KR20210042298A - 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 신규한 조기 간암 바이오마커및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 구체적으로 엑소좀 유래 신규 microRNA 마커인 miR-10b-5p를 포함하는 조기 간암 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 조기 간암 진단용 키트, 및 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 소량의 혈액만으로도 우수한 민감도와 특이도를 나타내어 조기 간암의 정확한 진단이 가능한 바, 진단의 정확성, 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하다.

Description

조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법{Method for providing information necessary for diagnosis of early liver cancer}

본 발명은 신규한 조기 간암 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암을 높은 정확도와 민감도로 진단이 가능한 microRNA 마커 또는 microRNA 마커의 조합을 개시한다. 본 발명에 따른 마커는 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 조기 간암 진단 또는 모니터링이하여, 간암 조기 발견에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

간세포암(hepatocellular carcinoma; HCC)은 조직검사 및 전형적인 간 조영 CT 또는 MRI 소견으로 진단 할 수 있다. 만성간염, 간경변 환자들과 같은 간암 고위험군은 간암 조기진단을 위한 선별검사(surveillance test)로 초음파 검사 및 혈청 알파태아단백(alpha-fetoprotein; AFP)를 정기적으로 시행하도록 권고 되고 있다.

현재 혈청 AFP는 간세포암의 혈액 바이오마커 또는 종양표지자로 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 간세포암 환자의 약 40 내지 60 %에서만 혈청 알파태아단백이 상승되어 있어 진단 정확도에 문제가 있어 기존 간암 진단 가이드라인에 AFP가 포함되어 있었으나, 최근 개정된 2018 간세포암종 진료 가이드라인에서는 간암 진단 알고리즘에 AFP가 빠진 상태이다. 이와 같이 현재 간암 환자에서 진단 및 예후 예측을 위한 신뢰성 있는 바이오마커가 없는 상태로 조기 진단 및 예후, 치료 반응 예측을 위한 차세대 혈청 간암 바이오마커 발굴이 절실한 상황이다. 또한 조직 검사의 경우 대부분의 간암 환자가 간경변을 동반하고 있어 출혈 위험도가 다른 암종에 비해 매우 높고, 간암 조직 검사는 간암을 초음파로 타겟하여 조직 검사용 바늘을 피부를 통해 병변으로 삽입하여 조직 검사가 진행되는데, 종양의 위치가 접근이 어렵고 크기가 작은 경우 조직 검사의 타게팅 오류가 발생할 가능성이 높다. 따라서 간암 진단 및 스크리닝을 위한 신뢰성 있는 혈청 바이오마커 개발이 절실한 상황이다. 본 연구는 간세포암 바이오마커, 종양표지자를 개발을 위한 연구이며, 간세포암 바이오마커 또는 종양표지자는 혈액검사를 통하여 간암의 진단 및 예후 예측에 도움을 줄 수 있는 인자를 말한다.

한편, 종양 유래‘엑소좀(Exosome)’은 암세포에서 만들어져 혈청내로 분비되는 매우 작은 50 내지 100 nm 막구조 물질로서 내부에 여러 가지 단백질 및 유전정보를 포함하고 있는 것으로 알려졌다.

암 세포가 혈액으로 분비하는 엑소좀(Exosome)을 검출하여, 암세포 분비 엑소좀 내부 물질을 분석함으로써, 조직 검사 없이 혈액만으로 암세포 유전체 및 단백체를 확인하는 것을 액체 생검이라고 한다. 최근 액체 생검에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 출혈 및 여러 합병증의 위험이 있는 조직 검사를 대체하여 간단한 혈액 채취만으로 암세포가 분비하는 단백질 및 유전 정보를 얻을 수 있어, 향후 진단 바이오마커 발굴을 위한 유용한 방법으로 액체 생검 활용 가능성이 매우 높을 것으로 예측되고 있다.

한편, 유전자발현 프로파일링(profiling), 특히 microRNA 프로파일링 기법은 암 진단과 예후 양쪽 모두에 유용한 것으로 제안되고 있다(Endoh et al., J. Clin. Oncol., 22: 811-819 (2004); Potti et al., N. Engl. J.Med., 355: 570- 580 (2006) 참조). 예를 들면, 암의 서브타입을 결정하는데 있어서 특정 microRNA의 발현 패턴이 단백질-암호 유전자의 발현 패턴보다 더 정확한 것으로 알려져 있다(Calin et al., Nat. Rev. Cancer, 6: 857-866 (2006); Volinia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103: 2257-2261 (2006) 참조).

microRNA는 유전자의 전사 후 과정에서 RNA 간섭을 통해 수백 개의 유전자의 발현을 제어함으로써, 광범위한 생체경로, 예컨대 세포 증식, 분화 및 세포자살을 조절하는 작은 비단백질-암호 RNA이다(Calin et al., Nat.Rev. Cancer, 6: 857-866 (2006)). 환자 그룹의 특정 발현 패턴을 보여주는 하나 또는 그 이상의 microRNA의 특정 microRNA 표식(microRNA signature)이 만성 림프구성 백혈병, 폐 선암, 유방암, 췌장암, 간암의 임상적 예후와 관련이 있다고 보고되어 있다. 이러한 microRNA 표식은 여러 가지 암의 임상적 예후를 예측하는데 유용하나, 아직까지 보다 높은 정확성으로 조기 간암 환자의 예후를 예측하는 microRNA는 거의 보고된 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 새로운 혈청 간암 바이오마커를 발굴하기 위해 간암 세포가 분비하는 엑소좀 내부의 microRNA를 분석하고, 간암 엑소좀에서 특이적으로 과발현되는 microRNA를 규명하여, 현재 신뢰성을 갖는 바이오마커가 없는 조기 간암에서 진단적 정확도가 높은 새로운 혈청 바이오마커를 발굴하고자 하였다.

한국등록특허 제10-1987358호(2019.06.10. 공고)

INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 41: 1809-1816, 2018(2018.01.11. 공개) Biomedicine & Pharmacotherapy Volume 111, March 2019, Pages 1221-1227(2019.01.15. 공개)

본 발명의 발명자들은 혈액으로 간편하게 간암인지 여부, 특히 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암인지를 확인할 수 있으며, 진단 예민도도 우수한 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 엑소좀 내부의 microRNA를 분석하고, 간암 엑소좀에서 특이적으로 과발현되는 49개의 microRNA를 선별하였고, 대단위 간암 코호트를 이용하여 간암 엑소좀 특이 microRNA 분석 및 검증하였다. 검증 결과 miR-10b-5p의 경우 간암 진단 시의 AUC가 0.932, 2cm 미만의 조기 간암 진단 시(mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암)의 AUC가 0.934로 상당히 유의적인 결과를 나타냄을 확인하였는바, miR-10b-5p를 조기 간암 진단을 위한 혈청 엑소좀 microRNA로 이용할 수 있음을 확인하게 되었고, 나아가 이는 단순한 혈액 감사만으로 mUICC 병기 Ⅰ 이하에 해당하는 조기 간암 환자를 쉽게 선별 및 진단할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 엑소좀 유래 microRNA인 miR-10b-5p를 포함하는 비침습적 체외진단을 위한 조기 간암 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 조기 간암 진단용 키트, 및 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.

따라서 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈청 엑소좀(exosome) 유래 miR-10b-5p를 포함하는, 조기 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래 microRNA인 miR-10b-5p의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조기 간암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 간암 환자의 개체로부터 분리된 비침습적 생물학적 시료에서 엑소좀 유래 microRNA인 miR-10b-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 miR-10b-5p 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 조기 간암 환자로 진단하는 단계를 포함하는, 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 키트는 비침습적 체외진단이 가능한 것으로, 단순한 혈액 검사만으로도 modified International Union Against cancer UICC (mUICC) 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암의 환자를 쉽게 선별 및 진단할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 바이오마커 및 키트는 소량의 혈액만으로도 우수한 민감도와 특이도를 나타내어, mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암 진단에 있어 정확성, 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하다.

도 1은 mUICC 병기 별로 간암의 특성을 나타낸 표이다.
도 2는 실시예 1에서 간암 세포주 및 정상 간세포주로부터 엑소좀 분리 과정하고, RNA를 추출하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 분리한 엑소좀의 형태학적 모습을 확인할 수 있는 투과전자현미경(TEM) 측정 사진이다. 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 엑소좀이 분리된 것으로 확인할 수 있다.
도 4는 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2로 부터 간암 특이적 엑소좀 유래 microRNA 마커를 동정하기 위한 분석 흐름도(파이프라인)이다.
도 5는 엑소좀 유래 microRNA 마커 동정을 위해 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7에 대하여 공통적으로 과발현된 microRNA을 선별하기 위한 벤다이어그램이다.
도 6은 간암 세포주 엑소좀 분석을 통해 선별한 49개 엑소좀 microRNA 리스트 및 과발현 microRNA를 이용한 네트워크 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7(A)는 49개의 간암 엑소좀 과발현 microRNA 중 18개의 microRNA가 대단위 간암 코호트인 TCGA 데이터에서도 과발현 하며, 이중 4개의 microRNA가 예후와의 연관성을 보였음을 확인할 수 있는 결과이고, 도 7(B)는 TCGA 데이터를 이용하여 4개의 후보 마커 microRNA 발현량을 산점도 평가한 결과이고, 도 7(C)는 TCGA 데이터를 이용하여 4개의 후보 마커 microRNA의 조직 발현에 따른 생존 데이터 분석한 결과이다.
도 8(A)는 비간암 환자(n=18) 및 간암 환자(n=19)의 혈청 엑소좀에서 후보 microRNA 발현량을 산점도 평가한 결과이고, 도 8(B)는 4개의 후보 마커 microRNA의 간암 진단에 대한 ROC 곡선 분석을 통한 AUC 결과를 나타낸 것이다.
도 9(A)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA의 발현량을 간질환 진행 정도에 따라 산점도로 평가한 결과이고, 도 9(B)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA가 코호트 내 모든 병기의 간암을 진단하는데 대한 진단적 정확도를 보기 위한 AUC 측정 결과이고, 도 9(C)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA가 mUICC II 이하 간암을 진단하는 것에 대한 AUC 측정 결과이고, 도 9(D)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA가 2cm 이하의 조기 간암인 mUICC I에 해당되는 간암을 진단하는 것에 대한 AUC 측정 결과이다.
도 10(A)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA 조합이 코호트 내 전체 병기의 간암을 진단한 것에 대한 AUC 측정 결과이고, 도 10(B)는 검증용 간질환 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA 조합이 코호트 내 mUICC II 이하 간암을 진단하는 것에 대한 AUC 결과이고, 도 10(C)은 검증용 간암 코호트에서 종래의 간암 마커인 AFP 및 후보 마커 microRNA가 mUICC I 이하 간암을 진단하는 것에 대한 AUC 측정 결과이다.

본 발명자들은 엑소좀 유래 miRNA인 miR-10b-5p이 비침습적 체외진단을 위한 조기 간암 진단용 바이오마커 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 간암 병기로 활용한 mUICC 는 2003년부터 대한간암학회-국립암센터 간세포암종 가이드라인에서 채택하여 사용하는 간암 병기 체제로 2018 간세포암종 진료 가이드라인에 근거하여 mUICC 병기 체제를 적용하였다. “mUICC 병기 I” 은 혈관을 침범하지 않은 직경 2cm 이하의 간암의 단독으로 있는 상태를 의미하며, “mUICC 병기 II”는 혈관을 침범하지 않은 2cm 초과 간암 조직이 단독으로 있거나, 혈관을 침범하지 않은 2cm 이하 간암이 다발성이로 있거나, 혈관을 침번한 직경 2cm 이하 간암이 단독으로 있는 경우를 의미한다(도 1 참조). 본 발명의 도 9(B) 및 도 10(A)에서 말하는 간암은 진행된 간암인 mUICC III 또는 IV 병기에 해당하는 간암까지 모두 포함한 전체 병기의 간암을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암 진단을 위한, 혈청 엑소좀(exosome) 유래 miR-10b-5p를 포함하는 조기 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

종래에는 간암 세포주에서 특이적으로 과발현 되는 엑소좀 miRNA로서 miR-10b-5p, miR-18a-5p, miR-215-5p, miR-940 등이 밝혀진 적이 있으나(INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 41: 1809-1816, 2018, Biomedicine & Pharmacotherapy Volume 111, March 2019, Pages 1221-1227), mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암 진단에 대한 용도는 전혀 알려진 바 없다.

본 발명에 따른 바이오마커 조성물은 miR-215-5p, 또는 알파태아단백(AFP), 또는 이의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 특히, miR-10b-5p, miR-215-5p, 및 알파태아단백(AFP)를 모두 조합하는 경우 가장 우수한 AUC 값을 나타냈는바, 조기간암 진단의 정확성이 가장 우수하였다.

본 발명에서 miR-10b-5p(miRBase Acession number:MIMAT0000254), miR-215-5p(miRBase Acession number:MIMAT0000272)은 각각 하기 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된다.

microRNA	염기서열	서열번호
miR-10b-5p	5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3‘	1
miR-215-5p	5'-AUGACCUAUGAAUUGACAGAC-3‘	2

상기 miR-10b-5p 또는 miR-215-5p는 엑소좀 유래일 수 있다. 엑소좀(Exosome)이란 30 내지 100 nm의 크기를 갖는 작은 세포막성 수포로서 다양한 세포에서 분비되며 혈액, 혈청, 소변 또는 타액 등과 같은 체액에서 발견된다.

본 발명의 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

또한, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래 miRNA인 miR-10b-5p를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 조기 간암 진단용 키트를 제공한다.

상기 제제는 엑소좀 유래 miRNA인 miR-10b-5p에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에서“비침습적 생물학적 시료”는 혈액, 혈청, 소변 또는 타액일 수 있고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서“프라이머”는 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서“프로브”는 miRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 miRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

본 발명에서“키트”는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로서 RT-PCR 키트의 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 간암의 진단용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 간암 환자의 개체로부터 분리된 비침습적 생물학적 시료에서 엑소좀 유래 microRNA인 miR-10b-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 miR-10b-5p 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암 환자로 진단하는 단계를 포함하는 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서의 비침습적 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 소변 또는 타액일 수 있으나, 바람직하게는 혈액 또는 혈청이다.

상기 (a) 단계는 miR-10b-5p의 발현 수준과 함께 miR-215-5p, 또는 알파태아단백(AFP), 또는 이들 혼합물의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 miR-10b-5p의 발현 수준은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 miRNA 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 방식으로 실시될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 시료 내 miR-10b-5p의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우 조기 간암으로 진단할 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 miRNA 수준, 즉, miRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 miR-10b-5p에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 miR-10b-5p 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 사용한 간암 질병 데이터 베이스는 “빅데이터”의 형태를 지닌 공개된 인간 유전자 발현 데이터로서, 구체적으로 GEO, TCGA, ICGC, ArrayExpress 및 Pan-cancerinitiative 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 대단위 간암 코호트(Cohort; 동일집단) 데이터로, TCGA(The Cancer Genome Atlas) RNA-seq data, ICGC(International Cancer Genome Consortium) RNA-seq data을 이용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 ROC 분석을 통한 AUC 값을 통해 상기 miR-10b-5p 바이오마커의 정확성을 검증할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서, "곡선 아래 영역(area under the curve)" 또는 "AUC"는 당업계에 모두 잘 알려져 있는 수용자 반응 특성(receiver operating characteristic curve; ROC) 곡선의 아래 영역을 말한다. AUC 측정은 전체 데이터 범위에 걸쳐 분류기의 정확성을 비교하는데 유용하다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 miR-10b-5p를 포함하는 조기 간암 진단용 혈청 바이오마커는 소량의 혈액만으로도 높은 진단적 정확도를 갖기에 경제적 측면에서도 유리하여 향후 조기 간암 진단용 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 엑소좀의 분리 및 검증

1-1. 엑소좀 분리

간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에 대한 각각의 배양액을 준비하고, 각각의 배양액을 원심분리기에 넣고 300×g에서 10 분간 원심분리하여 세포 데브리스(cell debris)를 제거한 다음, 다시 3000×g에서 20 분간 원심분리하여 세포자멸체(apoptotic body)를 제거하였다. 다음으로 100,000×g에서 70 분간 초원심분리하여 엑소좀 분획(exosome fraction)을 분리하고, 0.2 ㎛ 중공(pore)을 갖는 필터를 이용하여 초미세여과(ultrafiltration)를 통해 D-PBS 배지에 부유시킨 엑소좀을 250 ㎕로 농축시켰다(도 2(A)).

1-2. 엑소좀 정제: Opti-prep gradient 원심분리

실시예 1-1에서 획득한 엑소좀을 더욱 정제하기 위해, 수크로스 구배(sucrose gradient)를 시행하였다. 구체적으로, 설탕 버퍼와 60 % opti-prep gradient 배지(Sigma-Aldrich)를 희석하여 40 %, 20 %, 10 %, 5 %의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비하였다. 각 농도별 수크로스 용액을 초고속 원심 분리용 튜브에 차례대로 놓고(layering), 실시예 1-1에서 획득한 엑소좀 로딩(loading)하고 초고속 원심분리기(㎕tracentrifuge L-90k, Beckman)에서 100,000 g에서 12 시간 동안 20℃로 초고속 원심분리하였다. 초고속 원심분리한 후, 40 %와 20 % 수크로스 용액 부분에 위치한 엑소좀을 수득하였다.

1-3. 엑소좀 분리 및 검증

1-3-1. 환자의 혈청으로부터 엑소좀 분리 및 RNA 추출

본 연구는 아주대학교병원 인체자원단위은행에서 제공한 인체 자원을 이용하여 수행하였다. 정상인 28명 및 만성 간염 27명, 간경변 33명, 간암 환자90명, 총 178명의 혈청을 분양 받았다. 178명 각각의 혈청 300 ul에서 Exosome RNA isolation kit(SeraMir™ Exosome RNA Amplification(Cat #RA806A-1))를 이용하여 RNA를 분리하였다. 구체적으로, 혈청 300ul 에 ExoQuick™ 72ul를 넣고 볼텍싱(Vortexing) 해준 후, 4℃에 하루 정도 보관한 후, 혈청 300ul에 ExoQuick™ 넣어둔 샘플(Sample)을 13,000rpm, 4℃ 조건에서 , 2분 동안 원심분리하였다(도 2(B)). 생성된 펠렛(Pellet)만 남기고 상층액은 모두 제거 후 PBS(1x) (Hyclone™) 100 ul로 펠렛을 녹인 후 Lysis buffer 300ul 와 100% EtOH 200ul를 첨가 후 볼텍싱(Vortexing)을 10 초간 진행하였다. 스핀 컬럼(Spin Column)과 컬렉션 튜브(Collection Tube)를 준비하여 샘플 전량을(600 ul)을 컬럼(Column)에 옮겨 준 후 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 1 분간 원심분리하고, 컬렉션 튜브(Collection Tube)에 내려온 용액을 제거 후 워쉬 버퍼(Washing Buffer) 400 ul를 넣어 주고, 13,000rpm, 4℃ 조건에서 1분간 원심분리하고 컬렉션 튜브(Collection Tube)에 내려온 용액을 제거 후 반복 작업 후 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 2 분간 원심분리 진행 후 최종 건조시켰다. 여기에 용출 완충액(Elution buffer) 30 ul를 첨가하여 2,000 rpm, 4℃, 2 분간 원심분리 후, 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 1분간 최종 원심분리하였다. 수득한 용액을 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였다.

1-3-2. 투과전자현미경 측정

간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에 대한 각각의 세포 배양액에서 엑소좀이 잘 분리되었는지 확인하기 위해, 투과전자현미경(Transmission electron micrographs, TEM)을 측정하였다. 엑소좀 마커인 CD63 항체가 부착된 각각의 엑소좀을 TEM 이미지로 나타내었다(도 3).

도 3을 통해, 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 모두 엑소좀이 잘 분리된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

1-3-3. qPCR(Real-time qPCR) 분석을 통한 mRNA 발현 수준 측정

혈청 내 microRNA의 수준을 확인하기 위해, 실시예 1-3-1에서 분리한 microRNARNA를 miScript RT Ⅱ kit(Cat #218161)를 이용하여 cDNA 합성을 진행하였다. 구체적으로, Exosome RNA와 RNA Free Water (RFW)를 합하여 12 ul에 맞추고, miScript RT Ⅱ Buffer를 8ul (5X miScript Hiflex buffer는 4ul, 10X miScript Nucleics Mix는 2ul, miScript Reverse TranScriptase Mix는 2ul) 총 20 ul로 cDNA 합성을 진행하였다.

cADN 합성 조건	A. Stage 1 : 37℃, 60분 B. Stage 2 : 95℃, 5분 후 10℃
qRT-PCR 수행 조건	A. Stage 1 : 95℃, 2분 B. Stage 2 : 95℃, 15초, : 58~60℃, 34초 (miRNA별 상이) : 72℃, 30초 -> stage 2 : 40 cycle

구체적으로, 상기 분리한 microRNA를 12 ㎕에 맞추고, miScript RT Ⅱ Buffer를 8 ㎕(5× miScript Hiflex buffer는 4 ㎕, 10× miScript Nucleics Mix는 2 ㎕, miScript Reverse TranScriptase Mix는 2 ㎕)를 더하여 총 20 ㎕로 cDNA 합성을 진행하고 합성된 cDNA는 1/20 희석하여 사용하였다. 증폭하고자 하는 서열은 하기 표 3에 나타낸 서열과 상보적인 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

구분	염기서열	서열번호
hsa-miR-10b-5p primer	5'-TAC CCT GTA GAA CCG AAT TTG TG-3‘	3
hsa-miR-18a-5p primer	5'-TAA GGT GCA TCT AGT GCA GAT AG-3'	4
hsa-miR-215-5p primer	5'-ATG ACC TAT GAA TTG ACA GAC-3'	5
hsa-miR-940 primer	5'-AAG GCA GGG CCC CCG CTC CCC-3'	6
hsa-miR-1228-3p primer	5'-TCA CAC CTG CCT CGC CCC CC-3'	7

이 때 필요한 프라이머(primer)는 M.biotech (Hanam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. qPCR MasterMix(2X, High ROX)(Gendepot, Cat #Q5602)는 5 ul를 사용하여 총 10 ul로 만들어 qRT-PCR를 진행하였다.

실시예 2 : 간암 특이적 엑소좀 microRNA 마커 발굴을 위한 분석

2-1. microRNA sequencing 분석을 통한 혈청 엑소좀 microRNA 마커 선별

정상 간세포주에 비해 간암 세포주에서 특이적으로 발현되는 miRNA리스트 동정하기 위해, 도 4의 분석 흐름도에 따라 분석을 진행하였다.

정상 간세포주 THLE-2, 간암 세포주 Huh-7, 간암 세포주 Hep3b 각각의 엑소좀 microRNA을 추출하여 Ilumina Hiseq2000을 이용하여 small RNA sequencing을 진행하였다. 그리고 정상 간 세포주에 비해 간암 세포주에서 특이적으로 과발현되는 microRNA 리스트 동정하였다.

구체적으로, 첫번째 단계로 sequencing quality를 측정한 후, Q30 이상의 read를 확보하여 STAR를 이용하여 read mapping을 진행하였다. 정확한 발현값을 구현하기 위하여 샘플별로 miRNA의 read의 총량을 계산하여 길이별 miRNA의 측정을 정량화한 TPM (transcripts per million)으로 정규화 과정을 거친 후, 정상 간 세포주에 비하여 간암 세포주에서 특이적으로 발현 변화된 miRNA를 선별하기 위하여 1.5 배 이상 발현 값이 차이나는 miRNA를 선별하였다. 아울러, 선별된 miRNA들이 가지는 특정 기능을 추정하기 위하여 IPA (Ingenuity Pathway Analyis)를 진행하였다.

선별 결과, 정상 간세포주인 THLE-2 에서는 발현되지 않고 간암 세포주인 Hep3B, Huh7에서 공통적으로 1.5 배 이상 과발현되는 49 개의 microRNA 리스트 확인하였다(도 5). 세포주 엑소좀 분석을 통해 선별한 49 개의 엑소좀 microRNA 리스트 및 과발현 microRNA를 이용한 네트워크 분석하였다(도 6).

2-2. 대단위 간암 코호트(cohort)로서 TCGA 데이터를 이용한 바이오마커 확인

선별된 miRNA가 실제로 과발현 되어있는지 검증하기 위하여, 차세대염기서열분석법(NGS, next-generation sequencing)의 분석 결과로서 대단위 간암 코호트(cohort)인 TCGA(The Cancer Genomic A) 데이터세트(dataset), 구체적으로 TCGA_LIHC(The Cancer Genome Atlas Liver hepatocellular carcinoma)을 이용하여 선별된 miRNA의 발현을 확인하였다.

구체적으로, TCGA 데이터 중 총 50 개의 non-tumor 샘플과 363개의 간암 샘플에서 후보 microRNA 49개의 발현을 분석하였으며, 총 18개의 microRNA 가 TCGA 데이터에서 유의하게 간암 조직에서 과발현 되는 것으로 확인되었다(도 7(A)).

아울러, 18개의 microRNA에 대해 발현에 따른 생존 분석을 진행한 결과, 18개 중 총 4개의 microRNA(miR-10b-5p, miR-18a-5p, miR-215-5p, miR-940)가 생존과도 유의한 연관성을 보이는 것으로 확인되었다(도 7(B)). 이에, miR-10b-5p, miR-18a-5p, miR-215-5p, miR-940에 대해 간질환 코호트에서 생존 분석을 하여 유의성을 검증하였다(도 7(C)).

도 7의 결과를 통해, miR-10b-5p, miR-18a-5p, miR-215-5p, miR-940 4개의 miRNA가 간암 진단을 위한 후보 마커가 될 수 있음을 예측할 수 있었다.

2-3. 검증용 간암 코호트에 이용한 후보 microRNA 마커의 임상적 유의성 검증

실제 환자 조직에서도 후보 마커인 miR-10b-5p, miR-18a-5p, miR-215-5p, miR-940 발현이 높아 간암 진단을 위한 마커로 사용될 수 있는지를 검증용 간암 코호트를 이용하여 검증하고자 하였다.

검증용 간암 코호트는 아주대학교병원에서 IRB 심사를 통과 후, 인체자원은행을 통해 간질환 코호트 178명(정상 28명, 만성 간염 27명, 간경변 33명, 간암 99명)의 혈청 및 임상정보를 분양 받아 사용하였다. 참고로, 도 (B)의 x 축은 특이도, y 축은 민감도로 표현된 것으로, 진단의 정확도는 ROC curve 아래의 면적(area under the ROC curve; AUC)에 의해 측정되며, 면적이 1이라면 완벽한 진단 검사임을 의미한다.

[표 4] 검증용 간암 코호트의 구성 및 기본 특성

도 8의 결과, 간암 진단의 AUC를 확인하였을 때 4개의 후보 마커중에서도 특히 miR-10b-5p 및 miR-215-5p가 AUC 0.9 이상의 좋은 결과를 보였다(도 8(B); miR-10b-5의 AUC = 0.968, miR-18a-5p의 AUG = 0.842, miR-215-5p의 AUG = 0.936, miR-940의 AUG = 0.827).

이는 miR-10b-5p 또는 miR-215-5p가 간암 진단에 있어서 우수한 정확도 및 민감도를 갖을 수 있는 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다.

실시예 3 : 조기 간암 진단을 위한 혈중 마커로서의 miR-10b-5p 검증

기존에 알려진 간암 혈청 마커인 AFP의 발현과 상기 실시예 2를 통해 발굴한 혈청 엑소좀 microRNA 후보 마커들의 발현량을 상기 검증용 간암 코호트를 이용하여 검증하고자 하였다. 구체적으로, 조기 간암 판별 여부를 판단하기 위하여 mUICC 병기를 나누어 AUC를 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 참고로, mUICC 병기는 도 1에 나타낸 바와 같다. 아울러, 엑소좀 microRNA 결과의 통계 분석은 Microsoft Office Excel 프로그램을 사용하여 혈청의 상대적인 농도를 계산한 후, 통계 분석은 MedCalc statistical software 및 SPSS v22 분석 프로그램을 이용하여 분석 진행하였다.

도 9의 결과, 간암 진단에 있어 AFP의 AUC는 0.707이었는데, 2cm 미만의 조기 간암 진단(mUICC 병기 Ⅰ)을 위한 AUC는 0.542로서 기대에 미치지 못하였다.

반면에, 혈청 엑소좀 miR-10b-5p의 경우 간암 진단의 AUC가 0.932 이였으며, 2cm 미만의 조기 간암 진단(mUICC 병기 Ⅰ)의 경우 AUC 0.934로 상당히 좋은 성적을 나타냈다.

아울러, 혈청 엑소좀 miR-215-5p의 경우 간암 진단의 AUC가 0.723이였으며, 2cm 미만의 조기 간암 진단(mUICC 병기 Ⅰ)의 경우 AUC 0.666 로서, AFP 보다는 좋은 결과를 확인하였으나, 혈청 엑소좀 miR-10b-5p 보다는 정확성이 떨어졌다.

또한, 간암 진단을 위한 혈청 엑소좀 miR-10b-5p의 컷-오프(cut-off) 값을 비간암에 비하여 발현량이 1.7 배(fold change)로 하였을 때, 민감도(sensitivity) 92.222 %, 특이도(specificity) 71.591 %, 양성예측도(positive predictive value) 76.852 %, 음성예측도(negative predictive value) 90.00 %로 확인되었다. 참고로, 조기 간암의 경우 컷-오프(cut-off) 값이 비간암과 대비하여 1.8 정도이다.

mUICC 병기 Ⅰ이하의 조기 간암 진단을 위한 혈청 엑소좀 miR-10b-5p의 컷-오프(cut-off) 값을 비간암에 비하여 발현량이 1.7 배(fold change)로 하였을 때, 민감도(sensitivity) 93.750 %, 특이도(specificity) 71.591 %, 양성예측도(positive predictive value) 54.545 %, 음성예측도(negative predictive value) 96.923 %로 확인되었다.

이러한 결과는 혈청 엑소좀 miR-10b-5p가 간암 또는 mUICC 병기 Ⅰ이하의 조기 간암 진단에 있어서 우수한 정확도 및 민감도를 갖는 바이오마커임을 시사한다.

실시예 4 : microRNA 마커 조합을 통한 임상적 유의성 검증

기존에 알려진 간암 혈청 마커인 AFP와 본 발명에서 발견한 바이오마커로서 혈청 엑소좀 miR-10b-5p, miR-215-5p의 조합이, 기존 간암 혈청 마커인 AFP의 진단의 정확도 및 민감도를 보완하거나 개선할 할 수 있는지, 상기 검증용 간암 코호트를 이용하여 마커 조합별 AUC를 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10의 결과, 전체 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서는 AFP와 miR-10b-5p의 조합이 AUC가 0.944로 가장 좋았으나, 2cm 미만의 조기 간암 진단(mUICC 병기 Ⅰ)에서는 miR-10b-5p와 miR-215-5p의 조합이나 AFP 및 miR-10b-5p와 miR-215-5p의 조합이 AUC 0.936로 가장 좋은 결과를 나타내었다.

이러한 결과는 mUICC 병기 Ⅰ이하의 조기 간암 진단에 있어서 miR-10b-5p, miR-215-5p, 및 AFP를 모두 마커로 사용하는 경우 우수한 정확도 및 민감도를 갖는 바이오마커임을 시사하며, 특히 miR-10b-5p는 AFP의 진단의 정확도 및 민감도를 보완하거나 개선할 할 수 있음을 의미한다.

본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 신규한 조기 간암 바이오마커인 miR-10b-5p의 용도를 밝힌 것으로, miR-10b-5p는 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암을 높은 정확도와 민감도로 진단이 가능하여 간암 조기 발견에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> microRNA biomarker derived exosome for diagnosis of early liver cancer and use thereof <130> ADP-2019-0288 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-10b-5p <400> 1 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-215-5p <400> 2 augaccuaug aauugacaga c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-10b-5p primer <400> 3 taccctgtag aaccgaattt gtg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-18a-5p primer <400> 4 taaggtgcat ctagtgcaga tag 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-215-5p primer <400> 5 atgacctatg aattgacaga c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-940 primer <400> 6 aaggcagggc ccccgctccc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1228-3p primer <400> 7 tcacacctgc ctcgcccccc 20

Claims (3)

1. 비침습적 체외진단을 통해 mUICC 병기 Ⅰ 이하의 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
   (a) 간암 환자의 개체로부터 분리된 비침습적 생물학적 시료에서 엑소좀 유래 microRNA인 miR-10b-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 miR-10b-5p 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 조기 간암 환자로 진단하는 단계;
   를 포함하는, 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 (a) 단계는 miR-10b-5p의 발현 수준과 함께 miR-215-5p, 또는 알파태아단백(AFP), 또는 이들 혼합물의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 조기 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 비침습적 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 소변 또는 타액 중 어느 하나인 방법.

Images