JP7085235B2 - 膵がん診断キット - Google Patents

Description

本発明は、膵がんに対して高い感度と特異性を示すマーカー、当該マーカーを検出する膵がん診断キット、および、当該マーカーを利用して膵がんの進行を評価するための方法に関するものである。

「腫瘍」とは異常に増殖した細胞を指し、その異常増殖の原因が消失あるいは取り除かれても細胞の増殖が持続する状態をいう。腫瘍の中でも良性腫瘍は腫瘍の増殖が遅く、転移はしない。よって、一般的には切除すれば問題は無く、たとえ切除せずに放置しておいても命に別状はないといえる。一方、悪性腫瘍、即ちがんは、良性腫瘍とは異なり急速に増殖する上に、リンパ節や他の臓器に転移して増殖する。よって、例えば外科的手術により除去しても、僅かにでも残留したがん細胞や、既にリンパ節や他の臓器に転移していたがん細胞が再び増殖を開始することがある。よって、がんはいったん治療が終了した後の予後が悪く、各がんにおいては５年後生存率が調査されており、一般的に、治療によりがんが消失したとされてから５年経過後までに再発がない場合がようやく治癒と見なされる。

膵がんは、がんの中で最も予後が悪いといわれている。その原因としては、膵臓が後腹膜臓器であるために早期発見が困難であることに加え、膵がん細胞の運動性がきわめて高いため、例えば２ｃｍ以下の小さながんであっても、周囲の血管、消化管、神経などへすぐに浸潤し、また、近くのリンパ節に転移したり、肝臓などへ遠隔転移したりすることが挙げられる。よって、膵がんの進行を評価することは非常に重要である。

がんの進行を評価するには生検が正確であるが、生検は患者に苦痛を与える。そこで一般的には、予備的にがんマーカーを用いた検査が行われる。がんマーカーとは、がんにより生体内で特異的に産生される物質であり、その体液中量を測定することによりがんの進行を評価することができる。例えば膵がんマーカーとしてはＣＡ１２５、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、エラスターゼ１、ＳＬＸ、ＳＴＮが使われており、ＣＡ１９－９が最も一般的である。

しかし従来のがんマーカーも、感度や特異性などの面で完全なものはないことから、より優れたがんマーカーの研究が行われている。最近は、例えば特許文献１に記載の発明のように、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）をがんマーカーとして開発することが盛んである。

特開２０１５－５１０１１号公報

上述したように、がんマーカーは実際の臨床でも用いられているが、より高い感度や特異性を示すマーカーは常に求められている。例えば、特許文献１に記載のマーカーは「乳がんを除くがん」を対象とするものであり、この点で特異性は低いといえる。

そこで本発明は、膵がんに対して高い感度と特異性を示すマーカーを提供することを目的とする。また、本発明は、当該マーカーを検出する膵がん診断キット、および、当該マーカーを利用して膵がんの進行を評価するための方法を提供することも目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、膵がん細胞に特徴的な葉状仮足に集積するＲＮＡのうち特定のものが膵がんマーカーとして極めて有用であることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。

［１］ ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡからなる群より選択される１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする膵がんマーカー。

［２］ 下記塩基配列１～３のいずれかを有する上記［１］に記載の膵がんマーカー。
塩基配列１： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列；
塩基配列２： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列において、１以上１０以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、膵がん患者の体液中に見出されるＲＮＡの塩基配列；
塩基配列３： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、膵がん患者の体液中に見出されるＲＮＡの塩基配列。

［３］ 特定のＲＮＡを検出するための膵がん診断キットであって、
上記ＲＮＡが、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡからなる群より選択される１種または２種以上の組み合わせであり、
上記ＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列の一部に相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに、
ＰＣＲにより合成される二本鎖ＲＮＡに結合する蛍光インターカレーター、および、上記ＲＮＡの塩基配列の一部の相補配列を有する蛍光プローブから選択される少なくとも一方の蛍光化合物を含むことを特徴とする膵がん診断キット。

［４］ 上記塩基配列の一部に相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列が、それぞれ、配列番号２と配列番号３、配列番号５と配列番号６、配列番号８と配列番号９、配列番号１１と配列番号１２、配列番号１４と配列番号１５、配列番号１７と配列番号１８、配列番号２０と配列番号２１、配列番号２３と配列番号２４、および、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列の組み合わせからなる群より選択される１または２以上である上記［３］に記載の膵がん診断キット。

［５］ 膵がんの進行を評価するための方法であって、
ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７１Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡからなる群より選択される１種または２種以上の組み合わせの試料中の量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。

［６］ 上記試料として血液試料を用いる上記［５］に記載の方法。

［７］ 上記ＲＮＡの量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで測定する上記［５］または［６］に記載の方法。

本発明に係る膵がんマーカーは、膵がん細胞に特徴的な葉状仮足に集積するＲＮＡである。また、ＲＮＡではあっても、エクソソームに内包された状態で膵がん細胞外へ放出されることが本発明者により見出されている。よって、本発明に係る膵がんマーカーを検出対象とすれば、高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価できることから、本発明マーカーは、ＣＡ１９－９など従来の腫瘍マーカーにとって代わり得るものであるといえる。

図１は、血液中のＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。各群の中央値は、膵がん患者群で１５．１９（２．４４～１７５．８１，４分位範囲：１５．０２）、非膵がん患者群で６．５２（０．５～１２．４１，４分位範囲：４．５１）である。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られた膵がん患者群と非膵がん患者群との間で相対質量に有意差があるかをマン・ホイットニ Ｕ検定で検討したところ、ｐ＝０．００８６７３で有意差を認めた。 図２は、膵がん細胞内におけるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡの所在を確認するための蛍光写真である。（１）はＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ（緑色）の存在を示す蛍光写真であり、（２）はエクソソームマーカーであるＣＤ６３（赤色）の存在を示す蛍光写真であり、（３）は核（青色）の存在を示す蛍光写真に（１）と（２）の蛍光写真を重ね合わせた写真である。 図３は、血液中のＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図４は、血液中のＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図５は、血液中のＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図６は、血液中のＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図７は、血液中のＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図８は、血液中のＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図９は、血液中のＡＲＦ６ ｍＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１０は、血液中のＶＡＶ３ ｍＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１１は、血液中のＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡをワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１２は、マーカーとしてＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを用いた場合のＲＯＣ曲線である。 図１３は、従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９単独、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４Ｂとの組み合わせ、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４ＢとＣＡ１９．９との組み合わせを膵がんの診断に用いた場合のＲＯＣ曲線である。 図１４は、ＵＩＣＣステージごとの血液中のＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１５は、ＵＩＣＣステージごとの血液中のＡＲＦ６ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１６は、ＵＩＣＣステージごとの血液中のＶＡＶ３ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１７は、ＵＩＣＣステージごとの血液中のＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１８は、ＵＩＣＣステージごとの血液中のＣＡ１９－９をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフである。 図１９は、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中のＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線である。 図２０は、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中のＡＲＦ６ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線である。 図２１は、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中のＶＡＶ３ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線である。 図２２は、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中のＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線である。 図２３は、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中のＣＡ１９－９をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線である。

１． 膵がんマーカー
本発明に係る膵がんマーカーは、膵がん細胞の葉状仮足に集積する特定のＲＮＡである。当該ＲＮＡを検出対象とすることにより、高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価することができる。

本発明に係る膵がんマーカーは、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡから選択される。本発明に係る膵がんマーカーは、これらから１種のみ選択してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。２種以上の上記ＲＮＡを組み合わせることによって、より高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価できる可能性がある。

膵がん細胞は運動性が高く転移し易いという特徴を有しており、葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）という細胞の運動性に関与する突起部位を有する。本発明に係るマーカーである特定のＲＮＡは、膵がん細胞の葉状仮足に集積している。しかも、上記ＲＮＡは、エクソソームに内包された状態で膵がん細胞外へ放出されることが本発明者により見出されている。よって、被験者の体液試料における上記ＲＮＡ量を測定することにより、膵がんの進行を高い感度と特異性をもって評価することが可能である。

さらに、現在、膵がんマーカーとして主に使用されているＣＡ１９－９は、膵がんなどの進行に伴って増加する細胞膜糖脂質由来の糖鎖に対する抗体であるので、早期膵がんや小さな膵がんに対する感度が低いのに対して、本発明に係る膵がんマーカーは上記のとおり膵がん細胞に特徴的なＲＮＡであることから、早期膵がんや小さな膵がんに対しても高い感度を示す可能性がある。

本発明に係るマーカーの一つであるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡに加え、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡも、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡと同様に膵がん細胞の葉状仮足に集積し、エクソソームに内包された状態で膵がん細胞から分泌され、また、予備的実験によりＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡと同様の効果が確認されていることから、膵がんマーカーとして有用であると考えられる。

本発明マーカーであるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡは、一般的に、それぞれ配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５の塩基配列を有する。体液中に見出される上記ＲＮＡは、膵がん患者によっては、上記塩基配列に加えて別の配列を有していたり、上記塩基配列の一部に変異が生じている可能性がある。即ち、本発明範囲には、ＲＮＡが以下の塩基配列を有する場合が含まれるものとする。

塩基配列１： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列；
塩基配列２： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列において、１以上１０以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、膵がん患者の体液中に見出されるＲＮＡの塩基配列；
塩基配列３： 配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなる群より選択される１または２以上の塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、膵がん患者の体液中に見出されるＲＮＡの塩基配列。

上記塩基配列２において、欠失、置換および／または付加の数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下または４以下がより好ましく、２以下がよりさらに好ましい。上記塩基配列３における配列同一性としては、９６％以上または９８％以上が好ましく、９９％以上がより好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がよりさらに好ましい。なお、ｓｎｏＲＮＡに比べてｍＲＮＡは塩基数が多いため、ｓｎｏＲＮＡとｍＲＮＡとの間で上記変異数や配列同一性が異なっていてもよいものとする。例えば、ｓｎｏＲＮＡに比べて、ｍＲＮＡの上記変異数は多くてもよく配列同一性は低くてもよい。

上記塩基配列２および塩基配列３において、欠失、置換および／または付加の有無や位置、並びに配列同一性は、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。

但し、膵がん細胞の葉状仮足に集積するＲＮＡに関する研究例は少なく、これまで本発明に係るｍＲＮＡとｓｎｏＲＮＡが上記塩基配列以外の塩基配列を有するとの報告は無いので、本発明に係るＲＮＡの塩基配列は、上記の配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２５からなることが好ましい。

なお、以下において、本発明に係る配列番号１の塩基配列を有するＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡの説明は、その他の上記ＲＮＡにもあてはまるものとする。

なお、本発明において上記「感度」とは、膵がんに対する感度であって、例えば、上記ＲＮＡを検出対象とした場合に膵がん患者が陰性と判断される確率が低いことをいう。また、本発明において上記「特異性」とは、膵がんに対する特異性であって、上記ＲＮＡの量と膵がんの有無との間に強い相関性がある一方で、上記ＲＮＡの量が、膵がん以外のがん種のみならず、膵のう胞性腫瘍（ＩＰＭＮ）など良性の膵臓腫瘍の有無との相関性が無いか或いは低いことをいう。

２． 膵がんの進行の評価方法
次に、上記膵がんマーカーを検出対象とする、膵がんの進行の評価方法を、工程毎に説明する。なお、本発明における「膵がんの進行の評価」には、膵がんの進行度合いの評価の他に、膵がんの有無の判断も含むものとする。

（１） 試料の取得工程
本工程では、被験者から試料を取得する。ここでの試料とは、血液、リンパ液、尿など被験者の体液に加えて、血清や血漿など、採取した体液を処理したものをいう。

本工程で用いる試料としては、血液試料が好ましい。血液試料は、上記の血液自体、血清または血漿をいう。

（２） ＲＮＡ量の測定工程
本工程では、上記ｍＲＮＡおよび／またはｓｎｏＲＮＡの採取試料中の量を測定する。測定する量としては、所定量の試料中における上記ＲＮＡの絶対量のみならず、試料中における上記ＲＮＡの濃度であってもよい。

測定手段としては、試料中の上記ＲＮＡの量を測定できるものであれば特に制限されない。例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ解析、ノーザンブロットなどを挙げることができる。これらは常法により実施することが可能である。上記測定手段の中では、低コストで簡便に実施可能であることからリアルタイムＲＴ－ＰＣＲが特に好ましい。以下、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにつき代表的に説明する。

（２－１） 逆転写反応
本発明では、試料中の上記ＲＮＡの量を測定するので、ＰＣＲを行うには、先ず、逆転写反応により試料中の上記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する必要がある。

逆転写反応で用いるプライマーとしては、本発明に係る上記ＲＮＡを全長にわたって逆転写するためのオリゴｄＴプライマーもしくはランダムプライマー、または、続くＰＣＲで用いる遺伝子特異的プライマーのうちリバースプライマーを用いることができる。なお、後記のワンステップＲＴ－ＰＣＲの場合には、本発明に係る上記ＲＮＡに対する特異的なリバースプライマーを用いる必要がある。

本工程では、本発明に係る上記ＲＮＡに特異的なプライマーを用いて当該ＲＮＡを逆転写する。逆転写反応の条件は、常法に従えばよい。

（２－２） リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ
次に、本発明に係る上記ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを鋳型として用い、リアルタイムＰＣＲを行う。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲとしては、逆転写反応とＰＣＲをワンポットで連続して行うワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲと、逆転写反応の反応液を別の反応器に分注してＰＣＲを行うツーステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲとがある。

ツーステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲに比べて反応性が良いとされている。一方、ワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、逆転写反応とＰＣＲをワンポットで連続的に行うため、多くの試料につき効率的に測定を行うことが可能である。

リアルタイムＰＣＲで用いるプライマーは、上記ＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列の一部に相補的なものであり、上記ＲＮＡの全部または一部に対応するｃＤＮＡを増幅可能なものを設計する。例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および／または配列番号２５の塩基配列に特徴的な塩基配列を増幅できるものを設計する。また、一般的には、増幅されるＤＮＡのサイズが８０ｂｐ以上１５０ｂｐ程度となるプライマーセットを用い、各プライマーの長さを１７塩基以上２５塩基以下程度とすることが好ましい。増幅されるＤＮＡのサイズが８０ｂｐ以上１５０ｂｐ程度であれば、高い増幅効率が得られ、各プライマーの長さが１７塩基以上２５塩基以下程度であれば、十分な特異性が確保でき且つ合成も容易である。さらに、プライマー内での二次構造の形成やプライマー間の相補鎖形成を防ぐためにプライマー内部やプライマー間で３塩基以上相補しないようにしたり、フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値をそろえたり、ＢＬＡＳＴ検索などにより各プライマーの特性を確認することも重要である。

本発明に係る膵がんマーカーの一つであるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを検出するために用いられる好適なプライマーとしては、配列番号２（フォワードプライマー）および配列番号３（リバースプライマー）の塩基配列を有するプライマーを挙げることができる。また、その他の本発明に係る上記ＲＮＡを定量する場合には、配列番号５と配列番号６、配列番号８と配列番号９、配列番号１１と配列番号１２、配列番号１４と配列番号１５、配列番号１７と配列番号１８、配列番号２０と配列番号２１、配列番号２３と配列番号２４、および、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列を有するプライマーを好適に用いることができる。フォワードプライマーとリバースプライマーのセットとしては、上記組み合わせから１種のみ選択してもよいし、２種以上を選択してもよい。

本発明では、上記ＲＮＡの量に加えて、従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９の量も合わせて測定することによって、より高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価できる可能性がある。また、本発明では、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡとＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡとの組み合わせなど、上記ＲＮＡの中から特定の２種以上の量を測定することによって、より高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価できる可能性がある。よって、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおいて、２種以上のＲＮＡの量を同時に測定することが好ましい。その場合には、逆転写反応において、２種以上のＲＮＡの量を測定するためのリバースプライマーのうちより３’末端側のリバースプライマーを用いるか、或いは、ツーステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行う場合には、逆転写反応においてオリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーを用いて目的のＲＮＡの全長を逆転写する必要がある。

リアルタイムＰＣＲでは、増幅産物の量を蛍光強度により測定する。よって、ＰＣＲにより合成される二本鎖ＲＮＡに結合する蛍光インターカレーター、または、増幅すべきＤＮＡの塩基配列の一部の相補配列を有する蛍光プローブの存在下で反応を行う。

蛍光インターカレーターは、蛍光標識基を有し、且つＰＣＲにより生成する二本鎖（鋳型ＤＮＡとプライマーとの二本鎖や、伸張途中の二本鎖を含む）に結合する化合物である。蛍光インターカレーターとしては、例えば、タカラバイオ社のＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎシリーズを挙げることができる。

リアルタイムＰＣＲで用いられる蛍光プローブは、鋳型ＤＮＡの一部に相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一端に蛍光標識基を有し、他端にクエンチャー基を有する化合物であり、主に３つのタイプがある。１つは、単独で存在する場合およびプライマーのアニーリングと共に鋳型ＤＮＡと二重鎖を形成する場合にはクエンチャー基により蛍光を示さないが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により伸張反応時に分解されると、蛍光標識部分が遊離して蛍光が発せられるタイプである。もう１つは、ステムループ構造を有するものであり、単独で存在する場合には蛍光発色基とクエンチャー基が近接するために蛍光を示さないが、プライマーのアニーリングと共に鋳型ＤＮＡと二重鎖を形成すると、蛍光発色基とクエンチャー基が離れるため蛍光を示すタイプである。もう１つは、単独で存在する場合およびプライマーのアニーリングと共に鋳型ＤＮＡと二重鎖を形成する場合にはクエンチャー基により蛍光を示さないが、プライマーのアニーリング後、ＲＮａｓｅ Ｈの作用により切断され、蛍光発色基を有する部分が遊離して蛍光を示すようになるタイプである。

蛍光インターカレーターを用いるかまたは蛍光プローブを用いるか、或いはいかなるタイプの蛍光プローブを用いるかなどは、測定対象であるＲＮＡの量に対応するＤＮＡの検出感度などに応じて適宜決定すればよい。

リアルタイムＰＣＲでは、検出対象の量とＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）との間で検量線を事前に作成しておき、測定試料の増幅曲線上の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に対応するＣｔ値から、測定試料中における検出対象の量を求める。

本発明では、本発明に係る膵がんマーカーである上記ＲＮＡにつき様々な濃度の水溶液を調製し、各水溶液につきリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行ってサイクル数に対する蛍光強度から増幅曲線を求める。次に、適切な閾値を定め、各増幅曲線と閾値とが交わるＣｔ値を求める。得られたＣｔ値と各溶液の標的ＲＮＡ濃度との間には直線関係があるため、検量線を作成することができる。次いで、同様の条件で試料につきリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い、同様にＣｔ値を求め、検量線から測定試料中の標的ＲＮＡの量を求める。

（３） 判断工程
上記工程で得られた標的ＲＮＡ量から、膵がんの進行を評価する。実際には、膵がん患者および非膵がん患者、さらには様々な進行度の膵がん患者から試料を得、同一条件でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行って試料中の標的ＲＮＡ量を測定しておき、データを蓄積しておく。かかる蓄積データと、測定結果を照らし合わせ、被験者における膵がん有無や、膵がんの進行度を判断する。

３． 膵がん診断キット
本発明に係る膵がん診断キットは、上記の膵がんの進行評価方法で用いることができる。より詳しくは、上記ＲＮＡを検出するためのものであり、検出すべきＲＮＡに特徴的な塩基配列を増幅するための上記フォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに、上記蛍光インターカレーターまたは蛍光プローブを有する。

本発明に係る膵がん診断キットも、２種以上の上記ＲＮＡの量を測定するものであるものが好ましく、また、ＣＡ１９－９の量も合わせて測定できるものも好ましい。２種以上の上記ＲＮＡの量を測定したり、また、上記ＲＮＡの１種以上とＣＡ１９－９の量を合わせて測定することによって、より高い感度と特異性をもって膵がんの進行を評価でき得る。例えば、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡの量に加えて、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡの量や、さらに従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９の量も合わせて測定するために、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを定量するための配列番号２と配列番号３の塩基配列を有するプライマーセットと、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡを定量するための配列番号５と配列番号６の塩基配列を有するプライマーセット、および、これら増幅されたＤＮＡの量を定性的または定量的に求めるための蛍光化合物セットを有するもの、さらにＣＡ１９－９の定量用キットを有するものも好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

実施例１
日本膵臓学会の膵がん取扱い規約に基づいて分類したステージＩ～ＩＩＩの膵がん患者５名、ステージＩＶの膵がん患者１３名、および、慢性肝炎、大腸ポリープまたは胃ポリープを有するが膵がんを有さない非膵がん患者１２名に本実験の趣旨を説明し、同意を得て、採血した。次いで、３段階遠心分離法により速やかに血清を得た。得られた血清は、以下の実験開始まで、専用の冷凍庫に保管した。

ＢＬＡＳＴ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを用い、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡに特異性の高いプライマーセットを設計した。さらに、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを鋳型にしたワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い、当該プライマーセットにより、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡが特異的に増幅されることを予備的に確認した。

上記血清試料の一部（１００μＬ）から、Ｎｏｒｇｅｎ社のキットを用いて、エクソソームに含まれるｍＲＮＡを精製した。精製されたｍＲＮＡ、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡに特異的なプライマーセット（配列番号２，３）、およびワンステップＲＴ－ＰＣＲキット（タカラバイオ社「Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ」）を用い、ワンステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡに特異的な塩基配列を増幅した。膵がん患者群と非膵がん患者群から得た血清試料におけるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡの相対質量を図１に示す。

図１に示す結果につきマン・ホイットニ Ｕ検定を行ったところ、ｐ＝０．００８６７３で膵がん患者群－非膵がん患者群間に有意差が認められた。なお、膵がん細胞におけるＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡの存在（緑色部分）を示す蛍光写真を図２（１）に、エクソソームマーカーであるＣＤ６３の存在（赤色部分）を示す蛍光写真を図２（２）に、これら蛍光写真と核染色試薬であるＤＡＰＩの存在を示す蛍光写真を重ね合わせたものを図２（３）に示す。緑色と赤色を混合すると黄色となることから、これら蛍光写真により、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡがエクソソームに局在していることを確認することができる。

比較例１
非膵がん患者には保険診療でのがんマーカーＣＡ１９－９の測定が認められていないため、膵がん患者（１８名）のみにＣＡ１９－９測定を行った。結果を表１に示す。なお、ＣＡ１９－９値が３７超である場合が異常値である。

実施例２
上記実施例１のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで得られたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線において、診断能評価の指標の一つであるＡＵＣ値は０．７９であった。論文報告によれば、ＣＡ１９－９のＡＵＣ値は０．７～０．８であり、本発明方法によるＡＵＣ値はＣＡ１９－９と同等またはそれ以上であると考えられる。上記測定結果においては、得られたＲＯＣ曲線から閾値を７．９８とした。閾値を７．９８とした場合のχ2検定の結果を表２に示す。

上記比較例１の実験結果において、ＣＡ１９－９の感度は５５．５６であった。それに対して、上記結果のとおり、膵がんマーカーとしてＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを用いた場合の感度は７２．２２と、ＣＡ１９－９を上回っていた。なお、非膵がん患者群に対してはＣＡ１９－９測定を行っていないため、特異度の比較は行っていない。

実施例３
上記実施例１で得られた膵がん患者群の血清中ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ相対質量と、比較例１のＣＡ１９－９値との間の相関性を、スピアマン順位相関数検定により解析した。結果を表３に示す。

表３に示す結果のとおり、ｐ＝０．３９であり、両者に相関は無かった。従って、本発明方法においてＣＡ１９－９を併用することにより、正診率を向上させることができる可能性があるといえる。その他、本発明方法の結果における被験者の年齢や性別に関して検定を行ったが、年齢や性別に関して有意差はなかった。

実施例４
ＵＩＣＣ（国際対がん連合）分類による２０症例の膵がん患者（ステージＩＩＡ：２名，ＩＩＢ：４名，ＩＩＩ：６名，ＩＶ：８名）、慢性肝炎、大腸ポリープまたは胃ポリープを有するが膵がんを有さない非膵疾患患者３０名、およびＩＰＭＮ患者１３名を対象とし、上記実施例１と同様にして、患者群間における血清試料中における特定のｍＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡの相対質量を求めた。ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ（配列番号１）の検出には配列番号２，３のプライマーセットを用い、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号４）の検出には配列番号５，６のプライマーセットを用い、ＳＮＯＲＡ２５ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号７）の検出には配列番号８，９のプライマーセットを用い、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号１０）の検出には配列番号１１，１２のプライマーセットを用い、ＳＮＯＲＤ２２ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号１３）の検出には配列番号１４，１５のプライマーセットを用い、ＳＮＯＲＡ７４Ａ ｓｎｏＲＮＡ（配列番号１６）の検出には配列番号１７，１８のプライマーセットを用い、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ（配列番号１９）の検出には配列番号２０，２１のプライマーセットを用い、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡ（配列番号２２）の検出には配列番号２３，２４のプライマーセットを用い、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡ（配列番号２５）の検出には配列番号２６，２７のプライマーセットを用いた。

それぞれの結果を図３～１１に示す。なお、図３～１１中、「＊」はマン・ホイットニ Ｕ検定により、ｐ＜０．０５で膵がん患者群－非膵がん患者群間に有意差が認められることを示す。また、各マーカーの具体的なｐ値を表４に示す。

図３～１１および表４に示す結果の通り、上記ｍＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡをマーカーとして用いれば、膵がんを有意に検出することができる。

比較例２
上記実施例４の対象とした各患者群の血清試料のＣＡ１９－９測定を行った。膵がん患者群（２０名）の結果を表５に、コントロール非膵疾患患者群（３０名）の結果を表６に、ＩＰＭＮ患者群（１３名）の結果を表７に示す。なお、ＣＡ１９－９値が３７超である場合が異常値である。

表５～７に示す結果によれば、進行膵がん患者でもＣＡ１９－９値が小さい例や、非膵疾患患者およびＩＰＭＮ患者でもＣＡ１９－９値が大きい例が認められ、ＣＡ１９－９の感度は６０、特異度は８１であった。

実施例５
上記実施例４の標的ｍＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲに対する実験結果よりＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を作成し、診断能評価の指標の一つであるＡＵＣ値をそれぞれ求めた。マーカーとしてＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡを用いた場合のＲＯＣ曲線を代表的に図１２に示す。また、マーカーとして各ｍＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを用いた場合のコントロールと膵がんを比較したＡＵＣ値を表８に示す。

論文報告によれば、ＣＡ１９－９のＡＵＣ値は０．７～０．８であり、本実験では０．８１０であった。ＡＵＣ値に関し、ＡＲＦ６とＷＡＳＦ２はＣＡ１９－９に対してｐ＜０．０５で有意に勝っており、他のＲＮＡはＣＡ１９－９と同等であると考えられる。したがって、本発明に係るｍＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡは、ＣＡ１９－９と同等またはそれ以上に高い感度と特異性で膵がんを診断できる血清マーカーに成り得ることが示された。

また、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡをマーカーとして用いて得られたＲＯＣ曲線から、膵がん診断に関する閾値を定めてχ²検定を行った。感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率の結果を表９に示す。

上記比較例２の実験結果において、ＣＡ１９－９の感度は６０、特異度は８１であった。それに対して、上記結果のとおり、膵がんマーカーとしてＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡを用いた場合、いずれも特異度は７５以上であり、すべてのｍＲＮＡの感度はＣＡ１９－９を上回っていた。特に、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡ、ＶＡＶ３ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡの陽性適中率は９０％以上であり、ＣＡ１９－９より高い感度と特異性で膵がんを診断できるマーカーになり得ることが示された。

また、上記実施例３と同様に、ＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡ以外のマーカーの結果についてもスピアマン順位相関数検定により解析したところ、すべてＣＣＤＣ８８Ａ ｍＲＮＡと同様の結果であり、ＣＡ１９－９との関連性はなかった。

実施例６
複数のＲＮＡマーカーとＣＡ１９－９を組み合わせることにより高い感度と特異性をもって膵がんを診断できる可能性がある。従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９単独、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４Ｂとの組み合わせ、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４ＢとＣＡ１９．９との組み合わせを膵がんの診断に用いた場合のＲＯＣ曲線を図１３に示す。図１３に示す結果の通り、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４Ｂをマーカーとして組み合わせることにより、ＣＡ１９－９単独よりもＡＵＣ値が高値であり、高い感度と特異度で膵がんを診断できることが明らかとなった。さらには、ＣＣＤＣ８８ＡとＳＮＯＲＡ１４ＢをＣＡ１９－９と組み合わせることにより、ＣＡ１９－９単独に比較して、ｐ＝０．０１０８で有意に高い感度と特異性で診断できることが明らかになった。

実施例７
本発明で膵がんマーカーとして利用するｍＲＮＡであるＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＲＦ６、ＶＡＶ３およびＷＡＳＦ２は、ＵＩＣＣステージＩおよびＩＩの膵臓内に腫瘍がとどまる膵がん症例において、ＣＡ１９－９に比較して診断能が優れている傾向があった。血清中のＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＲＦ６、ＶＡＶ３およびＷＡＳＦ２をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで測定した。ＵＩＣＣステージごとの血液中の上記各ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフを図１４～１７に、また、ＣＡ１９－９値を図１８に示す。また、ステージＩＩＡとＩＩＢの膵がん症例とコントロール群の血液中の上記各ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量解析した結果を示すグラフとＲＯＣ曲線を図１９～２２に、また、ＣＡ１９－９値とＲＯＣ曲線を図２３に示す。

ステージＩ～ＩＩの膵がん症例は、ステージＩＩＩ～ＩＶの症例に比較して手術後の生命予後は良好であり、ステージＩ～ＩＩの段階で膵がんを診断できることは臨床的な意義が大きい。図１４～２３の通り、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＡＲＦ６、ＶＡＶ３およびＷＡＳＦ２によるＵＩＣＣステージＩ～ＩＩの膵がんの診断能はＣＡ１９－９に比べて高い可能性があり、将来の検診における利用が可能であることを示唆する結果を得た。

Claims (5)

1. 特定のＲＮＡを検出するための膵がん診断キットであって、
   上記ＲＮＡが、ＡＲＦ６ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡからなる群より選択される１種または２種以上の組み合わせであり、
   上記ＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列の一部に相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに、
   ＰＣＲにより合成される二本鎖ＲＮＡに結合する蛍光インターカレーター、および、上記ＲＮＡの塩基配列の一部の相補配列を有する蛍光プローブから選択される少なくとも一方の蛍光化合物を含むことを特徴とする膵がん診断キット。
2. 上記塩基配列の一部に相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列が、それぞれ、配列番号２０と配列番号２１、および、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列の組み合わせからなる群より選択される１または２以上である請求項１に記載の膵がん診断キット。
3. 膵がんの進行を評価するための方法であって、
   ＡＲＦ６ ｍＲＮＡおよびＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡからなる群より選択される１種または２種以上の組み合わせの試料中の量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
4. 上記試料として血液試料を用いる請求項３に記載の方法。
5. 上記ＲＮＡの量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで測定する請求項３または４に記載の方法。

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