KR102256747B1 - 엑소좀 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엑소좀 내의 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 miRNA는 간암 전이 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 바, 간암 전이 진단용 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 간암 전이 예후 예측 인자로 사용이 가능하므로 환자의 치료방법의 결정과 예후 예측에 따른 간암의 개인별 맞춤형 치료법(Personalized medicine)에 사용될 수 있다.

Description

엑소좀 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도{BIOMARKER FOR DIAGNOSING OR PREDICTING LIVER CANCER METASTASIS COMPRISING EXOSOMAL miR-125b AND USE THEREOF}

본 발명은 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엑소좀 내 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 해마다 50만명이 사망하는, 세계에서 5번째로 흔한 종양이다. 그 동안 다양한 기법의 치료기술이 임상에 도입되었으나 HCC 환자의 생존률은 여전히 불량하며, 우리나라에서 HCC 발생률은 20년에 걸쳐 개선되지 않았고, 사망율과 거의 동일한 발병률을 지니고 있다. B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성 간염, 알코올 및 아플라톡신 B1 (aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 HCC에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다.

한편, 간세포암의 진단을 위해 초음파 검사, CT검사, MRI 검사 등의 영상 진단 검사, 혈청 검사(AFP, PIVKA－II), 및 생검 재료의 병리 조직 검사가 이용되고 있다. 혈청 AFP 검사는 환자의 대략 7할 미만에서 높은 값을 나타내지만, 만성간질환 환자에 있어도 경도의 높은 값을 나타내는 것이 자주 인정되어 그 감별이 중요하다. 한편, 조기 간세포암에서는 낮은 값을 나타내는 일도 많다. 또, PIVKA－II(protein induced by ｖitamin K antagonist－II)의 양성율은 5할 미만으로 낮지만, 간세포암에의 특이성은 높고, 양자의 병용에 의해 진단 정밀도가 상승하는 것이 알려져 있다. 생검 재료의 병리 조직 검사는 간질환의 확정 진단에 있어 중요한 검사이다. 그러나, 병리학적 특징만으로 암 특히 초기의 간세포암과 비암부 조직을 식별하는 일도 때때로 곤란하다. 즉, 미소병변은 재생 결절, 혹은 초기의 고분화형의 간세포암인 경우를 볼 수 있다. 특히 경피적 침생검에 의해 종양성 조직을 채취했을 경우에는, 채취량이 한정되는 일도 있어 보다 확실한 진단 기술이 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0029936호

본 발명은, 엑소좀 내의 miR-125b를 포함하는, 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.

또한 본 발명은, 엑소좀 내 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은, 간암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 엑소좀 내 miR-125b를 포함하는, 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커(또는 바이오마커 조성물)를 제공한다.

상기 바이오마커는 간암의 간외 전이를 진단하거나 예후를 예측하는 것일 수 있다.

본 발명의 바이오 마커는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 간암의 전이를 진단하거나 예후를 예측하는 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은, 엑소좀 내 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 "엑소좀 miRNA의 발현 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 대상을 검출하는 것을 의미한다.

본 발명에서는, 그 검출하고자 하는 대상은 시료 내에 존재하는 엑소좀 내 miR-125b이다. 즉, 엑소좀 내 miR-125b를 검출함으로써 상기 간암 전이 여부를 확인 할 수 있다.

엑소좀 miRNAs의 검출은 통상적으로는 시료로부터 엑소좀을 추출하여, 추출된 엑소좀내의 miRNAs을 검출하는 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 엑소좀 miRNAs의 검출은 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준은 간암 전이가 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 측정할 수 있다.

상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

프라이머를 이용한 엑소좀 miRNAs의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 간암 발병 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

프로브는 짧게는 수개의 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 간암 전이 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.

예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트등)로의 변형이 있다.

상기 miRNA의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등이 포함되며 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트에는 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 간암의 전이 진단 또는 예후 예측용 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

예컨대 본 발명의 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 miRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 다음 단계를 포함하는, 간암 전이 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다: 대상의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계(단계 a); 및 상기 엑소좀 내의 miR-125b의 발현 수준을 비교대조군 시료의 해당 엑소좀 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계(단계 b).

상기 단계 b에서 엑소좀 내 miR-125b의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 저발현인 경우, 상기 대상은 간암 전이인 것으로 판정할 수 있다.

본 명세서에서 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 혈청일 수 있고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.

본 발명에 따른 miRNA는 간암 전이 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 바, 간암 전이 진단용 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 간암 전이 예후 예측 인자로 사용이 가능하므로 환자의 치료방법의 결정과 예후 예측에 따른 간암의 개인별 맞춤형 치료법 (Personalized medicine)에 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명은, 엑소좀 내의 miR-125b의 발현량을 이용하여 간암의 전이를 진단하거나 예후를 사전에 예측함으로써, 동일병기의 간암 환자에서도 개개인에 개별화된 치료법 선택을 가능하게 하여 환자들의 삶의 질 향상과 전체 생존률의 증가를 통한 국민 건강보건 향상에 이바지하고, 나아가 바이오마커-기반의 간암 표준 치료 지침 개발에 기여할 수 있다.

도 1은 혈청에서 엑소좀을 분리하는 과정을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 2는 엑소좀 내의 RNA (exosomal RNA)를 분리하는 과정을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 3은 혈청(serum) 내에서 분리한 엑소좀(exosome)을 TEM으로 확인한 이미지를 나타내는 것이다.
도 4는 엑소좀 내의 (exosomal) 특이적(specific) 마커들을 웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 확인한 것이다.
도 5는 혈청 내에 존재하는 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b) 발현량을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 같은 환자 내에서, 전이(meta) 유무에 따른 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b) 발현량을 분석한 결과를 나타내는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.

<실시예>

실험내용 및 방법

I. 엑소좀(exosome) 확인

1. 혈액 분리

환자의 혈액을 2000RPM, 25℃, 20min 동안 원심분리하여 혈청(serum)을 분리하였다. 분리한 혈청(serum)을 440ul씩 전용 튜브에 포장하여 -80℃에서 보관하였다.

2. 엑소좀(exosome) 분리

분리한 혈청(serum)에서 exoquick을 이용하여 엑소좀 펠릿(exosome pellet)을 분리한 뒤(도1), 1 X PBS(phosphate buffered saline)에 재현탁(resuspension)하였다.

3. 1) TEM(Transmission electron microscope) 분석

1X PBS에 재현탁(resuspension)한 엑소좀(exosome)을 필터링(filtering) 한 후 TEM을 측정하였다.

3. 2) 웨스턴 블랏(Western blot)

RIPA 버퍼로 세포를 용해시킨 후, 10000RPM, 4℃, 10 분 동안 원심분리을 하여 debris를 제거한 다음, 단백질을 정량하였다. SDS-PAGE 겔(gel)에 샘플을 로딩(loading) 한 후 90V 1시간 30 분 동안 전기영동시킨 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Polyvinylidene difluoride membrane, Amersham, Buckinghamshire, UK) 으로 이동시켰다(110V 2h). 멤브레인을 트리스-완충의 생리식염수(tris-buffered saline)와 트윈(tween) 20 용액(TBS-T)을 이용하여 10분 동안 3회 반복하여 세척한 후 10% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 차단(blocking)하였다. 이후 1차 항체(1st Antibody)를 붙인 뒤, 4℃에서 오버나이트 인큐베이션(overnight incubation)하고 24시간 뒤, 세척하였다. 이후 2 시간 동안 2차 항체(2^nd antibody)를 붙인 다음, 세척하고 ECL 용액(solution)으로 검출(detection)하였다.

Ⅱ. 엑소좀 내의 miRNA (exosomal miRNA) 발현량 확인

1. 혈액 분리 및 엑소좀 내의 RNA (exosomal RNA) 분리

환자의 혈액을 2000RPM, 25℃, 20분 동안 원심분리 혈청(serum)을 분리한 후 440ul씩 전용 튜브에 포장하여 -80℃에서 보관하였다. 이후 엑소좀 내의 RNA (exosomal RNA)를 분리하였다. 분리 과정은 도 2에 나타내었다.

2. cDNA 합성

Exoquick을 이용하여 엑소좀(exosome) RNA를 추출하고 Taqman 역전사 키트(reverse transcription kit)를 사용하여, cDNA를 얻는다. 증폭하고자 하는 서열 (hsa-miR-125b; 5'-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3')에 상보적인 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 필요한 프라이머(primer)는 Applied Biosystems에서 구입하여 사용하였다. master mix(100mM dNTP, Multiscribe Reverse Transcriptase(50U/ul), 10X Reverse transcription buffer, RNase inhibitor(20U/ul))를 7ul을 넣고, 혼합물에 5X RT 프라이머(primer) 3ul와 RNA 샘플 5ul을 넣고, PCR을 진행하였다(표 1). PCR의 조건은 16℃ 30분, 42℃ 30분, 85℃5분으로 설정하였다(표 2).

[표 1]

[표 2]

3. 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(Quantitative Reverse-Transcription polymerase chain reaction)

역전사를 통해 얻은 cDNA를 주형으로 Taqman universal PCR Master mix(2X) 5ul에 Taqman gene expression assay(20X)인 hsa-miR-125b 프로브(probe) 0.5ul, 반응시킨 cDNA 반응물, 뉴클레아제 프리 워터(Nuclease free water)로 총 10ul 용량을 맞춘 뒤, 384 well에 분주하여 qRT-PCR을 시행하였다(표 3). qRT-PCR 조건은 50℃ 2분, 95℃ 10분, 40 사이클 (95℃ 15초, 60℃ 1분)로 설정하였다(표 4).

[표 3]

[표 4]

실험결과

1. TEM 이미지 분석

혈청(serum) 내에 존재하는 엑소좀(exosome)을 확인하기 위하여, exoquick을 이용하여 엑소좀을 분리한 뒤, TEM을 이용하여, 엑소좀이 맞는지 육안으로 확인하였다(도 3).

2. 웨스턴 블랏 분석 결과

웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 엑소좀 내에 있는 다양한 특이적(specific) 마커들을 확인함으로써 엑소좀임을 증명하였다(도 4).

3. 혈청(serum) 내에 존재하는 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b 발현량) 분석 결과

전이(metastasis) 여부에 따른, 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)의 발현량을 확인하였다. 전이(metastasis)가 있는 그룹(HCC with mets(+))에서 전이(metastasis)가 없는 그룹(HCC without mets)에 비해 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)의 발현량이 감소되는 것으로 확인되었는 바, 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)가 간암의 전이(metastasis)와 관련성이 있는 것을 알 수 있다(도 5).

4. 같은 환자 내에서 전이(meta) 유무에 따른 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)의 발현량 분석

엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)와 전이(metastasis)와의 관련성을 좀 더 확인하고자 같은 환자 내에서 전이(metastasis) 유무에 따른엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)의 발현량을 확인하였다. 그 결과 전이(metastasis)가 있는 그룹에서 엑소좀 내의 miR125b(exosomal miR125b)의 발현량이 감소되는 것을 확인하였다(도 6).

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 간암의 간외 전이 시 저발현되는 혈액 유래 엑소좀 내 miR-125b 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 간외 전이 진단 또는 예측용 조성물.
   
4. 제3 항에 있어서,
   상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 간외 전이 진단 또는 예측용 조성물.
   
5. 청구항 3 또는 청구항 4의 조성물; 및
   혈액 유래 엑소좀 내 miR-125b 바이오마커의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 저발현인 경우 간암의 간외 전이인 것으로 판정하기 위한 지침서를 포함하는 간암의 간외 전이 진단 또는 예측용 키트.
   
6. 다음 단계를 포함하는, 간암의 간외 전이 진단 및 예측을 위한 정보제공 방법:
   대상의 혈액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계(단계 a);
   상기 엑소좀 내의 miR-125b의 발현 수준을 비교대조군 시료의 해당 엑소좀 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계(단계 b); 및
   상기 단계 b에서 엑소좀 내 miR-125b의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 저발현인 경우, 상기 대상은 간암의 간외 전이인 것으로 판정하는 단계(단계 c).
   
7. 삭제
8. 삭제

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