CN110241209A - 一种引物、试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种引物、试剂盒及用途。所述引物包括：5’末端的通用扩增引物序列、3’末端的与靶向DNA基因组序列互配的特异性引物序列，以及位于5’端和3’端中间的随机分子条码序列。利用本发明的引物可以有效地对循环肿瘤DNA分子加上分子条码，从而大大地提高循环肿瘤DNA的检测灵敏度。同时，本发明是针对原始循环肿瘤DNA分子进行加分子条码，也使得测定其绝对数量成为可能。本发明对于提高循环肿瘤DNA的检测灵敏度，有着非常重要的意义和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及癌症相关领域。具体涉及一种引物、试剂盒及用途。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)在全球是造成人类死亡的主要原因之一。遗憾的是，绝大多数癌症，一旦被查出，都已经是比较晚期，即肿瘤多数已经扩散，而肿瘤扩散是最终造成死亡的主因。因此，如果能够在肿瘤转移前，就能够发现并有针对性地进行治疗，将能大大地降低肿瘤给人类健康带来的威胁。在众多的肿瘤细胞标志物中，循环肿瘤DNA，即ctDNA，属于最灵敏也最可靠的。关于ctDNA的检测，大体上可以分为两大类：基于PCR(聚合酶链式反应)技术的检测方法，和基于NGS(高通量二代测序)技术的检测方法。NGS技术产生的信息量大，但缺点是误读率高，因此需要对每个分子加上分子条码，以去除这些误读带来的假阳性结果。目前，国际上流行的加条码方法，基本上全部依赖于直接连接的方法，即在目标分子的末端连上一段带有分子条码的序列，然后再构建NGS文库。直接连接法加分子条码的最大缺点是连接效率很低，所以需要在连接前低度扩增。即使如此做，其效率也只有不到20％，因此大大地降低了检测的灵敏度，同时因为低度扩增中，因为每个分子被扩增的不均一性，而破坏了ctDNA的比例。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的第一个目的在于提供了一种引物，该引物可以作为分子条码添加到特定的DNA分子上。
本发明的第二个目的在于提供一种包含上述引物的试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供一种上述引物在制备用于提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方案的试剂中的用途。
本发明利用带有分子条码的引物，与目标DNA进行配对，随后进行一轮DNA合成，使得目标DNA的序列信息，被转移到带有分子条码的新的DNA链上，能够同样达到添加分子条码的目的，关键是加上分子条码的ctDNA分子的比例达到平均70％。
为实现上述第一个目标，本发明采用了如下的技术方案：
一种引物，所述引物包括：5’末端的通用扩增引物序列、3’末端的与靶向DNA基因组序列互配的特异性引物序列，以及位于5’端和3’端中间的随机分子条码序列。
优选地，所述引物的5’末端包括17-25个核苷酸长的通用扩增引物序列。
优选地，所述引物的3’末端包括17-25个核苷酸长的特异性引物序列，所述特异性引物与靶向DNA基因组序列互配。
优选地，所述引物包括12-16个核苷酸长的随机分子条码序列。
为实现上述第二个目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的试剂盒，所述试剂盒包含如上任一所述的引物。
为实现上述第三个目标，本发明采用如下的技术方案：
如上所述的引物在制备用于提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方法的试剂中的用途。
其中，所述提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方法包括：
设计合成分子条码添加引物；
将所述分子条码添加引物添加到循环肿瘤DNA中；
启动DNA延伸反应；
消除未添加到循环肿瘤DNA中的游离的分子条码添加引物；
用PCR方法特异扩增已经含有分子条码添加引物的循环肿瘤DNA构建高通量序列文库；
对高通量序列文库进行测序，其中带有相同分子条码的序列被划分在同一序列族中，对每一序列族进行分析，得出结果。
上述“分子条码添加引物”用于启动DNA延伸反应，需要设计一系列的分子条码添加引物。
优选地，所述分子条码添加引物包含12-16个核苷酸长的随机分子条码序列，此为独一无二的分子条码。
优选地，所述分子条码添加引物的5’末端，包含20个核苷酸长的通用扩增引物(UBAA)。
优选地，所述分子条码添加引物的3’末端，包含20个核苷酸长的特异性引物，所述特异性引物与所述循环肿瘤DNA基因组序列互配。
优选地，将所述分子条码添加引物添加到循环肿瘤DNA中的方法为：将分子条码添加引物与循环肿瘤DNA进行混合，加入镁离子和聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后缓慢退火，使得所述分子条码添加引物和靶向的循环肿瘤DNA分子有效配对结合。
优选地，所述分子条码添加引物与循环肿瘤DNA的加入比例为100-100,000：1；所述镁离子的浓度范围为3-5mM。
优选地，所述聚合酶为例如Phusion聚合酶等高保真聚合酶。
优选地，所述加热后缓慢退火是指：在96℃处理2分钟，之后按照每15-30秒下降1℃或2℃的速度进行降温。
其中，用touch-up方法合成互补循环肿瘤DNA分子链。优选的合成条件为从51℃开始每10秒提高3℃直到72℃。
优选地，消除未添加到循环肿瘤DNA中的游离的分子条码添加引物的方法，是指向体系中引入抑制寡聚DNA，所述抑制寡聚DNA能够与游离的分子条码添加引物有效配对结合，使得游离的分子条码添加引物的3’末端发生扩展。
本发明通过添加一系列的“抑制寡聚DNA”用来抑制条码添加后多余的分子条码添加引物。
优选地，所述抑制寡聚DNA包含两部分：3’末端的与所述分子条码添加引物的3’末端完全互补的10-16个核苷酸长度的序列；5’末端的随机的8-15个核苷酸长度的序列；所述随机的核苷酸序列与所述循环肿瘤DNA不匹配。
优选地，将所述抑制寡聚DNA用于阻断游离的分子条码添加引物的作用的反应条件为：将所述抑制寡聚DNA添加到含有分子条码添加引物和循环肿瘤DNA的反应体系中，在82-86℃处理1-2分钟，之后从48℃开始按照每5-30秒升高3℃的速度进行升温直到72℃。
优选地，将上述“在82-86℃处理1-2分钟，之后从48℃开始按照每5-30秒升高三度的速度进行升温直到72℃”设为一个循环，所述方法包括至少30-35个所述循环。
优选地，所述抑制寡聚DNA的添加量为所述分子条码添加引物的5-50倍。
其中的只需一轮的条码添加反应，多余的条码添加引物的抑制反应，以及NGS文库的构建反应，全部在一个小管里完成。
本发明中的DNA样品在添加条码以前，不需要任何PCR扩增，或者其它的处理反应，因此原始的ctDNA分子被用于添加分子条码。
并且假设所述的分子条码添加引物包含13个核苷酸长的随机分子条码序列，那么该13个核苷酸长的随机分子条码，其总数为4的13次方，即总共有6千4百万种不同的组合，从而保证了每个ctDNA分子标记上的分子条码都不一样。
本发明中的DNA样品，在NGS文库构建以前，不需要任何的纯化步骤，因此在最终的NGS文库中保留了所有的ctDNA分子。
优选地，NGS文库构建的PCR产物，用琼脂糖电泳进行分离纯化。
本发明的方法适合多个基因组区域的测定，原则上没有数量限制，只要设计的引物组合，互相之间不干扰。
其中的NGS文库可以是“多路复用的”，即来自不同样品的NGS文库可以混合在一起，然后用同一个NGS反应进行多样品的分析。
其中的ctDNA分子，加上了分子条码后，可以去除NGS过程中产生的误读。
本发明的方法中，带有同样分子条码的多个NGS序列，被认为是来自同一个ctDNA分子，可以用来组建一个小序列族。
针对每一个小序列群，用生物信息学方法获得一个“一致序列”，其中的每个位置的核苷酸，根据在小序列族里出现频率最高的为准。
有益效果
本发明方法具备以下特点：首先，它可以高效地对每个ctDNA分子添加独特的分子条码；第二，因为原始的ctDNA分子被加上分子条码，能够很容易地测量ctDNA的绝对数量；第三，每个ctDNA分子携带一种独特的分子条码，能有效地抑制随机发生的测序误读；第四，在准备NGS文库之前，没有必要进行净化或清洁步骤，大大减少了ctDNA样品的损失，从而相应地提高了检测灵敏度；第五，可以很容易地在同一个NGS文库中使用多个样本，从而进行多路复用分析。
附图说明
图1示出了本发明的分子条码添加引物(BAP)的设计示意图。
图2示出了本发明在ctDNA分子上添加分子条码添加引物的示意图。
图3示出了本发明中的抑制寡聚DNA与游离BAP的作用原理示意图。
图4示出了本发明中利用抑制寡聚核DNA消除游离BAP的过程示意图(左)以及对比试验过程示意图(右)。
图5示出了本发明中测定分子条码添加引物的添加效率的实验设计示意图。
图6A-图6C示出了本发明的ctDNA添加分子条码的效率测定结果图。图6A显示出已经添加了分子条码的循环肿瘤DNA的数量，图6B显示出添加分子条码时用的循环肿瘤DNA的总数，图6C显示出阴性对比实验中已经添加了分子条码的循环肿瘤DNA的数量。
图7示出了本发明测定结果中显示预计的带有相同分子条码的序列族示意图。
图8示出了本发明检测的ctDNA分子上的突变结果图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。在这些附图中，对于相同或者相当的构成要素，标注相同标号。以下仅为本发明的最佳实施方式，本发明并不仅限于下述内容。
实施例
附图中的数字所代表的含义为：
1-正链，2-负链，3-分子条码添加引物(BAP)，31-20核苷酸长的基因组特异的引物，32-13个核苷酸长的随机分子条码(NNNNNNNNNNNNN)，33-20核苷酸长的通用扩增引物(UBAA)，4-内含子区域，5-外显子区域，6-带有分子条码添加引物的正链，7-抑制寡聚DNA，8-引物R1,9-引物R2，10-引物F1,11-引物F2，12-分子条码A，13-分子条码B，14-分子条码C，15-分子条码D，16-真正的突变。
一种提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方案，具体包括以下步骤：
1.引物设计。设计一系列分子条码添加引物(BAP)以及它们相对应的抑制寡聚DNA。每一个BAP都包含了三个部分：20个核苷酸长的通用扩增引物(UBAA)，12-16个核苷酸长的随机序列即随机分子条码，20个核苷酸长的基因组特异引物，该特异性引物与靶向的循环肿瘤DNA基因组序列互配。每个抑制寡聚DNA由两部分组成：5’端的8-15核苷酸长的随机序列，和3’端10-16个核苷酸长的和能与BAP配对的序列。
图1示出了本发明的分子条码添加引物(BAP)的设计示意图。
双链ctDNA分子中，以黑色线表示正链(5’到3'，左向右)，以灰色线(3'到5'，左向右)表示负链。每一个分子条码添加引物(BAP)(数字3所代表，即图1中黑色圆圈圈出的部分，图1底部的图例示出分子条码添加引物3中的各部分组成)包含3个部分序列:5'侧(黑色梯度线)的20个核苷酸长的通用扩增引物序列(UBAA)，中间(黑色断裂线)为由12-16个核苷酸长的随机序列(图中显示为13个核苷酸，nnnnnnnnnnn)组成的独特分子条码，3'侧有大约20个核苷酸序列组成的基因组特异性引物(黑色实线)。
该分子条码添加引物的数量，以13个核苷酸为例，等于13个核苷酸的每个位置上都有可能是四种核苷酸中的一种，也即为4的13次方，约6400万种，保证了每个ctDNA分子上添加的分子条码都是独一无二的。
2.给ctDNA分子添加分子条码。在此，本发明列举一个具体流程作为例子。将BAP和ctDNA按照10,000比1的比例混合，混合液用聚合酶的缓冲液，镁离子浓度为5mM。在95℃处理2分钟将ctNDA变性，然后安每分钟下降一度的速度，缓慢降低温度。加入dNTP和高保真聚合酶Phusion，用touch-up合成方法加上分子条码。其具体条件为：51℃30秒,54℃30秒,57℃20秒,60℃20秒,63℃15秒,66℃15秒,69℃10秒,和72℃10秒。
图2示出了本发明在ctDNA分子上添加分子条码添加引物的示意图。
在双链ctDNA变性后，退火过程中BAP和负链配对后，以负链为模板开始DNA合成，将负链上的序列信息转移到新合成的带有分子条码添加引物的正链上。新合成的正链，与原正链的序列相同。最初和新合成的正链的区别在于，后者现在包含了BAP引物中的分子条码。由于条码是随机序列，不同的BAP分子携带不同的条码。当多个ctDNA分子经过一轮合成后，它们新合成的正链带有不同的分子条码。
3.BAP引物的抑制。在此，本发明列举一个具体流程作为例子。根据ctDNA分子的数目，按照每个ctDNA分子加100,000个抑制寡聚DNA分子，即抑制寡聚DNA和BAP的分子比例为10:1。直接进行下一轮PCR反应，其中的具体条件为：85℃30秒,55℃15秒,57℃15秒,59℃10秒,61℃10秒,和72℃5秒,总共进行35个循环。
图3示出了抑制寡聚DNA与游离BAP的作用原理示意图。
在此，本发明举其中一种具体的抑制寡聚核苷酸作为例子。该抑制寡聚核苷酸被设计为包含两个部分的序列:5'侧的15个长的随机核苷酸，和3’与对应的BAP的3'末端完全互补的12个核苷酸长的序列。当一个抑制寡聚核苷酸和一个游离的BAP(而不是添加分子条码中被使用的BAP)退火时，DNA的扩展可以发生在两个引物的末端。因此，此时的游离的BAPs，并没有以基因组序列特异性引物来结尾，而是由15个随机核苷酸组成，完全阻断了BAP在与基因组序列退火后的起动DNA合成的作用。
图4示出了本发明中利用抑制寡聚DNA消除游离BAP的过程示意图(左)以及对比试验过程示意图(右)。其中，步骤一显示通过变性退火将所述分子条码添加引物与循环肿瘤DNA配对；步骤二显示启动DNA延伸反应的过程；步骤三显示向体系中引入抑制寡聚DNA，抑制寡聚DNA能够与游离的分子条码添加引物有效配对结合，使得游离的分子条码添加引物的3’末端发生扩展的过程。
通常对一个ctDNA分子用1万个BAP分子，但图中只显示3个游离的BAP分子。这些游离的BAP可以在下一轮的NGS文库构建中，启动新一轮的针对ctDNA添加分子条码，提高了同样的底物可以被多次添加条码的可能性，但也可以启动其它的合成反应而产生PCR副产物。为了防止此类事件发生，额外的BAP需要被抑制。如图4(左)所示，BAP能和抑制寡聚核苷酸(图中显示了5个分子，真正的分子数目是BAP的10倍)配对，而启动DNA合成，而已经和基因组序列结合并完成DNA延伸后的BAP，则在85℃的情况下，仍然以双链DNA的形式存在。图4(右)为阴性对比试验，该阴性对比试验所有的步骤与图4(左)是一样的。唯一的区别是，在“阴性对比试验”中，BAP没有被添加到条码添加反应混合物中，而是在用抑制寡聚核苷酸抑制额外BAP反应中加入。
图5示出了本发明中测定分子条码添加引物的添加效率的实验设计示意图。
为了测定BAP条码添加效率和抑制寡聚核苷酸对BAP的抑制的效率，本发明设计了一个巢式PCR反应。每一个PCR反应，在第一轮中使用2个起始ctDNA分子，这是由DNA质量的定量方法(如分光光度法)决定的。使用两套引物，它们是UBAA和引物R1，用于测量条码添加产物；引物F1引物R1来测量输入的DNA量(如图5所示)。第一轮PCR后，其部分产物用于第二轮PCR。所有第二次PCR使用同一套引物：引物F2和引物R2(如图5所示)。为了得到精确的测量结果,我建议每一套巢式PCR反应至少做96个反应。如果在第一轮PCR反应中，有一个可以被扩增的分子存在，那么在第二轮的PCR产物中，有足够的量可以用紫外(UV)光在琼脂糖凝胶上直接观察。根据有阳性产物的样品数量(Npositive)，没有阳性产物的样品数量(Nnegative),和样品的总数(Ntotal)。应用Poisson近似分析公式计算可扩增分子的比例μ＝-ln(Nnegative/Ntotal)/2。然后可以很容易地计算出可扩增的分子的总数：μ×2×96,在此2是指每个PCR反应含2个分子，而96代表每套PCR反应有96个重复。
图5中显示的是ctDNA的一个分子，它已经添加了分子条码。一共设计了两对引物，外侧的正向F1引物和反向的R1引物，以及内测的正向F2引物和反向的R2引物。测定添加了分子条码的ctDNA分子时，第一个PCR反应用引物UBAA和R1，第二个PCR反应用引物F2和R2。测定ctDNA的总分子数(包括了已经添加分子条码和未添加分子条码的)时，第一个PCR反应用引物F1和R1，第二个PCR反应用引物F2和R2。
要得到BAP的条码添加效率和抑制寡聚核苷酸对BAP的抑制效率，需要三个数据。首先，样品中UBAA和引物R1扩增的分子数，代表了已经添加分子条形的ctDNA分子(设为V2)。第二，阴性对照中引物F1和引物R1扩增的分子数(设为V3)，表示原ctDNA分子的条码。第三，阴性对照中UBAA和引物R1扩增的分子数量(设为V2’)，代表了抑制寡聚核苷酸抑制BAP的效率。在理想情况下，即100％的ctDNA分子被添加了分子条码，同时100％的游离BAP被抑制寡聚核苷酸所抑制，那么V2等于V3,而V2’是零。实际情况很可能是V2小于V3，而V2’大于0。
为了进一步验证，本发明选择了和癌症发生相关的12个位点，包括了BRAF，CTNNB1，EGFR，FGFR3，GNAS，IDH1，JAK2，KRAS，MED12，p53，PIK3CA等基因在内，设计了相应的BAP引物以及相应的抑制寡聚核苷酸。考虑到ctDNA分子是片段化了的，只有部分ctDNA分子能被检出，从DNA的质量来估算ctDNA的分子数目比较困难，不适合于作为本发明技术的验证；所以改用人乳腺癌细胞DNA，因为每个细胞基因组DNA的不同位点都可以被检出。如上所述，本发明以每个PCR反应平均2个拷贝的基因组DNA，按照前面所述的效率测定方法来验证。使用本发明提供的反应条件，条码添加的效率(V2/V3)从65％到81％之间，平均为71.2％(如图6所示)；而V2’值小于0.5％，也就是说99％以上的游离BAP分子被抑制寡聚核苷酸所抑制(如图6所示)。因此，本发明中所描述的对ctDNA加分子条码的技术是非常成功的。
图6A-图6C示出了本发明的ctDNA添加分子条码的效率测定结果图。
图6A-图6C中显示的只是其中一个代表性例子。图6A显示出已经添加了分子条码的循环肿瘤DNA的数量，用V2表示，图6B显示出添加分子条码时用的循环肿瘤DNA的总数，用V3表示，图6C显示出阴性对比实验中已经添加了分子条码的循环肿瘤DNA的数量，用V2’表示。每个PCR反应用大约2个起始ctDNA分子，其实际数量用Poisson近似值公式：分子数目＝-ln(无PCR产物的PCR反应数量/PCR反应的总数)/2。条码添加效率的PCR设计如图5中所描述，条码添加效率等于V2/V3。阴性对照反应的设计在图4(右)中被详细描述。根据图中的实验数据进行计算，添加分子条码效率(V2/V3)为74％。
为循环肿瘤DNA成功添加分子条码后，对其进行测序的过程为：
4.NGS文库的构建。加入UBAA和基因组各个区域特异的引物，按照常规PCR的方法做35个循环。将PCR混合物加到琼脂糖凝胶上，以便分离PCR产物和引物，用凝胶回收法纯化PCR产物，即得到NGS文库。
文库的构建用引物UBAA和针对12个区域的特异R1引物，进行常规PCR反应。其中的UBAA引物和/或基因组专一的R1引物，在其5’末端加上4到5个核苷酸，以区别来自不同的DNA样品。值得一提的是，发明所包含的技术主要三个步骤：包括对每个ctDNA分子添加分子条码，用抑制寡聚核苷酸抑制额外的BAP，以及常规PCR方法制备NGS文库。这三个反应都发生在同一个小管中，无需纯化或清理。这在简化了操作步骤的同时，也将显著降低在纯化或清理过程难以避免的样品丢失，从而增加ctDNA分子的有效使用，亦即提高ctDNA检测的灵敏度。
5.测序。按照供应商提供的流程，对NGS文库进行二代测序分析。
6.序列分析/确认一致序列。用生物信息学方法，将测出的序列进行分类，带有同一个分子条码的序列被划分在同一序列族里，这些读出来的序列来自同一个原始的ctDNA分子，因此理论上这些序列应该完全一样。对每一序列族里的所有进行分析，在每个核苷酸位置上，选择出现频率最高的核苷酸，从而得到每个特定序列族里的一致序列。
图7示出了本发明方法测定结果中显示预计的带有相同分子条码的序列族示意图。
如图7所示的4个序列族中，每个都有10个序列。在同一序列族中，所有10个序列都包含相同的分子条码(图中下斜线12代表一类分子条码A，平直线13代表一类分子条码B，上斜线14代表一类分子条码C，和虚线15代表一类分子条码D)，不同序列族之间的分子条码不一样。测序过程中产生的误读(小黑点)随机出现在各个序列中。这样的错误可以在序列读对齐过程中得到纠正，从而在序列族内部构建一致的序列。在将一致序列与参考序列进行比较后，可以确定一个真正的突变(如图7中方框圈出部分16所示)。
图8示出了采用本发明方法检测的ctDNA分子上的突变结果图。
图8中显示采用本发明方法得到的部分测序结果，其中的序列未从每个序列族得到的一致序列，和参考序列对比，约50个一致序列中几乎所有的都和参考序列一致，说明测序过程中产生的误读被有效地(几乎彻底)抑制。其中一个一致序列，含有真正的突变(黑色圆圈里)。因此，证实了本发明的方法可以作为新颖的检测ctDNA的手段，显示出癌症相关突变的实用性。
本发明的方法只需要一步DNA合成反应，即可以对ctDNA加上分子条码，从而可以跟踪每个ctDNA分子。在NGS测出的序列中，带有同样分子条码的序列，则来自同一个起始的ctDNA分子，所以这些序列应该是一样的，因此可以去除那些随机发生的测序过程中产生的错误，从而能够准确地检测出ctDNA分子中带有的突变。
本发明方法可以有效地对ctDNA分子加上分子条码，从而大大地提高ctDNA的检测灵敏度。同时，本发明是针对原始ctDNA分子进行加分子条码，也使得测定ctDNA分子的绝对数量成为可能。
本发明对于将来建立一个高灵敏度，高特异性，并且定量的ctDNA方法，有着非常重要的意义和实用价值。
以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进。这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种引物，其特征在于，
所述引物包括：5’末端的通用扩增引物序列、3’末端的与靶向DNA基因组序列互配的特异性引物序列，以及位于5’端和3’端中间的随机分子条码序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述引物的5’末端包括17-25个核苷酸长的通用扩增引物序列。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述引物的3’末端包括17-25个核苷酸长的特异性引物序列，所述特异性引物与靶向DNA基因组序列互配。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述引物包括12-16个核苷酸长的随机分子条码序列。
5.一种用于提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包含如权利要求1-4任一所述的引物。
6.如权利要求1-4任一所述的引物在制备用于提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方法的试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述提高循环肿瘤DNA检测灵敏度的方法包括：
合成如权利要求1-4任一所述的引物作为分子条码添加引物；
将所述分子条码添加引物添加到循环肿瘤DNA中；
启动DNA延伸反应；
消除未添加到循环肿瘤DNA中的游离的分子条码添加引物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：
将所述分子条码添加引物添加到循环肿瘤DNA中的方法为：将分子条码添加引物与循环肿瘤DNA进行混合，加入镁离子和聚合酶以及聚合酶缓冲液，加热后退火，使得所述分子条码添加引物和靶向的循环肿瘤DNA分子有效配对结合。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：
所述分子条码添加引物与循环肿瘤DNA的加入比例为100-100,000：1；所述镁离子的浓度范围为3-5mM。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：
消除未添加到循环肿瘤DNA中的游离的分子条码添加引物的方法，是指向体系中引入抑制寡聚DNA，所述抑制寡聚DNA能够与游离的分子条码添加引物有效配对结合，使得游离的分子条码添加引物的3’末端发生扩展。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：
所述抑制寡聚DNA包含两部分：3’末端的与所述分子条码添加引物的3’末端完全互补的10-16个核苷酸长度的序列；5’末端的随机的8-15个核苷酸长度的序列；所述随机的核苷酸序列与所述循环肿瘤DNA不匹配。
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