WO2006024737A2 - QUANTIFICATION DES ARNm DE PROTEINES D'INTERET AU MOYEN D'UNE REACTION RT-PCR EN TEMPS REEL - Google Patents

QUANTIFICATION DES ARNm DE PROTEINES D'INTERET AU MOYEN D'UNE REACTION RT-PCR EN TEMPS REEL Download PDF

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WO2006024737A2
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Charlotte Behr
Philippe Boeuf
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Centre National De La Recherche Scientifique
Institut Pasteur
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to the field of quantitation of RNAs in a biological sample, including the quantification of messenger RNAs encoding cytokines.
  • the present invention relates to the simultaneous quantification of different RNAs under the same experimental conditions.
  • RNAs and viral RNAs are a potential tool of great interest, both in the field of research and in the clinical field.
  • the cytokine-specific messenger RNA levels represent very sensitive markers of the activation state of the immune system in vivo.
  • knowledge of these rates in different models may therefore allow a better knowledge of the immune system.
  • knowledge of these rates is also crucial information for many clinical situations. Knowing precisely the level of expression of this or that cytokine, can indeed be an important parameter for the management of patients suffering from inflammatory, infectious or immune diseases.
  • An exemplary application of the quantification of messenger RNAs encoding certain cytokines to evaluate a disease state in a patient with rheumatoid arthritis is described in US Patent No. 6,555,320.
  • RT-PCR is an acronym commonly used in molecular biology, for “reverse transcription - polymerase chain reaction”, or reverse transcription followed by polymerase chain reaction. This type of reaction therefore comprises two steps: a reverse transcription step, that is to say, synthesis of a single-stranded DNA complementary to an RNA sequence, and a polymerase chain reaction step. The first is here referred to as the "reverse transcription” or the English acronym RT. Similarly, the second phase will be referred to as "amplification in polymerase chain ", either by the French acronym ACP, or by the English acronym PCR, more commonly used by biologists.
  • RNA detection techniques such as RnaseProtectionAssay (RPA kits, BD-Biosciences TM) and Northern Blot techniques (Quantikine TM mRNA, R & D TM) sometimes require more than 10 ⁇ g of total RNA for the detection of a single cytokine, an amount that is not always reached for many clinical samples, especially in biopsies. In addition to the need for a large amount of starting material, these techniques are very slow to implement and may involve the use of radioactivity.
  • RT-PCR is a very sensitive technique, since it makes it possible to achieve a significant increase in the initial number of targets. It is easier and faster to implement. However, very small variations in the efficiency of RT and / or PCR can very significantly affect the end result. It is therefore necessary to control both the RT and PCR phases. Conventional techniques that are based on plateau RT-PCR do not allow absolute quantification because the results are acquired during the saturation phase. Competitive techniques, where the target is co-amplified and an internal standard with the same efficiency, overcome this disadvantage, but have a lower sensitivity due to the co-amplification of two distinct sequences. As a result, they require large amounts of hardware, and can only be implemented for target / competitor reports of limited scope (usually between 1: 10 and 10: 1). In addition, pre-screening is usually necessary to estimate the order of magnitude in which is the amount of transcript to detect. Finally, the analysis of the results is long and tedious (Bustin 2000).
  • Real-time PCR techniques have opened the way to absolute quantification (Bustin 2000, Ginzinger 2002). Indeed, the detection of the amplification product is done in real time (hence their name) through the use of fluorescent markers. The quantification of the transcripts is done during the exponential phase, the only phase where the amount of amplicon is only dependent on the initial quantity of target. The addition of an external standard then allows absolute quantification if it is amplified with the same efficiency. This technique is also easier to automate, and the analysis of the results relatively simple. This explains why it is more and more used despite a high cost (Bustin 2000, Giulietti, Overbergh et al., 2001).
  • Cytokine assays using RT-PCR in real time use mostly fluorescent probes (Taqman TM, molecular beacon TM, etc.) to detect amplicon (Stordeur, Poulin et al., 2002).
  • This approach is interesting because only the desired amplicon is detected despite possible non-specific amplifications.
  • the use of these fluorescent probes results in a significant additional cost.
  • the lower requirement on the specificity of the primers has significant potential biases in the quantization. Indeed, in cases where the primers are not totally specific, several amplifications are likely to be performed in competition.
  • these techniques all use a standard DNA range, and therefore do not take into account, in their quantification, the efficiency of the reverse transcription phase.
  • the object of the present invention is to overcome at least in part the disadvantages mentioned above, and to allow absolute quantification of the determined levels of messenger RNAs, and in particular messenger RNAs of human cytokines present in a biological sample.
  • the invention uses a real-time RT-PCR technique based on the use of highly specific primers, the detection of amplifications by incorporation of a fluorescent intercalant, and the absolute quantification by means of RNA standards. internal (housekeeping genes) and external (standard reference RNA range).
  • the present invention thus relates to a method for quantifying one or more determined RNAs, especially at least two distinct RNAs, in a biological sample, comprising the following steps:
  • RNAs for each of the RNAs to be quantified, reverse transcription, then amplification of the product of this reverse transcription, with the aid of a specific pair of primers of said RNA, from the biological sample, and from a range of synthetic RNAs comprising the sequence amplified by the specific pair of primers, (ii) real-time detection of the product of the amplification reactions of step (i), and (iii) deduction of the amount of RNA in the sample.
  • the invention relates to a method for the absolute quantification of one or more target RNAs in a biological sample, comprising the following steps:
  • step (iii) real-time detection of the product of the amplification reactions of step (i) and (ii), (iv) deduction, on the one hand, of the amount of RNA or target RNAs in the sample and secondly, the amount of RNA or RNAs of household genes in the sample, and (v) Normalization of the amount of RNA or RNA targets relative to the amount of RNA or Household gene RNA
  • RNA to be quantified is preferably chosen so as to meet the following criteria:
  • the primers are as close as possible but do not overlap. They allow the amplification of a fragment of size less than or equal to 200 base pairs, preferably less than or equal to 150 base pairs, more preferably less than or equal to 100 base pairs,
  • the nucleotide content G and C of the primers is between 20 and 80%, it is preferable to avoid the repetition of nucleotides.
  • the primers do not contain a repetition of more than three consecutive guanines,
  • the melting temperature of the primers is between 58 and 60 ° C., using the Primer Express software as a reference for the calculation of the melting temperatures; the 5 nucleotides at the 3 'end of the primers should not contain more than 2 G and / or C bases.
  • RNA in a sample can be it viral RNA, 16S RNA or messenger RNA encoding viral proteins. , bacterial, vegetable, etc.
  • prefferably RNA an RNA whose sequence is sufficiently well known to make it possible to design primers specific for this RNA, in particular primers that comply with the criteria set out above.
  • the method of the invention allows the quantification of the messenger RNAs of one or more cytokines in a biological sample, and comprises the following steps:
  • step (i) for each of the messenger RNAs to be quantified, reverse transcription, then amplification of the product of this reverse transcription, using a specific pair of primers of said messenger RNA, from the biological sample, and from a synthetic RNA range comprising the sequence amplified by the specific primer pair, (ii) real-time detection of the product of the amplification reactions of step (i), and
  • step (i) may also involve transcription of the biological sample. reverse, then the amplification of the product of this reverse transcription, with the aid of a specific pair of primers of one or more messenger RNAs of household genes.
  • the choice of such a household gene requires very precise validation and it is preferable to combine several household genes to obtain reliable absolute quantification.
  • the method of the invention allows the absolute quantification of the messenger RNAs of one or more cytokines in a biological sample, comprising the following steps:
  • step (ii) reverse transcription of one or more RNAs of household genes to be quantified, and then amplification of the product of this reverse transcription, using a pair of primers specific for each RNA of housekeeping genes, from the biological sample, and from a synthetic household gene RNA range comprising the sequence amplified by the specific primer pair, (iii) real-time product detection of step (i) and (ii)
  • ⁇ 2-microglobulin ( ⁇ 2-MG) was chosen for the work on blood cells, and the expression of this gene is quantified by the same method as that of the gene. target. The results are thus expressed as the number of mRNA copies of the target gene for 1 million copies of ⁇ 2-microglobulin mRNA.
  • UBC ubiquitin C
  • YWHAZ ubiquitin C
  • Other household genes can obviously be used in the context of the invention.
  • Another possibility would be to express the results as a function of the amount of total retro-transcribed RNA.
  • this amount may vary according to the phase of the cell cycle where the cells are and depending on the activation state of the cells, which poses a problem for the comparison between a patient and a healthy control that certainly do not have the same status of cellular activation.
  • the amplification of the reverse transcription product can be carried out by any nucleic acid amplification technique used in molecular biology, such as PCR (polymerase chain reaction), TMA (mediated amplification transcription), NASBA (nucleic acid sequence based amplification), 3SR (self sustained sequence replication), strand displacement amplification (SDA), and LCR (ligase chain reaction).
  • PCR polymerase chain reaction
  • TMA mediated amplification transcription
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • 3SR self sustained sequence replication
  • SDA strand displacement amplification
  • LCR ligase chain reaction
  • RNA quantification of different RNAs can be carried out in different wells or in the same well.
  • the intercalent fluorescent will be replaced by markers allowing distinct readings of each amplification. This can be done using multiplex type techniques.
  • a range of synthetic RNA is therefore constituted for each messenger RNA to be quantified.
  • This range consists, for example, of a series of dilutions of an RNA transcribed from a DNA cassette comprising the phage T7 RNA polymerase promoter 5 'and 3' of the sequence of the amplicon amplified from the messenger RNA, by the specific pair of primers of said messenger RNA.
  • This DNA cassette may be further flanked by endonuclease restriction sites, e.g. EcoRI restriction sites.
  • Another object of the present invention is to allow easy automation of quantification of cytokines of interest.
  • the inventors have developed pairs of primers which make it possible to implement the above method under identical conditions for all the messenger RNAs to be quantified.
  • RT-PCR and in which all RT-PCR reactions are performed under the same temperature conditions, is therefore an integral part of the present invention.
  • This allows in particular the detection of several cytokines on the same plate and the absolute comparison of RNAs encoding several cytokines.
  • the use of fluorescent probes to label the amplicon has the dual disadvantage of being expensive, and to risk introducing a possible bias in the quantification, if the primers used are not strictly specific to the amplicon.
  • Messenger RNA to quantify the real-time detection of the amplification product will therefore preferably be carried out by measuring the incorporation of a fluorescent intercalator, for example SYBR Green I TM.
  • any other fluorescent intercalator such as BET, Hoeschst 33258, SYBR GoId, YOYO-1, or PicoGreen can be used for this.
  • the process developed does not exclude the use of probes or fluorescent primers or any other detection technique for the strict quantification of the amplification product.
  • the detection of the PCR product can in fact be carried out by means of any signal that can be transcribed electronically.
  • Oligonucleotide probes comprising other markers than SYBR Green I are, for example, described in the patents of Kayem et al. US 6,479,340 and US 6,495,323.
  • thermocycling conditions The inventors have developed a set of primers that can be used under standard conditions programmed in a thermocycler, and in a preferred implementation of the methods according to the invention, the RT-PCR reactions are carried out under the following thermocycling conditions:
  • reverse transcription incubation of the primers: 8 to 12 minutes at 23 to 27 ° C., preferably 10 minutes at 25 ° C .;
  • cycles comprising: 12 to 20 seconds between 90 and 98 ° C., preferably 15 seconds at 95 ° C., and
  • thermocycling conditions are as follows:
  • reverse transcriptase action 30 minutes at 48 ° C .
  • RT-PCR reactions can also advantageously be carried out in a single step (one step RT-PCR).
  • each pair of primers has the following characteristics: - specificity: the pairs of primers must be strictly specific for the messenger RNAs to be quantified, which means that they do not have to amplify genomic DNA or pseudo-genes.
  • - specificity the pairs of primers must be strictly specific for the messenger RNAs to be quantified, which means that they do not have to amplify genomic DNA or pseudo-genes.
  • one technique is to choose at least one primer at the junction between two exons. The choice of primers in different exons, separated by an intron of a length such as the amplification of the genomic DNA would require a duration greater than the duration of the elongation, also makes it possible to avoid the amplification of the Cellular DNA.
  • a pair of primers may be specific for a messenger RNA even if one of the primers of this pair (or both) also hybridizes with the cellular DNA and / or with pseudo -Genoa. Indeed, the specificity of a couple is linked to the combination of the two primers. As soon as one of the two primers is strictly specific for 1 mRNA, or the two primers do not hybridize to the cellular DNA or to a pseudo-gene under conditions suitable for allowing the exponential amplification which characterizes the PCR, a pair of primers will be specific for 1 mRNA.
  • the pairs of primers have been generated so as to all be usable under the same conditions, and particularly under the same conditions of thermocycling. This implies in particular that they have a melting temperature (Tm) of the order of 58-60 ° C., and that they allow the amplification of a sequence of a size of between 50 and 200 nucleotides, preferably between 75 and 150 nucleotides.
  • Tm melting temperature
  • IL-1B XM_010760 CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 1 GGGAACTGGGCAGACTCAAA 2 149
  • IL-10 AY029171 GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT 3 CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT 4 108
  • IL-4 NM 000589 AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC 21 GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT 22 101
  • At least two of the pairs of primers are chosen so that the sequence of primers hybridizing with the messenger RNA considered at least 85% or 90% identity with primer pairs listed in Table 1, considered as reference pairs for each mRNA considered.
  • version 2.06 can be used, as well as the standard version of nucleotide alignment available on the NCBI site or, for sequences between 7 and 20 nucleotides, the specific version for short sequences, available on this same site (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
  • the similar sequences thus envisaged may be of the same length as the sequences explicitly described in the present text, or of a different length, then preferably comprised between 15 and 35 bases.
  • primers differing from primers described by a modification at their 5 'end for example an addition of nucleotides that are not complementary to the messenger RNA sequence, but which retain the characteristics of specificity and conditions of use described herein.
  • heterologous RNA is meant herein any RNA that comprises an amplifiable sequence by RT-PCR with primers that do not allow the amplification of an identical sequence from the biological sample. It may be an RNA from a different species, for example bacteria or yeast when the sample comes from an animal, or a synthetic RNA. This heterologous RNA is then quantified after RT-PCR (or equivalent reaction), which makes it possible to control the extraction phase. Also in order to control the extraction yield, it is possible to introduce into the biological sample to be analyzed a known number of heterologous cells.
  • RNA of a household gene (or other) of these cells is then quantified after extraction.
  • this gene is chosen such that it comprises an amplifiable sequence by RT-PCR with primers which do not allow the amplification of an identical sequence from the biological sample.
  • the ratio between the number of messenger RNA copies of this heterologous cell gene and the number of heterologous cells introduced into the sample makes it possible to evaluate the yield of the extraction.
  • the invention also relates to a set of nucleotide primer pairs intended in particular for use in the methods of the invention, for quantifying messenger RNAs of one or more cytokines in a biological sample, and in which at least two pairs of primers, preferably three, are selected from, or have a degree of identity of at least 85% or 90% with the primer pairs of Table 1.
  • Another subject of the invention is a kit for detecting disorders related to the regulation of Th1 / Th2 lymphocytes, comprising a set of primer pairs as described above, characterized in that the primer pairs are specific.
  • messenger RNAs of cytokines selected from IL-10, IL-13, TGF- ⁇ , TNF- ⁇ , and IFN- ⁇ .
  • such a kit may also contain one or more pairs of specific cytokine messenger RNA progenitors selected from NL-2, IL-4, IL-5, and TNF- ⁇ .
  • the present invention also relates to a kit for detecting inflammatory disorders or disorders of innate immunity, comprising a set of primer pairs as described above, in which the primer pairs are specific for messenger RNAs.
  • cytokine selected from IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , TGF- ⁇ , IL-1- ⁇ , IL-12p35, IL-12p40 I 1, IL-15 and NL-18.
  • kit may also further comprise one or more pairs of cytokine messenger RNA-specific primers selected from IFN- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-21, IFN- ⁇ , TiNOS and IL-16.
  • the first comprises a set of primer pairs as described above, in which a pair of primers is specific for
  • IL-10 messenger RNA one or more primer pairs are specific for housekeeping genes selected from the human ⁇ 2-microglobulin genes, ubiquitin C and the YWMAZ gene, and other primer pairs are cytokine messenger RNAs selected from IL-19, IL-20, IL-22 and IL-24.
  • the second one, dedicated to IL-12-related cytokines comprises a set of primer pairs as described above, in which a pair of primers is specific for the messenger RNA of IL12p40, one or several pairs of primers are specific for messenger RNAs of household genes selected from the genes of human ⁇ 2-microglobulin, ubiquitin C and the gene YWMAZ, and others Primer pairs are specific for messenger RNAs of cytokines selected from IL-12p35, IL-23, IL-27 and I 1 AKI 55.
  • One of the purposes of the detection kits according to the present invention is to be used clinically to evaluate the state of the immune system of a patient, without requiring the development of the conditions for performing the RT-PCR for each messenger RNA. sought, with a view to directly obtaining an absolute quantification of messenger RNAs of cytokines involved in the disorders mentioned above.
  • kits according to the invention as described above, and further comprising, for each pair of specific primers of a messenger RNA, a synthetic RNA comprising the sequence of said messenger RNA which is amplified by the pair of primers, therefore also part of the present invention.
  • the kits of the invention will also advantageously include an explanatory note intended for the user.
  • kits according to the present invention can produce a standard RNA range from a DNA template.
  • the invention therefore also relates to a kit as described above, characterized in that it further comprises, for each specific pair of primers of a messenger RNA, a synthetic DNA comprising the sequence of the complementary DNA which is amplified by the pair of primers.
  • this synthetic nucleic acid can be present either directly in the form of a standard RNA range or in the form of a standard RNA. mother solution of determined concentration, from which the user will make dilutions, either in the form of precipitated and dried RNA, for example freeze-dried.
  • the stock solution of the standard range may also be present in the form of nucleic acid in solution in ethanol or isopropanol.
  • the user will then have to centrifuge this solution in order to pellet the nucleic acid before resuspending the pellet in an appropriate buffer (water type + Rnase inhibitors or DEPC treated water), and to determine by reading the optical density the concentration of the solution obtained. This will then be brought back to the concentration corresponding to the first point of the standard range.
  • the synthetic RNA can be obtained by in vitro transcription from a DNA cassette comprising the phage T7 RNA polymerase promoter 5 'and 3' of the sequence to be amplified.
  • Another kit according to the invention may therefore contain a DNA construct serving as a transcription matrix for obtaining the standard RNA and, where appropriate, the reagents necessary for the in vitro transcription of this matrix.
  • the user will, after transcription and purification, quantify the synthetic RNA in order to generate the standard RNA range. A notice with instructions to that effect may be included in the kit in question.
  • kits according to the invention may also comprise a heterologous RNA or heterologous cells with respect to the biological samples with which they are intended to be used, as well as a pair of primers specific for a sequence included in this RNA or in the RNA from these cells.
  • a quantity of the heterologous RNA or heterologous cells will be mixed with each biological sample to be treated, before the extraction of the RNA, in order to control the efficiency of the extraction phase.
  • Such a kit therefore preferably comprises primers specific for this heterologous RNA or an RNA sequence of these cells. heterologous. A control protocol for this effectiveness can then be described in the explanatory note possibly present in the kit.
  • the synthetic DNA can be obtained by PCR using either the primers specific for the RNA under consideration, or a modified version of these primers (addition of restriction sites, etc.).
  • the amplicon obtained can be cloned into a vector.
  • plasmid either using restriction sites, or by using cloning kits of PCR products type TA cloning kit of InVitrogen ®). This not only allows a better conservation of the construction, but also a better determination of the concentrations of standard solutions, because for an identical number of amplicons, the value of optical density will be higher, since it will take into account the nucleotides composing the vector.
  • a kit according to the invention may also comprise a data processing software capable of compiling the results obtained from the standard ranges, the household genes, and the biological sample, and directly giving the amount of messenger RNA. of each cytokine tested in the biological sample.
  • This software can be carried by any media, including a floppy disk or a card directly implantable on the thermal cycler used. If necessary, it can be reduced to a macro in Microsoft Excel® or other spreadsheets to automate the main steps of data processing.
  • these sets or kits comprise specific primer pairs of messenger RNAs of at least three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, or eleven cytokines.
  • the sets of primer pairs or kits described above preferably comprise primer pairs specific for the messenger RNAs of at least one, two, three or four housekeeping genes.
  • These household genes may for example be chosen from the ⁇ -actin (ACTB), ⁇ -2-microglobulin genes.
  • B2M glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • HMBS hydroxymethyl- Bilan synthase
  • HPRT I hypoxanthine phosphoribosyl transferase I
  • RPLI3A ribosomal protein LI3a
  • SDHA subunit A succinate dehydrogenase complex
  • TATA box binding protein TBP
  • UPC ubiquitin C
  • YWHAZ zeta peptide of the tyrosine-3-monooxygenase / tryptophan monooxygenase activation protein.
  • primers that can be used to amplify sequences of these household genes are given in the Vandesompele article, De Prêter et al. 2002.
  • the examples and figures presented below without limitation will highlight certain advantages and features of the present invention.
  • Figure 1 Diagram of real-time quantitative RT-PCR protocol using a range of recombinant standard RNAs.
  • Figure 2 Construction of a standard RNA range.
  • the specific primer pair generates an amplicon that serves as a template for a second PCR using the specific primers modified by the 5 'fusion of the promoter 11 sequence followed by an EcoRI restriction site.
  • the PCR product is purified before being used as an in vitro transcription matrix.
  • L 1 RNA standard product was purified, quantified to produce a range of standard RNA. This range will undergo RT-PCR and will serve as a reference for the absolute quantification of the number of copies of TARNm considered.
  • Figure 3 Comparison protocol of the RNA range versus the DNA range approaches.
  • Lane I After reverse transcription, a standard RNA cDNA is serially diluted 10 fold to generate a cDNA range. Lane II: The standard RNA is serially diluted by a factor of 10 and each dot undergoes RT-PCR. Lane III: A sequence of DNA sequence corresponding to that of the standard RNA is amplified by PCR. This way is classically used for the quantification of mRNAs. The real-time PCR conditions are identical for the 3 channels (same PCR mix, same plate). The corresponding amplification efficiencies are calculated from the slopes of the standard lines. The reverse transcription efficiency is equal to the ratio between EII and E1. Efficacy of PCR (E1) Efficacy of RT-PCR (EII)
  • Figure 4 Validation of the primers.
  • the specificity of the pairs of primers used is validated by analysis on agarose gel (A) and by sequencing.
  • the dissociation curves (B) also provide information on the formation of primer dimers.
  • the selected primers are used in real-time RT-PCR to amplify a range of standard RNAs specific for said pair of primers (example of ⁇ 2- ⁇ globulin: C).
  • FIG. 5 Dissociation curves of the human amplification products for ⁇ 2-microglobulin, MIF, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-15, IL-12p40, IL-10, Ie TNF, IL-13, IL-18 and TGF- ⁇ -1.
  • the amplicons are subjected to a gradual increase in temperature from 60 to 85 ° C.
  • a sharp decrease in fluorescence accompanies the dissociation of the two DNA strands of the amplification product when they reach their melting temperature.
  • the specificity of the primers used is validated by the presence of a single peak.
  • Figure 6 Dissociation curves of human amplification products for ubiquitin C (A.) and YWHAZ (B.). The specificity of the primers used is validated by the presence of a single peak.
  • Figure 7 Dissociation curves of the simian amplification products for ⁇ 2-microglobulin, MIF, IL-12p40, IL-10, IL-15 (A.) and IFN- ⁇ , the GAPDH and TNF- ⁇ (B.). The specificity of the primers used is validated by the presence of a single peak.
  • Figure 8 Determination of optimal primer concentrations for TNF- ⁇ . The sense and antisense primers were used at 50, 300 or 900 nM final to amplify TNF- ⁇ transcripts by RT-PCR in real time.
  • Figure 9 Determination of the sensitivity of the technique.
  • Total RNA from a decreasing number of cells was subjected to RT-PCR for the ⁇ 2-microglobulin gene.
  • a standard RNA range of this same gene has undergone the same steps.
  • the technique of the present invention allows the extraction and amplification of RNA from at least 10 cells. The improvement in the yield of the RNA extraction phase is underway and should make it possible to increase this sensitivity.
  • Figure 10 Sensitivity of RNA ranges. A standard RNA copy number range of each transcript was retro-transcribed and then amplified by
  • Figure 11 Intra-experimental reproducibility of the technique for the genes of ⁇ 2-microglobulin and IL-1 ⁇ .
  • Four identical ranges of standard RNA were retro-transcribed and PCR amplified.
  • the panels A. and B. show the average of the threshold cycles and the difference to this average for each of the points.
  • One of the ranges served as a basis for determining the number of copies present in the other 3 ranges.
  • Charts C. and D. represent the average of these calculated values and the standard deviation at this average for each of the points as a function of the number of theoretical copies.
  • Figure 12 Intra-experimental reproducibility of the technique for the IL-15 and IL-18 genes.
  • Four identical ranges of standard RNA have have been retro-transcribed and subjected to PCR amplification.
  • the panels A. and B. show the average of the threshold cycles and the difference to this average for each of the points.
  • One of the ranges served as a basis for determining the number of copies present in the other 3 ranges.
  • Charts C. and D. represent the average of these calculated values and the standard deviation at this average for each of the points as a function of the number of theoretical copies.
  • Figure 13 Intra-experimental reproducibility of the technique for the genes of IFN- ⁇ and TGF- ⁇ 1.
  • Four identical ranges of standard RNA were retro-transcribed and PCR amplified.
  • the panels A. and B. show the average of the threshold cycles and the difference to this average for each of the points.
  • One of the ranges served as a basis for determining the number of copies present in the other 3 ranges.
  • Charts C. and D. represent the average of these calculated values and the standard deviation at this average for each of the points as a function of the number of theoretical copies.
  • Figure 14 Intra-experimental reproducibility of the technique for the genes of ubiquitin C and YWHAZ.
  • Four identical ranges of standard RNA were retro-transcribed and PCR amplified.
  • the panels A. and B. show the average of the threshold cycles and the difference to this average for each of the points.
  • One of the ranges served as a basis for determining the number of copies present in the other 3 ranges.
  • Charts C. and D. represent the average of these calculated values and the standard deviation at this average for each of the points as a function of the number of theoretical copies.
  • Figure 15 Inter-experimental reproducibility of the technique for the genes of ⁇ 2-microglobulin and TGF- ⁇ 1.
  • Eight different ranges of standard RNA were retranscribed and subjected to PCR amplification. different days.
  • the panels A. and B. show the average of the threshold cycles and the difference to this average for each of the range points.
  • Charts C. and D. represent the average of the calculated values and the standard deviation at this average for each of the points as a function of the number of theoretical copies.
  • Figure 16 Comparison of the RT-PCR efficiencies between a standard range and a cell sample.
  • a standard RNA range for ⁇ 2-microglobulin ranging from 10 to 8 copies was amplified by RT-PCR.
  • the slope of the resulting standard line (A.) is equal to -3.305. This slope is very close to that resulting from the standard line B. corresponding to a cell density range ranging from 10 to 10 5 cells whose total RNA has undergone the same RT-PCR conditions as the standard range for amplification.
  • Figure 17 Comparison of the efficiencies and sensitivities between the method of the invention and the TaqMan TM kit for the amplification of transcripts of TNF- ⁇ .
  • a range of total cellular RNA was retro-transcribed and then amplified by real-time PCR using either the method of the invention or the TaqMan TM commercial kit.
  • the standard lines obtained make it possible to determine the efficiency and the sensitivities of the two techniques. Under the conditions tested, the method of the invention is as sensitive and more effective than TaqMan TM considered as a reference technique.
  • Figure 19 Gene transcription of different cytokines by monocytes isolated from healthy donors. Isolated monocytes were incubated for 0.5, 1, 2, 3, 6 or 9 hours in the presence of LPS (100 ng / mL) or
  • the cytokine transcripts are quantified and standardized for one million copies of ⁇ 2- ⁇ globulin RNA.
  • the histograms represent the ratio between the number of copies of target RNAs and ⁇ 2-microglobulin mRNA (average of 2 donors).
  • FIG. 20 Transcriptional capacity of TGF- ⁇ 1 in control subjects or patients with malaria.
  • PBMCs of control individuals (Asymptomatic Controls) or patients suffering from malaria (Malaria patients) were removed and stimulated for 22 hours by LPS (100 ng / mL). 1
  • the total RNA of the PBMC was extracted to quantify the number of transcripts TGF- ⁇ 1.
  • the histograms represent the copy number of TGF- ⁇ 1 mRNA for one million copies of ⁇ 2-microglobulin mRNA. * : statistically significant difference (p ⁇ 0.05)
  • Figure 21 Development of conditions for quantification of IL-4 mRNA.
  • the specificity of the chosen primers is validated by the presence of a single peak on the dissociation curve (A.) and by sequencing of the product.
  • a standard RNA concentration range is amplified by RT-PCR to validate its use for quantification of IL-4 (B.) mRNAs.
  • PBMCs Human mononuclear peripheral blood cells
  • RNA PLUS buffer Q-Biogene TM, 500 ⁇ l for 10 6 cells .
  • RNA-PLUS® kit from Q-Biogene®, following the supplier's instructions and resuspended in RNase-free water (Ambion TM). The amount of total RNA was determined by optical density at 260 nm. Complementary DNA has been obtained using the "TaqMan TM Reverse Transcription Reagents" reagents (Applied Biosystems TM) in a reaction volume of 50 ⁇ l.
  • PCR Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction
  • PCR master mix TM (Applied Biosystems TM) in a final volume of 30 ⁇ l.
  • thermocycling conditions were the default conditions: 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes and 40 cycles of ⁇ 95 ° C. for 15 seconds and then 60 ° C. for 1 minute ⁇ . Each point has been duplicated.
  • the primers used for each amplification (each at 900 nM final) are described in Table 1.
  • Modified primers were used on I 1 cell cDNA to construct the transcription template. These primers were the primers specific for the genes considered, fused at their 5 'end to the T7 promoter sequence. Each matrix was then purified on a silica column (Nucleospin TM, Macherey-Nagel TM) before being transcribed in vitro using the MegaShort Script Transcription Kit TM kit (Ambion TM). The concentrations of the standard RNAs were calculated by optical density at
  • ELISA test The ELISA tests were performed according to the supplier's instructions (TNF-alpha: BioSource and MIF: R & D).
  • the nested PCR technique was used to flank each specific amplicon of a T7 polymerase promoter sequence. This construct was used to generate a standard RNA that was loaded onto a gel and migrated to verify its clonality (results not shown). The molecular weight of each of the standards was calculated based on its expected sequence, and then solutions ranging from 10 1 to 10 12 standard RNA copies per microliter were made.
  • RNA ranges were subjected to a reverse transcription step and 5 ⁇ L of the RT product was amplified by real-time PCR.
  • a standard RNA sample was reverse transcribed, and I 1 corresponding cDNA was subject to serial dilutions of a factor of ten.
  • a range of cDNA has thus been generated and subjected to amplification (same mix, same final volume as the RNA and DNA ranges).
  • PCR Route II RT-PCR Efficiency Slope Efficiency Slope Efficiency Slope Efficiency of RT (ll / l)
  • the quantification bias provided by the RT phase therefore exists and varies. This can therefore in no way allow the use of DNA ranges for the reliable, reproducible and accurate quantification of messenger RNAs.
  • the number of transcripts present in the sample is therefore greatly underestimated.
  • the degree of underestimation varies according to the transcripts studied.
  • Primer pairs were drawn from genomic sequences published using Primer Express TM software (Applied Biosystems TM), best meeting the following criteria:
  • the 5 nucleotides at the 3 'end should not have more than 2 G and / or C bases.
  • the specificity of the primers for the target cDNAs has been ensured by designing direct and reverse primers amplifying a product covering an intron and which does not lead to the amplification of pseudo-genes or other related genes. Specificity was estimated by ethidium bromide agarose gel analysis by dissociation curves ( Figures 4 to 7) and sequencing the PCR amplification products (results not shown).
  • the forward and antisense primer concentrations ranged from 50 to 900 nM.
  • the concentrations of the primers were optimized to determine the minimum 1 primer concentrations giving the lowest threshold cycle (CT), and therefore the highest sensitivity, and the maximum signal-to-noise ratio in fluorescence ( ⁇ R n ), while minimizing non-specific amplifications (results not shown).
  • FIG 8 shows the results obtained for the detection of TNF- ⁇ .
  • the optimal concentration pair is 90OnM for the sense and antisense primer.
  • Example 3 Determination of the sensitivity of the technique: Minimum sample size and minimum number of copies
  • RNA dilution a range of cell density ranging from 10 5 cells to 1 cell was performed. The total RNA of these cells was extracted and retro-transcribed. One-tenth of the obtained cDNA was amplified by PCR for the ⁇ 2-microglobulin gene. In parallel, a standard RNA range of this same gene has undergone the same steps of RT-PCR. The results of this experiment are presented in FIG. 9. They show that this technique makes it possible to reliably detect transcripts of the ⁇ 2 -microglobulin gene in at least 10 cells. It should be noted that this is not an RNA dilution corresponding to a "Cell equivalent" of 10 but of RNA extracted directly from 10 cells. If we reason in standard RNA dilution, the sensitivity is 10 copies.
  • the reproducibility of the technique has been studied.
  • the experimental variability intra was calculated from point range of standard RNA in quadruplicate to the genes of the ⁇ 2-microglobulin, ubiquitin C, YWHAZ, IL-IB 1 IL-15, IL-18, IFN-gamma and TGF -B1.
  • the average threshold cycles for each point as well as the standard deviations at this average have been calculated and are shown in Figures 11, 12, 13 and 14 (A and B).
  • one of the ranges served as a standard for calculating standard RNA quantities for the other 3 points.
  • the average of the quantities obtained as well as the standard deviations at this average are shown in FIGS. 11, 12, 13 and 14 (C and D).
  • RNA concentration range whose points are spaced by a factor of 10.
  • the method of the invention has been compared to the Taqman TM technique, a reference technique in this field, for the TNF- ⁇ gene.
  • Monocytes were stimulated for 6 hours with LPS.
  • Total RNA was extracted from 10 6 cells and diluted serially. This range of RNA Total cellular amplification was amplified for 1 mRNA of the TNF- ⁇ gene, in parallel, on the same plate and under the same thermocycling conditions using either the method of the invention or Taqman TM chemistry (Applied-Biosystem). The results of this test are shown in FIG. 7. At the dilutions studied, it appears that the method of the invention is as sensitive as the Taqman TM reference technique. In addition, the present method shows a slightly higher efficiency than the Taqman TM technique: 105% versus 80% corresponding respectively to slopes of -3.2 (technique of the invention) and -3.9 (Taqman TM technique ).
  • a stably expressed endogenous gene which can be used as an internal standard (housekeeping gene) is a prerequisite for accurate RT-PCR quantification.
  • the internal standard is chosen based on the clinical evaluation of the patient and the tissue origin of the biological sample. Since cytokine analysis requires an internal standard that can be used on peripheral blood leukocytes, 3 known genes for the stability of their expression in leukocytes have been studied: ⁇ 2-microglobulin ( ⁇ 2-MG), ubiquitin C
  • PBMCs from healthy donors were stimulated for 3 hours with PBS or PHA (phytohaemaglutinin) and then separated into two identical aliquots.
  • the total cellular RNAs were extracted at two days' intervals then the same volume of RNA was retro-transcribed, and the transcripts of the 3 genes amplified by RT-PCR, under the same conditions.
  • Table 4 shows the results obtained: average obtained and in parentheses the results of the two extractions.
  • Table 4 Choice of the internal standard. For each gene tested, appear on the first line the average of the two extractions, and on the second line, the individual result of the two extractions. The tests were performed without stimulation (TO) or after 3 hours of stimulation with LPS or PHA.
  • Figure 18 shows the kinetics of transcription and production of MIF (A.) and TNF- ⁇ (B.) by PBMCs of a healthy donor stimulated by LPS, SAC, Plasmodium falciparum-parasitized red blood cells or healthy red blood cells for 3, 9 and 18 hours.
  • TNF- ⁇ approximately 3 hours after stimulation, transcription which precedes the secretion of the TNF- ⁇ protein (B.).
  • the MIF gene is strongly transcribed and constitutively in the basal state (TO), and neither stimulation with LPS nor with SAC increases this transcription.
  • FIG. 21 shows the dissociation curve of the selected primers (A.), as well as the line showing the efficiency of the amplification (B.).
  • messenger RNAs coding for IL-4 from PBMCs derived from 2 healthy donors (donors 16 and 18) were quantified, after stimulation of these PBMCs, between half an hour and 9 hours. with LPS (100 ng / ml), SAC (0.0075%) or Plasmodium falciparum-infected red blood cells at the concentration of 20 parasites for a leukocyte.
  • the expression kinetics of IL-4 appears comparable for both donors (C.)

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la quantification des ARN dans un échantillon biologique, en particulier la quantification des ARN messagers codant pour des cytokines. La présente invention permet une quantification absolue des taux d'ARN messagers de cytokines humaines présents dans un échantillon biologique, par une technique de RT- PCR en temps réel reposant sur l'utilisation d'amorces hautement spécifiques, la détection des amplifications par incorporation d'un intercalant fluorescent, et la quantification absolue grâce à des standards ARN internes (gènes de ménage) et externes (gamme standard ARN de référence). La présente invention concerne la quantification simultanée d'ARN différents, dans les mêmes conditions expérimentales.

Description

QUANTIFICATION DES ARNm DE PROTÉINES D1INTERET AU MOYEN D'UNE RÉACTION RT-PCR EN TEMPS RÉEL
La présente invention concerne le domaine de la quantification des ARN dans un échantillon biologique, notamment la quantification des ARN messagers codant pour des cytokines. La présente invention concerne la quantification simultanée d'ARN différents, dans les mêmes conditions expérimentales.
La quantification des ARN messagers et des ARN viraux est un outil potentiel présentant un grand intérêt, tant dans le domaine de la recherche, que dans le domaine clinique. En particulier, les taux d'ARN messagers spécifiques de cytokines représentent des marqueurs très sensibles de l'état d'activation du système immunitaire in vivo. Dans le domaine de la recherche, la connaissance de ces taux dans différents modèles peut donc permettre une meilleure connaissance du système immunitaire. Bien évidemment, la connaissance de ces taux est également une information capitale pour bon nombre de situations cliniques. Connaître précisément le niveau d'expression de telle ou telle cytokine, peut en effet être un paramètre important pour la prise en charge des patients souffrant de maladies inflammatoires, infectieuses ou immunes. Un exemple d'application de la quantification des ARN messagers codant pour certaines cytokines, pour évaluer un état pathologique chez un patient souffrant d'arthrite rhumatoïde, est décrit dans le brevet US 6,555,320.
Un des moyens utilisables pour quantifier les ARN messagers est la RT-PCR. La « RT-PCR » est un acronyme couramment utilisé en biologie moléculaire, pour « reverse transcription - polymerase chain reaction », ou transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymerase. Ce type de réaction comporte donc deux étapes : une étape de transcription inverse, c'est-à-dire de synthèse d'un ADN simple brin complémentaire d'une séquence d'ARN, et une étape d'amplification en chaîne par polymerase. La première est ici désignée soit par le terme « transcription inverse », soit par l'acronyme anglophone RT. De même, la deuxième phase sera désignée soit par l'expression « amplification en chaîne par polymérase », soit par l'acronyme francophone ACP, soit par l'acronyme anglophone PCR, plus couramment utilisé par les biologistes.
Par rapport à la détection des cytokines correspondantes dans les liquides biologiques ou sur coupe par immuno-histochimie, la détection des ARN messagers par RT-PCR est une technique beaucoup plus sensible permettant la détection dans des échantillons de très petite taille, comme les biopsies de peau. Les autres techniques de détection des ARN messagers, comme la RnaseProtectionAssay (Kits RPA, BD- Biosciences™) et les techniques de Northern Blot (Quantikine™ mRNA, R&D™) nécessitent parfois plus de 10 μg d'ARN total pour la détection d'une seule cytokine, quantité qui n'est pas toujours atteinte pour de nombreux prélèvements cliniques, notamment dans les biopsies. Outre la nécessité d'une grande quantité de matériel de départ, ces techniques sont très longues à mettre en place et peuvent faire appel à l'utilisation de la radioactivité.
La RT-PCR est une technique très sensible, puisqu'elle permet d'atteindre une augmentation importante du nombre initial de cible. Elle est de plus facile et rapide à mettre en œuvre. Cependant, de très petites variations dans l'efficacité de la RT et/ou de la PCR peuvent affecter de façon très significative le résultat final. Il est donc nécessaire de contrôler à la fois les phases de RT et de PCR. Les techniques conventionnelles qui sont basées sur la RT-PCR au plateau ne permettent pas une quantification absolue, car les résultats sont acquis pendant la phase de saturation. Les techniques compétitives, où sont co-amplifiés la cible et un standard interne avec la même efficacité, pallient cet inconvénient, mais présentent une sensibilité moindre en raison de la co-amplification de deux séquences distinctes. De ce fait, elles nécessitent de grandes quantités de matériels, et ne peuvent être mises en œuvre que pour des rapports cible / compétiteur d'étendue limitée (entre 1 :10 et 10:1 généralement). De plus, un précriblage est en général nécessaire pour estimer l'ordre de grandeur dans lequel se situe la quantité de transcrit à détecter. Enfin, l'analyse des résultats est longue et fastidieuse (Bustin 2000).
Les techniques de PCR en temps réel ont ouvert la voie de la quantification absolue (Bustin 2000; Ginzinger 2002). En effet, la détection du produit d'amplification se fait en temps réel (d'où leur dénomination) grâce à l'utilisation de marqueurs fluorescents. La quantification des transcrits se fait pendant la phase exponentielle, seule phase où la quantité d'amplicon n'est dépendante que de la quantité initiale de cible. L'adjonction d'un standard externe permet alors une quantification absolue si celui-ci est amplifié avec la même efficacité. Cette technique est par ailleurs plus facile à automatiser, et l'analyse des résultats relativement simple. Ceci explique qu'elle soit de plus en plus utilisée malgré un coût qui reste élevé (Bustin 2000; Giulietti, Overbergh et al. 2001 ).
Les dosages de cytokines utilisant la RT-PCR en temps réel utilisent pour la plupart des sondes fluorescentes (Taqman™, molecular beacon™, etc..) pour détecter l'amplicon (Stordeur, Poulin et al. 2002). Cette approche est intéressante car seul l'amplicon désiré est détecté en dépit de possibles amplifications non-spécifiques. Cependant, l'utilisation de ces sondes fluorescentes entraîne un surcoût non négligeable. De plus, la moins grande exigence sur la spécificité des amorces a pour revers des biais éventuels importants dans la quantification. En effet, dans les cas où les amorces ne sont pas totalement spécifiques, plusieurs amplifications sont susceptibles d'être réalisées en compétition. Par ailleurs, ces techniques utilisent toutes une gamme standard ADN, et ne prennent donc aucunement en compte, dans leur quantification, l'efficacité de la phase de transcription inverse. La transcription inverse a pourtant une efficacité variable, comme cela est exposé à l'exemple 1.2 ci-après. De ce fait, une quantification d'ARN messager basée sur une réaction de RT-PCR en temps réel utilisant comme standard externe une gamme d'ADN ne peut prétendre être une quantification absolue.. La présente invention a pour objet de pallier au moins en partie aux inconvénients mentionnés ci-dessus, et de permettre une quantification absolue des taux d'ARN messagers déterminés, et en particulier d'ARN messagers de cytokines humaines présents dans un échantillon biologique. Pour cela, l'invention met en oeuvre une technique de RT-PCR en temps réel reposant sur l'utilisation d'amorces hautement spécifiques, la détection des amplifications par incorporation d'un intercalant fluorescent, et la quantification absolue grâce à des standards ARN internes (gènes de ménage) et externes (gamme standard ARN de référence). La présente invention porte donc sur un procédé de quantification d'un ou plusieurs ARN déterminés, notamment au moins deux ARN distincts, dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique dudit ARN, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (ii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i), et (iii) déduction de la quantité d'ARN dans l'échantillon.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de quantification absolue d'un ou de plusieurs ARN cibles dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN cibles à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN cible, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii), (iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et (v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles par rapport à la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage Dans le procédé ci-dessus, le couple d'amorces pour chacun des
ARN à quantifier est de préférence choisi de façon à respecter les critères suivants :
- les amorces sont le plus proche possible mais ne se chevauchent pas. Elles permettent l'amplification d'un fragment de taille inférieure ou égale à 200 paires de bases, de préférence inférieure ou égale à 150 paires de base, de manière encore préférée inférieure ou égale à 100 paires de bases,
- le contenu en nucléotides G et C des amorces est compris entre 20 et 80%, - il est préférable d'éviter la répétition de nucléotides. En particulier, les amorces ne contiennent pas de répétition de plus de trois guanines consécutives,
- la température de fusion des amorces est comprise entre 58 et 600C, en utilisant comme référence pour le calcul des températures de fusion le logiciel Primer Express ; - les 5 nucléotides à l'extrémité 3' des amorces ne devraient pas comporter plus de 2 bases G et/ou C.
Les procédés de l'invention peuvent être mis en œuvre pour quantifier n'importe quel type d'ARN dans un échantillon, qu'il s'agisse d'ARN viraux, d'ARN 16S ou d'ARN messagers codant pour des protéines virales, bactériennes, végétales, etc. Par « ARN déterminé », on entend un ARN dont la séquence est suffisamment bien connue pour qu'il soit possible de concevoir des amorces spécifiques de cet ARN, notamment des amorces qui respectent les critères énoncés ci-dessus. Dans une mise en œuvre particulière, le procédé de l'invention permet la quantification des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique, et comprend les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN messagers à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique dudit ARN messager, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (ii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i), et
(iii) déduction de la quantité d'ARN messager de chacune des cytokines dans l'échantillon.
Afin d'obtenir des résultats représentatifs du nombre de cellules à partir duquel a été faite l'extraction d'ARN ayant subi la RT-PCR, l'étape (i) peut également impliquer, à partir de l'échantillon biologique, la transcription inverse, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique d'un ou plusieurs ARN messagers de gènes de ménage. Le choix d'un tel gène de ménage nécessite une validation très précise et il est préférable de combiner plusieurs gènes de ménage pour obtenir une quantification absolue fiable.
Ainsi, le procédé de l'invention permet la quantification absolue des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN messagers de cytokines à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN messager, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii)
(iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et
(v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines par rapport à la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage.
Dans les expériences décrites ci-dessous, la β2-microglobuline (β2- MG) a été choisie pour les travaux sur les cellules du sang, et l'expression de ce gène est quantifiée par la même méthode que l'est celle du gène cible. Les résultats sont ainsi exprimés en nombre de copies d'ARNm du gène cible pour 1 million de copies d'ARNm de β2-microglobuline.
Les inventeurs ont également développé les gènes de l'ubiquitine C (UBC) et de la YWHAZ dont l'expression est décrite comme étant très stable (Vandesompele et al.). D'autres gènes de ménage peuvent bien évidemment être utilisés dans le cadre de l'invention.
Alternativement, et toujours dans l'optique de quantifier le nombre de cellules à partir duquel s'est faite la réaction, il est possible d'effectuer un comptage des cellules avant extraction de l'ARN. Toutefois, ceci n'est pas toujours possible et souvent imprécis, et il peut également exister un biais au niveau de l'extraction de l'ARN, tout l'ARN des cellules comptées n'étant pas nécessairement extrait.
Une autre possibilité serait donc d'exprimer les résultats en fonction de la quantité d'ARN total rétro-transcrit. Cependant, pour un même nombre de cellules, cette quantité peut varier en fonction de la phase du cycle cellulaire où se trouvent les cellules et en fonction de l'état d'activation des cellules ce qui pose un problème pour la comparaison entre un patient et un contrôle sain qui n'ont certainement pas le même statut d'activation cellulaire. Dans le procédé de l'invention, l'amplification du produit de la transcription inverse peut être réalisée par n'importe quelle technique d'amplification d'acide nucléique utilisée en biologie moléculaire, telle que la PCR (polymerase chain reaction), la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid séquence based amplification), la 3SR (self sustained séquence replication), l'amplification par déplacement de brin ou SDA (strand displacement amplification) et la LCR (ligase chain reaction). La PCR sera néanmoins préférentiellement utilisée pour cette amplification.
La quantification d'ARN différents peut être réalisée dans différents puits ou dans un même puits. Dans le cas d'une quantification de plusieurs ARN dans un même puits, l'intercalent fluorescent sera remplacé par des marqueurs permettant des lectures distinctes de chaque amplification. On pourra pour ce faire utiliser les techniques du type multiplex.
L'utilisation d'une gamme d'ARN de référence, en permettant de prendre en compte le rendement de la phase de RT, permet donc une quantification absolue de l'ARN messager considéré initialement présent dans l'échantillon biologique.
Dans une mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention,, une gamme d'ARN synthétique est donc constituée pour chaque ARN messager à quantifier. Cette gamme est par exemple constituée d'une série de dilutions d'un ARN transcrit à partir d'une cassette d'ADN comprenant le promoteur de l'ARN polymérase du phage T7 en 5' et en 3' de la séquence de l'amplicon amplifié à partir de l'ARN messager, par le couple d'amorces spécifique dudit ARN messager. Cette cassette d'ADN peut être en outre flanquée de sites de restriction par une endonucléase, par exemple de sites de restriction EcoRI. Ceci peut permettre de cloner les constructions obtenues dans des vecteurs plasmidiques avec lesquels il est possible de transformer des bactéries, afin d'assurer le maintien et la conservation de ces constructions à long terme. Un autre objectif de la présente invention est de permettre une automatisation facile de la quantification des cytokines d'intérêt. Pour cela, les inventeurs ont développé des couples d'amorces qui permettent de mettre en oeuvre le procédé ci-dessus dans des conditions identiques pour tous les ARN messagers à quantifier. Un procédé selon l'invention, dans lequel l'étape de transcription inverse puis d'amplification est effectuée par
RT-PCR, et dans lequel toutes les réactions de RT-PCR sont réalisées dans les mêmes conditions de température, fait donc partie intégrante de la présente invention. Ceci permet notamment la détection de plusieurs cytokines sur une même plaque et la comparaison absolue des ARN codant pour plusieurs cytokines. Comme mentionné plus haut, l'utilisation de sondes fluorescentes pour marquer l'amplicon présente le double inconvénient d'être onéreuse, et de risquer d'introduire un biais éventuel dans la quantification, si les amorces utilisées ne sont pas strictement spécifiques de l'ARN messager à quantifier. Dans les procédés selon l'invention, la détection en temps réel du produit d'amplification sera donc préférentiellement effectuée par mesure de l'incorporation d'un intercalant fluorescent, par exemple du SYBR Green I™. Bien entendu, tout autre intercalant fluorescent, tel que le BET, le Hoeschst 33258, le SYBR GoId, le YOYO-1 , ou le PicoGreen peut être utilisé pour cela.
Le procédé développé n'exclut pas pour autant l'utilisation de sondes ou amorces fluorescentes ou toute autre technique de détection permettant la quantification stricte du produit d'amplification. La détection du produit PCR peut en effet être effectuée au moyen de tout signal susceptible d'être transcrit électroniquement. Des sondes oligonucléotidiques comportant d'autres marqueurs que le SYBR Green I sont, par exemple, décrites dans les brevets de Kayem et al. US 6,479,340 et US 6,495,323.
Les inventeurs ont mis au point un ensemble d'amorces utilisables dans des conditions standard programmées dans un thermocycleur, et dans une mise en oeuvre préférée des procédés selon l'invention, les réactions de RT-PCR sont effectuées dans les conditions de thermocyclage suivantes :
- transcription inverse : - incubation des amorces : 8 à 12 minutes entre 23 et 27°C, de préférence 10 minutes à 25°C ;
- action de la transcriptase inverse : 20 à 80 minutes entre 45 et 510C, de préférence 30 minutes à 48°C ;
- inactivation de la transcriptase inverse : 4 à 10 minutes entre 90 et 98°C, de préférence 5 minutes à 95°C ; - 2 à 7 minutes entre 45 et 550C, de préférence 5 minutes à 500C, puis 8 à 12 minutes entre 90 et 980C, de préférence 10 minutes à 95°C ;
- puis 30 à 45 cycles, de préférence 40 cycles, comprenant : - 12 à 20 secondes entre 90 et 98°c, de préférence 15 secondes à 95°C, et
- 50 à 80 secondes entre 55 et 65°C, de préférence 1 minute à 60°C.
Des conditions de thermocyclage particulières sont les suivantes :
- transcription inverse :
- incubation des amorces : 10 minutes à 250C ;
- action de la transcriptase inverse : 30 minutes à 48°C ;
- inactivation de la transcriptase inverse : 5 minutes à 95°C ; - 5 minutes à 500C, puis 10 minutes à 950C ;
- puis 40 cycles, comprenant :
- 15 secondes à 95°C, et
- 1 minute à 60°C.
Bien entendu, les conditions décrites ci-dessus sont essentiellement indicatives et en aucun cas restrictives.
Les réactions de RT-PCR peuvent également avantageusement être réalisées en une seule étape (one step RT-PCR).
Dans les exemples décrits ci-après, toutes les réactions de PCR ont été effectuées en utilisant le SYBR Green PCR master mix™ d'Applied Biosystems™, sur une machine ABI Prism™ 7700, dans les conditions de thermocyclage programmées par défaut, à savoir : 2 minutes à 50°C, 10 minutes à 95°C, puis 40 cycles de {15 secondes à 95°C et 1 minute à 60°C}.
Les inventeurs ont mis au point plusieurs couples d'amorces pour des cytokines humaines, ainsi que 3 gènes de ménage, de telle sorte que chaque couple d'amorces présente les caractéristiques suivantes : - spécificité : les couples d'amorces doivent être strictement spécifiques des ARN messagers à quantifier, ce qui signifie qu'ils ne doivent pas amplifier l'ADN génomique, ni des pseudo-gènes. Pour éviter l'amplification de l'ADN génomique, une technique est de choisir au moins une amorce à la jonction entre deux exons. Le choix d'amorces dans des exons différents, séparés par un intron d'une longueur telle que l'amplification de l'ADN génomique nécessiterait une durée supérieure à la durée de l'élongation, permet également d'éviter l'amplification de l'ADN cellulaire. Pour éviter l'amplification de pseudo-gènes, une mise au point au cas par cas a été nécessaire. Il convient de noter qu'un couple d'amorces peut être spécifique d'un ARN messager même si l'une des amorces de ce couple (ou même les deux) s'hybride aussi avec l'ADN cellulaire et/ou avec des pseudo-gènes. En effet, la spécificité d'un couple est liée à la combinaison des deux amorces. Dès lors qu'une des deux amorces est strictement spécifique de I1ARNm, ou que les deux amorces ne s'hybrident pas à l'ADN cellulaire ou à un pseudo-gène dans des conditions propres à permettre l'amplification exponentielle qui caractérise la PCR, un couple d'amorces sera spécifique de I1ARNm.
- conditions d'utilisation : comme mentionné ci-dessus, les couples d'amorces ont été générés de façon à être tous utilisables dans les mêmes conditions, et particulièrement dans les mêmes conditions de thermocyclage. Ceci implique notamment qu'ils aient une température de fusion (Tm) de l'ordre de 58-600C, et qu'ils permettent l'amplification d'une séquence d'une taille comprise entre 50 et 200 nucléotides, de préférence entre 75 et 150 nucléotides.
L'exemple 2 ci-dessous décrit la façon dont les amorces ont été mises au point. Les couples d'amorces sont décrits dans le tableau 1 suivant : SEQ ID SEQ ID
Gène Numéro d'accession Amorce directe (5'-> 3') Amorce inverse (5'-> 3') Taille de No No l'amplico
IL-1B XM_010760 CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 1 GGGAACTGGGCAGACTCAAA 2 149
IL-10 AY029171 GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT 3 CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT 4 108
IL-12p40 AF180563 CATGGTGGATGCCGTTCA 5 ACCTCCACCTGCCGAGAAT 6 131
IL-13 NM_002188 ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT 7 TCAGGTTGATGCTCCATACCAT 8 96
IL-15 U 14407 CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT 9 CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA 10 115
IL-18 E17135 CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 11 GGGAACTGGGCAGACTCAAA 12 105
IFN-g NM_000619 GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA 13 AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC 14 112
MIF M25639 GCCCGGACAGGGTCTACA 15 CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT 16 77
TGF-β1 NM_000660 CAAGGGCTACCATGCCAACT 17 AGGGCCAGGACCTTGCTG 18 83
TNF-a XM_041847 CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC 19 GGTTTGCTACAACATGGGCTACA 20 97
IL-4 NM 000589 AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC 21 GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT 22 101
B2-MG NM_004048 AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGA 23 GGCTGTGACAAAGTCACATGGTT 24 134
YWHAZ NM_003406 ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 25 CCGCCAGGACAAACCAGTAT 26 93
Ubiquitine C M26880 ATTTGGGTCGCGGTTCTTG 27 TGCCTTGACATTCTCGATGGT 28 132
Tableau 1
Dans une variante de réalisation des procédés de l'invention, pour la quantification d'ARN messagers de cytokines humaines, au moins deux des couples d'amorces sont choisis de façon à ce que la séquence des amorces hybridant avec l'ARN messager considéré présente au moins 85% ou 90% d'identité avec des couples d'amorces cités dans le tableau 1 , considérés comme couples de référence pour chaque ARNm considéré.
On considérera ici, pour un couple d'amorces, que la séquence hybridant avec l'ARN messager considéré présente au moins 85 % d'identité avec un couple donné si, pour chacune des amorces, la partie de cette amorce hybridant avec ledit ARN messager a au moins 85 % d'identité avec une des deux amorces du couple de référence décrit dans la présente demande pour ledit ARN messager. Bien entendu, une identité de 90% est calculée selon le même principe. Plusieurs logiciels existent pour calculer le pourcentage d'identité entre deux séquences, au nombre desquels figure le logiciel BLAST™, qui peut être utilisé ici. En particulier, la version 2.06 peut être utilisée, de même que la version standard d'alignement de nucléotides disponible sur le site de la NCBI ou, pour les séquences entre 7 et 20 nucléotides, la version spécifique pour les séquences courtes, disponible sur ce même site (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Les séquences similaires ainsi envisagées peuvent être de la même longueur que les séquences explicitement décrites dans le présent texte, ou d'une longueur différente, alors comprise de préférence entre 15 et 35 bases. En particulier, des amorces différant des amorces décrites par une modification à leur extrémité 5' (par exemple un ajout de nucléotides non complémentaires de la séquence d'ARN messager), mais qui conservent les caractéristiques de spécificité et de conditions d'utilisation décrites ci-dessus, peuvent être facilement utilisées en lieu et place des amorces spécifiques mises au point par les inventeurs. Par abus de langage, et pour une plus grande clarté du présent texte, il sera dit d'un couple d'amorces dont la séquence hybridant avec l'ARN messager considéré présente au moins 85 % d'identité avec un couple décrit dans la présente demande, qu'il présente au moins 85 % d'identité avec ledit couple d'amorces, même si cette identité n'est calculée que pour la partie de chaque amorce qui est susceptible de s'hybrider avec I1ARN messager.
Dans les procédés de l'invention, il est également possible de contrôler l'efficacité de la phase d'extraction de l'ARN à partir de l'échantillon biologique. Pour cela, une quantité connue d'ARN hétérologue est introduite dans l'échantillon avant l'extraction. Par "ARN hétérologue", on entend ici n'importe quel ARN qui comprend une séquence amplifiable par RT-PCR avec des amorces qui ne permettent pas l'amplification d'une séquence identique à partir de l'échantillon biologique. Il peut s'agir d'un ARN provenant d'une espèce différente, par exemple de bactéries ou de levure lorsque l'échantillon provient d'un animal, ou d'un ARN synthétique. Cet ARN hétérologue est alors quantifié après RT-PCR (ou réaction équivalente), ce qui permet de contrôler la phase d'extraction. Egalement dans l'objectif de contrôler le rendement de l'extraction, il est possible d'introduire dans l'échantillon biologique à analyser un nombre connu de cellules hétérologues. Le taux d'expression de l'ARN d'un gène de ménage (ou autre) de ces cellules est alors quantifié après extraction. Bien entendu, ce gène est choisi de façon telle qu'il comprend une séquence amplifiable par RT-PCR avec des amorces qui ne permettent pas l'amplification d'une séquence identique à partir de l'échantillon biologique. Le rapport entre le nombre de copies d'ARN messager de ce gène des cellules hétérologues et le nombre de cellules hétérologues introduites dans l'échantillon permet d'évaluer le rendement de l'extraction. L'invention porte également sur un ensemble de couples d'amorces nucléotidiques destinées en particulier à être utilisées dans les procédés de l'invention, pour quantifier des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique, et dans lequel au moins deux couples d'amorces, de préférence trois, sont choisis parmi, ou présentent un degré d'identité d'au moins 85% ou 90% avec les couples d'amorces du tableau 1. Un autre objet de l'invention est une trousse de détection de désordres liés à la régulation des lymphocytes Th1/Th2, comprenant un ensemble de couples d'amorces tel que décrit ci-dessus, caractérisée en ce que les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL-10, l'IL-13, le TGF-β, le TNF-α, et l'IFN-γ. Le cas échéant, une telle trousse peut également contenir un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi NL-2, l'IL-4, l'IL-5, et le TNF-β.
La présente invention porte également sur une trousse de détection de désordres inflammatoires ou de désordres de l'immunité innée, comprenant un ensemble de couples d'amorces tel que décrit plus haut, dans lequel les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFN-γ, le TNF-α, le TGF-β, l'IL-1-β, l'IL-12p35, I1IL- 12p40, l'IL-15 et NL-18. Une telle trousse peut également comprendre en outre un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFN-α, l'IL-6, l'IL-8, l'IL-21 , l'IFN-β, TiNOS et l'IL-16.
Deux autres trousses, destinées à quantifier les ARN messagers des cytokines reliées à l'IL-10, ou reliées à l'IL-12, font également partie de l'invention. La première comprend un ensemble de couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de
TARN messager de l'IL-10, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2- microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi PIL-19, l'IL-20, PIL-22 et l'IL-24. La deuxième, dédiée aux cytokines reliées à l'IL-12, comprend un ensemble de couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de l'ARN messager de l'lL12p40, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2- microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL-12p35, l'IL-23, l'IL-27 et I1AKI 55.
Un des buts des trousses de détection selon la présente invention est d'être utilisables en clinique pour évaluer l'état du système immunitaire d'un patient, sans nécessiter la mise au point des conditions de réalisation de la RT-PCR pour chaque ARN messager recherché, en vue d'obtenir directement une quantification absolue des ARN messagers de cytokines impliquées dans les désordres mentionnés ci-dessus.
Cette quantification absolue peut être obtenue grâce à l'utilisation de gammes d'ARN standard. Une trousse selon l'invention, telle que décrite plus haut, et comprenant en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ARN synthétique comprenant la séquence dudit ARN messager qui est amplifiée par le couple d'amorces, fait donc également partie de la présente invention. Les trousses de l'invention comporteront en outre avantageusement une notice explicative destinée à l'utilisateur.
Dans l'hypothèse où le rendement de la phase RT pourrait être maîtrisé, une gamme d'ADN comprenant la séquence de l'ADN complémentaire qui est amplifiée par le couple d'amorces pourrait également être utilisée. Alternativement, l'utilisateur des trousses selon la présente invention peut produire une gamme d'ARN standard à partir d'une matrice ADN. L'invention porte donc également sur une trousse telle que décrite plus haut, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ADN synthétique comprenant la séquence de l'ADN complémentaire qui est amplifiée par le couple d'amorces.
Dans les trousses de l'invention comportant un ARN ou un ADN synthétique destiné à constituer une gamme de référence, cet acide nucléique synthétique peut être présent soit directement sous la forme d'une gamme d'ARN standard, soit sous la forme d'une solution mère de concentration déterminée, à partir de laquelle l'utilisateur effectuera des dilutions, soit sous la forme d'ARN précipité et séché, par exemple lyophilisé.
La solution mère de la gamme standard (ADN ou ARN) peut être également présente sous forme d'acide nucléique en solution dans l'éthanol ou l'isopropanol. L'utilisateur devra alors centrifuger cette solution afin de culoter l'acide nucléique avant de resuspendre le culot dans un tampon adéquat (type eau + inhibiteurs de Rnases ou eau traitée au DEPC), et de déterminer par lecture de la densité optique la concentration de la solution obtenue. Celle-ci sera alors ramenée à la concentration correspondant au premier point de la gamme standard.
Comme mentionné ci-dessus, l'ARN synthétique peut être obtenu par transcription in vitro à partir d'une cassette d'ADN comprenant le promoteur de l'ARN polymérase du phage T7 en 5' et en 3' de la séquence à amplifier. Une autre trousse selon l'invention peut donc contenir une construction ADN servant de matrice de transcription pour l'obtention de l'ARN standard et, le cas échéant, les réactifs nécessaires à la transcription in vitro de cette matrice. Comme mentionné ci-dessus, l'utilisateur devra, après transcription et purification, quantifier l'ARN synthétique afin de générer la gamme d'ARN standard. Une notice comportant des instructions à cet effet pourra être incluse dans la trousse en question.
Les trousses selon l'invention peuvent également comporter un ARN hétérologue ou des cellules hétérologues par rapport aux échantillons biologiques avec lesquels elles sont destinées à être utilisées, ainsi qu'un couple d'amorces spécifiques d'une séquence comprise dans cet ARN ou dans l'ARN de ces cellules. Lors de l'utilisation de ces trousses, une quantité de l'ARN hétérologue ou de cellules hétérologues sera mélangée avec chaque échantillon biologique à traiter, avant l'extraction de l'ARN, afin de contrôler l'efficacité de la phase d'extraction, comme mentionné plus haut. Une telle trousse comporte donc de préférence des amorces spécifiques de cet ARN hétérologue ou d'une séquence d'ARN de ces cellules hétérologues. Un protocole de contrôle de cette efficacité peut alors être décrit dans la notice explicative éventuellement présente dans la trousse.
L'ADN synthétique peut être obtenu par PCR en utilisant soit les amorces spécifiques de l'ARN considéré, soit une version modifiée de ces amorces (ajout de sites de restriction, ...)- L'amplicon obtenu peut être clone dans un vecteur plasmidique (soit à l'aide des sites de restriction, soit en utilisant des kits de clonage de produits PCR type TA cloning kit ® de InVitrogen ®). Ceci permet non seulement une meilleure conservation de la construction, mais aussi une meilleure détermination des concentrations de solutions standard, car pour un nombre identique d'amplicons, la valeur de densité optique sera plus élevée, puisqu'elle prendra en compte les nucléotides composant le vecteur.
Une trousse selon l'invention peut également comprendre un logiciel de traitement des données, capable de compiler les résultats obtenus à partir des gammes standard, des gènes de ménages, et de l'échantillon biologique, et de donner directement la quantité d'ARN messager de chaque cytokine testée dans l'échantillon biologique. Ce logiciel peut être porté par tout support, y compris une disquette ou une carte directement implantable sur le thermocycleur utilisé. Le cas échéant, il peut être réduit à une macro dans Microsoft Excel® ou d'autres tableurs, pour automatiser les principales étapes du traitement de données.
Selon un mode de réalisation préféré des ensembles de couples d'amorces, ou des trousses de l'invention, ces ensembles ou trousses comprennent des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou onze cytokines.
Suivant un autre aspect de l'invention, les ensembles de couples d'amorces ou trousses décrits plus haut comprennent de préférence des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins un, deux, trois ou quatre gènes de ménage. Ces gènes de ménage peuvent par exemple être choisi parmi les gènes de β-actine (ACTB), β-2-microglobuline
(B2M), glycéraldéhyde-3-phosphate dehydrogénase (GAPD), hydroxyméthyl- bilane synthase (HMBS), hypoxanthine phosphoribosyl-transférase I (HPRT I), la protéine ribosomale LI3a (RPLI3A), la sous-unité A du complexe succinate dehydrogénase (SDHA), la protéine de liaison à la TATA box (TBP), l'ubiquitine C (UBC), et le peptide zêta de la protéine d'activation de la tyrosine-3-monooxygénase / tryptophane 5 monooxygénase (YWHAZ). Des exemples d'amorces utilisables pour amplifier des séquences de ces gènes de ménages sont donnés dans l'article de Vandesompele, De Prêter et al. 2002. Les exemples et figures présentés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.
Légende des figures
Figure 1 : Schéma du protocole de RT-PCR quantitative en temps réel utilisant une gamme d'ARN standards recombinants.
Figure 2 : Construction d'une gamme d'ARN standard. Le couple d'amorce spécifique génère un amplicon qui sert de matrice à une seconde PCR utilisant les amorces spécifiques modifiées par la fusion en 5' de la séquence du promoteur 11 suivie d'un site de restriction EcoRI. Le produit de PCR est purifié avant d'être utilisé comme matrice de transcription in vitro. L1ARN standard produit est purifié, quantifié afin de réaliser une gamme d'ARN standard. Cette gamme subira une RT-PCR et servira de référence pour la quantification absolue du nombre de copies de TARNm considéré.
Figure 3 : Protocole de comparaison des approches gamme ARN versus gamme ADN.
Voie I : après transcription inverse, un ADNc du standard ARN est dilué en série d'un facteur 10 afin de générer une gamme d'ADNc. Voie II : l'ARN standard est dilué en série d'un facteur 10 et chaque point subit une RT- PCR. Voie III : une gamme d'ADN de séquence correspondant à celle de l'ARN standard est amplifiée par PCR. Cette voie est celle classiquement utilisée pour la quantification des ARNm. Les conditions de PCR en temps réel sont identiques pour les 3 voies (même mix PCR, même plaque). Les efficacités d'amplification correspondantes sont calculées à partir des pentes des droites standards. L'efficacité de transcription inverse est égale au rapport entre EII et El. Efficacité de PCR (El) Efficacité de RT-PCR (EII)
Efficacité de PCR (EIII)
Figure 4 : Validation des amorces. La spécificité des couples d'amorces utilisés est validée par analyse sur gel d'agarose (A) et par séquençage. Les courbes de dissociation (B) renseignent également sur la formation de dimères d'amorces. Enfin, les amorces sélectionnées sont utilisées en RT- PCR temps réel pour amplifier une gamme d'ARN standard spécifique dudit couple d'amorces (exemple de la β2-μglobuline : C).
Figure 5 : Courbes de dissociation des produits d'amplification humains pour la β2-microglobuline, le MIF, l'IFN-γ, IL-1β, l'IL-15, l'IL-12p40, l'IL-10, Ie TNF, l'IL-13, l'IL-18 et le TGF-β-1. Après 40 cycles d'amplification, les amplicons sont soumis à une montée progressive en température de 60 à 85°C. Une diminution brutale de la fluorescence accompagne la dissociation des deux brins d'ADN du produit d'amplification lorsque ceux-ci atteignent leur température de fusion. La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique.
Figure 6 : Courbes de dissociation des produits d'amplification humains pour l'ubiquitine C (A.) et la YWHAZ (B.). La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique.
Figure 7 : Courbes de dissociation des produits d'amplification simiens pour la β2-microglobuline, le MIF, l'IL-12p40, l'IL-10, l'IL-15 (A.) et l'IFN-γ, la GAPDH et le TNF-α (B.). La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique. Figure 8 : Détermination des concentrations d'amorces optimales pour le TNF-α. Les amorces sens et antisens ont été utilisées à 50, 300 ou 900 nM final pour amplifier les transcrits du TNF-α par RT-PCR en temps réel.
Figure 9 : Détermination de la sensibilité de la technique. L'ARN total issu d'un nombre décroissant de cellules a été soumis à une RT-PCR pour le gène de la β2-microglobuline. Parallèlement, une gamme d'ARN standard de ce même gène a subi les mêmes étapes. Ainsi, il a été déterminé que la technique de la présente invention permettait l'extraction et l'amplification de l'ARN d'au moins 10 cellules. L'amélioration du rendement de la phase d'extraction de l'ARN est en cours et devrait permettre d'augmenter cette sensibilité.
Figure 10 : Sensibilité des gammes ARN. Une gamme de nombre de copies d'ARN standard de chaque transcrit a été rétro-transcrite puis amplifiée par
PCR en temps réel afin de déterminer le nombre minimum de copies amplifiable. Pour les transcrits de l'IL-1β, notre technique permet la détection de 10 copies d'ARNm.
Figure 11 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de la β2-microglobuline et de l'IL-1 β. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 12 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'IL-15 et de l'IL-18. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 13 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'IFN-γ et du TGF-β1. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 14 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'ubiquitine C et de la YWHAZ. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR.
Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 15 : Reproductibilité inter-expérimentale de la technique pour les gènes de la β2-microglobuline et du TGF-β1. Huit gammes différentes d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR à des jours différents. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points de gamme. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne des valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 16 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre une gamme standard et un échantillon cellulaire. Une gamme d'ARN standard pour la β2- microglobuline allant de 10 à 108 copies a été amplifiée par RT-PCR. La pente de la droite standard résultante (A.) est égale à -3,305. Cette pente est très proche de celle issue de la droite standard B. correspondant à une gamme de densité cellulaire allant de 10 à 105 cellules dont l'ARN total a subi les mêmes conditions de RT-PCR que la gamme standard pour l'amplification des ARNm de la β2-microglobuline (= -3,307).
Figure 17 : Comparaison des efficacités et des sensibilités entre la méthode de l'invention et le kit TaqMan™ pour l'amplification des transcrits du TNF-α. Une gamme d'ARN cellulaire total a été rétro-transcrite puis amplifiée par PCR en temps réel en utilisant soit la méthode de l'invention soit le kit commercial TaqMan™. Les droites standard obtenues permettent de déterminer l'efficacité et les sensibilités des deux techniques. Dans les conditions testées, la méthode de l'invention est aussi sensible et plus efficace que TaqMan ™ considérée comme technique de référence.
Figure 18 : Cinétiques de transcription et de sécrétion du MIF (A.) et du
TNF-α (B.)
A. Cinétiques de transcription et de sécrétion du MIF par des cellules mononucléées du sang périphérique issues d'un donneur sain après 3, 6 et 9 heures de culture en présence de LPS (10 ng/mL), de SAC (0,0075%), de globules rouges parasités par Plasmodium falciparυm au stade trophozoïtes
(20:1) ou de globules rouges sains (20:1). Cette cytokine étant pour partie préformée, il n'existe pas de relation directe entre les taux de transcrits et les taux de protéines sécrétées. La sécrétion du MIF est mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (R&D™). B. Cinétiques de transcription et de sécrétion du TNF-α par des cellules mononucléées du sang périphérique issues d'un donneur sain après 3, 9 et
18 heures de culture en présence de LPS (10 ng/mL), de SAC (0,0075%), de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum au stade trophozoïtes (20:1 ) ou de globules rouges sains (20:1). Cette cytokine n'étant pas stockée dans la cellule, la transcription de l'ARNm précède de quelques heures la sécrétion mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (BioSource). Il y a donc corrélation entre l'activité transcriptionnelle et la sécrétion de la protéine correspondante.
Figure 19 : Transcription des gènes de différentes cytokines par des monocytes isolés de donneurs sains. Les monocytes isolés ont été incubés pendant 0.5, 1 , 2, 3, 6 ou 9 heures en présence de LPS (100 ng/mL) ou de
SAC (0,0075%). Les transcrits de cytokines sont quantifiés puis normalisés pour un million de copies d'ARN de β2-μglobuline. Les histogrammes représentent le rapport entre le nombre de copies d'ARN cibles et d'ARNm de la β2-microglobuline (moyenne de 2 donneurs).
Figure 20 : Capacité de transcription du TGF-β1 chez des sujets contrôles ou des patients souffrant de paludisme.
Des PBMC d'individus contrôles (Asymptomatic Controls) ou de patients souffrant de paludisme (Malaria patients) ont été prélevés et stimulés pendant 22 heures par du LPS (100 ng/mL). L1ARN total de ces PBMC a été extrait afin de quantifier le nombre de transcrits TGF-β1. Les histogrammes représentent le nombre de copies d'ARNm de TGF-β1 pour un million de copies d'ARNm de β2-microglobuline. * : différence statistiquement significative (p< 0,05) Figure 21 : Développement des conditions pour la quantification de l'ARNm de l'IL-4. La spécificité des amorces choisies est validée par la présence d'un pic unique sur la courbe de dissociation (A.) et par séquençage du produit. Une gamme de concentration d'ARN standard est amplifiée par RT-PCR pour valider son utilisation pour la quantification des ARNm de l'IL-4 (B.).
Celle-ci est réalisée sur des PBMC de 2 donneurs sains (D16 et D18) stimulées par du LPS, du SAC ou des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum pendant 0.5, 1 , 2, 3, 6 ou 9 heures (C).
EXEMPLES
Pour tous les exemples qui suivent, les matériels et méthodes décrits ci-après ont été utilisés :
Stimulation des cellules
Des cellules humaines mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains ont été isolées en utilisant du Ficoll™ 1.077
(Nycomed™),
Un million de cellules vivantes ont été distribuées dans des plaques de culture à 48 puits à fond plat (Costar™), et stimulées avec du LPS (10 ng/ml, E. co// 0111 : B7, Sigma™), PHA-L (10 μg/ml, Sigma™), SAC (0,0075%, Pansorbin Cells™), des schizontes vivants de P. falciparum
(parasitémie finale de 1%, souche FCR3) ou des globules rouges O+ intacts et non infectés.
Les cellules ont été récoltées pour l'extraction de l'ARN après 3, 6, 9, 12, 18, 24 et 48 heures de stimulation, puis resuspendues dans du tampon RNA PLUS (Q-Biogene™, 500 μl pour 106 cellules).
Extraction d'ARN et transcription inverse
L'ARN cellulaire total a été extrait en utilisant le kit RNA-PLUS® de chez Q-Biogene®, en suivant les instructions du fournisseur et resuspendu dans de l'eau dépourvu de RNase (Ambion™). La quantité d'ARN total a été déterminée par densité optique à 260 nm. L'ADN complémentaire a été obtenu en utilisant les réactifs "TaqMan™ Reverse Transcription Reagents" {Applied Biosystems™) dans un volume réactionnel de 50 μl.
Amplification de IADN complémentaire
Une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (ACP ou polymérase chain reaction, PCR) quantitative en temps réel a été effectuée sur un thermocycleur ABI Prism 7700™ en utilisant le tampon SYBR-Green
PCR master mix™ (Applied Biosystems™) dans un volume final de 30 μl.
Les conditions de thermocyclage étaient les conditions par défaut : 500C pendant 2 minutes, 95°C pendant 10 minutes et 40 cycles de {95°C pendant 15 secondes puis 600C pendant 1 minute}. Chaque point a été dupliqué. Les amorces utilisées pour chaque amplification (chacune à 900 nM finale) sont décrites dans le Tableau 1.
Construction de standards ARN externes
Des amorces modifiées ont été utilisées sur I1ADNc cellulaire pour construire la matrice de transcription. Ces amorces étaient les amorces spécifiques des gènes considérés, fusionnées à leur extrémité 5' à la séquence du promoteur T7. Chaque matrice a ensuite été purifiée sur colonne de silice (Nucleospin™, Macherey-Nagel™) avant d'être transcrite in vitro en utilisant le kit MegaShort Script Transcription Kit™ (Ambion™). Les concentrations des ARN standard ont été calculées par densité optique à
260 nm. Des dilutions en série ont été réalisées pour chaque standard externe, dans une plage allant de 10 copies par μL à 1012 copies par μL, dans de l'eau dépourvue de RNase. Ces dilutions ont été aliquotées et stockées à -80°C. Ces standards ont ensuite subi la même transcription inverse que I1ARN cellulaire.
Analyse quantitative
Les courbes de standards externes et la quantification ont été obtenues en utilisant le logicielSDS 1.9. A partir de ces courbes standard, la quantité initiale des ARN messagers cibles a été déterminée pour chacun des échantillons, et standardisée pour la β2-microglobuline. Les résultats sont exprimés en nombre de copies d'ARN messager par million de copies d'ARN messager de β2-microglobuline.
Test ELISA Les tests ELISA ont été réalisés en suivant les instructions du fournisseur (TNF-alpha: BioSource et MIF: R&D).
Exemple 1 : Courbe standard d'ARN
1.1 : génération de la courbe standard
La technique d'ACP emboîtée (Nested-PCR) a été utilisée pour flanquer chaque amplicon spécifique d'une séquence promotrice de la polymérase T7. Cette construction a été utilisée pour générer un ARN standard qui a été chargé sur un gel et soumis à une migration pour vérifier sa clonalité (résultats non montrés). Le poids moléculaire de chacun des standards a été calculé sur la base de sa séquence attendue, puis des solutions allant de 101 à 1012 copies d'ARN standard par microlitre ont été faites.
Ces solutions diluées en série ont été soumises à une transcription inverse, et l'ADN a été amplifié en doublant chaque point, pour générer une courbe standard, en pointant le cycle seuil (CT) en regard de la valeur logarithmique du nombre de copies d'ARN de départ pour chaque dilution. La figure 2 montre un exemple de ces courbes pour IFN-γ. Chaque courbe générée a montré une efficacité de RT-PCR supérieure à 84% et une gamme dynamique d'au moins 7 ordres de grandeur. Ceci a permis une quantification fiable et reproductible d'un ARNm d'un échantillon cellulaire. 1.2 : Comparaison entre des courbes d'ARN et d'ADN standard
Afin de comparer les résultats générés par l'utilisation d'une gamme d'ARN standard à ceux issus de l'utilisation d'une gamme d'ADN standard, l'expérience suivante a été réalisée. Les matrices ADN servant de base à la transcription des ARN standard de I1IL-I β, de l'IFN-γ et du TNF-α ont été purifiées et quantifiées par D. O. afin de réaliser des gammes de concentrations allant de 10 copies à 1012 copies/μL. On disposait donc de deux types de gammes dans lesquelles les deux constructions ont quasiment la même séquence.
Les gammes d'ARN standard ont été soumises à une étape de transcription reverse et 5 μL du produit de RT ont été amplifiés par PCR en temps réel. Parallèlement, un échantillon d'ARN standard a été rétro-transcrit, et I1ADNc correspondant a fait l'objet de dilutions en série d'un facteur dix. Une gamme d'ADNc a donc ainsi été générée et soumise à amplification (même mix, même volume final que les gammes d'ARN et d'ADN).
Le protocole est schématisé à la figure 3. Les droites standard résultant de ces trois gammes ont les caractéristiques indiquées dans le tableau 1 ci-dessous:
D'après la théorie de la PCR1 le nombre de copies entre deux cycles augmente d'un facteur X qui est égal à 2 si la PCR est efficace à 100 %. L'efficacité E d'une PCR est donnée par E = X-1 , or X = 1 o-1/pente.
Ainsi, on a les efficacités indiquées ci-dessous.
RNA standard VOIE III : DNA standard
Voie : PCR Voie II : RT-PCR Efficacité Pente efficacité Pente efficacité pente efficacité de RT (ll/l)
IL-1β -3,1966 1 ,05 -3,4794 0,94 -3,067 1 ,11 0,84
IFN-y -3,1 161 1 ,09 -3,843 0,82 -2,944 1 ,19 0,76
TNF-α -3,556 0,91 -3,61 0,89 -3,503 0,93 0,97
Tableau 2 : Influence des approches gamme ARN versus gamme ADN sur la quantification des transcrits. Les données de pente et d'efficacité pour les trois types de gamme sont données. Les efficacités de transcription inverse (RT) sont calculées par le rapport entre l'efficacité de RT-PCR (voie II) et celle de PCR (voie I).
Il apparaît donc que les efficacités des RT-PCR sont inférieures à celles des PCR pour les 3 gènes.
Ceci est dû à la phase de RT puisque les efficacités des PCR sur ADNc et ADN sont similaires pour chaque gène.
Les efficacités des PCR sur ADNc étant semblables à celles des
PCR sur ADN, la différence d'efficacité entre la RT-PCR et la PCR est attribuable à la phase de RT qui n'a pas une efficacité de 100% contrairement à ce qui est avancé par la plupart des auteurs pour justifier l'emploi d'une gamme ADN pour la quantification d'ARNm.
Ceci est un premier biais à prendre en compte pour quantifier de façon fiable le taux de transcrits. Cependant, si ce biais était constant, la comparaison entre les expériences serait possible.
L'expérience montre que, l'efficacité de la phase de RT diffère selon les ARN
Le biais de quantification apporté par la phase de RT existe donc et varie. Ceci ne peut donc en aucun cas permettre l'utilisation de gammes d'ADN pour la quantification fiable, reproductible et précise des ARN messagers.
En effet, si on compare les données obtenues en se basant sur les droites standard issues des gammes ADN ou ARN pour quantifier un nombre connu de transcrits de TNF-α on obtient les résultats suivants :
Figure imgf000031_0001
Tableau 3 : Influence des approches gamme ARN versus gamme ADN sur la quantification des' transcrits
En se basant sur une gamme d'ADN, on sous-estime donc fortement le nombre de transcrits présents dans l'échantillon. De plus, le 5 degré de sous-estimation varie selon les transcrits étudiés.
L'ensemble de ces données justifie l'emploi d'une gamme d'ARN standard pour la quantification fiable et reproductible de transcrits et démontre le manque d'exactitude et l'inutilité de l'utilisation d'une gamme d'ADN. i o Exemple 2 : Amorces
Exemple 2.1 : Validation des amorces
Des paires d'amorces ont été dessinées à partir des séquences génomiques publiées en utilisant le logiciel Primer Express™ (Applied Biosystems™), en respectant au mieux les critères suivants :
15 - Choisir des amorces les plus proches possible l'une de l'autre à condition qu'elles ne se chevauchent pas
- Garder le contenu en GC entre 20 et 80%
- Éviter la répétition de nucléotides. Ceci est particulièrement vrai pour la guanine pour laquelle une suite de 4 guanines ou plus devrait être
20 évitée.
- Choisir des amorces dont la température de fusion se situe entre 58 et 600C quand on utilise le logiciel Primer Express™.
- Les 5 nucléotides à l'extrémité 3' ne devraient pas comporter plus de 2 bases G et/ou C.
25 La spécificité des amorces pour les ADNc cibles a été assurée en dessinant des amorces directes et inverses amplifiant un produit couvrant un intron et qui ne conduit pas à l'amplification de pseudo-gènes ou d'autres gènes reliés. La spécificité a été estimée par une analyse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium, par des courbes de dissociation (Fig. 4 à 7) et par séquençage des produits d'amplification par PCR (résultats non montrés).
Chaque amplicon a été clone dans un vecteur pCR2.1 en utilisant le kit d'Invitrogen™ (TyA cloning kit™), et séquence. Les séquences présentaient toutes au moins 98% d'identité avec la séquence attendue
(résultats non montrés).
Exemple 2.2 : Optimisation de la concentration des amorces
II s'agit de tester l'effet d'une variation de la concentration en amorces sur la quantité de copies d'ARN détectées. Pour ce faire, les concentrations d'amorces sens et anti-sens variaient de 50 à 900 nM. Les concentrations des amorces ont été optimisées pour déterminer les1 concentrations d'amorces minimum donnant le cycle de seuil (threshold cycle, CT) le plus bas (et donc la plus grande sensibilité) et le ratio signal/bruit maximum en fluorescence (ΔRn), tout en minimisant les amplifications non-spéficques (résultats non montrés).
La figure 8 présente les résultats obtenus pour la détection du TNF-α. Pour ce gène comme pour tous les autres, le couple de concentration optimale est de 90OnM pour l'amorce sens et anti-sens.
Exemple 3 : Détermination de la sensibilité de la technique : Taille minimale de l'échantillon et nombre de copies minimal
Afin de déterminer la sensibilité de la technique, une gamme de densité cellulaire allant de 105 cellules à 1 cellule a été réalisée. L'ARN total de ces cellules a été extrait et rétro-transcrit. Un dixième de l'ADNc obtenu a subi une amplification par PCR pour le gène de la β2-microglobuline. En parallèle, une gamme d'ARN standard de ce même gène a subi les mêmes étapes de RT-PCR. Les résultats de cette expérience sont présentés en figure 9. Ils montrent que cette technique permet de détecter de façon fiable les transcrits du gène de la β2-microglobuline dans 10 cellules au minimum. II est à noter qu'il ne s'agit pas ici d'une dilution d'ARN correspondant à un «équivalent cellule» de 10 mais bien d'ARN extrait directement de 10 cellules. Si on raisonne en dilution d'ARN standard, la sensibilité est de 10 copies.
Il a également été établi, pour chacun des gènes développés, la sensibilité de la technique en termes de nombre de copies détectables.
Celle-ci varie selon les cytokines entre 10 et 100 copies (Figure 10)
Exemple 4 : Variabilités intra et inter expérimentales
La reproductibilité de la technique a été étudiée. La variabilité intra expérimentale a été calculée à partir de points de gamme d'ARN standard en quadruplicate pour les gènes de la β2-microglobuline, ubiquitine C, YWHAZ, IL-IB1 IL-15, IL-18, IFN-gamma et TGF-B1. La moyenne des cycles seuils pour chaque point ainsi que les écarts types à cette moyenne ont été calculés et sont représentés sur les figures 11 , 12, 13 et 14 (A et B). De même, une des gammes a servi de standard pour calculer les quantités d'ARN standard pour les 3 autres points. La moyenne des quantités obtenues ainsi que les écarts types à cette moyenne sont montrés en figures 1 1 , 12, 13 et 14 (C et D).
La variabilité inter expérimentale a été déterminée pour les gènes de la β2-microglobuline et du TGF-β1 à partir de 8 expériences indépendantes réalisées à plusieurs jours d'intervalle et en utilisant des lots différents de mix PCR. La même stratégie que pour la variabilité intra expérimentale a été utilisée et les résultats sont présentés sur la figure 15. Ces résultats montrent que la technique de la présente invention est très reproductible, aussi bien au niveau intra expérimental qu'au niveau interexpérimental. Ceci est un atout majeur pour la fiabilité et la comparaison des résultats obtenus pour différents échantillons traités à différents moments. Exemple 5 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre la gamme et l'échantillon
Comme à l'exemple 4, l'efficacité de RT-PCR varie d'un gène à l'autre et selon les expériences pour un même gène. II est donc possible que cette variation entraîne un biais dans la quantification si elle se produit entre la gamme et les échantillons.
Les efficacités de RT-PCR entre une gamme de β2- microglobuline et des ARN cellulaires extraits de 10, 100, 1000, 10 000 ou 100 000 cellules ont donc été comparées. Ainsi, les ARN standard et cellulaires composent chacun une gamme de concentration en ARN dont les points sont espacés d'un facteur 10.
Ces deux populations d'ARN ont subi en parallèle les mêmes conditions de RT-PCR pour l'amplification des ARNm de la β2- microglobuline.
Les résultats sont présentés à la figure 16.
Ils montrent que les pentes des droites standards sont quasiment identiques et que donc les efficacités de RT-PCR sont très proches entre la gamme standard et l'échantillon cellulaire (100,7% et 100,6% respectivement).
Ainsi, la variabilité de l'efficacité de RT-PCR n'introduit pas de biais dans, la quantification des ARNm dans les conditions utilisées dans cette expérience. Les résultats obtenus par cette technique sont donc fiables.
Exemple 6 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre la méthode de l'invention et le kit TaqMan™
La méthode de l'invention a été comparée à la technique Taqman™, technique de référence dans ce domaine, pour le gène du TNF- α. Des monocytes ont été stimulés pendant 6 heures avec du LPS. L'ARN total a été extrait de 106 cellules et dilué en série. Cette gamme d'ARN cellulaire total a été amplifiée pour I1ARNm du gène TNF-α, en parallèle, sur une même plaque et dans les mêmes conditions de thermocyclage en utilisant soit la méthode de l'invention soit la chimie Taqman™ (Applied- Biosystem). Les résultats de ce test sont montrés figure 7. Aux dilutions étudiées, il apparaît que la méthode de l'invention est aussi sensible que la technique de référence Taqman™. De plus, la présente méthode montre une efficacité légèrement supérieure à celle de la technique Taqman™: 105% versus 80% correspondant respectivement à des pentes de -3,2 (technique de l'invention) et -3,9 (technique Taqman™).
Exemple 7 : Validation des standards internes (gènes de ménage)
Le choix d'un gène endogène exprimé de façon stable, et qui peut être utilisé comme standard interne (gène de ménage) est un pré-requis pour une quantification par RT-PCR précise. Le standard interne est choisi en fonction de l'évaluation clinique du patient et de l'origine tissulaire de l'échantillon biologique. Puisque l'analyse des cytokines nécessite un standard interne pouvant être utilisé sur des leucocytes périphériques sanguins, 3 gènes connus pour la stabilité de leur expression au sein des leucocytes ont été étudiés : la β2-microglobuline (β2-MG), l'ubiquitine C
(UBC) et le gène YWHAZ. La stabilité de la quantité de transcrits de ces 3 gènes a été comparée par la méthode de l'invention, dans différentes conditions d'activation.
Des PBMC de donneurs sains ont été stimulés pendant 3 heures par du PBS ou du PHA (phytohaemaglutinin) puis séparés en deux aliquots identiques. Les ARN cellulaires totaux ont été extraits à deux jours d'intervalle puis le même volume d'ARN a été retro-transcrits, et les transcrits des 3 gènes amplifiés par RT-PCR, dans les mêmes conditions. Le tableau 4 suivant montre les résultats obtenus : moyenne obtenue et entre parenthèse les résultats des deux extractions. Ces donnés montrent que la β2- microglobuline donnent des résultats reproductibles, avec moins de 12% de variabilité entre les différentes expériences, alors que les résultats concernant les gènes ubiquitine C et YWHAZ montrent une variabilité pouvant atteindre 47%. La β2-microglobuline a donc été choisi comme standard interne pour les futures expériences de quantification absolue.
TO (non-stimulé) LPS 3h PHA 3h
B2-MG 1 ,24.107 1 ,48.107 1 ,37.107 (1 ,00.107-1 ,49.107) (1 ,17.107-1 ,79.107) (1 ,11.107-1 ,64. 107)
UBC 2,04.105 2.39.105 1 ,98.105 (0,62.105-3,46.105) (1 ,51.105-3,28.105) (1 ,33.105-2,64. 105)
YWHAZ 1 ,89.105 2.80.105 3,36.105 (0,78.105-3,01.105) " (2 ,25.105-3,34.105) (2 ,60.105-4,13. 105)
Tableau 4 : Choix du standard interne. Pour chaque gène testé, apparaissent sur la première ligne la moyenne des deux extractions, et sur la seconde ligne, le résultat individuel des deux extractions. Les tests ont été réalisés sans stimulation (TO) ou après une stimulation de 3 heures avec du LPS ou du PHA.
Exemple 8 : Cinétique de transcription des facteurs MIF et TNF-α
La figure 18 représente les cinétiques de transcription et de production du MIF (A.) et du TNF-α (B.) par des PBMC d'un donneur sain stimulés par le LPS, le SAC, des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ou des globules rouges sains pendant 3, 9 et 18 heures.
Les résultats montrent une augmentation de la transcription de
TNF-α environ 3 heures après stimulation, transcription qui précède la sécrétion de la protéine TNF-α (B.). En revanche, le gène MIF est fortement transcrit et ce de façon constitutive à l'état basai (TO), et ni la stimulation par du LPS, ni par du SAC n'augmente cette transcription.
Ceci démontre que la méthode de l'invention est validée sur des échantillons stimulés in vitro. De plus, elle souligne la complémentarité de l'approche du dosage des ARN et des protéines pour des cytokines néoformées (TNF-α) en comparaison de cytokines préformées (MIF). Enfin, ces résultats confirment les données de la littérature qui rapportent que MIF est présent dans les cellules à la fois sous forme de protéines préformées prêtes à être sécrétées, et sous forme d'ARNm qui peuvent être rapidement traduits en absence de toute transcription.
Exemple 9 : Cinétique de transcription des gènes de différentes cytokines
Des expériences de stimulation in vitro par du LPS et du SAC ont été menées sur les sous-populations monocytaires et lymphocytaires, isolées du sang, pendant 0,5, 1 , 2, 3, 6 et 9 heures. L'extraction des ARN correspondants a été réalisée et la quantification des ARN messagers codant pour les cytokines IL-1 B, IL-15, IL-4, IL-18, IL-10, MIF, IL-12p40, TGF-βi, IL- 13 et TNF-α a été réalisée et rapportée à la quantité d'ARNm codant pour la beta-2 microglobuline, choisi comme gène de ménage (standard interne). La figure 19 présente le résultat obtenu avec les monocytes purifiés d'un des donneurs. Aucune augmentation significative de la quantité d'ARNm d'IL-15, d'IL-18, de MIF ou de TGF- β1 n'a été détectée. Concernant l'IL-1β et l'IL-10, les deux stimulants induisent une cinétique comparable d'accumulation de transcrits. En revanche, on observe une accumulation de transcrits d'IL-4 et d'IL-13 précoce en réponse au LPS (2 heures) que l'on ne retrouve pas pour la stimulation par le SAC. Quant à IML- 12p40, on observe une accumulation de transcrits plus précoce par stimulation avec le LPS qu'avec le SAC. Enfin, l'accumulation de transcrits TNF-α est plus prolongée dans le temps après stimulation avec le SAC, comparée à la stimulation avec le LPS.
Exemple 10 : Capacité de transcription du TGF-$1
Les ARN provenant de cellules mononucléées du sang périphérique de patients souffrant de paludisme ou d'individus contrôles, après stimulation par du LPS, ont été extraits. La quantification des ARNm des gènes de la β2 microglobuline et du TGF-β1 a été réalisée. La figure 20 présente la différence de capacité de transcription du TGF-β1 entre des patients atteints de paludisme et des individus contrôles.
Les cellules de patients atteints de paludisme montrent une transcription de TGF-β1 supérieure à ceux de sujets contrôles, après stimulation par le PBS (p= 0,036 ; différence statistiquement significative *).
Exemple 11 : Cinétique de quantification de l'ARNm de l'IL-4
Des amorces pour l'IL-4 ont été dessinées et les conditions d'amplification de l'IL-4 validées. La figure 21 présente la courbe de dissociation des amorces sélectionnées (A.), ainsi que la droite montrant l'efficacité de l'amplification (B.). De façon à valider cette cytokine, des ARN messagers codant pour l'IL-4 à partir de PBMC dérivés de 2 donneurs sains (Donneurs 16 et 18) ont été quantifiés, après stimulation de ces PBMC, entre une demi-heure et 9 heures, avec du LPS (100 ng/ml), du SAC (0, 0075%) ou des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum à la concentration de 20 parasites pour un leucocyte. La cinétique d'expression de l'IL-4 apparaît comparable pour les deux donneurs (C.)
BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de quantification absolue d'un ou de plusieurs ARN cibles dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN cibles à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN cible, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii),
(iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et
(v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles par rapport à Ia quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le couple d'amorces est choisi de façon à respecter les critères suivants : - les amorces ne se chevauchent pas et permettent l'amplification d'un fragment de taille inférieure ou égale à 200 paires de bases, de préférence inférieure ou égale à 150 paires de base, de manière encore préférée inférieure ou égale à 100 paires de bases,
- le contenu en nucléotides G et C des amorces est compris entre 20 et 80%,
- les amorces ne contiennent pas de répétition de plus de trois guanines consécutives, - la température de fusion des amorces est comprise entre 58 et
6O0C,
- les 5 nucléotides à l'extrémité 3' des amorces comportent au maximum 2 bases G et/ou C.
. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel I1ARN déterminé est un ARN viral, un ARN 16S ou un ARN messager.
, Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la quantification absolue des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(i) pour chacun des ARN messagers de cytokines à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN messager, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique,
(iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii),
(iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et
(v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines par rapport à la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel pour chaque ARN messager à quantifier, la gamme d'ARN synthétique est constituée d'une série de dilutions d'un ARN transcrit à partir d'une cassette d'ADN comprenant le promoteur de l'ARN polymérase du phage T7 en 5' et en
3' de la séquence de l'amplicon amplifié à partir de l'ARN messager, par le couple d'amorces spécifique dudit ARN messager.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les étapes (i) et (ii) sont effectuées par RT-PCR, toutes les réactions de
RT-PCR étant réalisées dans les mêmes conditions de température.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la détection en temps réel du produit d'amplification est effectuée par mesure d'un signal susceptible d'être transcrit électroniquement, de préférence par mesure de l'incorporation d'un intercalant fluorescent, et de manière encore préférée par mesure de l'incorporation de SYBR Green I.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel la RT-PCR est effectuée en une seule étape.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'étape (i) est précédée d'une étape d'introduction d'une quantité connue d'ARN hétérologue ou de cellules hétérologues dans l'échantillon biologique et d'une étape d'extraction de l'ARN de l'échantillon biologique, et dans lequel ledit ARN hétérologue ou l'ARN desdites cellules hétérologues fait l'objet, à l'étape (i), d'une transcription inverse suivie d'une amplification du produit de cette transcription inverse.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel les réactions de RT-PCR sont effectuées dans les conditions de thermocyclage suivantes :
- transcription inverse : incubation des amorces : 8 à 12 minutes entre 23 et 27°C, de préférence 10 minutes à 250C ; action de la transcriptase inverse : 20 à 80 minutes entre 45 et 510C, de préférence 30 minutes à 48°C ; inactivation de la transcriptase inverse : 4 à 10 minutes entre 90 et 980C, de préférence 5 minutes à 95°C ; - 2 à 7 minutes entre 45 et 55°C, de préférence 5 minutes à 500C, puis 8 à 12 minutes entre 90 et 98°C, de préférence 10 minutes à 95°C ;
- puis 30 à 45 cycles, de préférence 40 cycles, comprenant :
12 à 20 secondes entre 90 et 98°c, de préférence 15 secondes à 95°C, et 50 à 80 secondes entre 55 et 65°C, de préférence 1 minute à 600C.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 dans lequel les réactions de RT-PCR sont effectuées dans les conditions de thermocyclage suivantes :
- transcription inverse : incubation des amorces : 10 minutes à 25°C ; action de la transcriptase inverse : 30 minutes à 480C ; - inactivation de la transcriptase inverse : 5 minutes à 95°C ;
- 5 minutes à 5O0C puis 10 minutes à 95°C ;
- puis 40 cycles, comprenant :
15 secondes à 95°C, et 1 minute à 60°C.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lequel au moins deux des couples d'amorces sont choisis parmi les suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : - couple spécifique de l'IL-1 fi humaine :
5'- CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA -3' (SEQ ID No : 1 ) et 5'- GGGAACTGGGCAGACTCAAA -3' (SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL-10 humaine :
5'- GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT -3' (SEQ ID No : 3) et 5'- CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT -3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL-12p40 humaine : 5'- CATGGTGGATGCCGTTCA -3' (SEQ ID No : 5) et 5'- ACCTCCACCTGCCGAGAAT -3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL-13 humaine : 5'- ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT -3' (SEQ ID No : 7) et
5'- TCAGGTTGATGCTCCATACCAT -3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de l'IL-15 humaine :
51- CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT -3' (SEQ ID No : 9) et 5'- CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA - 31 (SEQ ID No : 10) couple spécifique de l'IL-18 humaine : 5'-CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA-3' (SEQ ID No : 11)et 5'-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFN-γ humain :
5'- GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA -3' (SEQ ID No : 13) et 5'- AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC -3' (SEQ ID No : 14) - couple spécifique du MIF humain :
5'- GCCCGGACAGGGTCTACA -3' (SEQ ID No : 15) et 5'- CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT -3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGF-&1 humain : 5'- CAAGGGCTACCATGCCAACT -3! (SEQ ID No : 17) et 5'- AGGGCCAGGACCTTGCTG -3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNF-α humain :
5'- CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC -3' (SEQ ID No : 19) et 5'- GGTTTGCTACAACATGGGCTACA -3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL-4 humaine : 51- AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC -3' (SEQ ID No : 21 )
51- GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT -3' (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2-μglobuline humaine : δ'-AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGA-S' (SEQ ID No : 23) et δ'-GGCTGTGACAAAGTCACATGGTT-S' (SEQ ID No : 24) - couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine :
5'- ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA -3' (SEQ ID No : 25) 5'- CCGCCAGGACAAACCAGTAT -31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5'- ATTTGGGTCGCGGTTCTTG -31 (SEQ ID No : 27) 5'- TGCCTTGACATTCTCGATGGT -3" (SEQ ID No : 28) 13. Ensemble de couples d'amorces nucléotidiques, dans lequel au moins deux couples d'amorces, de préférence trois, sont choisis parmi les couples d'amorces suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : - couple spécifique de l'IL-1 β humaine :
5'-CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA-3'(SEQIDNo : 1)et 5'-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3'(SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL-10 humaine :
5'- GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT -3' (SEQ ID No : 3) et 5'- CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT -3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL-12p40 humaine : 5'- CATGGTGGATGCCGTTCA -3' (SEQ ID No : 5) et 51- ACCTCCACCTGCCGAGAAT -3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL-13 humaine : 5'- ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT -3' (SEQ ID No : 7) et
5'- TCAGGTTGATGCTCCATACCAT -3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de l'IL-15 humaine :
5'- CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT -3' (SEQ ID No : 9) et 5'- CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA - 3' (SEQ ID No : 10) - couple spécifique de l'IL-18 humaine :
5'- CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA -3' (SEQ ID No : 11 ) et 5'- GGGAACTGGGCAGACTCAAA -3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFN-γ humain :
5'- GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA -3' (SEQ ID No : 13) et 5'- AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC -3' (SEQ ID No : 14) couple spécifique du MIF humain : 5'- GCCCGGACAGGGTCTACA -3' (SEQ ID No : 15) et 5'- CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT -3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGF-β1 humain : 5'- CAAGGGCTACCATGCCAACT -3' (SEQ ID No : 17) et
5'- AGGGCCAGGACCTTGCTG -3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNF-α humain :
5'- CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC -3' (SEQ ID No : 19) et 5'- GGTTTGCTACAACATGGGCTACA -3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL-4 humaine : 5'- AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC -31 (SEQ ID No : 21 )
5'- GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT -3' (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2-μglobuline humaine : δ'-AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGA-S' (SEQ ID No : 23) et δ'-GGCTGTGACAAAGTCACATGGTT-S' (SEQ ID NO : 24), - couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine :
5'- ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA -31 (SEQ ID No : 25) 51- CCGCCAGGACAAACCAGTAT -31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5'~ ATTTGGGTCGCGGTTCTTG -31 (SEQ ID No : 27) 5'- TGCCTTGACATTCTCGATGGT -3" (SEQ ID No : 28) lesdits au moins deux couples d'amorces étant utilisables dans des conditions telles que définies à la revendication 10 ou 11 pour quantifier des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique.
14. Ensemble de couples d'amorces nucléotidiques, dans lequel au moins deux couples d'amorces, de préférence trois, sont choisis parmi les couples d'amorces suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : - couple spécifique de l'IL-1 β humaine :
5'- CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA -3' (SEQ ID No : 1 ) et 5'- GGGAACTGGGCAGACTCAAA -3' (SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL-10 humaine :
5'- GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT -3' (SEQ ID No : 3) et 5'- CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT -3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL-12p40 humaine : 5'- CATGGTGGATGCCGTTCA -3' (SEQ ID No : 5) et 5'- ACCTCCACCTGCCGAGAAT -3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL-13 humaine : 5'- ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT -3' (SEQ ID No : 7) et 5'- TCAGGTTGATGCTCCATACCAT -3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de NL- 15 humaine :
5'- CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT -3' (SEQ ID No : 9) et 5'- CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA - 3' (SEQ ID No : 10) couple spécifique de l'IL-18 humaine : 5'- CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA -3' (SEQ ID No : 11 ) et
5'- GGGAACTGGGCAGACTCAAA -3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFN-γ humain :
5'- GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA -3' (SEQ ID No : 13) et 5!. AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC -3' (SEQ ID No : 14) - couple spécifique du MIF humain :
5'- GCCCGGACAGGGTCTACA -3' (SEQ ID No : 15) et 5'- CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT -3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGF-β1 humain : 51- CAAGGGCTACCATGCCAACT -3' (SEQ ID No : 17) et 5'- AGGGCCAGGACCTTGCTG -3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNF-α humain :
5'- CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC -3' (SEQ ID No : 19) et 5'- GGTTTGCTACAACATGGGCTACA -3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL-4 humaine : 5'- AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC -31 (SEQ ID No : 21 )
51- GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT -31 (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2-μglobuline humaine : δ'-AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGA-S' (SEQ ID No : 23) et δ'-GGCTGTGACAAAGTCACATGGTT-S' (SEQ ID NO : 24), - couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine :
51- ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA -31 (SEQ ID No : 25) 5'- CCGCCAGGACAAACCAGTAT -31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5'- ATTTGGGTCGCGGTTCTTG -31 (SEQ ID No : 27) 5'- TGCCTTGACATTCTCGATGGT -31 (SEQ ID No : 28) lesdits au moins deux couples d'amorces étant utilisables dans un procédé, tel que défini dans les revendications 4 à 11 , pour quantifier des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon * biologique.
15. Trousse de détection de désordres liés à la régulation des lymphocytes
Th1/Th2, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi PIL-10, l'IL- 13, le TGF-β, le TNF-α, et l'IFN-γ.
16. Trousse de détection selon la revendication 15, comprenant en outre un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, et le TNF-β.
17. Trousse de détection de désordres inflammatoires ou de désordres de l'immunité innée, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFN-γ, le TNF-α, le TGF-β, l'IL-1-β, l'IL-12p40, l'IL-15 et I1IL-18 et un couple d'amorces spécifiques d'ARNm de NL-12p35. .
18. Trousse de détection selon la revendication 17, comprenant en outre un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFN-α, I1IL-B, l'IL-8, l'IL-21 , l'IFN-β, TiNOS et l'IL-16. 19. Trousse pour l'analyse des niveaux d'expression de cytokines, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de I1ARN messager de I1IL-IO, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2- microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL-19, l'IL-20, l'IL-22 et l'IL-24.
20. Trousse pour l'analyse des niveaux d'expression de cytokines, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de I1ARN messager de l'IL-12p40, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2- microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL-12p35, l'IL-23, l'IL-27 et IΑK155.
21. Trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ARN synthétique comprenant la séquence dudit ARN messager telle que résultant de l'amplification par le couple d'amorces, sous forme d'une solution, d'une gamme, ou sous forme sèche.
22. Trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ADN synthétique comprenant la séquence de l'ADN complémentaire telle que résultant de l'amplification par le couple d'amorces, sous forme d'une solution, d'une gamme, ou sous forme sèche. 23. Trousse comprenant un ensemble d'amorces selon la revendication 13 ou 14, et un logiciel de traitement des données, capable de traiter les résultats obtenus à l'issue des étapes (i) à (iii) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, et d'en déduire la quantité d'ARN messager de chaque cytokine testée dans l'échantillon biologique.
24. Ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, ou trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix cytokines.
25. Ensemble de couples d'amorces ou trousse de diagnostic selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins un, deux, trois ou quatre gènes de ménage.
26. Trousse selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, comprenant en outre un ARN utilisable comme ARN hétérologue, ou des cellules utilisables comme cellules hétérologues lors de la mise en œuvre du procédé selon la revendication 10 et, le cas échéant, des amorces spécifiques dudit ARN hétérologue ou d'une séquence d'ARN desdites cellules hétérologues.
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