WO2006092530A1 - Procede pour le pronostic d ' une reponse a un traitement par l ' infliximab des patients atteints de polyarthrite rhumatoide - Google Patents

Procede pour le pronostic d ' une reponse a un traitement par l ' infliximab des patients atteints de polyarthrite rhumatoide Download PDF

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WO2006092530A1
WO2006092530A1 PCT/FR2006/050175 FR2006050175W WO2006092530A1 WO 2006092530 A1 WO2006092530 A1 WO 2006092530A1 FR 2006050175 W FR2006050175 W FR 2006050175W WO 2006092530 A1 WO2006092530 A1 WO 2006092530A1
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WO
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target gene
specific
rheumatoid arthritis
expression
response
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/050175
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English (en)
Inventor
Myew-Ling Toh
Pierre Miossec
Jean-Luc Blond
Bruno Mougin
Original Assignee
Biomerieux
Hospices Civils De Lyon
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Publication date
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Priority to EP06726199A priority patent/EP1853728A1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to rheumatoid arthritis, and particularly to a method for determining the response of a patient with rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • Symptomatic treatment uses nonsteroidal anti-inflammatory drugs and possibly corticosteroids.
  • etanercept and Infliximab® which are two inhibitors directed against TNF (Tumor Necrosis Factor), a cytokine involved in the inflammatory process of rheumatoid arthritis.
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • TNF alpha has emerged as a primary therapeutic target based on clinical studies with biological inhibitors such as monoclonal antibodies or soluble receptors.
  • biological inhibitors such as monoclonal antibodies or soluble receptors.
  • Infliximab® is prescribed to reduce inflammation but also to slow the progression of rheumatoid arthritis when other drugs are insufficient.
  • the present invention proposes to solve the disadvantages of the state of the art by presenting a new biological tool to improve the treatment of a patient against rheumatoid arthritis.
  • the present invention makes it possible to determine the response of a patient suffering from rheumatoid arthritis to a treatment such as Infliximab®.
  • the present invention is also very relevant for monitoring the response of a patient undergoing treatment such as Infliximab®.
  • the inventors have demonstrated that the response of a patient to such treatment can be determined by the analysis of the expression of the gene encoding synoviolin, especially in the peripheral sand.
  • the inventors have also demonstrated that the follow-up of a patient's response to a treatment such as Infliximab® can be carried out by monitoring the expression of the gene encoding synoviolin.
  • the invention relates to an in vitro method for determining, from a biological sample, the response of a patient suffering from rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease. or for monitoring the response of a patient with rheumatoid arthritis to treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease over time characterized by measuring the expression of the gene encoding the disease. synoviolin.
  • the treatment is directed against the cytokine TNF alpha.
  • a treatment blocking the action of TNF such as in particular Infliximab®, Etanercept and Radalimumab.
  • the measurement of the expression of the gene coding for synoviolin is carried out as follows: a) biological material is extracted from the biological sample, b) the material is brought into contact with each other; biological with at least one reagent specific for the gene encoding synoviolin; c) the expression of the gene encoding synoviolin is determined
  • the term "biological sample” is intended to mean any sample taken from a patient, and capable of containing a biological material as defined below.
  • This biological sample can be in particular a sample of blood, serum, tissue, synoviocytes of the patient.
  • This biological sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art.
  • the biological sample taken from the patient is a blood sample.
  • the biological material is extracted from the biological sample by all the nucleic acid extraction and purification protocols known to those skilled in the art.
  • the term "biological material” means any material making it possible to detect the expression of a target gene.
  • the biological material may comprise, in particular, proteins, or nucleic acids such as in particular deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • the nucleic acid may in particular be an RNA (ribonucleic acid).
  • the biological material extracted during step a) comprises nucleic acids, preferably RNAs, and even more preferably total RNAs.
  • Total RNAs include transfer RNAs, messenger RNAs (mRNAs), such as mRNAs transcribed from the target gene, but also transcribed from any other gene and ribosomal RNAs.
  • This biological material comprises material specific for a target gene, such as, in particular, the transcribed mRNAs of the target gene or the proteins derived from these mRNAs, but may also comprise non-specific material of a target gene, such as in particular the mRNAs transcribed from the target gene. a gene other than the target gene, tRNAs, rRNAs from genes other than the target gene.
  • the extraction of nucleic acids can be carried out by: a step of lysis of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the cells of the patient.
  • lysis methods as described in patent applications WO 00/05338, WO 99/53304 and WO 99/15321.
  • Those skilled in the art may use other well-known lysis methods, such as thermal or osmotic shocks or chemical lyses with chaotropic agents such as guanidium salts (US Pat. No. 5,234,809).
  • a purification step allowing separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally allows the nucleic acids to be concentrated, and may be suitable for the purification of DNA or RNA.
  • magnetic particles optionally coated with oligonucleotides, by adsorption or co-valence (see US Pat. No. 4,672,040 and US Pat. No. 5,750,338), and thus purify the nucleic acids that have attached to these particles. magnetic, by a washing step.
  • This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert or magnetic particles.
  • Other widely used methods rely on columnar or paramagnetic particulate ion exchange resins.
  • Another method that is very relevant but not exclusive to the invention is that of adsorption on a metal oxide support.
  • the term "specific reagent” means a reagent which, when it is brought into contact with biological material as defined above, binds with the specific material of said gene. target.
  • a reagent which, when it is brought into contact with biological material as defined above, binds with the specific material of said gene. target.
  • the specific reagent and the biological material are of nucleic origin, contacting the specific reagent and the biological material allows hybridization of the specific reagent with the specific material of the target gene.
  • Hybridization means the process during of which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments bind with stable and specific hydrogen bonds to form a double-stranded complex.
  • hybridization can be partial (we then speak of nucleotide fragments or sufficiently complementary sequences), that is to say that the double-stranded complex obtained comprises A-T bonds and CG bonds making it possible to form the double-stranded complex, but also bases not linked to a complementary base.
  • Hybridization between two nucleotide fragments depends on the operating conditions that are used, and in particular on stringency. The stringency is defined in particular according to the base composition of the two nucleotide fragments, as well as by the degree of mismatch between two nucleotide fragments.
  • the stringency may also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art.
  • the hybridization temperature is between approximately 20 and 70 ° C., in particular between 35 and 65 ° C. in a saline solution at a concentration of approximately 0 ° C. , 5 to 1 M.
  • a sequence, or nucleotide fragment, or oligonucleotide, or polynucleotide is a sequence of nucleotide units joined together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, which can hybridize to a nucleotide fragment, the sequence may contain monomers of different structures and be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or chemical synthesis.
  • a pattern is derived from a monomer which may be a natural nucleotide nucleic acid whose constituent elements are a sugar, a phosphate group and a nitrogen base; in the DNA sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogenous base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a modified nucleotide in at least one of the three constituent elements; for example, the modification can take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo Deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the level of the sugar, for example the replacement of at least one deoxyribose with a polyamide, or at the level of the
  • the specific reagent comprises at least one amplification primer.
  • amplification primer is intended to mean a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleic motifs, preferentially from 15 to 30 nucleic units allowing the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular an enzymatic amplification reaction.
  • a primer comprising all or part of a sequence of SEQ ID No. 1 or 2, preferably a pair of primers comprising SEQ ID No. 0 and SEQ ID No. 2, is used.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a nucleotide fragment by the action of at least one enzyme.
  • Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and mention may be made in particular of the following techniques: PCR (Polymerase Chain Reaction), as described in the US Pat.
  • the specific reagent comprises at least 2 amplification primers, specific for the target gene, in order to allow the amplification of the specific material of the target gene.
  • a primer comprising all or part of a sequence of SEQ ID N 0 I or 2 is used.
  • the specific material of the target gene then preferably comprises a complementary DNA obtained by reverse transcription of messenger RNA derived from the target gene (it is referred to then cDNA specific for the target gene) or a complementary RNA obtained by transcription of the cDNAs specific for a target gene (this is called specific cRNA of the target gene).
  • RT-PCR a reverse transcription reaction
  • the specific reagent of step b) comprises at least one hybridization probe.
  • Hybridization probe is understood to mean a nucleotide fragment comprising at least 5 nucleotide motifs, such as from 5 to 100 nucleic motifs, in particular from 10 to 35 nucleic motifs, having hybridization specificity under determined conditions to form a complex of nucleotides. hybridization with the specific material of a target gene.
  • the specific material of the target gene may be a nucleotide sequence comprised in a messenger RNA derived from the target gene (referred to as mRNA specific for the target gene), a nucleotide sequence included in a complementary DNA obtained by reverse transcription.
  • the probe hybridization may comprise a marker for its detection.
  • detection is meant either direct detection by a physical method, or indirect detection by a detection method using a marker.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal that can be detected.
  • tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, contact angle variation or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunneling effect, etc.
  • the hybridization probe may be a so-called detectioa probe.
  • the so-called detection probe is labeled by means of a marker such as than previously defined.
  • the detection probe may in particular be a "molecular beacon” detection probe as described by Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14: 303-308). These "molecular beacons” become fluorescent during hybridization. They have a stem-loop structure and contain a fluorophore and a "quencher” group. Attachment of the specific loop sequence with its target nucleic acid complement sequence causes stem unwinding and fluorescent signal emission upon excitation at the appropriate wavelength.
  • labeled target sequences can be used directly (in particular by the incorporation of a marker within the target sequence) or indirectly (especially by the use of a detection probe such as previously defined) the target sequence.
  • the target sequence may also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a detection probe according to the sandwich hybridization technique described in WO 91/19812. Another particular preferred mode of nucleic acid labeling is described in application FR 2 780 059.
  • the detection probe comprises a flurophore and a quencher.
  • the hybridization probe may also be a so-called capture probe.
  • the so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by co-valence or adsorption.
  • a solid support it is possible to use synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and cellulose.
  • nitrocellulose or dextran polymers, copolymers, especially based on styrene-type monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the solid support may be in the form of a microtiter plate, a membrane as described in application WO-A-94/11670, of a particle.
  • step c) the determination of the expression of the target gene can be carried out by all the protocols known to those skilled in the art.
  • the expression of a target gene can be analyzed by the detection of the mRNAs (messenger RNAs) which are transcribed from the target gene at a given instant or by the detection of the proteins derived from these mRNAs.
  • mRNAs messenger RNAs
  • the invention preferably relates to determining the expression of a target gene by detecting mRNAs derived from this target gene.
  • step c) of the method according to the invention determines the expression of a target gene as follows:
  • RNAs including the transfer RNAs (tRNAs), the ribosomal RNAs (rRNAs) and the messenger RNAs (mRNA)
  • tRNAs transfer RNAs
  • rRNAs ribosomal RNAs
  • mRNA messenger RNAs
  • this reverse transcription reaction can be carried out using a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment.
  • AMV Avian Myoblastosis Virus
  • MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
  • this reverse transcription step is carried out in the presence of nucleotide fragments comprising only thymine bases (polyT), which hybridize by complementarity on the polyA sequence of the mRNAs in order to form a polyT-polyA complex which then serves as a starting point for the reverse transcription reaction carried out by the reverse transcriptase enzyme.
  • polyT thymine bases
  • Complementary cDNAs are thus obtained from the mRNAs resulting from a target gene (cDNA specific for the target gene) and cDNAs complementary to mRNAs originating from genes other than the target gene (non-specific cDNA of the target gene).
  • the specific amplification primer or primers of a target gene are brought into contact with the cDNAs specific for the target gene and the nonspecific cDNAs of the target gene.
  • the target gene specific amplification primer or primers hybridize with the target gene-specific cDNAs and specifically amplify a predetermined region of the target gene. known length, cDNAs from mRNAs from the target gene.
  • the non-specific cDNAs of the target gene are not amplified, whereas a large quantity of cDNA specific to the target gene is then obtained.
  • target gene-specific cDNAs or "cDNAs from mRNAs derived from the target gene". This step may be carried out in particular by a PCR type amplification reaction or by any other amplification technique as defined above.
  • step 2) determining the expression of the target gene by detecting and quantifying the target gene-specific cDNAs obtained in step 2) above.
  • This detection can be performed after electrophoretic migration of the cDNAs specific for the target gene according to their size.
  • the gel and the migration medium may comprise ethydium bromide to enable the direct detection of the target gene specific cDNAs when the gel is placed, after a given migration time, on a UV light table (ultra violet) by the emission of a light signal. This signal is all the brighter as the amount of cDNA specific to the target gene is important.
  • Specific cDNAs of the target gene can also be detected and quantified by the use of a quantization range obtained by an amplification reaction conducted to saturation.
  • the expression of a target gene of different groups of patients can be standardized by simultaneous determination. expression of a so-called household gene, whose expression is similar in the different groups of patients.
  • a reverse transcription step is carried out, as described above, for cDNAs complementary to the mRNAs resulting from a target gene (specific cDNA) target gene) and complementary cDNAs of mRNAs from genes other than the target gene (non-specific cDNA of the target gene).
  • the hybridization reaction can be carried out on a solid support which includes all the materials as indicated above.
  • the hybridization probe is immobilized on a support.
  • the hybridization reaction may be preceded by a step of enzymatic amplification of the target gene specific cDNAs as described above to obtain a large amount of cDNA specific to the target gene and increase the probability that a specific cDNA of a The target gene hybridizes to a capture probe specific for the target gene.
  • the hybridization reaction may also be preceded by a step of labeling and / or cleaving the cDNA specific for the target gene as described above, for example using a labeled deoxyribonucleotide triphosphate for the amplification reaction. Cleavage can be achieved in particular by the action of imidazole and manganese chloride.
  • the specific cDNA of the target gene may also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in document WO-A-91/19812.
  • Other particular preferred modes of labeling and / or nucleic acid cleavage are described in the applications WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.
  • a step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • the detection can be carried out by contacting the support on which are hybridized the capture probes specific for the target gene with the target gene-specific cDNAs with a detection probe, labeled with a marker, and the signal emitted by the marker is detected.
  • the specific cDNA of the target gene has been previously labeled with a marker, the signal emitted by the marker is detected directly.
  • the expression of a target gene can also be determined as follows:
  • a reverse transcription step is carried out in order to obtain the cDNAs of the mRNAs of the biological material.
  • Polymerization of the complementary RNA of the cDNA is then carried out by the use of a polymerase-type polymerase enzyme which functions under the control of a promoter and which makes it possible to obtain, from a DNA template. , complementary RNA.
  • the cRNAs of the cDNAs of the mRNAs specific for the target gene are then obtained (this is called target gene specific cRNA) and the cRNAs of the cDNAs of the nonspecific mRNAs of the target gene.
  • all the cRNAs are brought into contact with a support, on which are immobilized capture probes specific for the target gene whose expression is to be analyzed, in order to carry out a hybridization reaction between the target gene specific cRNAs and the capture probes, the nonspecific cRNAs of the target gene not hybridizing on the capture probes.
  • the hybridization reaction may also be preceded by a step of labeling and / or cleaving the target gene specific cRNAs as described above.
  • a step of detecting the hybridization reaction is then carried out. The detection can be carried out by contacting the support on which the target gene-specific capture probes are hybridized with the target gene specific cRNA with a detection probe, labeled with a marker, and the signal emitted is detected.
  • cRNA is particularly advantageous when using a biochip type support on which is hybridized a large number of probes.
  • steps B and C are performed at the same time.
  • This preferred mode can be implemented in particular by "NASBA in real time” which combines in a single step the NASBA amplification technique and real-time detection that uses “molecular beacons”.
  • the NASBA reaction occurs in the tube, producing single-stranded RNA with which specific "molecular beacons” can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of the new RNA molecules is measured in real time by continuous control of the signal in a fluorescent reader.
  • the invention also relates to the use of at least one specific reagent of the gene encoding synoviolin, as defined above, for determining the response of a patient suffering from rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the process.
  • inflammatory disease or for monitoring the response of a patient with rheumatoid arthritis to treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease over time.
  • the treatment is directed against the cytokine TNF alpha.
  • the invention also relates to a prognostic kit for the response of a patient suffering from rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease, said treatment being as defined above, comprising at least a reagent specific for the gene encoding synoviolin, as defined above.
  • the invention also relates to a kit for monitoring the response of a patient with rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the treatment of rheumatoid arthritis.
  • inflammatory process of the disease said treatment being as defined above, comprising at least one reagent specific for the gene encoding synoviolin, as defined above.
  • the analysis of the expression of synoviolin then makes it possible to have a tool for the prognosis of the response of a patient suffering from rheumatoid arthritis to a treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease.
  • the expression of the target gene can be analyzed in a patient whose reaction to a treatment directed against a cytokine involved in the inflammatory process of the disease is unknown, and compared with known mean expression values of the target gene. patients responding to said treatment and known average expression values of the target gene of patients not responding to said treatment. This makes it possible to determine whether the patient is a respondent or a non-respondent, which makes it possible to propose a suitable treatment or to adapt his treatment throughout his therapy.
  • PAXGeneTM Blood RNA PreAnalytix, Hilden, Germany.
  • Infliximab® is a TNF alpha inhibitor. Inhibitors of TNF alpha bring a rapid improvement of clinical and biological signs in rheumatoid arthritis refractory to other treatments, including methotrexate. Infliximab® or remicade® is a chimeric anti-TNF alpha antibody. Methotrexate (MTX) treatment was prescribed as well.
  • MTX Methotrexate
  • the clinical response was assessed after the first injection (week 0) and immediately after the fifth injection (week 22) using the following criteria: joint pain, joint swelling, assessment of patient's pain, overall assessment of patient's perspective, overall assessment of the disease from the physician's point of view, a Health Assessment Questionnaire, the serum level of C-reactive protein (CRP) and the rate of sedimentation rate (ESR).
  • CRP C-reactive protein
  • ESR rate of sedimentation rate
  • Good responder (BR) patients were distinguished from treatment and poor responders (MR) treated.
  • Synoviocyte culture - A fibroblast-like synoviocyte (FLS) cell line was obtained from a patient sample (PR). Control cells from a skin sample of PR patients were also analyzed (CT). The FLS and CT were isolated by a digestion enzyme and cultured in RPMI medium comprising 10% fetal calf serum (Invitrogen) at 37 ° C. in a humid incubator comprising 5% CO 2 as described previously (Toh et al. Arthritis Rheum 2004 Oct; 50 (10): 3118-3128). The synoviocytes as well as the control cells were then cultured in 96-well microplates (10,000 cells per well) in a final volume of 200 ⁇ l in culture medium supplemented with 10% FCS and treated with IL-1. 1 ⁇ (0.1 ng / ml, Immunotools, Friesoythe, Germany) or TNF ⁇ ? (1 ng / ml, Immunotools, Friesoythe, Germany).
  • Synoviolin gene expression analysis The expression of the gene coding for synoviolin was measured by real-time PCR in the peripheral blood of control patients (C) and patients with rheumatoid arthritis (RA) before and after 6 months of treatment with Infliximab®. Expression of the gene encoding synoviolin was also measured in the FLS cell line and CT control cells.
  • the gene encoding cyclophilin B (PPIP) was used as a household gene for blood samples, and the gene encoding beta actin was used as a household gene for FLS cell lines and CT control cells as previously described (Pachot et al., J.
  • RNAs were extracted from whole blood using the PAXGeneTM Blood RNA kit (PreAnalytix) and were purified by the use of an RNA-easy kit (Qiagen, Hilden, Germany). RNAs were extracted from FLS and CT cells by the use of TRIzol (Gibco BRL) and were purified by the use of an RNA-easy kit (Qiagen, Hilden, Germany). The cDNAs were prepared from a 1 ⁇ g of total RNA by the use of a Thermoscript RT-PCR system (Invitrogen, California, USA).
  • RNA was reverse-transcribed by the use of the Thermoscript RT-PCR system (Invitrogen, California, USA) and a PCR amplification was carried out on LightCycler (Roche) by the use of the Fast-StartTM kit. DNA Master SYBR Green Real-time PCR (Roche Molecular Biochemicals). Specific primers for synoviolin that were used were: SEQ ID NO 0 I: 5'-GTT TAC AGG CTT CAT CAA GG-3 'and SEQ ID No. 2: 5'-CAT GAT GGC ATC TGT CAC AG -3 '.
  • cyclophilin B the primers were obtained from LC-Search (PPIB, accession number: M60857, amplicon 105 to 338).
  • beta actin the primers used were as follows (Toh et al., Arthritis Rheum., 2004 Oct; 50 (10): 3118-3128): SEQ ID NO: 3: 5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3 'and SEQ ID NO: 4 '-GATGTCACGCACGATTTCC-5'
  • a volume of 10 ⁇ l of standard cDNA and cDNA dilutions from the samples were added to the capillary tubes.
  • the amplification was carried out in a final volume of 20 ⁇ l comprising a concentration of 10 ⁇ M primers, 25 mM of magnesium chloride (MgCl 2), as well as the Taq enzyme and the SYBR Green I marker contained in the LightCycler Fast start kit. DNA Master SYBR green I (Roche).
  • the PCR was carried out for 45 amplification cycles (10 seconds at 95 ° C., 10 seconds at 68 ° C. and 16 seconds at 72 ° C.).
  • a standard was prepared by a PCR (polymerase chain reaction) amplification conducted until saturation.
  • the amplicons obtained were purified (PCR purification kit, Qiagen Ltd) and the presence of an amplicon unique was verified by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide labeling. The expression of the mRNAs was determined by the use of the LightCycler software. Statistical analyzes - Results were expressed as mean ⁇ SEM.
  • This table 1 shows the level of expression of the mRNA gene encoding synoviolin in control patients (C) and patients with rheumatoid arthritis (RA).
  • the results are expressed by the relative quantification ratio between the mRNAs of the target gene and the mRNAs of the cyclophilin B household gene. The results are expressed as the average of the ratios obtained for each of the patient groups. SEM (mean deviation standard) was also calculated for each group. The values presented in Table 1 are the averages obtained ⁇ SEM. The values were considered statistically different when the value of p obtained was less than 0.05.
  • RA patients had a significantly increased level of synoviolin mRNA expression compared to control patients.
  • Table 2 presents the ratio of the relative quantification ratio between the mRNA of the target gene and the mRNA of the household beta actin gene in FLS cells cultured in the presence of IL1 beta (0.1 ng / ml) or TNF alpha (lng / ml).
  • TNF increased synoviolin expression for 6h.
  • IL1 also increased the expression of synoviolin which remained high until 24h.
  • Table 3 shows the relative quantification ratio between the target gene mRNAs and the housekeeping beta actin gene mRNAs in FLS cells cultured in the presence of different concentrations of IL1 beta or TNF alpha. The ratio was dependent on the concentration of beta IL1 and TNF alpha
  • Table 4 shows the relative quantification ratio between the mRNA of the target gene and the mRNA of the household beta actin gene in CT control cells cultured in the presence of IL1 beta (0.1 ng / ml) or TNF alpha (lng / ml). No significant increase in synoviolin expression was observed in the presence of IL1 or TNF.
  • This table 4 presents the level of expression of the mRNAs of the gene encoding synoviolin in responder patients (BR) and non-responder patients (MR) before and 6 months after treatment.
  • the results are expressed by the relative quantification ratio between the mRNAs of the target gene and the mRNAs of the cyclophilin B household gene. The results are expressed as the average of the ratios obtained for each of the groups of patients. SEM (mean deviation standard) was also calculated for each group.
  • the values presented in Table 5 are the averages obtained ⁇ SEM.
  • MR patients exhibited a significantly increased level of synoviolin mRNA expression before and after treatment compared to BP patients.
  • the expression of synoviolin mRNA was decreased after 6 months of treatment in BP patients but not in MR patients.
  • the expression of synoviolin was significantly increased in BP patients compared to control patients.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie caractérisé en ce qu'on mesure l'expression du gène codant la synovioline.

Description

PROCEDE POUR LE PRONOSTIC D' UNE REPONSE A UN TRAITEMENT PAR L' INFLIXIMAB DES PATIENTS ATTEINTS DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE
La présente invention concerne la polyarthrite rhumatoïde, et notamment un procédé pour déterminer la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement 5 dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie.
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une affection chronique qui se caractérise par l'inflammation et la déformation de plusieurs articulations avec, en outre, un risque de complications extra- articulaires. La connaissance concernant le rôle de cytokines dans des
10 interactions de cellule- cellule a mené au développement raisonnable de traitement avec des agents anticytokine.
La gravité de l'affection varie d'un sujet à l'autre, mais elle est associée à long terme à une augmentation de la morbidité et de la mortalité. Le traitement symptomatique fait appel à des anti- inflammatoires non stéroïdiens, et éventuellement à des corticostéroïdes.
15 Actuellement, le méthotrexate apparaît comme le traitement de référence. Des traitements inhibiteurs des cytokines proinflammatoires sont également proposés pour le traitement de fond de la polyarthrite rhumatoïde. On peut citer à ce titre, l'étanercept et l'Infliximab®, qui sont deux inhibiteurs dirigés contre le TNF (Tumor Necrosis Factor), une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la polyarthrite rhumatoïde. De telles
20 molécules sont qualifiées d' anti- TNF. D'une manière plus générale, le facteur TNF alpha est apparu comme une cible principale thérapeutique basée sur des études cliniques avec des inhibiteurs biologiques comme des anticorps monoclonaux ou des récepteurs solubles. A ce titre, l'Infliximab® est prescrit pour réduire l'inflammation mais également pour ralentir l'évolution de la polyarthrite rhumatoïde lorsque d'autres médicaments sont insuffisants.
25 Toutefois, tous les patients ne répondent pas d'une manière comparable à un traitement par l'Infliximab®. Ainsi, des radiographies d'articulations de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et traités par l'Infliximab®, prises après un an ont révélé que, si un nombre important de patients a bénéficié d'amélioration, un plus petit nombre avait subi une détérioration articulaire. D'une manière comparable, tous les patients ne répondent pas d'une manière comparable à un traitement par l'étanercept.
H est donc important d'un point de vue clinique de déterminer, avant toute prescription, si le patient répondra ou non au traitement proposé par le médecin. A l'heure actuelle, il n'existe aucun procédé permettant de déterminer, préalablement à un traitement par un anti-TNF, quel pourra être la réponse d'un patient pris individuellement. La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil biologique pour améliorer le traitement d'un patient contre la polyarthrite rhumatoïde. La présente invention permet en effet de déterminer la réponse d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoïde à un traitement tel que l'Infliximab®.
La présente invention est également très pertinente pour le suivi de réponse d'un patient soumis à un traitement tel que l'Infliximab®.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la réponse d'un patient envers un tel traitement peut être déterminée par l'analyse de l'expression du gène codant la synovioline, notamment dans le sand périphérique. Les inventeurs ont également démontré que la suivi de réponse d'un patient à un traitement tel que l'Infliximab® peut être réalisée par le suivi de l'expression du gène codant la synovioline.
A cet effet, l'invention concerne un procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps caractérisé en ce qu'on mesure l'expression du gène codant la synovioline.
Préférentiellement, le traitement est dirigé contre la cytokine TNF alpha. On peut citer à ce titre un traitement bloquant l'action du TNF, tels que notamment l'Infliximab®, l'étanercept et radalimumab. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la mesure de l'expression du gène codant la synovioline est réalisée de la manière suivante : a) on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique, b) on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline; c) on détermine l'expression du gène codant la synovioline
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de tissu, de synoviocytes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin. Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques connus de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : - une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet WO 00/05338, WO 99/53304, WO 99/15321. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809).
- une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou co valence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO-A- 97/45202 et WO-A- 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes ou magnétiques. D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique. Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique.
Lors de l'étape b), et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 7O0C, en particulier entre 35 et 650C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide, soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Préférentiellement, on utilise une amorce comprenant tout ou partie d'une séquence de SEQ ID N0I ou 2, préférentiellement un couple d'amorces comprenant la SEQ ID N0 et la SEQ ID N°2. Par réaction d'amplification enzvmatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US
4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159,
LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184,
RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995,
NASBA (Nucleic Acid Séquence- Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et - TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491.
Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques du gène cible, afin de permettre l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Préférentiellement, on utilise une amorce comprenant tout ou partie d'une séquence de SEQ ID N0I ou 2. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation.
Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant au moins 5 motifs nucléotidiques, tel que de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détectioa Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection «molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2 780 059. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par co valence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A- 94/12670, d'une particule. Ces étapes d'hybridation sur support peuvent être précédées d'une étape de réaction d'amplification enzymatique, telle que définie précédemment, pour augmenter la quantité de matériel génétique cible.
Lors de l'étape c) la détermination de l'expression du gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier. D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.
L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible.
Lorsque le réactif spécifique comprend une ou des amorces d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).
2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' « ADNc spécifiques du gène cible » ou d' « ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment.
3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces techniques d' électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA, J Mol Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).
2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L' ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.
3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybrides les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.
Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type 17 polymérase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.
2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybride un grand nombre de sondes.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être notamment mise en oeuvre par «NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment, pour déterminer la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps. Préférentiellement, le traitement est dirigé contre la cytokine TNF alpha. On peut citer à ce titre un traitement bloquant l'action du TNF, tels que notamment l'Infliximab®, l'étanercept et l'adalimumab.
L'invention concerne enfin un kit de pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, ledit traitement étant tel que défini ci dessus, comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment.
L'invention concerne également un kit pour le suivi de réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, ledit traitement étant tel que défini ci dessus, comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment.
L'analyse de l'expression de la synovioline permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie. On peut par exemple analyser l'expression du gène cible chez un patient dont on ne connaît pas sa réaction à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients répondant audit traitement et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients non répondant audit traitement. Ceci permet de déterminer si le patient est répondant ou non répondant, ce qui permet de lui proposer un traitement adapté ou d'adapter son traitemnt tout au long de sa thérapie.
L'exemple suivant est donné à titre illustratif et n'a aucun caractère limitatif. Il permettra de mieux comprendre l'invention.
Exemple - Etude de l'expression du gène codant la synovioline pour le diagnostic / pronostic de la polyarthrite rhumatoïde
Patients - L'étude a été réalisée sur des patients contrôles (C, n = 23) ou atteint de polyarthrite rhumatoïde (PR, n =47). Les groupes de patients PR et C avaient un sex- ratio et une moyenne d'âge similaire. Les patients PR étaient classés selon les critères révisés du Collège Américain de Rhumatologie (Arnett et al. Arthirtis Rheum 1988;31:315-324). Les échantillons sanguins étaient prélevés et collectés dans des tubes
PAXGeneTM Blood RNA (PreAnalytix, Hilden, Germany).
Traitement - Tous les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde recevaient une injection intraveineuse de 3 mg/kg d' Infliximab® aux semaine 0, 2, 6, 14, et 22.
L'Infliximab® est un inhibiteur du TNF alpha. Les inhibiteurs du TNF alpha apportent une amélioration rapide des signes cliniques et biologiques dans la polyarthrite rhumatoide refractaire aux autres traitements, notamment au methotrexate. L'Infliximab® ou remicade ® est un anticorps anti-TNF alpha chimérique. Un traitement au methotrexate (MTX) était prescrit également. La réponse clinique était évaluée après la première injection (semaine 0) et immédiatement après la cinquième injection (semaine 22) par l'utilisation des critères suivants: douleurs articulaires, gonflements articulaires, évaluation de la douleur du patient, évaluation globale de la maladie du point de vue du patient, l'évaluation globale de la maladie du point de vue du médecin, un Questionnaire d'Évaluation de Santé, le niveau sérique de la C réactive protéine (CRP) et le taux de vitesse de sédimentation (ESR). On distinguait les patients bons répondeurs (BR) au traitement et les mauvais répondeurs (MR) au traitement.
Culture de synoviocytes - Une lignée cellulaire de synoviocytes fibroblast-like (FLS) était obtenues à partir d'un prélèvement de patients (PR). Des cellules contrôles issus d'un prélèvement de peau des patients PR étaient également analysée (CT). Les FLS et CT étaient isolées par une enzyme de digestion et mises en culture dans un milieu RPMI comprenant 10% de sérum fœtal de veau (Invitrogen) à 370C dans un incubateur humide comprenant 5% de CO2 tel que décrit précédemment (Toh et al. Arthritis Rheum 2004 Oct ;50(10) :3118-3128). Les synoviocytes, ainsi que les cellules contrôles ont ensuite été cultivés dans des microplaques de 96 puits (10 000 cellules par puits) dans un volume final de 200 μl dans un milieu de culture complété avec 10 % FCS et traité avec de l'IL- 1 β (0.1 ng/ml, Immunotools, Friesoythe, Germany) ou du TNFα? (1 ng/ml, Immunotools, Friesoythe, Germany).
Analyse de l'expression du gène codant la synovioline - L'expression du gène codant la synovioline a été mesurée par PCR en temps réelle dans le sang périphérique de patients contrôles (C) et de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (PR) avant et après 6 mois de traitement à l'Infliximab®. L'expression du gène codant la synovioline a été également mesurée dans la lignée cellulaire FLS et les cellules contrôles CT. Le gène codant la cyclophiline B (PPIP) était utilisé comme gène de ménage pour les échantillons sanguins, et le gène codant la beta actine était utilisé comme gène de ménage pour les lignées cellulaires FLS et les cellules contrôles CT tels que décrit précédemment (Pachot et al, J. Biotechnology 2004;114:121- 124 ; Toh et al, Arthritis Rheum 2004;50:3118-3128.). Les ARN totaux étaient extraits du sang total par l'utilisation du kit PAXGeneTM Blood RNA kit (PreAnalytix) et étaient purifiées par l'utilisation d'un kit RNA- easy (Qiagen, Hilden, Germany). Les ARN étaient extraits des cellules FLS et CT par l'utilisation de TRIzol (Gibco BRL) et étaient purifiées par l'utilisation d'un kit RNA- easy (Qiagen, Hilden, Germany). Les cDNA étaient préparés à partir d'un 1 μg d'ARN totaux par l'utilisation d'un système Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, California, USA). Une quantité de 1 μg d'ARN était reverse- transcrit par l'utilisation du système Thermoscript RT-PCR (Invitrogen, California, USA) et une amplification par PCR étaient réalisée sur LightCycler (Roche) par l'utilisation du kit Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I real-time PCR (Roche Molecular Biochemicals). Les amorces spécifiques pour la synovioline qui ont été utilisés étaient les suivants : SEQ ID N0I: 5'- GTT TAC AGG CTT CAT CAA GG-3' et SEQ ID N°2: 5'-CAT GAT GGC ATC TGT CAC AG -3' .
Pour la cyclophiline B, les primers étaient obtenus auprès de LC-Search (PPIB, accession number: M60857, amplicon 105 to 338). Pour la beta actine, les primers utilisés étaient les suivants (Toh et al, Arthritis Rheum. 2004 Oct ;50(10) :3118-3128) : SEQ ID N°3 : 5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT- 3' et SEQ ID N°4' -GATGTCACGCACGATTTCC-5'
Un volume de 10 μl de ADNc standard et de dilutions d'ADNc provenant des échantillons étaient additionnés aux tubes capillaires. L'amplification était réalisée dans un volume final de 20 μl comprenant une concentration en amorces de 10 μM, 25 mM de chlorure de magnésium (MgC12), ainsi que l'enzyme Taq et le marqueur SYBR Green I contenu dans le kit LightCycler Fast start DNA Master SYBR green I (Roche). La PCR était réalisée pendant 45 cycles d'amplification (10 secondes à 950C, 10 secondes à 680C et 16 secondes à 720C). Pour chacun des gènes d'intérêt, un standard a été préparé par une amplification PCR (polymerase chain reaction) conduite jusqu'à saturation. Les amplicons obtenus ont été purifiés (PCR purification kit, Qiagen Ltd) et la présence d'un amplicon unique a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d'éthidium. L'expression des ARNm était déterminé par l'utilisation du logiciel LightCycler. Analyses statistiques - Les résultats étaient exprimés par la moyenne ± SEM.
Les différences de valeurs étaient calculés par un test ANOVA, et les valeurs ayant une probabilité inférieure à 0.05 était considérés comme significativement différentes. Résultats
Analyse de l'expression de la synovioline chez des patients témoins et des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci après.
Figure imgf000019_0001
Tableau 1
Ce tableau 1 présente le niveau d'expression des ARNm du gène codant la synovioline chez des patients contrôles (C) et patients atteint de polyarthrite rhumatoide (PR). Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 1 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05.
Les patients PR présentaient un niveau d'expression des ARNm de la synovioline significativement augmenté par rapport aux patients contrôles. Analyse de l'expression de la synovioline dans les lignées cellulaires FLS et les cellules contrôles CT
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 et 4 ci dessous.
Figure imgf000020_0001
Tableau 2
Le tableau 2 présente le rapport le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules FLS mises en culture en présence de ILl beta (0.1 ng/ml) ou de TNF alpha (lng/ml). Le TNF augmentait l'expression de synovioline pendant 6h. L'ILl augmentait également l'expression de synovioline qui restait élevée jusqu'à 24h.
Figure imgf000020_0002
Tableau 3
Le tableau 3 présente le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules FLS mises en culture en présence de différentes concentrations de ILl beta ou de TNF alpha. Le rapport était dépendant de la concentration en ILl beta et de TNF alpha
Ces résultats démontrent que l'upregulation de la synovioline par le TNF alpha et l'ILl beta peut contribuer à la dérégulation de la prolifération de FLS dans la polyarthrite rhumatoïde.
Figure imgf000020_0003
Tableau 4 Le tableau 4 présente le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage beta actine chez des cellules contrôles CT mises en culture en présence de ILl beta (0.1 ng/ml) ou de TNF alpha (lng/ml). Aucune augmentation significative d'expression de synovioline n'était observé en présence de ILl ou de TNF.
Analyse de l'expression de la synovioline chez des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide répondant à un traitement à l'Infliximab® et chez des patients atteints de la polyarthrite rhumatoide ne répondant pas à un traitement à l'Infliximab® Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5 ci dessous.
Figure imgf000021_0001
Tableau 5
Ce tableau 4 présente le niveau d'expression des ARNm du gène codant la synovioline chez des patients répondeurs (BR) et des patients non répondeurs (MR), avant et 6 mois après traitement. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophiline B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 5 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les patients MR présentaient un niveau d'expression des ARNm de la synovioline signiflcativement augmenté avant et après le traitement par rapport aux patients BP. L'expression des ARNm de la synovioline était diminuée après 6 mois de traitement chez des patients BP mais pas chez les patients MR. L'expression de la synovioline était signiflcativement augmentée chez les patients BP par comparaison aux patients contrôles.
Conclusion - L'étude de l'expression des ARNm des gènes codant la synovioline 3 partir de prélèvements de sang total permet ainsi de discriminer très efficacement les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde de patients contrôles, mais permet également de discriminer les patients bons répondeurs, des patients mauvais répondeurs à un traitement par l'Infliximab®. La synovioline est donc un excellent marqueur de diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde, mais surtout de pronostic quant à la réponse d'un patient vis à vis d'un traitement. La synovioloine est également un excellent marqueur pour le suivi d'un patient sous traitement à l'Infliximab®. Ceci permet au médecin d'identifier rapidement les patients qui ne répondent par à l'Infliximab®, ce qui permet de leur donner un autre traitement plus adapté.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps caractérisé en ce qu'on mesure l'expression du gène codant la synovioline.
2) Procédé selon la revendication 1 dans laquelle la mesure de l'expression du gène codant la synovioline comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline; c. on détermine l'expression du gène codant la synovioline
3) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques.
4) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation
5) Utilisation d'au moins réactif spécifique du gène codant la synovioline pour déterminer la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie ou pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps. 6) Kit de pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline.
7) Kit pour le suivi de réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant la synovioline, tel que défini précédemment.
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