CN114144188A - 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 - Google Patents

放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是有关一种放大及检测核糖核酸(RNA)片段的方法。具体而言，本发明的方法包含转换RNA片段为cDNA及放大DNA。本发明亦提供一种用于进行本文所述方法的试剂盒。

Description

放大及检测核糖核酸(RNA)片段的方法
相关申请
本申请基于35U.S.C.§119，主张2019年5月21日申请的美国专利临时申请号62/850,651的权益，其全部内容在此并入本申请以作为参考数据。
技术领域
本发明涉及一种放大及检测核糖核酸(RNA)片段的方法。具体而言，本发明的方法包含转换RNA片段为cDNA及放大DNA。本发明亦提供一种用于进行本文所述方法的试剂盒。
背景技术
RNA为参与基因表现与调控的重要遗传物质。具体而言，生物流体(如，血液、唾液、尿液等)中的无细胞RNAs(cfRNAs)具有生物学与医学意义的重要遗传信息，因此，成为诊断许多疾病的有价值非侵入性样本。然而，cfRNAs非常多样，其结构与功能仍未知。此外，由于cfRNAs在正常情况下以少量存在于生物流体中，且可能容易降解或片段化，因此，以当前的方法检测或分析cfRNAs一直都是挑战。
已经开发出一些常规技术，用于RNA检测、验证、及定量。通常而言，从生物样本中分离RNAs，并利用反转录反应(RT)转换为互补DNAs(cDNAs)，接着以常规或定量聚合酶链反应(qPCR)进行放大。常规的DNA放大PCR方法需要二或多条配对的寡核苷酸引子，每一配对包含一条正向引子与一条反向引子，以特异性地界定出欲放大的特定标靶核酸序列的边界。举例而言，New England Biolabs(NEB)商业化一种带有试剂盒的方法(NEBNext小型RNA文库制备试剂盒)，其产生cDNA片段在5’端与3’端具有不同转接子，供两条不同的引子结合(参见图1的步骤f)，但其可能导致效率问题。在这方面，Ferrero等人描述了人类生物流体与健康个体替代组织中的小型非编码RNA概貌(Ferrero等人，2018)。Yuan等人描述了健康与癌症病患的血浆细胞外RNA概貌(Yuan等人，2016)。Everaert等人描述了人类生物流体与细胞外囊泡(EVs)的总RNA定序的表现评估(Everaert等人，2019)。这些方法有所局限，原因在于欲评估的cfRNAs的各种实施方式，包括数量稀少、片段长度短、种类繁多、或降解迅速。因此，亟需能完整评估样本中所有RNA种类的全面性方法。
发明内容
本发明提供一种新颖的RNA评估方法。
一般而言，本发明提供一种增进的基于PCR的技术，以进行RNAs评估，其特征在于RNAs的反转录反应以产生cDNA产物，其在两端皆具有单一类型(同源性)转接子，使得能以单一引子作为正向与反向引子进行DNA放大。本发明的方法仅需以较少的RNA量作为初始投入量，且特别适于检测微量的RNA分子，从而可以更高的灵敏度进行后续的标靶特异性探针检测。此外，本发明的方法达到涵盖各RNA种类的总RNA的全面RNA概貌而无偏差，其中放大的cDNAs保持原始样本中相应的RNA片段的相对数量，其至少提供优势，即可以更高的灵敏度与更少的伪阴性进行后续的标靶特异性探针检测。
特定而言，本发明提供一种转换线性、单股RNA(ssRNA)片段为DNA片段及放大DNA片段的方法。该方法包含下列步骤：
(a)从ssRNA片段移除5’磷酸根以产生去磷酸化的ssRNA片段；
(b)将P寡核苷酸(DNA)(具有P寡核苷酸序列且携带5’磷酸根的单股DNA)连接至去磷酸化的ssRNA片段的3’端以形成ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股；
(c)通过以5’-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)-3’股作为模板且添加T寡核苷酸(DNA)(具有与P寡核苷酸(DNA)互补并黏合的T寡核苷酸序列的单股DNA)作为引子进行第一反转录反应，以合成与ssRNA片段互补的互补DNA(cDNA)股，以产生5’-T寡核苷酸(DNA)-cDNA-3’股，从而形成由ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股与cDNA-T寡核苷酸(DNA)股组成的初始RNA/DNA杂合体；
(d)将T寡核苷酸(RNA)(与P寡核苷酸(DNA)互补的单股RNA)连接至初始RNA/DNA杂合体中的5’-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)-3’股的5’端，以形成5’-T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)-3’股，从而形成由该5’-T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)-3’股与5’-T寡核苷酸(DNA)-cDNA-3’股组成的中间物RNA/DNA杂合体，其具有非互补T寡核苷酸(RNA)悬垂；
(e)以非互补T寡核苷酸(RNA)悬垂作为延伸模板进行第二反转录反应以取得完整cDNA股，其5’端具有T寡核苷酸序列且3’端具有P寡核苷酸序列，从而形成该5’-T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)-3’股与该完整cDNA股的完整RNA/DNA杂合体；
(f)从RNA/DNA杂合体移除T寡核苷酸(RNA)与ssRNA片段以产生部分、双股DNA，其包含该完整cDNA股在其5’端与P寡核苷酸(DNA)部分地杂合化；以及
(g)利用此延伸的cDNA股作为PCR模板与具有T寡核苷酸序列的T寡核苷酸引子进行T寡核苷酸启始的聚合酶链反应(TOP-PCR)，以启始合成双股cDNA产物。
在一些具体实施例中，ssRNA片段包含表示个体的健康/疾病状态的核酸序列。
在一些具体实施例中，ssRNA片段是存在于个体(如，患病的个体)的样本中。
在一些具体实施例中，样本是取自体液样本，包括但不局限于，源自个体的血液、尿液、唾液、泪液、汗液、母乳、鼻分泌物、羊水、精液、或阴道分泌物的样本。
在一些具体实施例中，ssRNA片段为无细胞RNAs(cfRNAs)。具体而言，cfRNAs为囊泡中的RNAs(vc-RNAs)，如胞外体、微囊泡、或胞内体中的彼等。
在一些具体实施例中，在步骤(d)之前，ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股是经磷酸化。
在一些具体实施例中，在步骤(g)中，T寡核苷酸引子为唯一用于PCR反应的引子。
在一些具体实施例中，ssRNA片段是以0.01ng至100ng或更少量(如，0.01ng至10ng或更少)的初始投入量(总RNA)存在。
在一些具体实施例中，ssRNA片段是以约90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、5ng、2.5ng、1ng、或更少量的初始投入量(总RNA)存在。
在一些具体实施例中，ssRNA片段是以0.01ng至100ng或更多量(如，0.1ng至100ng或以上、10ng至100ng或以上、或1微克或以上)的初始投入量(总RNA)存在。
在一些具体实施例中，本发明的方法更包含通过诊断或临床装置(如，质谱法、杂合法、或定序法)检测放大的cDNA产物。
在一些具体实施例中，本发明的方法可包括一或多个纯化步骤。
在一些具体实施例中，本发明的方法不包括纯化步骤。
本发明亦提供一种RNA评估方法，其包含：
(i)提供个体的生物流体样本，其中生物流体包括ssRNA片段；
(ii)进行如本文所述的本发明RNA TOP-PCR方法，以将ssRNA片段转换为相应的DNA片段及放大此DNA片段；以及
(iii)分析放大的DNA片段，以测量放大的DNA片段的一或多个特征。
在一些具体实施例中，(iii)分析步骤包括定序、匹配、及/或比对。
本发明亦提供一种进行如本文所述的RT-PCR方法的试剂盒，其包含：
(i)去磷酸化试剂，其包含碱性磷酸酶与去磷酸化缓冲液；
(ii)连接试剂，其包含连接酶、连接缓冲液、P寡核苷酸(DNA)、及T寡核苷酸(RNA)；
(iii)磷酸化试剂，其包含激酶与激酶缓冲液；
(iv)反转录试剂，其包含反转录酶(RT)、RT缓冲液、dNTP、及T寡核苷酸(DNA)；
(v)RNA消化试剂，其包含RNase与RNase缓冲液；以及
(vi)PCR试剂，其包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、及该T寡核苷酸引子。
本发明的一或多个具体实施例的细节如以下的描述中所示。本发明的其他特征或优势将因以下数个具体实施例的详尽说明以及所附的申请专利范围而变得显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容及以下对本发明的详细描述。欲说明本发明，在附图中显示当前较佳的特定具体实施例。然而，应理解到，本发明不局限于所示的精确排列与手段。
图1显示本发明的方法(RNA T寡核苷酸启始的聚合酶链反应(RNA TOP-PCR))与NEB的方法的比较。首先的两个步骤(A-B与a-b)类似，除了本发明RNA TOP-PCR方法始于更少量的总RNA。随后，两个实验程序实质上分歧：针对本发明的RNA TOP-PCR方法，第一股cDNA合成(C)，随后将T寡核苷酸(RNA形式)连接至RNA股的5’端(D)，接着反转录为完整全长的第一股cDNA(E)。随后，在TOP-PCR放大(G)之前，将RNA部分消化(F)。针对NEB的方法，先进行3’引子杂合反应(c)，随后进行5’单股RNA(ssRNA)转接子连接(d)，合成全长第一股cDNA(e)，接着以其条件与两个不同的PCR引子进行PCR放大(f)。此外，其PCR产物需进行大小筛选，以移除转接子二元体，而TOP-PCR方法不需要大小筛选。
图2显示本发明特定具体实施例中的EV-RNA评估的工作流程。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术性与科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
本文中使用的冠词“一”与“一个”意指一或一个以上(即至少一个)的冠词语法对象。举例而言，“一组件”意指一个组件或一个以上的组件。
“包含”或“包含有”等词通常以包括/包括了的意义使用，其意指允许存在一或多个特征、成分、或组分。“包含”或“包含有”等词包括“组成自”或“由～组成”。
本文中使用的“约”、“大约”、或“近似”等词通常可指一给定数值或范围的20％以内，特别地10％以内，且更特别地5％以内。本文给定的数值为近似值，意指若无明确指出，则可推测为“约”、“大约”、或“近似”。
“多核苷酸”或“核酸”等词意指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，如脱氧核糖核酸(“DNA”)与核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物，包括彼等具有非天然存在的核苷酸者。多核苷酸可诸如利用自动化DNA合成仪合成。“核酸”一词通常意指大型多核苷酸。多核苷酸或核酸可为单股(如，ssRNA或单股cDNA)或双股(如，RNA/DNA双股或dsDNA)。将理解到，当将核苷酸序列以DNA序列(亦即，A、T、G、C)为代表时，此亦包括一RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中以“U”代替“T”。“寡核苷酸”一词意指一相当短的核酸片段，通常小于或等于150个核苷酸长(如，介于5与150个之间)。寡核苷酸可视需求设计与合成。在引子方面，其长度通常介于5与50个核苷酸之间，特别是介于8与30个核苷酸之间。在探针方面，其长度通常介于10与100个核苷酸之间，特别是介于30与100个核苷酸之间。本文中使用的“P寡核苷酸”一词可指一携带5’磷酸根以连接RNA片段的3’端的寡核苷酸。本文中使用的“T寡核苷酸”一词可指一与P寡核苷酸互补的寡核苷酸。
本文中使用的“互补”一词意指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑学兼容性或相互匹配。因此，这两个分子可描述为互补，且接触表面的特征为彼此互补。若第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5’-TATAC-3’的多核苷酸与序列为5’-GTATA-3’的多核苷酸互补。
本文中使用的标靶核酸一词意指欲于样本中检测出的特定感兴趣核酸。特定而言，标靶核酸包括RNA，特别是cfRNA，包括mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、cfRNA、及/或vcRNA。标靶核酸可源自任何来源，包括天然存在的来源或合成的来源。举例而言，标靶核酸可源自动物或病原体来源，包括但不局限于，哺乳类动物(如，人类)及病原体(如，细菌、病毒、及真菌)。标靶核酸可取自任何体液或组织(如，血液、尿液、皮肤、头发、粪便、及黏液)，或环境样本(如，水样本或食物样本)。在一些具体实施例中，标靶核酸可为相同来源(如，源自正常或疾病个体或病原体的相同基因)的核酸分子的集合，但长度不同。
本文中使用的“无细胞RNA”或cfRNA(s)等词意指在个体体液中循环的任何类型的RNAs，但不存在于细胞体或细胞核内部。无细胞RNAs已成为早期发现、预后、或监测疾病(尤其是癌症)的有价值侵入性生物标记。RNA不稳定，其对核糖核酸酶的降解敏感。发现到，在体液中循环的无细胞RNA被包裹在细胞外囊泡(EVs)之内，或以与脂蛋白或其他RNA结合蛋白结合的无囊泡形式存在。无细胞RNAs可为任何类型的RNA，包括但不局限于，传讯RNA(mRNA)、传递RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、及非编码RNA(包括长型非编码RNA(IncRNA)(超过200个核苷酸)与小型非编码RNA(SncRNA)(小于200个核苷酸))。SncRNA的实例包括小型干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、穹窿体RNAs(vtRNA)、及Y-RNA等。无细胞RNAs可为彼等全长或片段化者，例如，编码一或多个蛋白(如，癌症相关蛋白、发炎相关蛋白、信息传递相关蛋白、能量代谢相关蛋白)的mRNA片段(如，全长的至少80％、全长的至少70％、全长的至少60％、全长的至少50％、全长的至少40％等)。RNA的大小可变，例如，范围为约10个碱基或以下至约3,000个碱基或以上，特定而言包括70至80个碱基、80至90个碱基、90至110个碱基、及150至170个碱基的群体。
有适合用于分离无细胞RNA的方法。通常，无细胞RNA分离自生物流体，如全血(较佳地加工成血浆或血清)，或任何其他流体(如，唾液、腹水、尿液、脊髓液等)，只要此类液体中存在无细胞RNA，即视为适用。在一些典型的具体实施例中，将全血离心以分离血浆。随后，将由此获得的血浆分离并离心以除去细胞碎片。利用商业化试剂(如，Qiagen试剂)从血浆中萃取出无细胞RNA。所得RNA样本可在进一步处理之前冷冻。
本文中使用的与样本中的核酸相关的“微量”或“低量”一词可指相对低于常规评估核酸的方法所用的量。举例而言，与生物样本中欲分析的RNAs相关的微量可指约0.01ng至100ng或更少量(如，0.01ng至10ng或更小，或者少数RNA分子或甚而单一RNA分子)。
本文中使用的“引子”一词意指可用于放大方法(如，聚合酶链反应(PCR))的寡核苷酸，以放大标靶核苷酸序列。在常规PCR中，欲进行放大，需要至少一对引子，包括一条正向引子与一条反向引子。通常，针对由欲放大的(+)股与(-)股组成的标靶DNA序列，正向引子为可杂合至(-)股的3’端的寡核苷酸，从而可在反应条件下开始新的(+)股的聚合反应；而反向引子为可在反应条件下杂合至(+)股的3’端的寡核苷酸，从而可在反应条件下开始新的(-)股的聚合反应。特定而言，作为一实例，正向引子可具有与(+)股的5’端相同的序列，且反向引子可具有与(-)股的5’端相同的序列。正常而言，进行标靶核酸序列放大的正向引子与反向引子彼此序列不同。本文中使用的“单一”引子意指仅一种类型的引子，其全部具有相同的序列，而非一对具有不同序列的引子，一者为正向引子，另一者为反向引子。
本文中使用的“杂合反应”一词应包括一股核酸经由碱基配对与互补股结合的任何过程。相关方法为本领域中已知，且描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，以及Frederick M.A.等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.(2001)。通常，选择的严格条件为比指定序列在规定的离子强度与pH下的热熔点(Tm)低约5至30℃。更常为，选择的严格条件为比指定序列在规定的离子强度与pH下的Tm低约5至15℃。举例而言，严格的杂合条件为，彼等盐类浓度小于约1.0M钠(或其他盐类)离子者，通常在约为pH 7.0至pH 8.3下约0.01至约1M钠离子浓度，且针对短探针(如，10至50个核苷酸)的温度为至少约25℃及针对长探针(如，大于50个核苷酸)的温度为至少55℃。长探针(如，大于50个核苷酸)的示例性非严格或低严格条件将包含20mM Tris，pH 8.5、50mM KCl、及2mM MgCl2的缓冲液，以及反应温度25℃。
本文中使用的“反转录反应”一词意指从RNA模板产生互补DNA(cDNA)，其通常由酵素(如，反转录酶)进行，且需要引子黏合至RNA模板。
“单一(single)”、“同源性(homogenous)”、或“通用(universal)”引子意指在PCR反应中仅有一种类型的引子，其中存在相同序列，而非一对引子。“异源性引子(homogenousprimers)”一词意指在PCR反应中存在至少一对引子，每一成员彼此具有不同序列。
本文中使用的“转接子(adaptor)”一词意指可连接至核酸分子末端的寡核苷酸。转接子的长度可为10至50个碱基，较佳地长度为10至30个碱基，更佳地长度为10至20个碱基。长度小于10个核苷酸会降低黏合特异性。长度大于20个核苷酸可能不具成本效益。“同源性(homogenous)”转接子一词意指用于连接双股核酸分子两端的单一类型转接子。“异源性(heterogenous)”转接子一词意指至少两类型的转接子，其彼此具有不同核苷酸序列，一者存在于双股核酸分子5’端且一者存在于3’端。在本发明中，使用由P寡核苷酸与T寡核苷酸形成的同源性转接子。在本发明的一具体实施例中，T寡核苷酸具有序列：5’-AGACTCCGACT-3’(SEQ ID NO:2)；且P寡核苷酸具有相应的序列：5’-AGTCGGAGTCT-3’(SEQID NO:1)。序列可为RNA形式(其中在一些位置可使用碱基U而非碱基T)。
本发明提供一种增进的RNA转换与cDNA放大技术，称作“RNA T寡核苷酸启始的聚合酶链反应(RNA TOP-PCR)”，其特别适用于全面无偏误放大微量的线性、单股RNA。相较于常规RT-PCR技术，其产生在5’端与3’端具有不同转接子的cDNA片段，从而后续的放大反应需要两条不同的引子，本发明方法产生具有同源性(单一类型)转接子的cDNA片段(其由P寡核苷酸与T寡核苷酸彼此互补制成)，从而所得cDNA片段可由单一T寡核苷酸引子黏合至同源性转接子的P寡核苷酸而放大。据此，RNA片段的初始投入量可以更少，且RNA转换为DNA及DNA放大效率增加。此外，样本中的所有RNA片段皆可均等地放大，且后续的靶标特异性探针检测可以提高的灵敏度进行。依据本发明的方法，微量的RNA样本即足够，例如，在欲检测的样本中，以约0.01ng至100ng或以下(如，90ng或以下、80ng或以下、70ng或以下、60ng或以下、50ng或以下、40ng或以下、30ng或以下、20ng或以下、10ng或以下、5ng或以下、1ng或以下、0.5ng或以下、0.1ng或以下、0.01ng或以下、或少数RNA分子或甚而单一RNA分子)作为初始投入量。可理解到，本发明的方法亦可应用在更高量的RNA样本中，例如，0.01ng至100ng或以上(如，0.1ng至100mg或以上、10ng至100ng或以上、或1微克或以上)。
图1为本发明方法的程序(步骤A至G)示意图。步骤A进行cfRNA的5’去磷酸化。步骤B进行cfRNA的3’连接至P寡核苷酸。步骤C进行利用反转录反应的第一cDNA合成。步骤D进行cfRNA与T寡核苷酸(RNA形式)的5’转接子连接。步骤E进行延伸的反转录反应。步骤F进行RNA消化反应。步骤G进行TOP-PCR放大反应。TOP-PCR技术已说明于，例如，美国专利申请公开号20160298172(亦即，美国专利号10,407,720)，其全部内容在此并入本申请以作为参考数据。细节将在下面实施例中说明。
本发明的RNA TOP-PCR是经特别设计以放大体液中的低量RNA片段。相较之下，NEBNext小型RNA文库制备试剂盒旨在从“总RNA”而非cfRNA制备小型RNA文库，以进行由Illumina定序仪的定序。NEB的方法需要至少100ng的总RNA作为起始材料以制造小型RNA定序文库。此外，NEB的方法使用两条不同转接子，从而下游放大反应需要两条不同的引子，其导致效率更低。Illumina的方法不适合少量cfDNA定序，从而亦不适合cfRNA/vcRNA定序。
本发明方法优于NEB方法的优势包括但不局限于，以下：1)本发明的方法可评估cfRNAs(包括vcRNAs)，尽管其亦可应用在细胞中的RNAs；2)本发明的方法需较少量的RNAs作为初始投入量(约1ng或更少即足够)；3)本发明的方法可检测多种RNA群体，且不局限于特定类型的RNAs；4)本发明的方法可通过将样本中的多种RNA种类转换为相对量的相应cDNAs，达到全面的RNA概貌，而无偏误；(5)当应用于诊断时，本发明的方法可提供更高的灵敏度与更少的伪阴性；6)本发明的方法产生单一类型(同源性)转接子，而NEB的方法产生两个(异源性)转接子；以及7)本发明的方法利用T寡核苷酸启始的聚合酶链反应(TOP-PCR)放大RNA衍生的cDNA，其使用单一T寡核苷酸引子(其在一些位置可使用碱基U而非碱基T)。相较于Illumina的方法，TOP-PCR为一优越且更有效的方法(Nai等人，2017；Sci.Rep.7:40767)。
通过以下实施例进一步说明本发明，其之提供旨在说明而非局限。鉴于本发明，本领域技术人员应理解到，可对揭示的特定具体实施例进行许多改变，且仍取得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神与范畴。
实施例
1.材料与方法
1.1.无细胞RNA分离
无细胞RNA是从健康男性血浆中分离出。以BD Vacutainer静脉采血管(BD，#367525)收集健康男性的全血样本。利用miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen，#217184)分离血浆fRNA片段。以Qubit RNA HS试验试剂盒(Thermo Fisher，#Q32852)将分离的cfRNA样本定量并保存在-70℃。以采用RNA或DNA凝胶的片段分析仪(Fragment Analyzer，AATI)评估RNA与DNA样本的定量与定性。
1.2转换cfRNA为cDNA及放大以取得dsDNA产物
图1显示本发明过程的程序，包括步骤A至G。
利用下列步骤将cfRNA样本转换为cDNA而不纯化。
步骤A：cfRNA的5’去磷酸化
在步骤A中，将cfRNA的5’端去磷酸化。5μL的去磷酸化混合物含有20mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1单位/μL的RNase抑制剂(NEB，#M0314)、及1单位的虾碱性磷酸酶(NEB，#M0371)。混合物在37℃下培养30分钟及在65℃下培养10分钟。其结果为，cfRNA的5’端去磷酸化。
步骤B：cfRNA的3’连接至P寡核苷酸
在步骤B中，添加P寡核苷酸，并连接至去磷酸化的cfRNA的3’端。18μL的3’连接混合物含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、1mM ATP、40x摩尔比率的11nt P寡核苷酸(DNA)(Sigma，5’-磷酸-AGTCGGAGTCT(SEQ ID NO:1)-[AmC3]-3’)、25％PEG 8000、1单位/μL的RNase抑制剂、及1单位/μL T4 RNA连接酶1(NEB，#M0437)。反应混合物在37℃下培养1小时，并保持在4℃。其结果为，得到cfRNA片段的3’端连接至P寡核苷酸。
步骤C：利用反转录反应(RT)进行第一cDNA合成
在步骤C中，添加T寡核苷酸(DNA形式，其与P寡核苷酸互补)，并黏合至cfRNA片段的P寡核苷酸部分。30μL的RT混合物含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、6mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM dNTP、1单位/μL的RNase抑制剂、及100单位的ProtoScript II反转录酶(NEB，#M0368)。在RT之前，将40x摩尔比率的11nt T寡核苷酸(DNA，其与P寡核苷酸互补)(IDT，5’-[AmMC6]-AGACTCCGACT(SEQ ID NO:2)-3’)加入3’端连接混合物(取自步骤B)中，并在65℃下培养5分钟，在37℃下培养5分钟，在25℃下培养5分钟，并保持在4℃下，导致T寡核苷酸黏合至P寡核苷酸。随后，反应混合物在25℃下培养10分钟，在42℃下培养50分钟，在65℃下培养20分钟，并保持在4℃下。其结果为，合成第一股cDNA，并形成RNA/DNA杂合体，包括第一股cDNA与具有P寡核苷酸的cfRNA片段互补。
步骤D：具有T寡核苷酸(RNA形式)的cfRNA的5’转接子连接
在步骤D中，添加T寡核苷酸(RNA形式)，并连接至RNA/DNA杂合体中的cfRNA片段的5’端。45μL的磷酸化混合物含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、10mM DTT、1.4mMATP、20％PEG 8000、1单位/μL的RNase抑制剂、及10单位的T4多核苷酸激酶(NEB，#M0201)。用于磷酸化的反应混合物在37℃下培养30分钟，并保持在4℃下。随后，以200X摩尔比率将RNA形式的11nt T寡核苷酸(IDT，5’-AmMC6-rArGrArCrUrCrCrGrArCrU(SEQ ID NO:3)-3’)加入磷酸化混合物中，并在65℃下培养5分钟，在37℃下培养5分钟，在25℃下培养5分钟，并保持在4℃下。接下来，将T寡核苷酸连接至cfRNA的5’端。在总共60μL的连接混合物中含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、7.5mM MgCl2、7.5mM DTT、1.8mM ATP、25％PEG 8000、1单位/μL的RNase抑制剂、及5单位的T4 RNA连接酶2(NEB，#M0239)。用于连接的反应混合物是在37℃下培养2小时，并保持在16℃下。
步骤E：延伸的反转录反应
在步骤E中，进行延伸的反转录反应，以形成完整RNA-DNA双股。75μL的延伸的RT混合物含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、6mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM dNTP、1单位/μL的RNase抑制剂、及100单位的ProtoScript II反转录酶。反应混合物在42℃下培养20分钟，在65℃下陪养20分钟，并保持在4℃下。其结果为，形成完整RNA/DNA杂合体。
步骤F：RNA消化反应
在步骤F中，添加RNase，以消化RNA/DNA杂合体中的RNA片段。将总共7.5单位的RNase H(NEB，#M0297)与7.5μg的RNase A(QIAGEN，#19101)加入延伸的RT混合物(取自步骤E)中，随后在37℃下培养20分钟，在65℃下培养20分钟，并保持在4℃下，以移除RNA，在TOP-PCR放大步骤之前仅保留DNA片段。
步骤G：TOP-PCR放大反应
在步骤G中，以DNA片段(在变性之后无P寡核苷酸)作为模板，并以T-3U寡核苷酸(IDT，5’-AGCGCUAGACUCCGACU-3’)(SEQ ID NO:4)作为单一引子，进行PCR放大反应，以取得dsDNA产物。
750μL的PCR混合物含有1X Phusion HF缓冲液、0.2mM dNTP、1μM 17nt T-3U寡核苷酸、及15单位的Phusion U Hot Start DNA聚合酶(ThermoFisher，#F555)。PCR条件：1)1个循环的初始变性反应(在98℃下30秒)；2)3至5个循环的变性反应(在98℃下10秒)、引子黏合(在27℃下1分钟)、及延伸反应(在72℃下1分钟)；3)15至20个循环的变性反应(在98℃下10秒)、引子黏合(在57℃下30秒)、及延伸反应(在72℃下1分钟)；以及4)最终延伸反应(在72℃下5分钟)并保持在4℃下。以核酸外切酶I(NEB，#M0293)处理PCR产物，以移除引子，并以QIAquick核苷酸移除试剂盒(QIAGEN，#28304)纯化。以QubitTM DNA HS试验试剂盒(ThermoFisher，#Q32851)将转接子连接的dsDNA定量，并保存在-70℃下。
在定序文库构筑之前移除T-3U寡核苷酸。
1.3定序文库制备与定序
TOP-PCR所使用的转接子必须在定序文库构筑之前移除。欲制造定序文库，在25μL的1X TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mM EDTA)中，以2单位的不耐热USER II酵素(NEB，M5508)处理约10ng前面步骤产生的DNA，然后在37℃下培养15分钟并保持在25℃，以完全移除转接子。按照制造商的说明，以NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒(NEB，E7645)构筑Illumina定序文库。定序文库以Qubit DNA HS试验试剂盒定量，并保存在-20℃下。
利用Agilent片段分析仪评估片段大小，并以Roche LightCycler LC480 II机器进行定量，其使用基于qPCR的KAPA文库定量试剂盒(Roche，KK4854)。文库以2x150bp配对端(PE)定序，其中使用HiSeq X Ten(Macrogen，South Korea)。
1.4原始读取的处理
利用Cutadapt软件，从原始读取中移除由P与T-3U寡核苷酸形成的转接子序列的潜在迁移(carryover)。Cutadapt亦可调整Illumina定序所使用的P5与P7转接子。随后，以PRINSEQ软件检查碱基质量评分与不明确碱基(N)的存在。随后，以NGS QC工具试剂盒(使用预设参数)检查读取质量。针对每一步骤，最小读长为15。应用FLASH，其具有定义的参数(-m4-M 151)，将配对的读取组合成片段。
1.5匹配与序列分析
利用RNA-seq比对器STAR(Dobin等人，2013)，将品质读取定位到人类基因体GRCh38.p12。此外，采用GENCODE参考批注(第29版)，以鉴定人类基因体的基因(Frankish等人，2019)。计算与分析基因相关的读取，以进一步利用featureCounts软件进行分析(Liao等人，2014)。以SAMtools执行SAM/BAM文件的后处理(Li等人，2009)，并以Picard工具从BAM文件产生统计信息(https://broadinstitute.github.io/picard)。
2.结果
2.1 cfRNA评估
从三名健康男性的每一人的血浆中分离出cfRNA样本，并进行本发明的RNA TOP-PCR方法。在读取质量控制方面，发明人以QV值20作为截止值。表1显示其结果。
表1.无细胞RNAs的起源
Figure BDA0003363780640000121
cfRNA片段的主要来源为1)rRNA，接着为2)mRNA，3)线粒体RNA，以及4)YRNA。特别感兴趣的是YRNA，其已知涉及免疫性。
已经证实，本发明的方法能将微量的cfRNA片段转换为DNA片段，其可进行放大及/或定序，以产生全面的RNA概貌，且有助于RNA种类的生物学研究与分析，例如，用于疾病诊断与早期检测。
2.2 EV-RNA评估
2.2.1工作流程
以下概述工作流程，以说明细胞外囊泡RNAs(EV-RNAs)定序的过程(图2)。简言之，从EVs中分离出EV-RNAs，并进行RNA TOP-PCR，将RNAs转换为cDNAs，接着再进行TOP-PCR放大反应。该过程在单一试管中进行，防止珍贵材料损失。利用酵素消化，移除经放大的cDNA中的转接子，并利用NGS将cDNA定序。将质量读取匹配至GENCODE数据库，以鉴定人类基因体中的序列起源。随后，数据以featureCounts进行分类。进一步分析mRNAs、lncRNAs、Y-RNAs、及miRNAs的序列。
2.2.2文库统计与大小分布
从三名健康男性的每一人的全血中分离出EV-RNA样本，并进行本发明的RNA TOP-PCR方法。表2显示文库统计。本发明仅使用R1-R2配对的可射匹配读取。
表2.EV-RNA文库的文库统计与分子组成
Figure BDA0003363780640000131
分析所有EV-RNAs的大小分布。剖析EV-RNA样本中的片段大小显示两个主要区域(数据未显示)。主要尖峰范围介于150至170碱基之间，主要由rRNAs与mRNAs形成，而第二个区域范围介于90-110碱基之间，主要由Y-RNAs与tRNAs(72至80个碱基，87至89个碱基(主要)与120至126个碱基)组成。
2.2.3 EV-RNAs包含多样的RNA种类
如featureCounts所显示，所有EV-RNA集合皆含有多样的RNA种类(表3)。
表3.批注的EV-RNAs的摘录
Figure BDA0003363780640000132
Figure BDA0003363780640000141
发明人进一步分析EV-RNA种类与数个主要群组的关联性(表4)。通常，rRNA构成主要群组，接着是Y-RNA。相反地，miRNA构成最小群组，可能是因从EVs中分离初始RNA时的损失(发明人使用的试剂盒并非针对miRNA分析)。
表4.EV-RNAs的主要群组
Figure BDA0003363780640000151
2.2.4 EV-mRNAs源自数千个蛋白编码基因
该受测的三名健康男性的EV-mRNAs是由总共约15,000个蛋白编码基因转录而来，其中该三个体的彼等基因之间共有约25％的重叠(％意指在总数14,851个基因中所占的百分比，数据未显示)。
发明人进一步以IPA结合与全部三个体共有的蛋白编码基因(总共3,688个)相关联的EV-mRNAs进行途径分析。结果显示，前5个途径皆与信息传递有关(表5)。
表5.基于所有三个体共有的3688个基因的途径分析。
Figure BDA0003363780640000152
另一个以IPA结合前5000个基因的每一者的独立途径研究，以相关读取数目加权，亦显示类似结果(表6)。
表6.每一个体的IPA。
Figure BDA0003363780640000153
Figure BDA0003363780640000161
欲经由再现性评估数据可靠性，发明人确认与比较三个体的前50个蛋白编码基因。发明人发现，在任何个体中，有50％以上的前50个蛋白编码基因亦可与其他个体共有，显示在彼等个体中的高度再现性(数据未显示)。粒线体起源序列的高盛行率亦指出特定粒线体序列的选择性，尤其是彼等编码NADH去氢酶异构型的序列。
2.2.5 Y-RNA/RNY分析
人类有四种Y RNAs。彼等Y RNAs已知为Ro 60-kDa(含有螺旋形HEAT重复序列的RNA结合蛋白)的抑制子及DNA复制的起始因子，且由Y RNA产生的小型RNA生合成是与miRNA无关(Nicolas等人，2012)。每一类型的Y RNA皆含有环形结构域、上部茎(stem)结构域、下部茎结构域、及聚尿苷尾部。
发明人的结果显示，RNY3与RNY4为EVs中的主要Y-RNA种类，接着是RNY1，RNY5则非常次要(表7)。
表7.所有个体的Y-RNA种类
基因名称 M1 M2 M3
RNY1 913,042 593,943 179,880
RNY3 3,301,852 1,573,633 643,852
RNY4 2,902,204 1,899,113 861,435
RNY5 2,043 1,776 752
7,119,141 4,068,465 1,685,919
2.2.6发明人的数据与先前报导的数据的比较
发明人比较了其结果与先前的报导(表8)。大多数的报导(其亦由健康人类的血液血浆携带的EVs产生)聚焦在EVs中的小型或长型RNAs(Ferrero等人，2018；Li等人，2019；Yuan等人，2016)。在此，发明人比较了其结果与Everaert等人的报导(Everaert等人，2019)，聚焦在总EV-RNAs的分析。
表8.健康个体血浆衍生的EV-RNA概貌的比较。
Figure BDA0003363780640000171
发明人的实验程序与Everaert等人所使用的之间存在显著差异。首先，其在文库制备步骤期间预先排除rRNA，同时，欲与之比较EV-RNA概貌，发明人在此将rRNA屏蔽。其次，发明人在cDNA合成之前对RNA进行片段化，同时，发明人在单管程序中直接使用原始EV-RNAs，其中不涉及片段化或纯化，直到TOP-PCR放大反应完成。此类实验程序中的变化可能是导致结果差异的主要原因。
3.讨论
众所周知，存在于生物体液中的cfRNAs为诊断许多疾病(包括癌症)的有价值的遗传物质。然而，cfRNAs通常为片段化，丰度低且种类繁多，使得cfRNAs的鉴定与评估成为巨大挑战。大多数先前的报告都聚焦在与特定疾病相关联的特定类型RNAs，而有许多cfRNAs可能涉及不同的生理过程及/或疾病，但尚未进行鉴定或研究。
在本研究中，发明人开发了新颖的RNA TOP-PCR方法，以全面分析个体生物样本中的RNAs。作为设计用于放大微量RNAs的方法，本发明的RNA TOP-PCR方法具有许多优势，包括单一试管程序，其利用消除RNA/cDNA分离直到放大完成，以防止样本损失。此外，可在放大反应之后移除转接子，从而样本可直接进行定序或用于常规方法的诊断。本发明的RNATOP-PCR方法。
发明人证实，本发明的RNA TOP-PCR方法可用于全面放大与检测个体生物流体样本中的总cfRNAs。
血管在心血管循环中的作用就像超级运河系统一样，可使人体潜在地在所有生理方面达到体内稳定状态。在血液循环系统中，类似于携带氧分子的红血球细胞，EVs的作用就像分子载具，用于细胞之间特定分子的系统性运输。在此过程中，核酸(如，EV-mRNAs与EV-ncRNAs)已知分别保留其编码与调节活性，以在细胞间协调基因表现与调节。EV-RNAs的研究逐步揭开了基因表现本身的水平协调，以及基因表现的调节，从细胞内层级延伸至细胞间层级。
重要的是，以独立方式或方法进行EV-RNAs分析。通过本发明的RNA TOP-PCR，发明人不仅鉴定了先前报导的ncRNAs，还鉴定了人类基因体中大量的新颖ncRNA转录位点。大多数先前的研究皆聚焦在一或少数几类EV-RNAs，而在此，利用RNA TOP-PCR无偏误的本质的优势，发明人旨在调查EVs中的所有RNA种类。欲避免高估RNA含量，样本制备未涉及片段化。
应注意到，EV-RNA定序的质量首先受到用于EV与RNA分离方法的影响，接着受到定序文库制备方法的影响。特定“选择性”试剂试剂盒容许研究人员聚焦在特殊的RNA类型(如miRNA或mRNA)，同时忽略其余的。此外，下游序列数据分析亦受到匹配工具、所用数据库、及生物信息学方法的影响。
发明人鉴定了大量的EV-mRNAs，且发现彼等mRNA序列属于约15,000个蛋白编码基因，其亦主要参与信息传递。在彼等男性之间的前50个EV-mRNA编码基因之间存在高度重叠(三者共享者有44％，而任两者共享者有8-40％)。此外，前20个EV-mRNAs的大多数皆编码NADH去氢酶的次单元，其通常位于粒线体的内膜。
参考文献
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<213> 人工序列
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agacuccgac u 11
<210> 4
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T-3U寡核苷酸
<400> 4
agcgcuagac uccgacu 17

Claims (17)

1.一种转换线性、单股RNA(ssRNA)片段为DNA片段及放大该DNA片段的方法，其包含：
(a)从该ssRNA片段移除5’磷酸根以产生去磷酸化的ssRNA片段；
(b)将P寡核苷酸(DNA)(具有P寡核苷酸序列且携带5’磷酸根的单股DNA)连接至该去磷酸化的ssRNA片段的3’端以形成ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股；
(c)通过以ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股作为模板且添加T寡核苷酸(DNA)(具有与该P寡核苷酸(DNA)互补的T寡核苷酸序列的单股DNA)作为引子进行第一反转录反应，以合成与该ssRNA片段互补的互补DNA(cDNA)股，以产生cDNA-T寡核苷酸(DNA)股，从而形成由该ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股与该cDNA-T寡核苷酸(DNA)股组成的初始RNA/DNA杂合体；
(d)将T寡核苷酸(RNA)(与该P寡核苷酸(DNA)互补的单股RNA)连接至该初始RNA/DNA杂合体中的该ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股的5’端，以形成T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股，从而形成由该T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股与该cDNA-T寡核苷酸(DNA)股组成的中间物RNA/DNA杂合体，其具有非互补T寡核苷酸(RNA)悬垂；
(e)以该非互补T寡核苷酸(RNA)悬垂作为延伸模板进行第二反转录反应以取得完整cDNA股，其5’端具有该T寡核苷酸序列且3’端具有该P寡核苷酸序列，从而形成该T寡核苷酸(RNA)-ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股与该完整cDNA股的完整RNA/DNA杂合体；
(f)从该完整RNA/DNA杂合体移除该ssRNA片段与该T寡核苷酸(RNA)以产生部分、双股DNA，其包含该完整cDNA股在其5’端与P寡核苷酸(DNA)部分地杂合化；以及
(g)利用此完整cDNA股作为PCR模板与具有该T寡核苷酸序列的T寡核苷酸引子进行聚合酶链反应(PCR)，以启始合成双股DNA产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中该ssRNA片段包含表示个体的健康/疾病状态的核酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其中该ssRNA片段存在于个体(如，患病的个体)的样本中。
4.如权利要求3所述的方法，其中该样本取自体液。
5.如权利要求3所述的方法，其中该样本为个体的血液、尿液、唾液、泪液、汗液、母乳、鼻分泌物、羊水、精液、或阴道分泌物。
6.如权利要求1所述的方法，其中该ssRNA片段为无细胞RNAs(cfRNAs)或囊泡中的RNAs(vc-RNAs)。
7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)之前，该ssRNA-P寡核苷酸(DNA)股是经磷酸化。
8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(g)中，该T寡核苷酸引子为唯一用于放大的引子。
9.如权利要求1所述的方法，其中该ssRNA片段是以0.01ng至100ng或更少量的初始投入量(总RNA)存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中该ssRNA片段是以0.01ng或10ng或更少量的初始投入量(总RNA)存在。
11.如权利要求1所述的方法，其中该ssRNA片段是以0.01ng至100ng或更多量的初始投入量(总RNA)存在。
12.如权利要求1所述的方法，其更包含检测该放大的cDNA产物。
13.如权利要求12所述的方法，其中该检测是利用质谱法、杂合法、或定序法进行。
14.如权利要求1所述的方法，其中不包括纯化步骤。
15.一种RNA评估的方法，其包含：
(i)提供个体的生物流体样本，其中该生物流体包括ssRNA片段；
(ii)进行如权利要求1的方法，以将该ssRNA片段转换为DNA片段及放大该DNA片段；以及
(iii)分析该放大的DNA片段，以测量该放大的DNA片段的一或多个特征。
16.如权利要求15所述的方法，其中该分析步骤包括定序、匹配、及/或比对。
17.一种进行如权利要求1所述的方法的试剂盒，其包含：
(i)去磷酸化试剂，其包含碱性磷酸酶与去磷酸化缓冲液；
(ii)连接试剂，其包含连接酶、连接缓冲液、该P寡核苷酸(DNA)、及该T寡核苷酸(RNA)；
(iii)磷酸化试剂，其包含激酶与激酶缓冲液；
(iv)反转录试剂，其包含反转录酶(RT)、RT缓冲液、dNTP、及该T寡核苷酸(DNA)；
(iv)RNA消化试剂，其包含RNase与RNase缓冲液；以及
(v)PCR试剂，其包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、及该T寡核苷酸引子。
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