具有胃癌转移的淋巴结中检测到标记物(Okada，Fujiwara等人，2001)。CK-20被用作标记物用于胰腺、结肠、胃、和肺癌的血液内播散的癌细胞的逆转录酶PCR检测(Chausovsky，Luchansky等人，1999，Chen，Chen等人，2004)。
在这里，鉴定了一种标记物组合其以可轻易检测的水平在具有胃癌转移的淋巴结内一致表达，这种可检测的水平在正常的淋巴结内可与其背景表达区分开来。这种标记物组合可用于检测来自胃癌、或类似细胞来源的癌，例如食道癌、胰腺癌和肠癌的播散性癌细胞。
发明内容
在本发明的一方面中，组合使用一组标记物以检测来自胃癌的淋巴结转移。在具有胃癌转移的淋巴结中，这些标记物的表达水平显著高于正常淋巴结的表达水平。标记物组合为CK19、CEA和MUC-2标记物。
在本发明的另一方面中，诊断胃癌的淋巴结转移包括从患者中获取生物学样品并测定选自标记物组的基因表达水平，其中超过预定临界水平的基因表达水平则表明胃癌转移。优选地，生物学样品为淋巴结样品。
在本发明的另一方面中，标记物被组合用于检测胃癌的淋巴结转移的方法中。
仍然在本发明的另一方面中，在手术中分析标记物。可以通过一种方法进行手术中分析，该方法包括如下步骤：制备从胃引出的淋巴结的RNA；实施针对一个或多个标记物的定量RT-PCR方法并确定出现的标记物是否超出预定截断值。
本发明包括用于实施这里提供的方法的微阵列或基因芯片，还有进行该分析的试剂盒和制品。
该说明书中所描述和要求保护的发明方法、组分、制品、和试剂盒包括标记物的组合。整个说明书中所使用的“标记物”是指：
a)基因和基因表达产物，例如mRNA和相应cDNA、肽、蛋白质，上述每种物质的片段和补体，和
b)组分例如探针、抗体、配体、半抗原、和标记物，其通过与a)的物理或化学相互作用表明基因的表达或基因表达产物的存在，并且其中该基因、基因表达产物或组分对应于SEQ ID NO NM_002276、SEQ ID NO NM_002457、和SEQ ID NO M17303。
如果基因包含那段序列则其对应于SEQ ID NO所指示的序列。如果基因表达产品的区段(segment)或片断(fragment)包含足以区分其为该基因或基因表达产品的序列的一部分参考基因表达产品或其补体，则该区段或片段相应于该基因或基因表达产品的序列。另外如果基因表达产物的RNA、mRNA、或cDNA与具有这种序列的组分(例如探针)杂交，则该基因表达产物也如前述那样对应于这种序列，或者在所述产物是肽或蛋白质的情况下，其由这种mRNA编码。当基因表达产物区段(segment)或片段(fragment)包含足以区分其为该基因序列或基因表达产物的部分参考基因表达产物或其互补物时，则该基因表达产物区段(segment)或片段(fragment)也对应于这种基因序列或基因表达产物。
本发明的标记物对应于编码三个已知蛋白的基因：癌胚抗原(SEQ ID NOM1 7303)、粘蛋白2(SEQ ID NO NM_002457)、和细胞角蛋白19(SEQ ID NONM_002276)。当它们各自用作癌标记物时这些基因不能使分析具有可接受的功效，尤其是对于在手术中使用。但是，以组合方式，如同实施例中显示的，这些标记物提供了灵敏和特异性的检测以确定胃癌转移。通常还会分析对照品以确保阴性结果并非产生自分析中所产生的错误。组成性表达的基因例如PBGD(SEQ ID NO NM_000190)在这方面是有用的并且用于分析它们的试剂优选包括在试剂盒组分内。优选PBGD是因为，其中，在人体中它不包含已知的假基因、它组成性表达于人体组织并且它以相对低的水平表达而且因此很少会引起感兴趣的目标序列扩增的抑制。
样品制备一般包括操作切除的组织，优选淋巴结组织。组织中转移和微转移的分布在淋巴结或其它组织中并不一致。因此，应当获取足够大的样品使得不会漏掉转移。在目前的方法中一种样品采集方法是匀质化大组织样品，随后采用适当部分的组织匀浆以制备用于分子检测的RNA。
本发明方法中采用的样品优选为来自从胃引出的淋巴结的淋巴结样品。接着是制备这种用于RT-PCR分析的样品的有用步骤；使用Omni匀浆器和一次性探针用于匀浆后再用Rneasy(Qiagen)试剂盒试剂纯化RNA：
a)如果之前没有记录，以毫克确定样品重量。将一张新的蜡纸放置在天平上、校准并秤量样品。优选淋巴结样品超过30mg。
b)利用新的手术刀，将同一淋巴结的所有组织切碎成直径约4mm的块。注意在处理过程中避免污染组织。
c)将匀化(RLT)缓冲液加到聚丙烯匀化管中。每100mg组织优选使用2ml匀化缓冲液。
d)利用干净的镊子，将组织转移到匀化缓冲液内。
e)将新的匀化探针放置在人工匀浆器上。
f)完全匀化每个淋巴结。
g)按标准Qiagen规程中的每个RNA纯化步骤处理组织匀浆，在使用前将RNA存储在-65℃或更低温度。
h)去掉匀化探针。
i)将任何剩余的组织匀浆存储在-65℃或更低温度用于以后可能的利用。
然后可以进行诊断分析。本发明的标记物用于提供重要的临床信息例如胃癌是否已经转移到了淋巴结、哪个标记物表示胃癌的临床阶段和患者的预后。
总的来说，在本说明书中该信息被称为“诊断信息”。另外，这种诊断信息包括其在所提供的治疗中作为组分的用途。例如，拥有这种诊断信息的医生可以使他的治疗(例如，辅助疗法)以胃癌已经转移到了淋巴结的指征为依据。
分析本发明标记物的优选方法包括确定可以编码蛋白或肽的基因产生的mRNA量。这可以通过竞争性逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR、北方吸印技术(Northem Blot)分析或其它具有相似功能的试验来实现。也可以从mRNA(RNA)制备扩增的互补RNA(cRNA)，然后应用到DNA微阵列和其它正在开展的用于测试和分析的检测方式。用于生产所述阵列的许多阵列构型和方法为本领域技术人员所熟知并且在如下列美国专利中得到了描述，例如：5,445,934、5,532,128、5,556,752、5,242,974、5,384,261、5,405,783、5,412,087、5,424,186、5,429,807、5,436,327、5,472,672、5,527,681、5,529,756、5,545,531、5,554,501、5,561,071、5,571,639、5,593,839、5,599,695、5,624,711、5,658,734和5,700,637。最受欢迎的用于对PCR结果进行定量的的检测方法是Ct(循环阈值)测定，其中Ct被定义为荧光发射超过固定临界值的循环数。根据用于确定Ct的算法的公知程序这很容易确定，该程序被装入大多数PCR分析仪的软件内。一个这样的实例体现为Cepheid公司的SmartCycler PCR仪，其为优选的分析平台。
微阵列技术允许测定基因的稳态mRNA水平。这些分析的结果通常是对接收自用于检测从样品制备的目标序列的探针组信号强度所进行的测定，该探针组在微阵列的已知位置与核酸序列杂交。通常，该信号强度与制备的目标物的量成比例，并且因此其也与样品细胞内表达的mRNA量成比例。许多这样的技术是可获得的并且是有用的。在美国专利6,271,002、6,218,122、6,218,114、和6,004,755中可以找到确定基因表达的优选方法。
可以通过比较微阵列的信号强度来进行基因表达水平的分析。通过生成测试样品内基因表达强度对对照样品内的那些基因表达强度的比值矩阵来完成这种分析。例如，病变组织的基因表达强度可以与产生自相同类型的良性或正常组织的基因表达强度相比。这些表达强度的比例表示测试样品和对照样品之间基因表达的倍数变化。本发明还包括上述方法，在上述方法中利用模式识别方法进行表达模式的比较。
可以根据杂交的微阵列探针的测定强度的倍数变化区分上调和下调水平。优选1.5倍的差异用于作出这种区分(或者p值小于0.05)。也就是，在说某个基因在病变与正常细胞内表达不同之前，应发现病变细胞比正常细胞产生至少多于约1.5倍或少于1.5倍的强度。倍数差异越大，越优选使用该基因作为一种诊断或预后工具。选择用于本发明组合的基因具有能引起信号产生的表达水平，利用临床实验室仪器该信号以超过背景的量可区分于正常或未调节基因的那些信号。本发明包括用于实施这里提供的方法的微阵列或基因芯片。微阵列可以包含分离的核酸序列、它们的补体、或其对应于标记物的部分，在该部分的结合足以表征生物样品内胃癌或复发风险。微阵列优选测定或定性至少约1.5倍的过度或不足表达，提供统计上有显著意义p值的过度或不足表达，或p值小于0.05。优选地，微阵列包含cDNA阵列或寡核苷酸阵列并且可以包含一个或多个内对照试剂。
相对于那些没有转移情况的淋巴结，具有胃癌转移的淋巴结中基因标记物有差别地上调表达。上调为一个相对性术语，意味着相对于一些基线在基因的表达量中发现可检测的差异(超过用于测定其的系统内的噪音贡献)。在这种情况下，基线是没有胃癌转移的淋巴结内标记物的测定的基因表达。然后利用相同的测定方法测试淋巴结样品内感兴趣的基因相对于基线水平或上调或不变。诊断或预后包括疾病/状态问题的确定，例如确定复发的可能性以及治疗类型。确定复发的可能性包括该模式与已知复发和/或已知未复发情况相关的模式比较，或与超过用于这种区分而设定的截断值(在PCR的情况下通常为Ct)比较。
在本发明的一些实施方案中，本发明的标记物组合可以与其它基于基因的标记物以及在癌症诊断、预后、或治疗监测中有用的非基因性诊断方法结合使用。例如，在一些情况下，将基于上述基因表达的方法的诊断能力与来自传统标记物例如血清蛋白标记物(例如，癌抗原27.29(“27.29”))的数据相结合是有益的。当其它方法产生模糊结果时该方法尤其有用。
本发明包括通过获取患者的生物样品产生胃癌诊断患者报告的方法以及由此获取的报告；检测样品的基因表达；并且利用由此获得的结果产生报告。该报告还可以包含患者的结果评估和/或相对于患者群体的危险概率。
本发明包括包含对应于标记物的微阵列探针组或PCR引物/探针组的组合物。依据本发明的制品还包括用于揭示基因表达信息的介质或格式化分析法。这些可包括，例如，微阵列，其中互补序列或探针被固定到基质上，感兴趣基因的指示序列结合到所述基质上产生确定它们存在的可读确定物。或者依据本发明的制品可以制成试剂诊断盒用于进行杂交、扩增、以及用于检测癌症的兴趣基因表达水平的信号生成指示。
依据本发明的试剂盒包括格式化的分析。这些可包括进行该分析需要的所有或部分材料，例如试剂和说明以及通过其分析核酸序列、它们的互补序列、或其部分的介质。当要以另一种形式进行该分析时，试剂盒将具有那个形式特有的组分。例如，如果该形式为扩增形式例如PCR、滚环扩增方法(RCA)、连接酶链式反应方法(LCR)、链置换扩增方法(SDA)、基于核酸序列的扩增方法(NASBA)，然后试剂盒将包含适于这种技术的试剂和材料。任选地，试剂盒包括样品制备试剂和/或用于从组织例如淋巴结组织提取核酸的制品(例如，管)。试剂盒还可以包括最小化样品污染风险的制品(例如，一次性手术刀和用于淋巴结切割和制备的表面)。
在优选试剂盒中，单管QRT-PCR过程必需的试剂包括例如逆转录酶、逆转录酶引物、相应的PCR引物对(用于标记物和，优选地，对照物)、热稳定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶，以及合适的检测试剂，例如，没有限制地，scorpion探针、用于荧光5`核酸酶分析的探针、分子标志探针、单染料引物或针对双链DNA的荧光染料，例如溴化乙锭。引物优选为产生高浓度的量。热稳定DNA聚合酶很普通并且可从各制造商那里商购到。试剂盒内的其它材料可以包括：合适的反应管或瓶、隔离组分例如石蜡小球，任选包括镁；用于逆转录酶的反应混合物(通常为10×的)和PCR阶段，包括必需的缓冲液和试剂例如dNTP；不含核酸酶或RNA酶的水；RNA酶抑制剂；对照核酸和/或任何附加缓冲液、化合物、辅助因子、离子组分、蛋白和酶、聚合物等，其可以用于逆转录中和/或QRT-PCR反应的PCR阶段。任选地，该试剂盒包括核酸提取试剂和材料。
提供下列实施例以说明但不限制要求保护的发明。本文所引用的全部参考文献在此引入作为参考。
实施例1
该实施例基于采用实时PCR。在实时PCR中，在PCR的指数期过程中实时监测聚合酶链式反应的产物而不是终点检测。因此，DNA和RNA的量化更加精确并且是可重现的。在每个循环过程中记录荧光值并表示在扩增反应中的那个点的扩增产物量。在反应开始出现的模板越多，到达其中首次记录的荧光信号在统计学上显著高于背景的点花费的循环数越少，这是(Ct)值的定义。循环临界值(Ct)的观点允许利用基于RT-PCR的荧光的精确性和可重现性定量。PCR产物的匀浆化检测优选基于：(a)双链DNA结合染料(例如，SYBRGreen)，(b)荧光探针(例如，Taq Man probes，Molecular Beacons)，和(c)直接标记引物(例如，Amplifluor引物)进行。
从诊断为胃癌的患者得到总共24个淋巴结转移阳性的H&E和18个淋巴结转移阴性的H&E。淋巴结被选为那些从胃部引出的。从每个淋巴结切取30mg的组织块。
按照以下处理每个淋巴结组织的30mg块：
1.将组织块加到2ml缓冲液RLT中并利用一次性组织研磨器手工匀浆20-40秒。
2.通过涡旋在4.5ml的管中将400μl组织匀浆与400μl70％的乙醇混合10秒。
3.对于每份样品，在多头抽真空装置上附加一个真空阀，并且在每个阀上附加一个一次性真空接头。
4.将小柱子附加到真空接头上，盖子打开。
5.把700μl由步骤2所得的组织匀浆/乙醇混合物等分量加入到RNA Spin柱上。
6.将真空阀转到打开位置并施加真空(800-1200毫巴)直到样品被过滤(大约30秒)。
7.停止真空；加700μl洗脱缓冲液1到柱子。开始真空并允许溶液通过柱子过滤。停止真空。
8.加700μl洗脱缓冲液2到柱子。开始真空并允许溶液通过柱子过滤。停止真空。
9.从多头抽真空装置移去每个柱子并放置在2ml收集管(与柱子一起提供)内。
10.在微型离心机中以＞10,000RPM离心30秒。
11.丢弃收集管。将柱子放入一个新的干净收集管内(1.5ml聚丙烯微离心管)。
12.直接将50μl不含RNA酶的水加到柱子的过滤膜上。
13.在微型离心机中以＞10,000RPM离心包含RNA Spin柱的管30秒。
14.在继续到步骤14之前，确保收集管已经以这样的方式被标记过：即可以识别来源标本(例如：患者ID&淋巴结ID)。
15.丢弃柱子。离心管内会容纳大约50μl洗脱的RNA溶液。
提取的RNA在Cepheid Smart Cycler II内进行一步RT-PCR扩增。反应包含下列组分：50mM N-二甘氨酸/KOH，pH8.2，115mM醋酸钾，8％体积/体积甘油，0.2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，150mM海藻糖，0.2％体积/体积吐温20，0.2mM Tris-Cl pH 8，3.5mM硫酸锰或锰(乙酸)，0.3mM dATP，0.3mMdCTP，0，3mM dGTP，0.3mM TTP，100U/ml Tth，20ug/m抗体TP6-25.3，每个探针和引物0.4-0.8μM。设计探针和引物序列使得最小化非特异性引物事件并且使得它们适合利用下列快速RT-PCR模式的多重扩增/检测：95℃3秒，60℃3分钟，然后32个循环：95℃3秒、65℃6秒*和72℃3秒-总扩增时间等于16分钟。
该例中使用的引物和探针如下：
MUC2：
上游引物：ATGAACTACGCTCCTGGCTT(SEQ ID NO：5：NM_002457)
下游引物：AAACTCTCTGGGCACATTGTC(SEQ ID NO：6：NM_002457)
探针：FAM-CGTGAAGACCTGCGGCTGTGT-BHQ1-TT(SEQ ID NO：7：NM_002457)
CEA：
上游引物：ACCACAGTCACGACGATCACA(SEQ ID NO：8：M17303)
下游引物：CGGGGTTGGAGTTGTTGCT(SEQ ID NO：9：M17303)
探针：TexasRed-CTATGCAGAGCCACCCAAACCCTT-BHQ2-TT(SEQ ID NO：10：M17303)
CK19：
上游引物：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT(SEQ ID NO：11)
下游引物：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC(SEQ ID NO：12)
探针：5’Quasar 570d(ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT)-BHQ-2-TT)3′(SEQ IDNO：13)
PBGD：
引物1CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA(SEQ ID NO：14)
引物2CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA(SEQ ID NO：15)
探针-FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA(SEQ ID NO：16)
样品和试验结果总结在表1中。所得Ct值用于确定覆盖所有测试样品基因的相对表达。用于标记物建立的Ct值是27并且内对照(PBGD)建立的Ct值是35。具有3个标记物中的任何一个Ct为27或更低的样品将被认为是转移阳性，但是具有3个标记物中的任何一个为27以上Ct值的样品将被视为是转移阴性。由于为了使阴性诊断结果有效内对照的Ct值需低于35。基于这些截断值，试验用于正确评估了18个阴性淋巴结中的17个(特异性94.4％)以及所有24个阳性淋巴结(灵敏度100％)。
表1.具有胃腺癌的患者的淋巴结转移检测
  样品   淋巴结诊断   IC Ct   MUC Ct   CK19 Ct   CEA Ct
  1   正常   25.65   36.6   27.25   27.9
  2   正常   25.45   30.6   18.8   23.15
  3   正常   23.7   32.8   31.2   33.5
  4   正常   24.8   40   40   40
  5   正常   25.2   40   33.3   40
  6   正常   24.4   40   31.7   40
  7   正常   24.8   31.8   30.5   33.9
  8   正常   25.2   40   31.2   40
  9   正常   26.1   35.4   40   40
  10   正常   27.4   34.5   34.6   40
  11   正常   24.7   28.2   28   28.9
  12   正常   25.7   27.3   28.5   29.1
  13   正常   25.8   40   32.8   32.7
  14   正常   26.2   40   31   40
  15   正常   19.2   40   37.4   40
  16   正常   26.4   40   35.7   40
  17   正常   27.2   40   32.9   40
  18   正常   26.3   40   32.7   40
  19   转移的   23.6   23.9   21.05   21.35
  20   转移的   23.85   19.05   19.65   19.5
  21   转移的   21.15   21   19.3   19.2
  22   转移的   26.1   22.45   20.1   20.7
  23   转移的   25.25   24.8   18.65   20.35
  24   转移的   31.85   26.7   24.75   24.4
  25   转移的   30.3   26.25   23.45   25.65
  26   转移的   26.7   22.1   20.95   23.9
  27   转移的   27.7   24.55   23.5   28.3
  28   转移的   26.15   32.6   25.55   30.3
  29   转移的   25.85   24.95   19.55   24.45
  30   转移的   25.75   24.65   19.45   23.8
  31   转移的   29.05   22.85   18.5   21.5
  32   转移的   27.7   24.95   20.2   24.25
  33   转移的   27.8   27   21.5   21.05
  34   转移的   25.15   25.25   25.8   19.95
  35   转移的   26.6   23.05   23.5   22.1
  36   转移的   27.65   32.55   17.05   16.05
  37   转移的   24.95   26.35   19.25   17.35
  38   转移的   24.75   25.4   18.2   15.2
  39   转移的   25.8   28   21.85   19.3
  40   转移的   28.1   31.95   20.35   18.15
  41   转移的   25.25   18.8   19.45   18.05
  42   转移的   25   32.9   19.2   19.5

Claims (32)

1. 一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法，包括以下步骤：
a)从患者获得生物学样品，和
b)检测样品中的标记物水平；
其中高于预定截断水平的水平表明胃癌的淋巴结转移。
2. 根据权利要求1的方法，其中标记物是基因、基因片段、或其补体。
3. 根据权利要求1的方法，其中标记物是蛋白质、蛋白质片段、或多肽。
4. 权利要求1的方法，进一步包括使用另一种诊断方法。
5. 权利要求4的方法，其中另一诊断方法包括进行血清分析。
6. 权利要求1的方法，进一步包括组成性表达基因的测定。
7. 权利要求1的方法，具有至少80％的敏感性。
8. 权利要求1的方法，具有至少70％的特异性。
9. 权利要求1的方法，其中样品包括淋巴结组织。
10. 一种确定或调整用于胃癌患者的治疗方法的方法，包括以下步骤：
a、从胃癌患者获得生物学样品，和
b、测定样品中的标记物水平；
其中高于或低于截断水平的水平与疾病过程或身体状况相一致，据此确定或调整治疗方法。
11. 根据权利要求10的方法，其中标记物是基因、基因片段、或其补体。
12. 根据权利要求10的方法，其中标记物是蛋白质、蛋白质片段、或多肽。
13. 权利要求10的方法，进一步包括组成性表达基因的测定。
14. 权利要求10的方法，其中特异性至少是70％。
15. 权利要求10的方法，其中敏感性至少约为80％。
16. 采用微阵列实施的权利要求1的方法。
17. 采用微阵列实施的权利要求10的方法。
18. 使用扩增方法实施的权利要求1的方法。
19. 根据权利要求18的方法，其中扩增方法是PCR。
20. 根据权利要求19的方法，其中PCR是RT-PCR。
21. 使用扩增方法实施的权利要求10的方法。
22. 一种用以实施化验以确定生物学样品中的胃癌诊断的试剂盒，包括用来检测标记物的材料。
23. 权利要求22的试剂盒，包括微阵列和试剂。
24. 权利要求22的试剂盒，包括PCR试剂。
25. 权利要求22的试剂盒，包括说明书。
26. 权利要求22的试剂盒，其中标记物由CEA、MUC2和CK-19组成。
27. 一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法，包括以下步骤：
a)从患者获得生物学样品，和
b)测定样品中的标记物水平；
其中高于预定截断水平的水平表明胃癌的淋巴结转移，并且其中标记物由CEA、MUC2、和CK-19组成。
28. 权利要求27的方法，进一步包括使用另一种诊断方法。
29. 权利要求27的方法，其中另一诊断方法包括进行血清分析。
30. 权利要求27的方法，进一步包括组成性表达基因的测定。
31. 权利要求27的方法，具有至少80％的敏感性。
32. 权利要求27的方法，具有至少70％的特异性。
CNA2007101282861A 2006-06-05 2007-06-05 胃癌的淋巴结转移的检测 Pending CN101236193A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/447255 2006-06-05
US11/447,255 US20070281305A1 (en) 2006-06-05 2006-06-05 Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101236193A true CN101236193A (zh) 2008-08-06

Family

ID=38535587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101282861A Pending CN101236193A (zh) 2006-06-05 2007-06-05 胃癌的淋巴结转移的检测

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20070281305A1 (zh)
EP (1) EP1865076A1 (zh)
JP (1) JP2008099664A (zh)
KR (1) KR20070116567A (zh)
CN (1) CN101236193A (zh)
CA (1) CA2590445A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102687011A (zh) * 2009-07-23 2012-09-19 新加坡国立大学 癌症生物标志物及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101399409B1 (ko) * 2012-04-03 2014-05-30 부산대학교 산학협력단 위암의 림프절 전이 진단 마커로서의 유전자의 용도
CN110295230A (zh) * 2018-03-23 2019-10-01 中山大学 分子标志物inhba和spp1及其应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI97304C (fi) * 1994-11-16 1996-11-25 Locus Genex Oy Menetelmä mahasyövän riskin seulonnaksi
JP3681405B2 (ja) * 1997-02-21 2005-08-10 タカラバイオ株式会社 癌関連遺伝子
US6218521B1 (en) * 1997-07-17 2001-04-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules associated with gastric cancer and methods for diagnosing and treating gastric cancer
US6783933B1 (en) * 1999-09-15 2004-08-31 The Johns Hopkins University School Of Medicine CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor
US20040170977A1 (en) * 2000-03-31 2004-09-02 Peter Laird Epigenetic sequences for esophageal adenocarcinoma
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
WO2002006484A1 (fr) * 2000-07-19 2002-01-24 Takara Bio Inc. Procede de detection de cancer
US7153653B2 (en) * 2001-02-23 2006-12-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Differentially methylated sequences in pancreatic cancer
CA2439854A1 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Epigenomics Ag Method for the development of gene panels for diagnostic and therapeutic purposes based on the expression and methylatoin status of the genes
US7101663B2 (en) * 2001-03-02 2006-09-05 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education PCR method
US20030190602A1 (en) * 2001-03-12 2003-10-09 Monogen, Inc. Cell-based detection and differentiation of disease states
US8025684B2 (en) * 2001-11-09 2011-09-27 Zimmer Spine, Inc. Instruments and methods for inserting a spinal implant
EP1454982A4 (en) * 2001-12-14 2005-12-28 Takeda Pharmaceutical PROCESS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION
US20040019353A1 (en) * 2002-02-01 2004-01-29 Freid James M. Spinal plate system for stabilizing a portion of a spine
US7303564B2 (en) * 2002-02-01 2007-12-04 Spinal Concepts, Inc. Spinal plate extender system and method
WO2003069307A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 The Johns Hopkins University School Of Medicine Claudins, markers for diagnosis, prognosis and therapy of breast, bone, brain cancer
WO2003076593A2 (en) * 2002-03-07 2003-09-18 The Johns Hopkins University School Of Medicine Genomic screen for epigenetically silenced genes associated with cancer
ATE363251T1 (de) * 2002-03-11 2007-06-15 Spinal Concepts Inc Einrichtung zum einsetzen von wirbelsäulenimplantaten
US20040018525A1 (en) * 2002-05-21 2004-01-29 Bayer Aktiengesellschaft Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasma
EP2366349B1 (en) * 2002-10-30 2017-04-05 Zimmer Spine, Inc. Spinal stabilization system insertion
US20040147928A1 (en) * 2002-10-30 2004-07-29 Landry Michael E. Spinal stabilization system using flexible members
WO2004041131A2 (en) * 2002-10-31 2004-05-21 Spinal Concepts, Inc. Movable disc implant
US20040133278A1 (en) * 2002-10-31 2004-07-08 Marino James F. Spinal disc implant
AU2003290925A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 John Wayne Cancer Institute Detection of micro metastasis of melanoma and breast cancer in paraffin-embedded tumor draining lymph nodes by multimaker quantitative rt-pcr
US7267950B2 (en) * 2003-05-01 2007-09-11 Veridex, Lcc Rapid extraction of RNA from cells and tissues
EP2199406A1 (en) * 2003-05-01 2010-06-23 Veridex, LLC Intraoperative lymph node assay
US7713287B2 (en) * 2003-05-02 2010-05-11 Applied Spine Technologies, Inc. Dynamic spine stabilizer
CA2527285A1 (en) * 2003-05-28 2004-12-23 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for predicting response to chemotherapy
WO2004111273A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-23 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for response to egfr inhibitor drugs
WO2005008213A2 (en) * 2003-07-10 2005-01-27 Genomic Health, Inc. Expression profile algorithm and test for cancer prognosis
JP2007501002A (ja) * 2003-08-01 2007-01-25 ザ ユニバーシティ オブ ウェスタン オーストラリア 癌治療の成功の可能性を予測するための方法及びキット
US7794480B2 (en) * 2003-08-05 2010-09-14 Flexuspine, Inc. Artificial functional spinal unit system and method for use
US20050171610A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Sdgi Holdings, Inc. Mobile bearing spinal device and method
US20050178726A1 (en) * 2004-02-18 2005-08-18 Robert Belly Disruption of cells and tissues
CN101090675A (zh) * 2004-06-23 2007-12-19 应用脊柱外科技术公司 用于脊柱稳定的系统和方法
US20070207467A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Ming Xu Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102687011A (zh) * 2009-07-23 2012-09-19 新加坡国立大学 癌症生物标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1865076A1 (en) 2007-12-12
US20070281305A1 (en) 2007-12-06
KR20070116567A (ko) 2007-12-10
JP2008099664A (ja) 2008-05-01
CA2590445A1 (en) 2007-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laurell et al. Identification of biomarkers of human pancreatic adenocarcinomas by expression profiling and validation with gene expression analysis in endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration samples
JP2012005500A (ja) 食道癌、結腸癌、頭頸部癌、およびメラノーマにおけるマーカーの同定
US11667909B2 (en) Diagnosis of prostate cancer
CN101611154A (zh) 用于癌症治疗的成对诊断测定
KR20170136525A (ko) 전립선암을 예측하기 위한 전혈 기반 mRNA 마커 및 그의 검출 방법
CN101236193A (zh) 胃癌的淋巴结转移的检测
US20040241707A1 (en) Enhanced diagnostic potential of prostate-specific antigen expressing cells
JP2007275054A (ja) 胃癌腫のリンパ節転移の検出
AU630001B2 (en) A sensitive method for measurement of chimeric transcripts of dna containing translocations
EP1082460A1 (en) A novel method of diagnosing, monitoring, and staging prostate cancer
CN110295232A (zh) 用于结直肠癌的microRNA生物标记物
KR102256747B1 (ko) 엑소좀 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도
KR102131519B1 (ko) 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도
WO2002081656A2 (en) Enhanced diagnostic potential of prostate-specific antigen expressing cells
CN108220421A (zh) 自身免疫性肝炎的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用
CN106755426A (zh) Ifi27在制备诊断布加综合征产品中的用途
KR102545543B1 (ko) BK 바이러스 신병증의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
US20230274836A1 (en) Method of calculating diagnostic score for prostate cancer and use thereof
US6861215B1 (en) Method of diagnosing, monitoring, and staging prostate cancer
KR20230156518A (ko) 엑소좀 내의 인터페론 감마 유전자 측정을 이용한 암 조기 진단 방법 및 진단 키트
WO2023023064A1 (en) Methods and materials for predicting the progression of prostate cancer and treating same
KR20210120737A (ko) Pik3ca 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
CN106636408A (zh) 一种布加综合征诊断工具
CN116121369A (zh) 肾癌相关生物标志物及其应用和检测方法
CN106435011A (zh) Myom2的诊断用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication