CN112080569A - 用于检测体内移植人源细胞的特异性引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测体内移植人源细胞的特异性引物，由针对人源性β2M基因的特异性引物和针对人管家基因GAPDH的特异性引物组成，其中，所述针对人源性β2M基因的特异性引物包括F‑β2M和R‑β2M，所述针对人管家基因GAPDH的特异性引物包括F‑GAPDH和R‑GAPDH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。还公开了一种试剂盒，包括上述特异性引物。还公开了一种体内移植人源细胞的检测方法：(1)细胞/组织RNA提取；(2)cDNA反转录；(3)β2M基因表达标准曲线的制备；(4)荧光定量PCR反应；(5)检测结果分析：将ΔCT值代入标准曲线，计算得出LOG(人细胞数)，换算成人细胞数。本发明包含两套引物系统，可特异性检测β2M和GAPDH基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，不受外界刺激影响。

Description

用于检测体内移植人源细胞的特异性引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测体内移植人源细胞的特异性引物组合、试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。

背景技术

目前细胞药物已成为药物研发中最新的领域之一。由于细胞药物具有增殖和自主趋化的能力，其在体内的药学特征与我们所熟知的大分子、小分子药物差异较大。目前虽然细胞药物已开始应用于临床，但是对细胞类药物进入体内的变化尚缺乏认知。如果借助药代动力学理论，预测不同细胞产品的体内分布、代谢和排泄规律，进而了解细胞药物进入机体后的动态分布并与细胞治疗之间建立关系，将可以提高细胞药物的临床疗效，降低风险。细胞药物只有在体内能够被检测到，目前检测手段可以分为侵入式(收集体液和组织测定细胞mRNA、特定蛋白质等)和非侵入式(活体成像技术等)两大类。不同的检测手段有各自的优势。对于需要准确定量的药代动力学而言，目前可以实现且能够准确定量细胞的存活率和清除率的方法还是依靠侵入式检测，首选的检测方式是qPCR，qPCR可以通过DNA含量，实现对血液、组织样品中的人源细胞进行定量分析。

荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单，可应用SYBRGreen染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单；采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，从而很好的判断人源细胞的存活率与清除率，整个PCR反应过程只需1.5小时即可完成。细胞管家基因在所有细胞中均有所表达，且表达水平受环境影响较小。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，G3PDH)是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞。该酶由4个30～40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，所以用来做校准使用。内参的选择有β-actin、GAPDH及其他，本研究中内参只作为基因表达的校准作用，所以本研究选择的GAPDH并非唯一。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种用于检测体内移植人源细胞的特异性引物、试剂盒及方法。本发明通过设计人源性β2M基因的特异性引物和管家基因GAPDH的特异性引物，将其用于体内移植人源细胞的存活定量检测。本发明的工作原理是：通过荧光定量PCR SYBR Green方法根据相对定量原理，即确定基因在动物组织内的表达水平，从而判定移植细胞的存活数量，进而计算存活率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

用于检测体内移植人源细胞的特异性引物，由针对人源性β2M基因的特异性引物和针对人管家基因GAPDH的特异性引物组成，其中，所述针对人源性β2M基因的特异性引物包括F-β2M和R-β2M，其核苷酸序列如下所示；所述针对人管家基因GAPDH的特异性引物包括F-GAPDH和R-GAPDH，其核苷酸序列如下所示；

F-β2M：5’-ATCCATCCGACATTGAAGTTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

R-β2M：5’-GGCAGGCATACTCATCTTTTTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

F-GAPDH：5’-TGCACCACCAACTGCTTA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

R-GAPDH：5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

上述特异性引物在检测体内移植人源细胞中的应用。

一种用于检测体内移植人源细胞的试剂盒，包括上述特异性引物。

进一步的，所述试剂盒中还包括iTaq SYBR green SuperMix。

所述试剂盒在检测体内移植人源细胞中的应用。

本发明还提供了一种体内移植人源细胞的检测方法，包括以下步骤：

(1)细胞/组织RNA提取：采用商品化试剂盒，提取待检测组织/血液/体液/细胞中的RNA，并测定浓度，控制提取质量OD260/OD280≈2.0；

(2)cDNA反转录：取RNA，采用商品化试剂盒进行cDNA反转录；

(3)β2M基因表达标准曲线的制备；

(4)荧光定量PCR反应：利用上述特异性引物或试剂盒进行荧光定量PCR反应；

(5)检测结果分析：根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的CT值，即实验组β2M基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数；

ΔCT＝(CTβ2M(实验组)-CT GAPDH(实验组)；

将ΔCT值代入标准曲线，计算得出LOG(人细胞数)，换算成人细胞数。

进一步的，所述步骤(3)中，β2M基因表达标准曲线的制备方法为：分别取1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、0个人源细胞，分别与移植对象的细胞混和，共计1×10⁶个，抽提RNA，进行反转录cDNA，检测体系cDNA模板按照10倍稀释加入；根据β2M基因检测的ΔCT值作为纵坐标，人源细胞的LOG值作为横坐标，制作标准曲线。

进一步的，所述步骤(4)中，荧光PCR的反应体系为：

iTaq SYBR green SuperMix，10μL；

上游引物(F-β2M，F-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

下游引物(R-β2M，R-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

模板(1：10稀释的cDNA)，1μL；

总体积20μL。

进一步的，所述步骤(4)中，荧光定量PCR的反应条件：95℃，10min，然后再运行40个循环(具体95℃，15S，62℃，30S)，退火时检测荧光信号。

本发明的用于检测体内移植人源细胞的特异性引物组合，包含两套引物系统，一套引物是针对人源性β2M基因的特异性引物，另一套引物是针对人的管家基因GAPDH设计的特异性引物。这两套引物可特异性检测β2M和GAPDH基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，所选择的关键基因表达水平不受外界刺激影响，可对β2M基因的表达水平进行准确的定量。

本发明的试剂盒、检测方法，采用SYBR green荧光染料，使用方便，操作简便。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：内参GAPDH引物扩增效率检测结果。

图2：β2M基因引物扩增效率检测结果。

图3；通用性结果示意图。

图4；特异性结果示意图。

图5：应用实例1中β2M和GAPDH基因扩增产物的融解曲线，其中，A为GAPDH基因扩增产物融解曲线；B为β2M基因扩增产物融解曲线。

图6：应用实例1中人神经干细胞移植大鼠体内β2M基因表达水平。

图7：应用实例1中的标准曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1设计特异性引物

临床前的检测可以使用人源性特殊基因片段(例如灵长类动物特有的Alu基因或是人微球蛋白基因)作为生物标志物，大多数研究选择检测Alu基因，因为此基因存在于基因组内，对于检测的样本只需要抽提DNA样本即可，但得到的结果只能定性。而对于不同的实验目的，如果是对基因的转录水平进行比较，检测的样本必须为RNA样本，而RNA序列是不含有此Alu基因序列的，且主要的研究目的是定量分析，所以本研究选择人微球蛋白基因β2M作为人源细胞的标记物，用于检测人源性细胞在动物体内的分布和清除。使用RNA样本作为模板，其对引物的要求会更高，其引物设计时引物需要跨内含子，对G/C含量，产物长度，扩增效率等因素均需满足qPCR检测要求。

根据研究需求设计合成所需基因引物序列，本研究使用的引物对设计和目标序列选择的程序主要是NCBI网站的Primer-Blast以及Primer 5软件，引物序列可选择的数据库进行引物对比，以确保目标基因的特异性，引物设计原则应满足以下要求：

(1)引物上下游设计应至少跨1个内含子；

(2)扩增产物长度在100-200bp，最长不要超过200bp；

(3)引物长度：一般在18-25碱基之间，上下游引物不宜相差太大，引物长度是决定退火温度(Tm值)最重要的因素；

(4)产物不能形成二级结构；

(5)引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免形成发卡结构；

(6)引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免形成引物二聚体；

(7)引物G+C含量在45％～60％之间，最好在45-55％；

(8)引物Tm值在55-65℃之间，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超过5℃；

(9)引物设计时应根据实验需求满足物种特异性或通用性。

本研究对内参引物要求特殊，需要其满足通用性，因为此内参需要在不同物种之间做校准，所以要求此内参在两个物种等量模板之间的表达无显著差异。

根据NCBI公布的humanβ2M mRNA序列(序列号：NM_004048.3)，设计β2M引物。

根据NCBI公布的human GAPDH的mRNA序列(序列号：NM_001256799.3)，设计特异性引物。

本研究中设计的引物序列如下表1所示。

表1

名称	序列5＇-3＇
		GAPDH-1-F	CCCTTCATTGACCTCAACTACATG
GAPDH-1-R	TGGGATTTCCATTGATGACAAGC
		GAPDH-2-F	TGCACCACCAACTGCTTA
GAPDH-2-R	GGATGCAGGGATGATGTTC
		GAPDH-3-F	TGCCACTCAGAAGACTGTGG
GAPDH-3-R	TTCAGCTCTGGGATGACCTT
		β2M-1-F	TTTGGCTCACAGTGTAAAGGG
β2M-1-R	GCAGGAAAGAACGCTGGCTAA
		β2M-2-F	CAGTGTAAAGGGCCTCAGTGAT
β2M-2-R	GCTGGCCTCCCACTAGACAG
		β2M-3-F	TCACAGTGTAAAGGGCCTCAG
β2M-3-R	CAGGAAAGAACGCTGGCTAA
		β2M-4-F	TCCATCCGACATTGAAGTTGAC
β2M-4-R	ACACGGCAGGCATACTCATC
		β2M-5-F	ATCCATCCGACATTGAAGTTG
β2M-5-R	GGCAGGCATACTCATCTTTTTC

通过软件对比，得到较多的序列，通过筛选对表1中的引物序列进行合成，PCR进行其单一性、特异性、通用性、扩增效率(GAPDH-图1、β2M-图2)等方面的检测，对GAPDH通用性进行qPCR检测，等量不同样本间表达Ct是否无显著差异，以及β2M的物种特异性(通用性结果如图3，特异性结果如图4)。最终筛选得到可用的β2M及GAPDH基因序列，如下所示。

F-β2M：5’-ATCCATCCGACATTGAAGTTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

R-β2M：5’-GGCAGGCATACTCATCTTTTTC-3’，如SEQ ID NO.2所示。

F-GAPDH：5’-TGCACCACCAACTGCTTA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

R-GAPDH：5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

实施例2体内移植人源细胞的定量检测

步骤如下：

(1)细胞/组织RNA提取：采用商品化试剂盒，提取待检测组织/血液/体液/细胞中的RNA，并测定浓度，控制提取质量OD260/OD280≈2.0。

(2)cDNA反转录：取1微克RNA，采用商品化试剂盒进行cDNA反转录。

(3)β2M基因表达标准曲线制备：分别取1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、0个人源细胞，分别与移植对象的细胞混和，共计1×10⁶个，抽提RNA，进行反转录cDNA，检测体系cDNA模板按照10倍稀释加入；根据β2M基因检测的ΔCT值作为纵坐标，人源细胞的LOG值作为横坐标，制作标准曲线。

(4)荧光定量PCR反应：

荧光PCR反应体系为：

iTaq SYBR green SuperMix，10μL；

上游引物(F-β2M，F-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

下游引物(R-β2M，R-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

模板(1：10稀释的cDNA)，1μL；

总体积20μL。

荧光定量PCR反应条件：95℃，10min，然后再运行40个循环(具体95℃，15S，62℃，30S)，退火时检测荧光信号。

(5)检测结果分析：根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的CT值，即实验组β2M基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数。ΔCT＝(CTβ2M(实验组)-CT GAPDH(实验组)，将ΔCT值代入标准曲线，计算得出LOG(人细胞数)，换算成人细胞数。

应用实例1移植人NSC(人神经干细胞)至大鼠体内残留细胞定量检测

移植NSC前一天复苏冻存的大鼠淋巴细胞，先将含10％FBS的1640培养基于37℃水浴锅预热30min，然后从液氮中取一支冻存的淋巴细胞，细胞总量为3×10⁷，用10ml培养基重悬，1700r离心5min，去上清后用2ml培养基重悬，培养在24孔板内，1ml/孔，于37℃，5％CO₂培养箱内培养过夜18小时。第二天首先取正常培养第8天的人神经干细胞，代数为第19代，消化计数1×10⁶个细胞，用25μL生理盐水重悬，然后用已消毒的微量注射器取5μL细胞悬液总量为2×10⁵，立体定位打入已处于昏迷状态的大鼠海马处，待细胞移植1小时后进行取材。取材部位选择针孔部位、附近组织，以及对侧未移植细胞海马组织，各称量约50mg。剩余的人NSC取1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、0个分别与大鼠淋巴细胞混和，共计1×10⁶个，取材组织与混合细胞细胞样本进行抽提RNA，取等量样本1μgRNA反转录为cDNA，qPCR检测体系中cDNA模板按照1/10稀释比例加入。以β2M基因检测的ΔCT值作为纵坐标，人NSC细胞数的LOG值作为横坐标，制作标准曲线，如图7所示。移植检测结果见表2。

表2β2M在大鼠体内的表达情况

表2结果说明移植NSC组在1小时后组织内仍可检测到人神经干细胞约1021个，抑制部位附近组织可检测到人神经干细胞351个，检测数量较少的原因可能是在一个小时内人神经干细胞可能已经发生迁移或者在打入的细胞不适应体内环境发生调亡，而对侧未移植NSC组织未检测到人特异性基因，也说明引物的物种特异性较好，符合理论要求。内参GAPDH和β2M引物扩增的融解曲线均只出现单一的融解曲线峰(见图5)，说明引物特异性较好，无非特异性扩增。

通过上述的实例可以知道，本发明的特异性引物组合及相应方法，可以特异性的检测大鼠组织内特异性人源基因β2M的表达(如图6所示)，并且可推倒出组织内残留多少移植人源细胞数量，且内参在人源细胞及大鼠体内表达无显著差异，避免检测基因在非同等条件的干扰。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110> 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司

<120> 用于检测体内移植人源细胞的特异性引物、试剂盒及方法

<141> 2020-09-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atccatccga cattgaagtt g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggcaggcata ctcatctttt tc 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tgcaccacca actgctta 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggatgcaggg atgatgttc 19

Claims (10)

1.一种用于检测体内移植人源细胞的特异性引物，其特征在于：由针对人源性β2M基因的特异性引物和针对人管家基因GAPDH的特异性引物组成，其中，所述针对人源性β2M基因的特异性引物包括F-β2M和R-β2M，其核苷酸序列如下所示；所述针对人管家基因GAPDH的特异性引物包括F-GAPDH和R-GAPDH，其核苷酸序列如下所示；

F-β2M：5’-ATCCATCCGACATTGAAGTTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

R-β2M：5’-GGCAGGCATACTCATCTTTTTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

F-GAPDH：5’-TGCACCACCAACTGCTTA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

R-GAPDH：5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的用于检测体内移植人源细胞的特异性引物在检测体内移植人源细胞中的应用。

3.一种用于检测体内移植人源细胞的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的特异性引物。

4.根据权利要求3所述的用于检测体内移植人源细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括iTaq SYBR green SuperMix。

5.根据权利要求3所述的用于检测体内移植人源细胞的试剂盒在检测体内移植人源细胞中的应用。

6.一种体内移植人源细胞的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)细胞/组织RNA提取：采用商品化试剂盒，提取待检测组织/血液/体液/细胞中的RNA；

(2)cDNA反转录：取RNA，进行cDNA反转录；

(3)β2M基因表达标准曲线的制备；

(4)荧光定量PCR反应：利用上述特异性引物或试剂盒进行荧光定量PCR反应；

(5)检测结果分析：根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的CT值，即实验组β2M基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数；

ΔCT＝(CTβ2M(实验组)-CT GAPDH(实验组)；

将ΔCT值代入标准曲线，计算得出LOG(人细胞数)，换算成人细胞数。

7.根据权利要求6所述的体内移植人源细胞的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，提取RNA时，控制提取质量OD260/OD280≈2.0。

8.根据权利要求6所述的体内移植人源细胞的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，β2M基因表达标准曲线的制备方法为：分别取1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、0个人源细胞，分别与移植对象的细胞混和，共计1×10⁶个，抽提RNA，进行反转录cDNA，检测体系cDNA模板按照10倍稀释加入；根据β2M基因检测的ΔCT值作为纵坐标，人源细胞的LOG值作为横坐标，制作标准曲线。

9.根据权利要求6所述的体内移植人源细胞的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，荧光PCR的反应体系为：

iTaq SYBR green SuperMix，10μL；

上游引物(F-β2M，F-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

下游引物(R-β2M，R-GAPDH)，0.1μM-0.5μM；

模板(1：10稀释的cDNA)，1μL；

总体积20μL。

10.根据权利要求6所述的体内移植人源细胞的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，荧光定量PCR的反应条件：95℃，10min，然后再运行40个循环(具体95℃，15S，62℃，30S)，退火时检测荧光信号。

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