FR2842211A1

FR2842211A1 - Procede et moyens pour l'analyse quantitative du nombre des molecules d'arnm codant pour des genes differents dans des cellules

Info

Publication number: FR2842211A1
Application number: FR0208593A
Authority: FR
Inventors: Benedita Rocha; Fernandes Henrique Veiga; Antonio Peixoto
Original assignee: INSTITUT NECKER
Current assignee: INSTITUT NECKER
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2004-01-16
Also published as: WO2004007763A3; EP1552006A2; AU2003264700A1; WO2004007763A2

Abstract

L'invention concerne un procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, de préférence sur une seule cellule, dans lequel:- on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase (par RT-ACP) de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées,- on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, et- on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, tandis que:- ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association d'amorces 5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant identiques aux amorces 3' utilisées pour la transcription inverse,- on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré,- on contrôle l'efficacité de la transcription inverse, au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase des ADNc de l'un des gènes concernés, parallèlement à la même amplification des molécules d'ARNm du même gène, sur des échantillons cellulaires contenant le même nombre de molécules, et- on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification.

Description

PROCÉDÉ ET MOYENS POUR L'ANALYSE QUANTITATIVE DU
NOMBRE DES MOLÉCULES CODANT POUR DES GÈNES
DIFFÉRENTS DANS DES CELLULES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la biologie. Elle concerne plus précisément l'analyse et le diagnostic en biologie, et plus particulièrement encore l'analyse quantitative du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau des cellules animales ou végétales. L'invention trouve des applications dans tous les secteurs de la biologie et/ou de la médecine, dans lesquels il est utile de pouvoir connaître un tel nombre de molécules d'acides nucléiques codantes, à des fins aussi bien de diagnostic que de traitement et/ou de suivi médical.

L'invention repose sur une approche méthodologique utilisant un système multiplex de techniques d'amplification, notamment par RT-ACP (ou RT-PCR en anglais), appliqué à des molécules d'acide nucléique codant pour des gènes différents exprimés au niveau des cellules.

Bien que cela ne soit pas limitatif, l'invention peut être mise en pratique préférablement sur un très petit nombre de cellules ou même sur une cellule unique.

ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE
De nos jours, il est nécessaire de pouvoir caractériser un nombre de plus en plus restreint de cellules si l'on veut pouvoir faire progresser les méthodes de diagnostic. A cet effet, les méthodes de séparation et d'isolement connues de l'homme du métier permettent maintenant de subdiviser des populations complexes en des sous-populations ayant des caractéristiques phénotypiques différentes, probablement associées à des fonctions biologiques différentes. Certaines populations cellulaires (par exemple les cellules précurseurs ou "stem cells") sont habituellement présentes dans des proportions inférieures à 1% dans les matières biologiques qui les contiennent. Ainsi chez l'homme, pour lequel ces populations minoritaires sont habituellement recueillies à partir du sang périphérique, le nombre limité de cellules qui peuvent être récupérées

constitue une limitation considérable pour toute approche diagnostique utilisant la technique de transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase ou RT-ACP (en anglais "RT-PCR").

Classiquement, la quantification de l'expression génique de cellules à ARN nécessite l'extraction de l'ARNm. Or, les techniques d'extraction d'ARNm ne sont pas très efficaces. Cette limitation inhérente aux techniques d'extraction mises en oeuvre oblige à utiliser un nombre relativement important de cellules (d'ordinaire au moins 100. 000 cellules) pour en extraire l'ARNm. Or, l'efficacité de l'extraction de l'ARNm diminue au fur et à mesure qu'on réduit le nombre des cellules. Même quand environ 100.000 cellules sont utilisées, l'efficacité de l'extraction d'ARNm est faible. Ces données entraînent alors deux types de limitations, à savoir respectivement le nombre de cellules qui peuvent être étudiées et le nombre de fonctions/caractéristiques qui peuvent être déterminées dans chaque population de cellules étudiée.

Les techniques de RT-ACP actuelles, même celles appelées "quantitatives" ne permettent pas la quantification du nombre des cellules d'ARNm exprimées. Elles permettent tout au plus de comparer l'amplification d'un témoin interne d'ADNc avec l'ADNc exprimé par une population cellulaire. Ces techniques font l'impasse sur un paramètre important, l'efficacité de la transcription inverse, qui peut varier avec le type et/ou la concentration d'ARNm, la localisation du fragment d'ADN à amplifier, et l'enzyme utilisée pour la transcription inverse.

Par ailleurs, dans la majorité des cas où l'on amplifie actuellement des gènes différents par des techniques de RT-ACP, on peut comparer l'expression d'un même gène dans des populations différentes, mais on ne peut pas comparer l'expression relative de plusieurs gènes dans la même population. C'est ainsi qu'il n'est pas possible de déterminer si une population de cellules exprime plus d'ARNm codant pour un gène que pour un autre.

Même avec les techniques actuellement pratiquées, selon lesquelles on tente de quantifier les produits d'amplifications par RT-ACP, l'interprétation des résultats est trompeuse s'il s'agit d'une population cellulaire.

En effet, si l'on s'appuie sur la quantification au niveau d'une population de cellules, le nombre total peut provenir aussi bien de quelques

cellules exprimant des taux élevés d'ARNm que de très nombreuses cellules n'exprimant chacune que de faibles quantités d'ARNm. Il est aisé de conclure que les significations de ces deux occurrences n'ont rien de comparable, et que par conséquent les prétendus résultats que l'on tire de telles méthodes sont fortement sujets à caution, comme cela sera montré plus loin.

Les phénomènes de différenciation cellulaire impliquent aussi fréquemment plusieurs gènes simultanément. Ils peuvent être associés à l'induction ou l'extinction de l'expression d'un groupe de gènes, ou à la variation de la proportion de l'expression de ces mêmes gènes. L'évaluation de ces paramètres dans une population cellulaire est donc également trompeuse. Elle ne permet pas de connaître le profil d'expression génique de chaque cellule individuelle. Par exemple, la fonction cytotoxique des lymphocytes T implique la co-expression simultanée de perforine et granzymes dans la même cellule. Or seules les cellules co-exprimant ces deux gènes sont des cellules efficaces du point de vue cytotoxique. Les méthodes reposant sur l'étude des populations cellulaires ne permettent pas de savoir si les gènes étudiés sont exprimés par la même cellule ou par des cellules différentes, présentes dans la même population cellulaire. Seules des études de co-expression par des cellules uniques pourraient permettre la détermination des programmes de différenciation qui imposent un profil génétique particulier pou chaque cellule individuelle différenciée.

Les études effectuées jusqu'à ce jour par des techniques d'amplification sur une cellule unique ont visé à améliorer cette situation et à procurer des résultats interprétables plus directement et avec plus de fiabilité. Elles n'ont cependant toujours pas permis une appréciation absolue au sens vrai, et donc ne procurent pas un outil de quantification suffisamment fiable.

Ainsi, D. Lôffert et al., dans Immunity, vol. 4,133-144, février 1996, éd.

Cell Press, décrivent l'étude de l'exclusion allélique sur le locus ou emplacement IgH dans des cellules B de souris au moyen d'une approche par ACP sur cellule unique, pour conclure qu'une telle exclusion allélique nécessite l'expression du récepteur de cellules pré-B soit contenant une chaîne , soit contenant une chaîne Du.. L'étude porte sur les rôles respectifs de la chaîne et de son récepteur de cellule pré-B dans cette exclusion allélique, par l'analyse du réarrangement du gène d'IgH. Le mode opératoire

utilisé met en oeuvre un triage de cellules pour traitement d'une seule cellule, ainsi qu'une ACP classique pour amplification de l'ADN génomique, accompagnée d'une hybridation croisée des amorces. Cette méthode portait sur l'amplification de l'ADN et non pas de l'ARN.

M. Correia-Neves et al., dans Immunity, vol. 14,21-32, janvier 2001, éd. Cell Press, traitent du répertoire des cellules T et de son évolution. Ils préconisent pour cette étude d'utiliser une ACP sur cellule unique et un séquençage à haut débit. Cette étude a été faite avec de l'ARNm et de l'ADN.

Dans le cas des deux dernières études susdites, même si plusieurs amorces ont été utilisées dans l'ACP, un seul fragment génique a été amplifié dans chaque cellule (soit respectivement la chaîne lourde des Ig ou la chaîne P du récepteur de cellules T (TCR)). Dans ces circonstances, ces réactions d'ACP n'avaient pas les mêmes exigences que les systèmes multiplex, dans lesquels plusieurs gènes doivent être amplifiés dans la même cellule. Elles n'imposent pas de restrictions associées à la compétition entre les amorces et les différents produits d'ACP, présents dans le même puits. De plus, les deux dernières études susdites n'étaient pas quantitatives et l'efficacité de l'amplification (dans ces deux études) et de la transcription inverse (dans les travaux de M. Correia-Neves, et al. ) n'a pas été déterminée.

Des études précédentes du groupe de recherche dont font partie les présents inventeurs (voir H. Veiga-Fernandes et al., dans Nature Immunology (immunol.nature.com), vol. 1, No. 1, juillet 2000) concernent l'influence des propriétés des cellules T mémoire sur l'efficacité des réponses immunes secondaires, en comparant la réponse immune in vivo des mêmes nombres de cellules T naïves et des cellules T mémoire avec le même récepteur de cellules T. La méthode utilisée comporte une analyse par ACP sur cellule unique, en deux étapes, avec indication de ce que les amorces 3' de l'ACP sont les mêmes que celles utilisées pour la transcription inverse.

Dans cette étude, il est précisé par les auteurs que les RT-ACP sur cellule unique ne sont pas quantitatives, et seulement quatre gènes ont ainsi pu être étudiés selon une approche comparative.

U. Walter et al., dans Eur. J. Immunol. 2000,30: 1224-1232, décrivent le suivi de l'expression génique de membres de la famille du récepteur de facteur de nécrose tumorale par une ACP multiplex sur cellule unique, avec pour résultat la mise en évidence de la contribution apoptotique de cellules ss

comme facteur de progression du diabète auto-immun. Tout comme pour les études antérieures mentionnées plus haut, les méthodes utilisées n'étaient pas quantitatives, l'expression relative des gènes n'a pas été comparée, et l'efficacité de la transcription inverse et des réactions d'ACP n'a pas été déterminée. De plus, ces auteurs font état d'une limitation importante de leur technique, à savoir l'impossibilité d'associer plus de 5 gènes dans le même multiplex, en faisant état des effets fortement inhibiteurs de cette association.

B. Rocha, dans Nature Immunology (immunol. nature.com), vol. 3, No.

3, mars 2002, décrit l'influence sur la mémoire immune à long terme des signaux reçus via le CMH par les cellules concernées. Il est indiqué que l'étude de la fonction des cellules T nécessite des tests nouveaux et plus précis, et des approches plus complexes de l'analyse du fonctionnement des cellules T.

Il y avait donc un besoin pour une technique réellement fiable et quantifiant de façon absolue l'expression des gènes respectifs sur une cellule unique ou sur un très petit nombre de cellules.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION
Conformément à la présente invention on a maintenant trouvé de manière inattendue que l'on peut procurer de tels résultats, notamment une quantification absolue du nombre de molécules d'ARNm codant pour des gènes différents dans des cellules contenant ceux-ci, en mettant en oeuvre des techniques d'amplification sur un très petit nombre de cellules, ou même sur une cellule unique, dans des conditions et avec des paramètres opératoires qui seront exposés plus loin.

La présente invention procure ainsi un procédé pour l'analyse quantitative par RT-ACP ou une technique équivalente in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, ou même sur une seule cellule, dans lequel: on effectue une transcription inverse (ou réverse-transcription, en abrégé RT) avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas l'inhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse et dans un récipient séparé, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de

l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de 1 à 1000 cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis que dans ledit procédé on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise en référence aux dessins annexés, qui illustrent certains résultats ayant trait aux moyens préconisés selon l'invention et aux résultats obtenus par leur mise en oeuvre, et dans lesquels: Fig. 1 représente un graphe illustrant l'expression comparée d'ARNm de
HPRT et de yIFN, entre autres, selon une technique traditionnelle.

Fig. 2 est un graphe montrant la quasi-identité de l'amplification par
ACP d'ADN et d'ARN.

Fig. 3 représente un graphe en deux parties concernant respectivement une première et une deuxième ACP conduites en temps réel sur des populations de cellules T intestinales exprimant toutes les fonctions effectrices. Fig. 3a a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de première ACP ; 3b a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de deuxième ACP.

Fig. 4 représente un graphe montrant les amplifications par ACP en temps réel de perforine et de HPRT, dans des deuxièmes réactions d'ACP au sens de la présente invention. Fig. 4a montre les résultats obtenus après une première ACP effectuée avec toutes les amorces simultanément conformément à l'invention ; 4b représente les résultats obtenus lorsque seules les amorces pour la perforine et le HPRT étaient présentes dans la première réaction d'ACP.

Fig. 5 est un graphe illustrant les résultats comparés obtenus avec une première amplification par ACP sur un nombre variable de cycles (5,15 et 20 respectivement), ainsi que l'incorporation de Sybr-

Green dans une deuxième amplification par ACP, chaque courbe correspondant à une cellule individuelle.

Fig.6 est une illustration schématique de la succession des étapes fondamentales du procédé selon l'invention.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'invention a pour premier objet un procédé pour l'analyse quantitative par RT-ACP ou une technique équivalente in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, ou même sur une seule cellule, dans lequel: on effectue une transcription inverse (RT) avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas l'inhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse et dans un récipient séparé, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de 1 à 1000 cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis qu'on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.

En pratique, on préconise d'utiliser pour ledit étalonnage, au moins une référence composée d'un nombre variable de molécules d'ADNc, en parallèle avec le même nombre de molécules d'ARNm, l'amplification simultanée de ce moyen d'étalonnage permettant de vérifier l'efficacité de la RT pour des concentrations différentes de la molécule d'ARNm, en même temps que l'efficacité de l'ACP.

Dans une forme de réalisation du procédé selon l'invention, la première et/ou la deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sont mises en oeuvre au moyen d'une technique connue utilisant la méthodologie de la RT-ACP. En variante, cette RT-ACP peut être une RTACP nichée ("nestée").

Le principe général qui est à la base de la présente invention consiste ainsi en un système multiplex de RT-PCR pour une telle analyse quantitative, dans lequel on conduit successivement au moins deux réactions d'ACP, dont la première est effectuée sur les produits d'une réaction de transcription inverse (RT), avantageusement elle-même effectuée en double, c'est-à-dire respectivement au moins une RT spécifique et au moins une RT étalonnée, puis après individualisation des gènes d'intérêt issus de la première réaction d'ACP, on effectue une deuxième réaction d'ACP ou une réaction équivalente, dont les résultats sont analysés.

Dans ce procédé, la transcription inverse est mise en oeuvre d'une manière classique pour ce type de technique.

Selon une forme de réalisation, ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association appropriée d'amorces 5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant avantageusement choisies identiques aux amorces 3' utilisées dans la transcription inverse.

Pour la réalisation de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on utilise avantageusement ensemble toutes les amorces 3' et 5' appropriées pour la totalité des gènes contenus dans lesdites cellules.

Selon une forme de réalisation avantageuse, on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré.

Une caractéristique prévoit la mise en oeuvre d'un étalonnage permettant le contrôle et l'évaluation de l'efficacité de la transcription inverse et de l'ACP. Selon une réalisation, ce contrôle s'effectue au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase de différentes concentrations d'ADNc à différentes concentrations de l'un des gènes concernés dans le procédé, parallèlement à la même amplification du même nombre de molécules d'ARNm du même gène. Les calculs que l'homme du métier peut alors effectuer sur la base de ses connaissances permettent ainsi de déterminer des nombres de copies absolus. Pour ce faire, on utilise des courbes témoin avec différents nombres de copies. Chaque cellule possède deux copies d'ADN codant pour un gène. En parallèle avec les RT-ACP, on établit donc une échelle de référence, fondée sur une gamme de nombres de

cellules (par exemple 1 cellule/2 cellules/4 cellules/8 cellules) contenant respectivement 2/4/8/16 copies du même gène. On peut ensuite calculer dans chaque cas les nombres de copies à partir de ces courbes d'amplification, et ainsi déterminer en parallèle l'efficacité et la reproductibilité des réactions de RT et d'ACP mises en oeuvre.

Dans la pratique, il convient de veiller à ce que les amorces choisies ne donnent pas lieu à une compétition entre elles. En pratique cela revient à faire en sorte que les amorces utilisées dans la RT-ACP multiplex n'hybrident pas entre elles et que les produits de la réaction d'amplification en chaîne par polymérase amplifiés grâce à elles n'hybrident pas entre eux de telle manière qu'il y ait compétition ou inhibition d'amplification dans ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase.

Avantageusement les amorces utilisées sont conservées à environ -80 C jusqu'à leur utilisation.

Selon une forme de réalisation préférée, on réduit la concentration des amorces dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase.

La technique selon l'invention permet ainsi de vaincre les deux limitations de la technique antérieure, indiquées plus haut. Elle n'utilise pas d'extraction de l'ARNm et permet l'étude et la quantification d'un nombre quelconque de cellules, jusqu'à une cellule unique. Elle permet en outre l'étude simultanée de plusieurs ARNm, en pratique d'un nombre d'ARNm différents allant jusqu'à 19, dans un nombre de cellules quelconque, y compris dans une seule cellule.

Elle est à notre connaissance la première à permettre la quantification du nombre absolu de molécules d'ARNm, en fournissant un étalon interne permettant l'évaluation de l'efficacité de la transcription inverse, ainsi que l'évaluation de l'efficacité de l'amplification par ACP.

La technique selon l'invention permet en pratique la comparaison fiable d'environ 20, avantageusement de 2-19 gènes, entre eux. Elle permet de déterminer, dans une cellule quelconque, le nombre de molécules d'ARNm codant pour l'expression de ces 2 à 19 gènes simultanément.

Cette technique permet l'étude d'un nombre quelconque de cellules, inclusivement de cellules uniques. Elle est pour la première fois réellement quantitative, et permet la quantification du nombre des molécules d'ARNm exprimées. Elle permet la comparaison, en valeurs absolues, du nombre de molécules d'ARNm codant pour plusieurs gènes simultanément. L'ensemble de ces caractéristiques introduit un progrès considérable dans le diagnostic et la recherche, en particulier chez l'homme ou l'animal. En permettant la quantification du nombre de molécules d'ARNm codant pour plusieurs

gènes simultanément au niveau d'une cellule unique, cette technique permet pour la première fois d'établir des programmes de différenciation cellulaire.

Sous un autre aspect, le premier objet de la présente invention est un procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'ARNm codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, de préférence sur une seule cellule, dans lequel: on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase (par RT-ACP) de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, tandis que les amorces choisies sont placées dans des exons différents, pour permettre la reconnaissance de l'amplification de l'ARNm, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés.

On est alors en mesure d'évaluer les résultats de cette dernière.

Selon une caractéristique préférée, les amorces choisies dans le procédé ci-dessus sont placées dans des exons différents de telle sorte qu'elles ne puissent pas amplifier l'ADN.

Il s'est avéré avantageux de sélectionner la (les) de gène à amplifier dans cette première réaction d'amplification, en pratique par une étude préalable détaillée des gènes concernés, afin de sélectionner des portions de ceux-ci ayant une structure similaire et une sensibilité comparable à la transcription inverse et à l'amplification en chaîne par polymérase. Egalement, pour une efficacité similaire de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on veille à ce que les fragments amplifiés aient la même taille. De plus, dans ce contexte, plus lesdits fragments sont courts, plus la réaction de RT-ACP est efficace. Ainsi, il est recommandé de sélectionner des fragments d'acide nucléique ayant environ 300 à 400 paires de bases dans ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase. De plus, il est également avantageux que les fragments d'acide nucléique à amplifier dans ladite deuxième réaction d'amplification soient plus courts, c'est-à-dire aient environ 150 paires de bases (pb).

Par ailleurs, dans le procédé selon l'invention, dans lequel plusieurs gènes différents peuvent être traités selon un mode multiplex, il s'est avéré particulièrement avantageux d'utiliser dans l'étape de transcription inverse des tampons n'induisant pas l'inhibition des réactions d'ACP, tels que par

exemple un tampon identique ou semblable à celui qu'on prévoit d'utiliser dans les réactions d'ACP, contrairement au cas des tampons de transcription inverse conventionnels. On préconise par conséquent pour la transcription inverse selon l'invention des tampons avantageusement choisis parmi les tampons utilisés classiquement pour les réactions d'ACP.

Cet aspect est déterminant pour permettre d'augmenter le nombre des gènes que l'on peut tester dans le système multiplex concerné.

Selon une forme de réalisation, on conduit la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur un nombre de cycles tel que l'on dispose ensuite d'assez de copies dans l'échantillon recueilli pour introduction dans la deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase, afin de conférer une bonne reproductibilité à celle-ci.

Avantageusement, pour 16 copies ou plus introduites dans la première ACP, une première amplification avec environ 10 cycles s'est avérée suffisante, tandis que pour un nombre de copies entre 16 et 2, on a pu établir que 20 cycles environ de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase étaient nécessaires.

Selon une autre caractéristique, on a établi que le nombre de cycles dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase devait être assez faible pour prévenir tout risque d'une accumulation atteignant des niveaux de saturation dans ladite première réaction d'amplification. Là encore, les expériences ont montré qu'environ 10 cycles dans ladite première réaction d'amplification devrait constituer un optimum pour un nombre de molécules d'ARNm entre 16 et 60 environ.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un kit d'analyse et/ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, ledit kit comportant: - des moyens pour l'étalonnage interne de l'ARN et celui de l'ADNc, - l'ensemble ou mélange des amorces pour la première ACP, - des amorces spécifiques pour chaque gène à soumettre à la deuxième
ACP, et - en option, un étalon interne et/ou un étalon interne sur base d'ADN, et, en option, également des tampons de lyse, de transcription inverse et/ou d'amplification, et tous autres composants conventionnels souhaités.

Les amorces sont avantageusement conçues et/ou choisies de manière à ne pas être compétitives.

Selon une forme de réalisation, ledit kit est utilisé avec ou comporte un intercalant de l'ADN, avantageusement un tel intercalant commercialisé sous la dénomination Sybr-Green (Sybr-Green Master Mix, de la société Perkin-Elmer).

Un tel kit est avantageusement fourni avec des indications d'utilisation appropriées pour procurer des précisions sur les conditions d'utilisation du kit par l'usager.

Selon une forme de réalisation, ledit kit comporte en outre des instructions pour l'utilisation des amorces sens et anti-sens dans des réactions de RT-ACP pour la quantification du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule.

Dans la pratique, le kit selon l'invention peut être mis en oeuvre et/ou utilisé dans différents niveaux de sophistication.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel kit ou du procédé tel que décrit plus haut, pour la quantification de gènes individuels, en particulier pour l'étude de l'expression génique dans un matériel biologique, en particulier pour l'étude et/ou l'évaluation quantitative, comparée et simultanée, de l'expression de multiples gènes au niveau d'une seule cellule ou d'un petit nombre de cellules d'un matériel biologique.

En pratique, bien que cela ne soit nullement limitatif, il est préféré de procurer dans un tel kit des moyens pour la réalisation simultanée de l'analyse quantitative, comparative et simultanée du nombre de molécules d'ARNm codant pour un maximum pratique de 19 gènes différents exprimés au niveau d'une cellule unique. Au-delà de ce nombre, on ne peut trouver aisément dans les séquences des gènes étudiés de possibilité réelle de noncompétition entre elles.

De manière plus générale, l'invention présente un intérêt majeur dans le domaine des tests cliniques sur les animaux, y compris l'homme.

L'invention est décrite plus en détail ci-après, en référence à des modes opératoires utilisés pour des expérimentations effectuées tant à des fins d'investigation que pour la réalisation d'essais in vitro ou ex vivo.

Plus spécifiquement, l'invention est maintenant décrite en référence à un système multiplex qui a été développé pour l'étude ex vivo de la différenciation des cellules T dans un organisme. Ce multiplex mis en oeuvre conformément à l'invention a permis d'évaluer avec quantification absolue l'expression de l'ARNm codant pour au moins dix neuf gènes simultanément présents dans une cellule.

Mode opératoire
On a trié des cellules T individuelles de souris C57 Bl/6 au moyen d'un équipement pour FACS (en particulier celui commercialisé sous la dénomination FACS Vantage par la société Becton Dickinson), équipé d'une unité de déposition de cellules automatique, agencée pour le dépôt des cellules directement dans des tubes pour ACP dans lesquels on avait préalablement introduit 5 \il de PBS-DEPC lx par tube.

On a lysé les cellules en les refroidissant à -80 C. Ensuite, immédiatement avant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on a chauffé les cellules à 65 C pendant 2 minutes.

Après refroidissement à 4 C, on a effectué une transcription inverse de l'ARN pendant 1 h à 37 avec 0,13 M d'amorces 3' spécifiques (voir plus loin) dans un volume de 10 l contenant également du tampon II 10x (Perkin-Elmer, Brauchburg, NJ), MgCl2 2 mM (Perkin-Elmer), dNTP 1 mM (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), un agent bloquant de RNase (2,6 U/ l) (Stratagene, La Jolla, CA) et du M-MLV (2,3 U/ l) (Perkin-Elmer). La réaction a été stoppée par incubation 3' à 95 C.

Les ADNc ont été amplifiés par une réaction d'ACP nestée, en deux étapes.

Le premier round d'ACP consistait en 10 cycles d'amplification (incubation initiale pendant 10 min à 95 C; puis 45 s à 94 C; 1 min à 60 C; 1 min 30 s à 72 C) avec du tampon II lx (Perkin-Elmer), MgCl2 1,2 mM (Perkin Elmer), dNTP 0,2 M (Perkin-Elmer), 0,035 U/ l de Taq polymérase GOLD (Perkin-Elmer) et 0,01 M d'amorces spécifiques dans un volume de 85 l.

Les produits de cette première ACP (2 l) ont ensuite été répartis pour mise en oeuvre d'une deuxième amplification par ACP portant sur chaque gène individuel d'intérêt, ainsi préalablement séparé. L'amplification selon cette deuxième ACP a ensuite été conduite pendant 60 cycles. La dénaturation initiale a été opérée pendant 5 min à 95 C, suivie de 30 s à 94 C, 30 s à 60 C et 30 s à 72 C, dans 20 l de milieu contenant un mélange d'intercalant d'ADN commercialisé sous la dénomination Sybr-Green Master Mix (Perkin-Elmer) et 0,25 M d'amorces spécifiques, et on a amplifié par ACP en temps réel avec utilisation d'un appareil d'amplification Taqman (PCR System 7700).

Pour ces réactions respectivement de RT et de 1ère et 2ème ACP, on a élaboré les mélanges et/ou ensembles d'amorces suivants, utilisables à convenance en fonction des besoins pour chacun des gènes respectivement indiqués, à titre d'exemples: TNF bêta A. 5'-TCAGGATCCTACCTCCTTTC-3' (SEQ ID N0.1) B. 5'-ATCAGGAGGGAGTTGTTGCT-3' (SEQ ID NO.2) C. 5'-TTCTCCACATGACACTGCTC-3' (SEQ ID NO.3) TNF alpha A. 5'-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3' (SEQ ID N0.4) B. 5'-AACCTGGGAGTAGACAAGGT-3' (SEQ ID NO.5) C. 5'-CCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3' (SEQ ID NO.6) Granzyme B A. 5'-GTCAATGTGAAGCCAGGAGA-3' (SEQ ID NO.7) B. 5'-AGGATCCGATGTTGCTTCTG-3' (SEQ ID NO.8) C. 5'-GGGAGTGTGAGTCCTACTTT-3' (SEQ ID NO.9) CD40 ligand A. 5'-TCCTTGCTGAACTGTGAGGA-3' (SEQ ID NO.10) B. 5'-TGCCGCCTTGAGTAAGATTC-3' (SEQ ID NO.11) C. 5'-ACACGTTGTAAGCGAAGCCA-3' (SEQ ID NO.12) IL-4 A. 5'-TGACGGCACAGAGCTATTGA-3' (SEQ ID NO.13) B. 5'-ATGGTGGCTCAGTACTACGA-3' (SEQ ID NO.14) C. 5'-AGAGAGTGAGCTCGTCTGTA-3' (SEQ ID NO.15)

HPRT A. 5'-TTCTTTGCTGACCTGCTGGA-3' (SEQ ID NO.16) B. 5'-ATCCAACACTTCGAGAGGTC-3' (SEQ ID NO.17) C. 5'-GGTGGAGATGATCTCTCAAC-3' (SEQ ID N0.18) D. 5'-CTGTACTGCTTAACCAGGGA-3' (SEQ ID NO.19) IFN gamma A. 5'-GCTCTGAGACAATGAACGCT-3' (SEQ ID N0.20) B. 5'-AAAGAGATAATCTGGCTCTGC-3' (SEQ ID NO.21) C. 5'-TGTTTCTGGCTGTTACTGCC-3' (SEQ ID NO.22) IL-2 A. 5'-TCAAGTCCTGCAGGCATGTA-3' (SEQ ID NO.23) B. 5'-TCAATTCTGTGGCCTGCTTG-3' (SEQ ID NO.24) C. 5'-CTCTACAGCGGAAGCACAGC-3' (SEQ ID N0.25) Perforine A. 5'-TCACACTGCCAGCGTAATGT-3' (SEQ ID NO.26) B. 5'-CTGTGGTAAGCATGCTCTGT-3' (SEQ ID NO.27) C. 5'-CACAGTAGAGTGTCGCATGT-3' (SEQ ID N0.28) Granzyme A A. 5'-TCAAATACCATCTGTGCTGG-3' (SEQ ID NO.29) B. 5'-AGAGGGAGCTGACTTATTGC-3' (SEQ ID NO.30) C. 5'-GGGATCTACAACTTGTACGG-3' (SEQ ID NO.31) Fas ligand A. 5'-TTCATGGTTCTGGTGGCTCT-3' (SEQ ID NO.32) B. 5'-GAGCGGTTCCATATGTGTCT-3' (SEQ ID N0.33) C. 5'-TGTATCAGCTCTTCCACCTG-3' (SEQ ID NO.34) TGF bêta A. 5'-ACCATCCATGACATGAACCG-3' (SEQ ID NO.35) B. 5'-CAATCATGTTGGACAACTGC-3' (SEQ ID NO.36) C. 5'-GCTACCATGCCAACTTCTGT-3' (SEQ ID NO.37) CD3 epsilon A. 5'-ACCAGTGTAGAGTTGACGTG-3' (SEQ ID NO.38) B. 5'-TATGGCTACTGCTGTCAGGT-3' (SEQ ID NO.39) C. 5'-GCTACTACGTCTGCTACACA-3' (SEQ ID N0.40)

IL-10 A. 5'-TGGGAACTGAGGTATCAGAG-3' (SEQ ID N0.41) B. 5'-TGGAGCAGGTGAAGAGTGAT-3' (SEQ ID N0.42) C. 5'-CCAGCAGACTCAATACACAC-3' (SEQ ID N0.43) TGF bêta RI A. 5'-GTCTCAGTCACTGAGACCA-3' (SEQ ID NO.44) B. 5'-AGGTGAATGACAGTGCGGTT-3' (SEQ ID N0.45) C. 5'-TGCAATCAGGACCACTGCAA-3' (SEQ ID N0.46) TGF bêta RII A. 5'-AGATGCATCCATCCACCTAA-3' (SEQ ID N0.47) B. 5'-TGCACTCTTCCATGTTACAG-3' (SEQ ID N0.48) C. 5'-CGATGTGAGACTGTCCACTT-3' (SEQ ID N0.49) TGF bêta RIII A. 5'-GAGTGAACGATCCATGACAG-3' (SEQ ID NO.50) B. 5'-TGACTGACAGGGCGATATTC-3' (SEQ ID NO.51) C. 5'-CATTGGACAATGGCTACAGC-3' (SEQ ID N0.52) IL10R alpha A. 5'-AACAGTCAGTACTCCAACT-3' (SEQ ID N0.53) B. 5'-CTGCTCCGTCGTGATAAGTA-3' (SEQ ID NO.54) C. 5'-CGGCATCATCTATGGGACAA-3' (SEQ ID N0.55) IFNgamma RII(bêta) A. 5'-GGACATCACAGAGACAAAGT-3' (SEQ ID N0.56) B. 5'-CTGTATGGCTTCAGATTGCC-3' (SEQ ID NO.57) C. 5'-CAGTAGTGGACAAGATACTG-3' (SEQ ID NO.58) où A désigne une amorce sens pour la 1ère ACP, B représente une amorce anti-sens pour la 1ère ACP, une amorce anti- sens pour la 2ème ACP (sauf pour le gène HPRT) et une amorce de
RT, C désigne une amorce sens pour la 2ème ACP, et D représente une amorce antisens pour la 2ème ACP, ici pour le gène de
HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase) uniquement.

Il est en outre recommandé, d'utiliser de l'eau exempte de nucléase (fournie par exemple par Promega); de ne pas décongeler les amorces (aussi bien de RT que d'ACP) plus de deux fois et de les aliquoter et les conserver au froid; d'utiliser des espaces ou volumes séparés pour respectivement la RT, la 1ère ACP et la 2ème ACP.

Elaboration et sélection des amorces
Pour l'élaboration de ces amorces, on a suivi la méthodologie suivante, dont tous les paramètres individuels et leurs combinaisons techniquement possibles font partie intégrante de la présente invention: les régions cibles pour l'amplification, dans le gène d'intérêt à amplifier, devaient être non-répétitives; les amorces ont été élaborées dans différents exons de la région cible de telle sorte que la région d'amplification comporte toujours au moins un intron; la teneur en GC de chaque amorce était approximativement de 50% ; la taille du fragment d'amplification était la même pour chaque gène, dans la première réaction d'ACP; les amorces pour la 2ème ACP spécifique étaient dans une position plus interne, par comparaison avec la combinaison d'amorces pour la lère ACP ; toutes les amorces ont été conçues pour qu'elles n'hybrident pas entre elles; également, toutes les amorces devaient pouvoir hybrider seulement dans les régions d'amplification spécifiques et pas avec tous autres produits d'amplification des autres gènes ; on a utilisé en pratique un programme d'ordinateur, dénommé Amplify 1. 2, disponible librement, pour s'assurer de la compatibilité des combinaisons d'amorces.

Détermination de la quantité de molécules d'ARN
Pour la détermination du nombre de molécules d'ARN pour n'importe quel gène donné, on a procédé par interpolation d'un échantillon quelconque, en utilisant une droite d'évolution (ou courbe de tendance), que l'on avait tracée par enregistrement sous forme graphique d'une série de dilutions provenant d'un échantillon ayant un nombre déterminé de molécules d'ARN synthétisées in vitro, en fonction du Ct (cycle de seuil, ou en anglais Cycle of threshold) d'une ACP quantitative en temps réel de ces mêmes dilutions en série.

En d'autres termes, le Ct d'un échantillon quelconque est déterminé par l'ACP quantitative en temps réel conformément au procédé de RT-ACP selon l'invention, avec enregistrement et tracé graphique optionnel pour le nombre n de molécules d'ARN dans chaque échantillon, ce qui permet alors la détermination du nombre de molécules d'ARN dans tout échantillon en contenant.

Détermination de l'efficacité de la transcription inverse
L'efficacité de la transcription inverse est la capacité de l'enzyme concernée, la transcriptase inverse, à fournir de l'ADNc à partir d'ARNm à partir de n'importe quel gène déterminé. Cette efficacité peut être exprimée en termes de pourcentage de molécules d'ADNc produites par rapport au nombre total des molécules d'ARN présentes au début de la réaction.

Ainsi, pour la détermination de l'efficacité de la transcription inverse, on utilise différentes quantités connues de molécules d'ARN pour un gène défini dans la transcription inverse. Après avoir accompli la transcription inverse, on effectue un 1er round d'ACP, suivi d'un 2ème round d'ACP, constituant en réalité une ACP quantitative en temps réel, conformément au procédé selon l'invention, décrit plus haut. Cela permet de déterminer la quantité de molécules d'ADNc produites dans la transcription inverse.

A des fins de comparaison, on amplifie par un 1er round d'ACP, suivi par une ACP quantitative en temps réel, les mêmes quantités exactes de molécules d'ADNc que celles utilisées dans la transcription inverse, qui représentent le nombre de molécules d'ADNc présentes si l'efficacité de la transcription inverse était de 100%.

Les valeurs du coefficient Ct (Cycle de seuil) des tracés des résultats d'amplification, dans une ACP quantitative en temps réel des mêmes molécules d'ARN et molécules d'ADNc permettent alors de déterminer le pourcentage de molécules d'ADNc produites dans la transcription inverse, et d'en déduire l'efficacité de la transcription inverse.

On a ainsi mis en oeuvre l'invention sur différents gènes et dans différentes conditions. Les figures annexées représentent sous forme synthétique les résultats alors obtenus.

A titre de comparaison, la figure 1 représente un graphe illustrant l'expression comparée d'ARNm de HPRT et de IFNy (ou IFNg), entre autres, selon une technique traditionnelle.

Sur cette figure 1, ainsi que sur les figures 2-5, les valeurs portées en ordonnée sont des valeurs d'absorbance, exprimées en valeur absolue de l'intercalant d'ADN SYBR Green utilisé (en abrégé : SYBR Green).

La figure 2 montre la quasi-identité de l'amplification par ACP d'ADN et d'ARN, sur l'exemple de deux copies d'un gène. Les courbes d'accumulation se recouvrent pratiquement.

Les graphes de la figure 3 concernent respectivement une première et une deuxième ACP conduites en temps réel sur des populations de cellules T intestinales exprimant toutes les fonctions effectrices. Fig. 3a a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de première ACP ; 3b a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de deuxième ACP. L'efficacité de l'amplification par ACP est déterminée par la pente de la courbe. Toutes les combinaisons d'amorces dans la première amplification par ACP et dans la deuxième amplification par ACP avaient des courbes parallèles pour la représentation de l'accumulation des produits d'ACP, ce qui indique qu'elles avaient la même efficacité.

Sur la figure 4 sont représentées les amplifications par ACP en temps réel de perforine et de HPRT, à chaque fois dans des 2èmes réactions d'ACP au sens de la présente invention. La figure 4a montre les résultats obtenus après une première ACP effectuée avec toutes les amorces simultanément conformément à l'invention, tandis que la figure 4b représente les résultats obtenus lorsque seules les amorces pour la perforine et le HPRT étaient présentes dans la 1ère réaction d'ACP. L'obtention de résultats quantitatifs

semblables indique que la présence des 38 amorces et des 19 produits d'amplification par ACP n'interférait pas avec la réaction spécifique pour la perforine. On a obtenu des résultats similaires avec tous les autres gènes individuels, à la condition que les 38 amorces présentes dans la première réaction d'ACP ne réagissent pas entre elles et que les 19 produits de cette réaction d'ACP ne se lient pas à d'autres amorces que leurs amorces spécifiques.

La figure 5 illustre les résultats comparés obtenus avec une 1ère amplification par ACP sur un nombre variable de cycles (5,15 et 20 respectivement), ainsi que l'incorporation de Sybr-Green dans une 2ème amplification par ACP, chaque courbe correspondant à une cellule individuelle. Les indications pratiques et les conclusions que l'on peut en tirer ont été indiquées plus haut.

Quant à la figure 6, elle illustre schématiquement la succession préférée des étapes fondamentales du procédé selon l'invention.

En suivant le procédé, avantageusement avec un kit approprié du type décrit plus haut, on a en outre appliqué ledit procédé à la détermination du nombre des molécules d'ARN de perforine au niveau d'une cellule unique.

Pour ce faire, des cellules T de CD8 provenant de souris transgéniques (TCR) ont été testées pour l'expression de la perforine au niveau d'une cellule unique, au moyen d'un système de RT-ACP multiplex selon l'invention.

Après détermination des cellules positives pour la perforine, on a effectué une deuxième ACP quantitative sur au moins l'un des gènes isolés du produit de la première ACP, pour déterminer le nombre exact de molécules d'ARN pour au moins un gène d'intérêt.

Cette deuxième ACP quantitative comportait une série de dilutions à partir d'un étalon ayant une concentration connue de molécules d'ARN (en pratique 4000,2000, 1000,500, 250,125, 75,37, 16,8 copies). Ce mode opératoire a permis de déterminer le nombre de molécules d'ARN de perforine dans les cellules étudiées, par comparaison de la valeur de Ct de chaque cellule avec les valeurs de Ct des dilutions étalon.

La valeur obtenue pour chaque cellule a ensuite été corrigée en fonction de l'efficacité de la transcription inverse (le plus souvent, 95%) pour permettre d'obtenir le nombre exact de molécules d'ARN dans la cellule concernée.

Les essais effectués ont fait ressortir les résultats suivants.

Dilutions de l'étalon

<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> 4000 <SEP> 2000 <SEP> 1000 <SEP> 500 <SEP> 250 <SEP> 125 <SEP> 75 <SEP> 37 <SEP> 16 <SEP> 8
<tb> copies
<tb> Ct(cycles) <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb>
Nombre de molécules d'ARN de perforine dans diverses cellules

<tb>
<tb> Cellules
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Ct <SEP> (cycles) <SEP> 17,5 <SEP> 12,3 <SEP> 19,5 <SEP> 15,5 <SEP> 14,2
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> 56 <SEP> 1400 <SEP> 12 <SEP> 187 <SEP> 400
<tb> copies
<tb> # <SEP> 95% <SEP> d'efficacité
<tb> Nombre
<tb> réel <SEP> de <SEP> 59 <SEP> 1470 <SEP> 13 <SEP> 196 <SEP> 420
<tb> copies
<tb>

On a en outre pu noter que, dans cette expérience, l'efficacité de la transcription inverse et celle de l'ACP étaient pratiquement identiques pour tous les gènes étudiés.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule, caractérisé en ce que: on effectue une transcription inverse ou RT avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas l'inhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse et dans un récipient séparé, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de 1 à 1000 cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis qu'on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que: on effectue une transcription inverse ou RT et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, caractérisé en ce que:

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5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant identiques aux amorces 3' utilisées pour la transcription inverse, on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré, on contrôle l'efficacité de la transcription inverse, au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase des ADNc de l'un des gènes concernés, parallèlement à la même amplification des molécules d'ARNm du même gène, sur des échantillons cellulaires contenant le même nombre de molécules, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification.

ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association d'amorces
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite réaction de transcription inverse ou RT est effectuée en double, et comporte au moins une RT spécifique et au moins une RT étalonnée.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise pour le contrôle l'efficacité de la transcription inverse des courbes témoin avec différents nombres de copies, établies avec de l'ADN de cellules individuelles.
5. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on choisit les amorces utilisées dans la RT-ACP multiplex pour qu'elles n'hybrident pas entre elles et que les produits de la réaction d'amplification en chaîne par polymérase amplifiés grâce à elles n'hybrident pas entre eux.
6. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que : on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible

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nombre de cellules lysées, tandis que les amorces choisies sont placées dans des exons différents de telle sorte qu'elles ne puissent pas amplifier l'ADN, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés., et on évalue les résultats de celle-ci.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce qu'on sélectionne la (les) de gène à amplifier dans ladite première réaction d'amplification de telle manière qu'elle (s) une structure similaire et une sensibilité comparable à la transcription inverse et à l'amplification en chaîne par polymérase.
8. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase des fragments d'acide nucléique ayant environ 300 à 400 paires de bases.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise des fragments d'acide nucléique à amplifier dans ladite deuxième réaction d'amplification soient plus courts.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les amorces utilisées sont conservées à environ -80 C jusqu'à leur utilisation.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce qu'on réduit la concentration des amorces dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase et/ou on utilise dans l'étape de transcription inverse des tampons n'induisant pas l'inhibition des réactions d'ACP.
12. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue une première amplification en chaîne par polymérase

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sur environ 10 cycles pour 16 copies ou plus, et sur environ 20 cycles pour un nombre entre 16 et 2 de copies.
13. Kit d'analyse et/ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes extraits d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, ledit kit comportant: des moyens pour l'étalonnage interne de l'ARN et celui de l'ADNc, l'ensemble ou mélange des amorces pour la première ACP, des amorces spécifiques pour chaque gène à soumettre à la deuxième ACP, et en option, un étalon interne et/ou un étalon interne sur base d'ADN, ainsi que, en option, également des tampons de lyse, de transcription inverse et/ou d'amplification, et d'éventuels autres composants classiques.
14. Kit d'analyse et/ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes extraits d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, caractérisé en ce qu'il comporte les composants selon la revendication 13, et des instructions pour l'utilisation des amorces sens et anti-sens dans des réactions de RT-ACP pour la quantification du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule.
15. Kit selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comporte comme amorces au moins l'un des ensembles ou combinaisons d'amorces choisis parmi les suivants, pour les gènes respectifs indiqués : pour TNF bêta, SEQ ID NOS.1-3 ; TNF alpha, SEQ ID NOS.4-6; pour Granzyme B, SEQ ID NOS.7-9 ; CD40 ligand, SEQ ID NOS.10-12 ; IL-4, SEQ ID NOS.13-15 ; HPRT, SEQ ID NOS.16-19 ; pour IFN gamma, SEQ ID NOS.20-22 ; IL-2, SEQ ID NOS.23-25 ; pour perforine, SEQ ID NOS.26-28 ; Granzyme A, SEQ ID NOS.29-31 ; Fas ligand, SEQ ID NOS.32-34 ; TGF

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bêta, SEQ ID NOS.35-37 ; CD3 epsilon, SEQ ID NOS.38-40 ; IL-10, SEQ ID NOS.41-43 ; TGF bêta RI, SEQ ID NOS.44-46 ; TGF bêta RII, SEQ ID NOS.47-49 ; TGF bêta RIII, SEQ ID NOS.50- 52 ; pour IL10R alpha, SEQ ID NOS.53-55 ; pour IFN gamma RII (bêta), SEQ ID NOS.56-58.
16. Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 13-15 ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1-12 pour la quantification de gènes individuels, en particulier pour l'étude de l'expression génique dans un matériel biologique, notamment pour l'étude et/ou l'évaluation quantitative, comparée et simultanée, de l'expression de multiples gènes au niveau d'une seule cellule ou d'un petit nombre de cellules d'un matériel biologique.