CN116121369A - 肾癌相关生物标志物及其应用和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肾癌相关生物标志物及其应用及其检测方法。miR‑378a‑5p及DAB2IP蛋白中的至少一种作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。研究发现,miR‑378a‑5p与DAB2IP较癌旁组织样本,均在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达,二者表达水平均对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度。联合评估miR‑378a‑5p与DAB2IP的表达水平,可望提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种肾癌相关生物标志物及其应用和检测方法。
背景技术
肾癌是起源于肾脏系统的恶性肿瘤的总称,约90%左右的肾癌起源于肾上皮细胞,即肾细胞癌,根据组织和分子特性又可以分成10个以上的亚型,其中透明细胞肾癌是最为常见的,约占肾细胞癌的85%,其也是引起肾癌患者死亡常见的亚型。当前诊断该疾病的技术包括:影像学技术(B超、多层螺旋CT、磁共振成像、PEI-CT全身扫面检查技术等),病理学技术(肾脏穿刺活检)、及分子生物学技术(荧光原位杂交技术、免疫组织化学技术)等。然而,由于肾癌患者临床症状不明显,被确诊时多表现为晚期症状,且初次确诊的患者约有25%可能伴有肿瘤转移[3],此时患者已失去了根治性手术的机会。
研究报道表明,遗传性突变基因VHL、MTOR、MET等是诱发肾透明细胞癌发生的起因。VHL的缺失表达能诱导致癌性的低氧诱导因子HIF1与HIF2的异常增加,从而导致调控血管生成、糖酵解与凋亡的靶基因激活。MTOR通常发生错义突变和功能性激活,从而促进肾透明细胞癌的发生进展。当前,治疗发生转移的恶性肾透明细胞癌患者主要使用靶向血管内皮生长因子VEGF及其受体VEGFA的药物,如sorafenib、sunitinib等,和靶向mTOR的药物,如everolimus、temsirolimus等,然而治疗效果不一,大部分患者最终发生进展。
因此,需要进一步鉴别新的肾透明细胞癌的关键驱动基因,这对于早期诊断与预后肾透明细胞癌具有至关重要的作用,且能为今后该疾病的分子靶向治疗提供理论基础。
发明内容
基于此,有必提供一种肾癌相关生物标志物。
此外,还提供一种肾癌相关生物标志物的应用及其检测方法。
miR-378a-5p及DAB2IP蛋白中的至少一种作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
经过大量的探索,预料不到地发现,miR-378a-5p与DAB2IP较癌旁组织样本,均在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达,二者表达水平均对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度。联合评估miR-378a-5p与DAB2IP的表达水平,可望提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度。
miR-378a-5p和DAB2IP蛋白作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
一种肾癌检测试剂,包括:检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中,由如下试剂组成:所述检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及所述检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂。
在其中一个实施例中,所述检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂包括检测miR-378a-5p分子转录水平的引物或能够检测miR-378a-5p分子转录水平的探针。
在其中一个实施例中,检测miR-378a-5p分子转录水平的引物的序列如SEQ IDNo.1所示;
检测miR-378a-5p分子转录水平的探针的序列如SEQ ID No.2所示。
在其中一个实施例中,所述检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂为检测DAB2IP蛋白水平的原位杂交检测试剂或者免疫组织化学检测试剂。
在其中一个实施例中,所述肾癌为肾透明细胞癌。
一种肾癌检测试剂盒,包括上述肾癌检测试剂。
一种肾癌检测装置,包括上述肾癌检测试剂或者上述肾癌检测试剂盒。
一种生物标志物的含量的检测方法,其特征在于,所述生物标志物为miR-378a-5p和DAB2IP蛋白,所述检测方法包括:
从待测样本中获得测试RNA样品,采用检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂检测miR-378a-5p的转录水平含量;
从待测样本中获得组织切片,并检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂检测DAB2IP蛋白表达含量。
附图说明
图1为TCGA数据库中miR-378a-5p在肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本中的表达差异对比;
图2为GEO数据库中miR-378a-5p在肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本中的表达差异对比;
图3为荧光定量PCR检测方法检测miR-378a-5p在48例肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本中的表达差异对比;
图4为原位杂交技术检测miR-378a-5p在90例肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本中的表达差异对比;
图5为免疫组化技术检测miR-378a-5p在90例肾透明细胞癌组织及癌旁组织样本中的表达差异对比;
图6为DAB2IP与miR-378a-5p在90例肾透明细胞癌组织及其配对组织中呈现正相关;
图7为联合检测miR-378a-5p与DAB2IP的受试者工作特征曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究提供一实施方式的应用,miR-378a-5p及DAB2IP蛋白中的至少一种作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
经过大量的探索,预料不到地发现,miR-378a-5p与DAB2IP较癌旁组织样本,均在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达,二者表达水平均对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度。
其中,肾癌为肾透明细胞癌。
具体地,miR-378a-5p和DAB2IP蛋白作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
联合评估miR-378a-5p与DAB2IP的表达水平,可望提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度。
具体地,生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。
miR-378a-5p是miR-378a家族成员之一,在线粒体丰富的组织中表达,如心脏、骨骼肌等。目前关于miR-378a-5p的报道较少。本研究意外发现在肾透明细胞癌和癌旁组织样本中miR-378a-5p的表达量存在明显差异。实验结果表明,与癌旁组织样本相比,miR-378a-5p在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达。
DAB2IP蛋白是一种GTP激活蛋白。本研究意外发现在肾透明细胞癌和癌旁组织样本中DAB2IP蛋白的表达量存在明显差异。实验结果表明,与癌旁组织样本相比,DAB2IP蛋白在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达。
研究发现,miR-378a-5p和DAB2IP蛋白在早期肾透明细胞癌的病人中能够被检测且表达量与健康人有一定的差异。因此miR-378a-5p和DAB2IP蛋白能够作为检测早期肾癌的生物标记物,用于肾癌早期诊断、预测治疗或监测复发等,能为今后该疾病的分子靶向治疗提供理论基础。
进一步地,miR-378a-5p和DAB2IP蛋白均能够稳定的存在组织中,能够经过长期保存、反复冻融后仍可稳定存在而不发生降解,因此,miR-378a-5p和DAB2IP蛋白作为肾癌的生物标记物能够准确反应被检测对象中生物标志物的含量或水平。
本研究提供一实施方式的肾癌检测试剂,包括:检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
具体地,miR-378a-5p和DAB2IP的具体信息请参见前文描述。
当然,需要说明的是,生物标志物不限于上述生物标志物,还可以包括其他与肾癌表达相关的miRNA或蛋白。
具体地,由如下试剂组成:检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂。
在其中一个实施例中,检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂包括检测miR-378a-5p分子转录水平的引物或能够检测miR-378a-5p分子转录水平的探针。通过扩增该生物标志物的引物或检测该生物标志物的探针定量或定性的测定生物标志物miR-378a-5p的含量。
具体地,检测miR-378a-5p分子转录水平的引物的序列如SEQ ID No.1所示。如SEQID No.1所示的序列为:CTCCTGACTCCAGGTCCTGTG。
检测miR-378a-5p分子转录水平的探针的序列如SEQ ID No.2所示。如SEQ IDNo.2所示的序列为:CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU。
进一步地,该肾癌检测试剂还包括PCR反应检测miR-378a-5p常用的酶和试剂,能够和与miR-378a-5p特异性结合的检测物相互配合,以实现对miR-378a-5p的检测。
其中,酶例如DNA聚合酶。DNA聚合酶是细胞复制DNA中的重要作用酶,在特定的条件下能够诱导DNA链的复制延长,DNA聚合酶一般以DNA为复制模板,将DNA由5'端向3'端延伸。其中,DNA聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。
试剂包括缓冲液、dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸,包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP)、荧光染料和稳定剂。
在其中一个实施例中,检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂为检测DAB2IP蛋白水平的原位杂交检测试剂或者免疫组织化学检测试剂。
具体地,肾癌为肾透明细胞癌。
上述肾癌检测试剂通过对miR-378a-5p和DAB2IP蛋白的检测,得到的结果具有较高的敏感度和较高的特异性,有利于肾癌的筛查和早期诊断,对推动肾癌的早期诊断具有重要的临床应用价值。此外,上述肾癌的检测试剂盒仅需要对miR-378a-5p和DAB2IP蛋白进行检测,就可得到具有较高的敏感度和较强的特异性的结果,操作简单且方便,工作量小。
此外,提供一种肾癌检测试剂盒,包括上述肾癌检测试剂。
上述肾癌检测试剂盒通过对miR-378a-5p和DAB2IP蛋白的检测,得到的结果具有较高的敏感度和较高的特异性,有利于肾癌的筛查和早期诊断,对推动肾癌的早期诊断具有重要的临床应用价值。此外,上述肾癌的检测试剂盒仅需要对miR-378a-5p和DAB2IP蛋白进行检测,就可得到具有较高的敏感度和较强的特异性的结果,操作简单且方便,工作量小。
一种肾癌检测装置,包括上述肾癌检测试剂或者上述肾癌检测试剂盒。
一种生物标志物的含量的检测方法,生物标志物为miR-378a-5p和DAB2IP蛋白,检测方法包括S110-S120:
S110、从待测样本中获得测试RNA样品,采用检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂检测miR-378a-5p的转录水平含量。
具体地,待测样本为肾透明细胞肿瘤组织样本和癌旁组织样本。
具体地,采用荧光定量PCR方法检测miR-378a-5p转录水平含量。
其中,检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂的具体描述详见上文,此处不再赘述。
S120、从待测样本中获得组织切片,并检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂检测DAB2IP蛋白表达含量。
具体地,待测样本为肾透明细胞肿瘤组织样本和癌旁组织样本。
具体地,采用原位杂交或者免疫组织化学方法检测DAB2IP蛋白表达含量。
其中,检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂的具体描述详见上文,此处不再赘述。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
分析miR-378a-5p基因的表达水平
采用TCGA数据库与GEO数据库(GSE16441)对肾透明细胞癌与癌旁样本的转录组测序进行分析miR-378a-5p基因的表达水平。统计分析方法包括:T检验分析。分析结果详见图1~2。其中,图1表示TCGA数据集的miR-378a-5p基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图,图2表示GSE16441数据集的miR-378a-5p基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图。
实施例2
检测miR-378a-5p基因的表达水平
采用TAKARA RNAiso Plus试剂盒(购于TAKARA公司)从待测样本的肾透明细胞肿瘤组织中获得测试RNA样品,并采用荧光定量PCR法检测miR-378a-5p基因的表达水平,所使用的的试剂为Mir-X miRNA qRT-PCR TBKit(购于TAKARA公司)。其中,待测样本为48对肾透明细胞癌及癌旁组织样本。用于扩增miR-378a-5p基因的扩增引物对的序列如SEQID No.1所示。荧光定量PCR的反应体系如下表1所示,表1中的PCR Primer和mRQ 3’Primer(试剂盒自带)构成的引物对即为第一扩增引物对,PCR Primer的序列如SEQ ID No.1所示;荧光定量PCR的反应条件如表2所示。
表1荧光定量PCR的反应体系
试剂 | 体积(μL) |
TB Green Advantage Premix(2X) | 12.5 |
ROX Dye(50X) | 0.5 |
miRNA-specific primer(10μM) | 0.5 |
mRQ 3’Primer(10μM) | 0.5 |
cDNA | 2 |
<![CDATA[dH<sub>2</sub>O]]> | 9 |
总体积 | 25 |
表2荧光定量PCR的反应条件
测试结果详见图3。图3表示miR-378a-5p基因在48对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图。
采用QIAGEN公司合成针对miR-378a-5p基因的探针,并在5’与3’双端分别进行地高辛标记,探针序列如SEQ ID No.2所示。使用300nM制备好的探针对肾透明细胞癌的组织样本于55℃杂交24h。使用生理盐水枸橼酸钠缓冲液洗涤后,使用山羊血清(购于碧云天公司)进行封闭30min,使用anti-DIG-AP Fab fragments(Boster):上样血清体积比为1:400的于4℃杂交过夜。磷酸缓冲液洗涤后,使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂(购于碧云天公司)进行显色反应,使用核固红(购于索莱宝公司)进行核复染,显微镜下判断染色强度。分析结果详见图4。图4表示miR-378a-5p基因在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁的原位杂交差异分析图。
实施例3
检测DAB2IP基因的蛋白质表达水平
采用免疫组织化学法检测DAB2IP基因的蛋白质表达水平。其中,采用免疫组织化学法检测DAB2IP基因的蛋白质表达水平的具体步骤如下:
1)石蜡切片,常规脱蜡至水。
2)体积百分含量为0.3%或3%H2O2的去离子水溶液孵育10-30分钟。
3)蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟。
4)采用抗原修复:微波、高压、酶修复方法。自然冷却,此操作重复3次。
5)血清封闭:室温15-30分钟,尽可能与二抗来源一致。倾去,勿洗。
6)滴加适当比例稀释的一抗,4℃过夜。PBS冲洗,3分钟×5次。
7)滴加生物素标记的二抗,室温或37℃孵育0.5h~1h。
8)PBS冲洗,3分钟×5次。
9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶),室温或37℃孵育0.5h~1h。
10)PBS冲洗,3分钟×5次。
11)显色剂显色。
12)自来水充分冲洗。
13)可进行复染,脱水,透明。
测试结果详见图5。图5表示DAB2IP蛋白质在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁的免疫组化差异分析图。
实施例4
miR-378a-5p与DAB2IP的联合诊断分析
基于90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中miR-378a-5p表达水平、DAB2IP蛋白质表达水平,Spearman(斯皮尔曼)等级相关分析miR-378a-5p基因与DAB2IP蛋白质的表达相关性。分析结果详见图6。图6为DAB2IP与miR-378a-5p在90例肾透明细胞癌组织及其配对组织中呈现正相关。
基于90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中miR-378a-5p表达水平、DAB2IP蛋白质表达水平及二者结合水平,使用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-378a-5p基因、DAB2IP蛋白质作为肾透明细胞癌诊断标志物的潜能。图7为联合检测miR-378a-5p与DAB2IP的受试者工作特征曲线。
从图1-图4可以看出,miR-378a-5p在肾透明细胞癌组织中低表达,可作为该肿瘤的诊断标志物。从图5可以看出,DAB2IP在90例肾透明细胞癌组织中低表达,可作为该肿瘤的诊断标志物。从图6可以看出,DAB2IP与miR-378a-5p在90例肾透明细胞癌组织及其配对组织中呈现正相关,说明二者可以用于联合检测肾癌。从图7可以看出,miR-378a-5p检测的AUC值为0.807,DAB2IP检测的AUC值为0.954,二者结合检测AUC值为0.97,说明miR-378a-5p与DAB2IP二者联合检测对肾透明细胞癌的诊断效能高于miR-378a-5p与DAB2IP之一单独检测对肾透明细胞癌的诊断效能。
综上,miR-378a-5p与DAB2IP较癌旁组织样本,均在肾透明细胞癌的组织样本中呈现显著的低表达,二者表达水平均对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度。联合评估miR-378a-5p与DAB2IP的表达水平,可望提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度。这组联合分子同时具有肾透明细胞癌分子靶向治疗的潜能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 肾癌相关生物标志物及其应用和检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctgactc caggtcctgt g 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cuccugacuc cagguccugu gu 22
Claims (11)
1.miR-378a-5p及DAB2IP蛋白中的至少一种作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
2.miR-378a-5p和DAB2IP蛋白作为生物标志物在制备检测肾癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。
3.一种肾癌检测试剂,其特征在于,包括:检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的肾癌检测试剂,其特征在于,由如下试剂组成:所述检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂及所述检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂。
5.根据权利要求3所述的肾癌检测试剂,其特征在于,所述检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂包括检测miR-378a-5p分子转录水平的引物或能够检测miR-378a-5p分子转录水平的探针。
6.根据权利要求5所述的肾癌检测试剂,其特征在于,检测miR-378a-5p分子转录水平的引物的序列如SEQ ID No.1所示;
检测miR-378a-5p分子转录水平的探针的序列如SEQ ID No.2所示。
7.根据权利要求3所述的肾癌检测试剂,其特征在于,所述检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂为检测DAB2IP蛋白水平的原位杂交检测试剂或者免疫组织化学检测试剂。
8.根据权利要求3-7任一项所述的肾癌检测试剂,其特征在于,所述肾癌为肾透明细胞癌。
9.一种肾癌检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求3-8任一项所述肾癌检测试剂。
10.一种肾癌检测装置,其特征在于,包括权利要求3-8任一项所述肾癌检测试剂或者权利要求8所述的肾癌检测试剂盒。
11.一种生物标志物的含量的检测方法,其特征在于,所述生物标志物为miR-378a-5p和DAB2IP蛋白,所述检测方法包括:
从待测样本中获得测试RNA样品,采用检测miR-378a-5p分子转录水平的试剂检测miR-378a-5p的转录水平含量;
从待测样本中获得组织切片,并检测DAB2IP蛋白表达水平的试剂检测DAB2IP蛋白表达含量。
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