KR20010034814A

KR20010034814A - 유전자 발현의 정량적 분석

Info

Publication number: KR20010034814A
Application number: KR1020007011723A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 지. 로웨; 질 알. 스코엔펠드
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2001-04-25
Also published as: AU3867199A; JP2002512046A; CA2325343A1; EP1071824A2; WO1999054510A2; WO1999054510A3; IL138851A0

Abstract

생물학적 시료내 관심 유전자의 발현양 또는 일군의 관심 유전자들의 발현양을 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 PCR 증폭검사에서 총 RNA로부터 제조된 연속적 희석물을 검사함으로써 각각의 관심유전자에 대한 표준곡선을 제조하는 것을 포함한다. 역전사되고 증폭된 각각의 구성원에 대한 역치 사이클(Ct)을 결정하고 연속적 희석물내 총 RNA 양의 로그값에 대하여 도시한다. 이 도시를 이용하여 RNA 등가치를 결정하고 이로부터 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정한다. 본 검사는 시료에 대한 처리가 관심 유전자 또는 일군의 관심 유전자들의 발현양에 미치는 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.

Description

유전자 발현의 정량적 분석{Quantitative Analysis of Gene Expression}

PCR에 의한 표적 핵산(DNA 또는 mRNA)의 정량적 측정은 제어할 수 없는 변수 및 수행상의 오염의 우려를 개입시킬 수 있는 시간소모적인 증폭 후 단계를 요구한다. 이러한 문제점들을 해결하기 위하여 PCR 산물의 더 직접적인 검출을 가능하게 하는 기술이 개발되어 왔다.

형광에너지 전이("FET") PCR 검사법은 표적 DNA의 내부 세그먼트에 상보적인 비연장성 핵산 프로브를 이용한다. 이 프로브는 하나의 방출 스펙트럼이 다른 하나의 여기 스펙트럼과 중첩되는 성질을 갖는 두 개의 형광 부분으로 표지된다. 그 결과, 제1 플루오로포아의 방출은 제2 플루오로포아에 의해 대부분 감쇄된다. 이 프로브는 PCR 도중에 존재하고, PCR 산물이 제조되면 이 프로브가 상보적인 가닥에 혼성화하는 DNA에 특이적인 DNA 폴리머라제의 내재적인 5'-엑소뉴클리아제 활성에 의해 분해되기 쉽게 된다. 이 프로브의 뉴클레오리틱 분해는 이 두 개의 플루오로포아를 용액중에서 분리되게 하고, 이는 상쇄를 감소시키고 방출광의 강도를 증가시킨다. 형광 플레이트 판독기에서 시료를 측정하면 추가적인 증폭후 프로세싱이 필요하지 않다.

일반적으로, 정량적 PCR에 의한 DNA의 검출 및 정량적 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응("RT-PCR")에 의한 mRNA의 검출은 표적 서열과 함께 증폭되는 내부 대조군의 사용을 필요로 한다. 내부 대조군을 표적 서열로부터 구별하기 위하여 내부 대조군은 스크램블 내부 서열, 표적 앰플리콘의 돌연변이, 표적 앰플리콘 내 서열의 결손 또는 부가, 또는 비상종성 DNA 서열로 스플라이싱된 표적 프라이머 서열 일 수 있다. 그러나, 대조군과 실험 핵산 사이의 증폭 효율의 차이는 이들의 PCR 산물의 양에 상당한 차이를 가져올 수 있다.

최근에, 실시간으로 축적되는 PCR 산물의 양을 추적하는 FET PCR을 이용하는 정량적 PCR법이 개발되어, 표적 핵산의 초기 농도의 측정으로 PCR 산물이 소정 양에 도달하는데 필요한 싸이클의 수를 계산 사용한다. 그러나, 이 검사법은 또한 함께 증폭되는 대조군의 사용을 필요로 하고 따라서, PCR의 지수적 증폭기 동안 상이한 시료내 및 시료와 대조군 사이의 상대적 증폭 효율에 관한 추정을 필요로 한다.

또한, 통상적인 조건하 또는 자극의 응답시의 발현 활성의 "프로필"을 결정하기 위하여, 수많은 관심 유전자의 발현양에 대하여 시료 스크리닝하는 것은 시간 소모적이고 번거로운 일이다. 유전자 발현의 프로필화에 대한 접근에서 중요한 난점의 하나는 다양한 분포의 카피수를 갖는 일군의 유전자의 발현을 정량적으로 측정할 손쉽게 접근가능한 기술의 설계이다.

발명의 요약

당업계에는 상기 방법들에 내재적인 문제점 없이, 관심 유전자의 발현양을 측정할 수 있게 하는 검사법에 대한 필요성이 있었다. 또한, 당업계에는 관심 유전자 또는 관심 유전자군의 자극에 대한 응답시의 발현양 변화를 쉽게 검사할 수 있는 방법에 대한 요구가 있다. 이러한 방법들은 소량의 조직 시료에 사용할 수 있어야 하고, 이로써 동일 대상으로부터의 연속적 실험 시료간의 직접 비교를 가능하게 하고, 잠재적인 백그라운드 유전자 다양성에 대한 조절 및 임상적 표본에 대한 분석을 가능하게 한다. 본문에 개시되고 청구된 정규화된 RNA 등가치를 측정하기 위한 방법은 유전자 발현 프로필화를 위한 상기 기준을 만족하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응("RT-PCR")에 대한 5'-엑소뉴클리아제 검사에 기초하여 정량적 RNA 프로필화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 관심 유전자가 코딩하는 표적 mRNA의 시료내 상대적 양을 측정하여 관심 유전자의 발현을 정량적으로 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여전히 또다른 목적은 자극에 응답하는 유전자 발현의 정량적 측정에 미치는 자극의 영향을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 시료내 일군의 유전자의 발현양 프로필을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 시료내 유전자 발현양 프로필에 미치는 자극의 영향을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

일 실시태양에서, 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정함으로써 생물학적 시료내 관심 유전자의 발현을 정량적으로 측정하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 첫째, 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 폴리머라제 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 관심 유전자에 대한 표준 곡선을 만드는 것을 포함한다. 이 표준 곡선은 하기를 포함하는 방법에 의해 만들어진다; (i)알려진 총 RNA 농도를 갖는 총 RNA추출물로부터 역전사물(reverse transcript) 표준 연속 희석물의 제조, (ii) 검사물의 성분으로 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 비연장성 FET 혼성화 프로브 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 함유하고, 상기 프라이머 및 프로브는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물의 세그먼트 또는 그의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하여 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있으며, 상기 프라이머는 연장 반응을 개시할 수 있고, 상기 DNA 폴리머라제는 프라아머 연장 반응을 촉매할 수 있으면서 5'-엑소뉴클리아제 활성을 가지는, 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사를 이용한 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원의 증폭, (iii) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 PCR 각 사이클 동안 실시간으로 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사로 인한 형광 강도의 모니터, (iv) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 역치 사이클(Ct)의 결정, (v) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원내 총 RNA양의 로그값에 대하여 Ct를 도시하고 이로부터 RNA 등가치의 결정, 및 (VI) 이 RNA 등가치를 정규화하여 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치 표준 곡선의 제공. 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치는 RT-PCR내 시료를 검사하고, 그 결과를 표준 곡선과 비교함으로써 결정된다.

본 발명의 또다른 실시태양에서는, 시료내 관심 유전자의 발현의 정량적 측정에 미치는 처리의 효과를 결정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기한 RT-PCR 검사법을 이용하여 관심 유전자에 대한 표준곡선의 제조를 포함한다. 제1 비처리된 시료 및 제2 처리된 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치는 RT-PCR에서 제1 및 제2 시료를 검사하고 이로부터 얻어진 결과를 표준 곡선과 비교하여 결정된다.

본 발명의 또다른 실시태양에서는, 시료내 일군의 관심 유전자의 발현을 정량적으로 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기 RT-PCR 검사법 및 별도의 구별되는 세트의 각 관심 유전자에 대한 포워드 프라이머, 리버스 프라이머 및 혼성화 프로브를 이용하여 관심유전자들 각각에 대한 표준 곡선을 만드는 것을 포함한다. 시료내 관심 유전자들에 대한 정규화된 RNA 등가치들은 각각의 관심 유전자에 대한 RT-PCR에서 시료를 검사하고, 이로부터 얻은 결과를 각각의 관심 유전자에 대한 표준 곡선과 비교하여 결정한다.

본 발명의 추가적 목적은, 제1 비처리 시료 및 제2 처리된 시료내에서 일군의 관심 유전자의 발현의 정량적 측정에 미치는 처리의 효과를 결정하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 상기한 RT-PCR 검사법을 이용하여 관심 유전자 각각에 대한 표준 곡선을 만드는 것을 포함한다. 제1 시료 및 제2 시료내 각 관심유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치는 RT-PCR 내 시료의 검사 및 이로부터 얻은 결과를 각 관심 유전자에 대한 표준 곡선과 비교하여 결정된다.

또한 추가적인 실시태양에서, 본 발명은, (a) 표적 mRNA 분자의 역전사물 또는 이의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하고, 이들의 세그먼트와 안정적 하이브리드 이중결합을 형성하는 프라이머 및 프로브, 및 연장반응을 개시할 수 있는 프라이머인 포워드 프라이머, 리버스 프라이머 및 혼성화 프로브, (b) 역전사효소, (c) 열안정성 DNA 폴리머라제, (d) 상기 방법을 수행하는 지시서, 및 임의로 (e) 역전사 및(또는) PCR 증폭 반응을 수행하기 위하여 필요한 기타의 시약을 포함하는, 상기한 방법을 수행하는 키트에 관한 것이다.

상기 및 기타 목적들, 실시태양 및 본 발명의 특징들은 하기의 본 발명의 개시 및 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

본 발명은 일반적으로 정량적 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응("PCR")검정법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 시료중 표적 mRNA를 정량화하기 위한 상대적 RNA 표준을 이용한 역전사효소-PCR 법에 관계된다. 본 발명은 정량적 유전자 발현에 응용될 수 있고, 여기서 유전자 발현의 변화 검출은 생물학적 응답을 측정할 수 있고, 또는 예후 또는 진단적 가치가 있을 수 있다.

도1a는 심장 안키린 반복 단백질에 특이적인 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 및 혼성화 프로브를 이용한 마우스 심실 추출물로부터의 총 RNA 추출물의 4배 연속 희석에 대하여 PCR 사이클 수의 함수로서, △Rn으로 표시되는, 혼성화 프로브 분해로 인한 형광 강도 증가를 보여주는 그래프이다. 쌍으로 러닝(running)시키는 반응 튜브중 총 RNA 농도(ng)는 400(내부가 칠해진 원), 100(내부가 칠해진 삼각형), 25(내부가 칠해진 사각형), 및 6.25(내부가 칠해진 마름모)이었다. 각 PCR 증폭 반응이 기준 형광선 표준편차의 10배에 도달하는 역치 PCR 사이클(Ct)을 화살표로 나타내었다. 도1b는 로그 스케일로 반응내 총 RNA의 양 (ng)에 대하여 도시한 도1a로부터 측정된 Ct를 보여주는 그래프이다. 도1b에 도시된 점들에 대하여 결정한 선형 감소 방정식은 y=24.90-3.36 log(x), R=0.997이다.

도2a 및 도2b는 발생적 및 압력 과부하 심장 비대증(POL)에 대한 비교 분자 표현형을 보여주는 그래프이다. 신생아 대 성인(도2a) 및 POL 대 성인(도2b)에 대한 차등 유전자 발현치를 유도(개방 막대) 및 억제(줄무늬 막대)에서 거울상 막대 그래프로서 도시한다.

본 발명의 실시에는 달리 언급이 없는 한, 당업계의 기술내인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 심장혈관 생리학, 및 약학분야의 통상의 기술들이 사용될 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 삼부르크, 프리트쉬 ＆ 마니아티스 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)]; [DNA Cloning, Vols. I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; 페르발, 비. [A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)]; 시리즈물[Methods In Exzymology, S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.]; 서적[Transcription and Translation, Hames et al. eds. 1984]; [Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller et al. eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.]; 스코페[Protein Purification: Principles and Practice (2nd ed., Springer-Verlag)]; 및 [PCR: A Practical Approach (McPherson et al. eds. (1991) IRL Press)]를 참조하라.

상기 또는 하기의 본문에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은 그 전문을 본문에 참고문헌으로 삽입한다.

명세서 및 첨부하는 클레임에 사용되는 단수형태 "a," "an" 및 "the"는 내용상 명백히 달리 언급하지 않는 한 복수 참조를 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들어 "프라이머"에 대한 참조는 둘 이상의 이러한 프라이머들을 포함하는 것이고, "프로브"에 대한 참조는 둘 이상의 이러한 프로브들을 포함하며, "관심 유전자"에 대한 참조는 둘 이상의 이러한 관심 유전자들을 포함하는 것이고, "치료"는 하나 이상의 이러한 치료들을 포함한다.

A. 정의

본 발명을 설명함에 있어서, 하기의 용어가 사용될 것이고, 이는 하기와 같이 정의된다.

"표준 곡선"이란, 시료중 표적 RNA의 양을 정량화하기 위한 목적으로 알려진 양의 RNA, 바람직하게는 이의 연속적 희석물을 검사하여, 이를 미지의 표적 RNA의 양을 함유하는 시료에서 얻은 결과와 비교하는 RT-PCR 검사법 결과의 그래프 도시에서 얻어지는 데이터의 수학적 변형을 의미한다. 표준 곡선은 총 RNA 추출물로부터 각 관심 유전자에 대하여 개발된다. 총 RNA 추출물은 바람직하게는 미지의 시료가 얻어진 조직 및(또는) 종과 동일한 것에서 얻는다. 총 RNA 추출물은 신선하거나 또는 동결될 수 있고, 동결시, 추출물로서 저장되거나 또는 사용 직전에 추출될 수 있는 조직시료로서 저장될 수 있다. "표준 곡선"이란 용어는 또한 그래프 데이터가 얻어지는 총 RNA 또는 cDNA 희석물을 의미하기 위해 사용될 수도 있다.

"PCR 역치 사이클" 또는 "Ct"란, 각 PCR 증폭 반응이 상당한 역치, 예를 들면, 형광 기준선 표준편차의 10배에 도달하는 PCR 사이클을 의미한다.

"연속적 희석물"이란, 관심 유전자 각각에 대한 표준 곡선이 만들어지는 표준으로서 사용되는 생물학적 시료로부터 회수되는 총 RNA 또는 총 RNA로부터 제조되는 cDNA의 한세트의 희석물을 말한다. 연속적 희석물의 역전사효소 및(또는) PCR 증폭의 결과로 각 유전자에 대한 표준 곡선이 정해진다. 연속적 희석물의 구성은 직렬적 또는 병렬적 방법으로 RNA 또는 cDNA를 희석하여 제조될 수 있다. 이 RNA 또는 cDNA 표준은 대조군 생물학적 시료, 모의조작된 생물학적 시료, 처리된 생물학적 시료 또는 관심 유전자를 함유하고(하거나) 발현시키는 기타의 카테고리의 생물학적 시료로부터 얻을 수 있다.

"대조군 총 RNA"란, 시료의 기준선 조건의 측정에 사용되는 시료로부터 추출된 총 RNA를 의미한다. "처리된 총 RNA"는 관심 유전자 발현에의 영향을 시험하기 위하여 처리 또는 개입이 이루어진 시료로부터 추출한 총 RNA를 의미한다.

"RNA 등가치"란, 하기하는 바와 같이, 역전사효소-5'엑소뉴클리아제 검사법을 이용하여 관심 유전자에 대하여 결정된 총 RNA 표준 곡선에 대하여 상대적인 시료내 표적 RNA의 측정량을 언급하는데 사용된다. "정규화된 RNA 등가치"란, 5'-엑소뉴클리아제 검사법에서 각 반응 용기내 RNA의 양에 대하여 정규화된 RNA 등가치를 말한다.

"처리"란, 생물학적 시료 또는 생물학적 시료가 채취된 대상에 대한 임의의 조작을 의미한다. 예를 들어, 대동맥 수축에 의한 심장 압력 과부하 비대증의 유도와 같은 물리적 처리, 물리적, 생화학적, 치료적 또는 독성적 효과를 갖거나 또는 효과를 가질 것으로 우려되는 화학물질에 생물학적 시료 또는 대상을 노출시키는 것과 같은 약물학적 처리, 질병, 예를 들어, 암, 심부전과 같은 질병의 발생 또는 성장과 같은 병리 상태의 발생, 모의 수술을 포함하는 외과 처리, 녹아웃 세포 또는 동물의 생산을 위한 유전자 치료 또는 유전자 조작 또는 형질전환 세포 또는 동물과 같은 유전자 처리, 상기한 처리들의 임의의 하나의 조합들, 임의의 상기 처리에 대한 적응적 응답 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다.

"폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"란, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 폴리뉴클레오티드의 임의의 기타 타입, 및 비뉴클레오티드 골격을 함유하는 기타 폴리머, 예를 들어, 폴리아미드(예, 펩티드 핵산(PNAs)) 및 폴리모르폴리노(오레곤주 코르발리스 소재, 안티 바이럴사 제품, 상품명 Neugene 폴리머), 및 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍 및 염기 겹침(base stacking)이 일어날 수 있는 구조의 뉴클레오염기를 함유하는 폴리머인 기타 합성된 서열 특이적 핵산 폴리머에 대한 총괄명칭이다. "폴리뉴클레오티드"와 "올리고뉴클레오티드" 사이에 길이의 차이점은 없고, 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 것이다. 이들 용어는 이 분자의 1차 구조만을 의미한다. 따라서, 이들 용어는 예를 들어 3-데옥시-2', 5'-DNA, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트, 2'-O-알킬 치환된 RNA, 이중 및 단일 가닥 DNA, 뿐만 아니라, 이중 및 단일 가닥 RNA, DNA:RNA 하이브리드, 및 PNA와 DNA 또는 RNA 사이의 하이브리드를 포함하고, 또한, 예를 들어, 당업계에 공지인 표지들, 메틸화, "캡", 자연 발생적 뉴클레오티드의 하나 이상의 유사체로의 치환과 같은 공지된 유형의 개질, 예를 들어 비하전 연결(예. 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트,카르바메이트 등), 음하전 연결(예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등) 및 양하전 연결(예. 아미노알킬포스포라미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르)을 갖는 것들, 예를 들어 단백질(뉴클리아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등을 포함)과 같은 부속 부분을 함유하는 것들, 삽입물(예. 아크리딘, 프소라렌 등)을 갖는 것들, 킬레이터(예. 금속, 방사선 금속, 보론, 산화적 금속, 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 개질된 연결(예. 알파 아노메릭 핵산 등)을 갖는 것들, 및 비개질된 형태의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 뉴클레오티드간 개질을 포함한다.

"프라이머"라는 용어는 DNA 및(또는) RNA, 및(또는) 합성 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 말하고, 이는 프라이머 연장 산물의 합성에 적합한 조건하에서 상보적 폴리뉴클레오티드 분자를 따라 합성을 시작하는 시작점으로서 작용한다. 이러한 조건으로는 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제와 같은 중합화-촉매제 하나 이상의 존재를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오티드는 적합한 온도에서 필요한 조인자를 포함하는 적합한 완충액내에 존재한다. 바람직하게는 프라이머는 단일가닥 올리고뉴클레오티드이다.

"표적 부위" 또는 "표적 뉴클레오티드 서열"이란 관심 유전자내에, 관심유전자가 암호화하는 mRNA내에, 관심유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물 또는 관심 유전자 또는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 상보적 가닥내에 함유된, 증폭 및(또는) 검출하고자 하는 부위를 말한다. "표적 서열"이란 원하는 조건하에서 프로브가 안정적 하이브리드를 형성하는 서열을 의미한다.

"혼성화 프로브"란, 관심 유전자 내에, 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물내, 또는 관심 유전자 또는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 상보적 가닥내에 존재하는 핵산서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구조를 말한다. 혼성화 프로브는 DNA 및(또는) RNA, 및(또는), 합성 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수 있다. 또한, 프로브는 이 프로브가 DNA 중합화 효소 또는 역전사효소를 위한 연장 프라이머로서 작용하지 않기 위하여 3'-포스페이트를 임의로 함유한다. "프로브"는 또한 검출가능한 표지를 함유한다. 이 표지는 프로브가 그대로이고 분해되지 않을 때는 신호를 만들지 않고, 5'-엑소뉴클리아제 절단에 의해 그 상보가닥으로부터 유리될 때 검출가능한 신호를 방출한다. 이 검출가능한 표지는 일반적으로 2개의 상이한 형광 다이(dye)로 이루어진다. 제1 다이는 리포터 다이이고 제2 다이는 상쇄 다이이다. 프로브가 그대로인 경우, 형광에너지 전이가 일어나서 리포터 다이 형광 방출은 상쇄 다이에 의해 흡수된다. PCR 사이클의 연장기 도중, 형광 혼성화 프로브는 DNA 폴리머라제의 5'-3' 뉴클레오리틱 활성에 의해 절단된다. 프로브의 절단시, 리포터 다이 방출은 더이상 상쇄 다이로 효과적으로 전이되지 않게 되고, 결과적으로 리포터 다이 형광 방출의 증가를 가져온다.

안정한 하이브리드를 제공하기 위하여 혼성화하는 서열이 완벽하게 상보성을 가져야하는 것은 아니라는 점을 이해해야 할 것이다. 많은 경우, 4개 이상의 뉴클레오티드의 루프를 무시하면, 안정적 하이브리드는 약 10% 미만의 비합치에서도 형성될 것이다. 따라서, 본문에서 "상보적"이란 용어는 검사 조건에서 그 "상보가닥"과 안정적 이중가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드, 일반적으로 약 90% 이상의 상동성이 있는 경우를 의미한다.

"생물학적 시료"란, 대상으로부터 단리된 조직 또는 유체 시료, 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수액, 정액, 림프액, 및 피부, 호흡기, 내장 및 비뇨생식관의 외부 섹션, 눈물, 침, 우유, 혈세포, 종양, 기관, 생체절취물(biopsy), 및 실험실적 세포 배양 구성성분(세포배양 배지내 세포 성장의 결과인 조건화된 배지, 추정 바이러스 감염 세포, 재조합 세포 및 세포 구성성분을 포함하나 이에 국한되지 않음)을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 본 방법의 바람직한 사용은 하기와 같이 유전자 발현을 검출하고 (또는) 정량화하는데 있다: 유전자 치료, 녹아웃 세포 또는 동물의 생산 및 형질전환 세포 또는 동물의 생산과 같은 유전자 조작; 심근경색 또는 압력 과부하 비대증의 외과적 동물 모델; 예를 들어, 암적인 유방 조직의 연구 목적용 또는 임상시도 도중 얻어지는 생체절취물과 같은 임상 시료; 및 화학적 처리에 대한 배양 세포 및(또는) 조직의 응답.

"임의의" 또는 "임의적으로"란, 후속적으로 기술되는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있음을 의미하고, 이러한 기재는 상기 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "세라믹 분말을 임의로 포함하는"이란 어구는 세라믹 분말이 존재할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있음을 의미하며, 이러한 기재는 세라믹 분말이 존재하는 경우 및 존재하지 않는 경우를 모두 포함한다.

본 발명은 표적 유전자 발현양을 측정하기 위하여 실시간 검출 및 5'-엑소뉴클리아제 검사법을 이용하는 정량적 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하였다. 달리 5'-뉴클리아제 검사, 닉 번역 검사 등으로 알려진, RT-PCR을 위한 5'-엑소뉴클리아제 검사는, 예를 들어, 홀란드 등(Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280), 깁슨 등(Gibson et al. (1996) Genome Res. 6:995-1001) 및 헤이드 등(Heid et al.(1996) Genome Res. 6: 986-994)에 기재되어 있다. 요약하면, PCR 산물을 검출하기 위한 5'-＞ 3'엑소뉴클리아제 검사는 비연장성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 사용한다. 이 프로브는 검사 결과를 모니터하기 위하여 이중 표지된다. 이 프로브는 그 5' 말단에 리포터 형광 다이, 즉, 형광 포스포라미다이트, 예를 들어, 6-카르복시-플루오레세인("FAM"), 2,7-디메톡시-4,5-디클로로-6-카르복시-플루오레세인("JOE") 및 테트라클로로-6-카르복시-플루오레세인("TET")로 표지되고, 상쇄 형광 다이, 예를 들어 6-카르복시-테트라메틸 로다민("TAMRA")로 표지된다. 이 표지된 프로브는 PCR 산물의 하나의 가닥에서 PCR 프라이머의 하나로부터 하류쪽 부위에 결합하도록 설계된다. 프로브의 3' 말단은 3'-포스페이트에 의해 연장이 차단된다. 이 프로브는 다른 PCR 시약들, 예를 들어 dNTP들과 함께 포함되고, 결합시 DNA 폴리머라제에 내재적인 5'-3' 엑소뉴클리아제 활성에 의해 분해된다. 프로브가 그대로인 경우에는 리포터와 상쇄 형광 다이의 물리적 근접성에 의해 리포터 다이 방출이 상쇄된다. 그러나, PCR 사이클의 연장기 동안에는, DNA 폴리머라제의 뉴클레오리틱 활성으로 혼성화 프로브가 절단되고 프로브로부터 리포터 다이가 유리된다.

결과적으로 리포터 형광 다이 방출의 상대적 증가가 PCR 증폭 도중에 실시간으로 모니터된다. PCR 증폭 도중 리포터 다이 방출(R) 양을 비반응성 기준 다이, 예를 들어, 5-카르복시-X-로다민(ROX) (P)와 비교하여 △Rn치(R/P)를 생성한다. 이 △Rn치는 분해된 혼성화 프로브의 양을 반영한다. 전형적으로 각 PCR 연장 사이클의 마지막 세 데이터 점들의 평균 △Rn치에 지수 함수가 적합하여 증폭도를 생성한다. 상대적 형광 방출 역치는 처음 10-15 사이클 도중 △Rn치의 기준선에 기초하여 정해진다(헤이드 등의 논문[(1996)Genome Res. 6:986-994]참고). 각 PCR 증폭이 상당한 역치, 예를 들어 기준선 표준편차의 10배에 이르는 사이클인 Ct가 계산된다. 이 Ct는 시료내에 존재하는 표적 카피수에 비례한다. 헤이드 등(1996, 상기 참조). 따라서, Ct치는 임의 시료내 표적의 카피수의 정량적 측정값이다.

본문에 개시되고 청구되는 발명을 이용하여, 총 RNA 표준 곡선을 이용한 표적 유전자 RNA 등가치를 결정함으로써 유전자 발현양의 상대적 변화를 신속하게 측정할 수 있다. 따라서, 미지의 표적 유전자 RNA의 카피수를 결정하기 위하여 알려진 카피수의 동시증폭되는 폴리뉴클레오티드가 첨가되는 반응인 내부 대조군(internal control)의 사용이 필요하지 않다. 표적 유전자의 발현양은 표준 곡선에 대하여 사용된 총 RNA에 대한 상대적인 표적 유전자 RNA의 양, 즉, 상대적 RNA 등가치를 계산함으로써 결정된다.

전형적 RT-PCR 검사는 다음과 같이 수행된다. 생물학적 시료로부터 총 RNA를 추출한다. 대조군 생물학적 시료 및 실험적 처리, 자극 또는 기타 개입처리를 한 생물학적 시료를 포함하는 검사를 한다면, 대조군 시료로부터 대조군 총 RNA를 추출하고, 처리된 시료로부터 처리된 총 RNA를 추출한다.

세포를 파괴하고, 바람직하게는 리보뉴클리아제를 불활성화시키는 방법으로 세포 또는 균질화된 조직 시료를 용혈시킨다. RNAses는 4 M 구아니디늄 티오시아네이트 및 β-머르캅토에탄올과 같은 환원제로 불활성화시킨다. 이러한 시약의 조합은 RNAse 활성을 함유하는 조직으로부터 전체 RNA를 단리하기 위하여 사용될 수 있다. 삼부르크 등의 7.6 내지 7.11 페이지 참조.

총 RNA는 당업계에 공지인 임의의 방법으로 추출될 수 있다. 예를 들어, 총 RNA는 글리신 등(Glisin et al. (1974) Biochemistry 13:2633), 울리치 등(Ullrich et al. (1977) Science 196:1313) 및 콤스진스키 등(Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156)에 기재된 바와 같은 구아니디늄 티오시아네이트/세슘 클로리드법을 이용하거나, 또는 스트로만 등(Strohman et al. (1977) Cell 10:265) 및 맥도날드 등(McDonald et al. (1987) Meth. Enzymol. 152:219)에 기재된 바와 같은 구아니딘 HCl/유기 용매법에 의하여 단리될 수 있다.

별법으로, 예를 들어, RNA STAT-60(텍사스주 프렌즈우드 소재, 텔테스트사 제품), RNeasy 총 RNA 추출 키트(키아젠), Tripure(인디아나주 인디아나폴리스 소재 베링거만하임 바이오케미컬사 제품), Trizol(메릴랜드주 가이테르스버그 소재 깁코 래보로토리사 제품) 및 등록상표 TRI Reagent(오하이오주 신시네티 소재, 분자연구센터사 제품)와 같은, 상업적으로 시판되는 수많은 키트의 임의의 것을 이용하여 RNA를 추출할 수도 있다.

표준 곡선을 만들기 위하여 총 RNA 추출물의 희석이 사용된다. 관심 유전자의 검사시 매번, 포워드 프라이어, 리버스 프라이머 및 관심 유전자에 특이적인 혼성화 프로브를 이용하여 새로운 표준 곡선을 만든다. 전형적으로, 반응당 약 0.1 ng의 총 RNA 내지 반응당 약 5000 ng RNA, 바람직하게는 약 반응튜브당 약 5 ng RNA 내지 반응튜브당 약 1000 ng RNA를 이용하여 반응을 수행한다. 반응당 총 RNA의 범위는 표적 유전자의 상대적 풍부도 및 반응당 시험 RNA의 양에 의존적으로 조정가능하다. 따라서, 비교적 풍부한 유전자에 대하여는 반응 튜브당 첨가되는 총 RNA 추출물의 양이 범위 중 낮은 쪽이고, 희귀한 전사물의 경우에는 총 RNA 추출물의 양이 범위의 높은 쪽일 것이다.

각 관심 유전자에 대한 총 RNA 표준 곡선의 런닝(running) 이외에, 표준 곡선은 임의로 각 반응에 첨가된 총 RNA 양에 대하여 정규화하기 위하여 하우스키핑(housekeeping) 유전자에 대하여 런닝된다. "하우스키핑 유전자"란, 시료간 또는 조직간 그 유전자의 발현이 실질적으로 같은 유전자, 또는 외부 자극에 대한 변화에 상대적으로 무관한 유전자를 말한다. 하우스키핑 유전자는 관심 유전자에 의해 암호화되는 것 이외의 시료 RNA의 표준화를 가능하게 하는 임의의 RNA 분자 또는 각 반응에 첨가된 총 RNA의 양을 위한 표준화에 사용될 수 있는 임의의 기타 마커일 수 있다. 예를 들어, GAPDH 유전자, G6PD 유전자, β-액틴 유전자, 리보좀 RNA, 36B4 RNA 등이 하우스키핑 유전자로서 사용될 수 있다. 따라서, 표적 유전자 발현을 위한 표준 곡선을 만들기 위하여 사용되는 총 RNA 추출물의 희석물은 예를 들어 GAPDH 유전자의 발현에 대하여도 또한 검사될 수 있다. 총 RNA 표준 농도 각각에 대하여 PCR 역치 사이클이 결정되고, 검사시 하우스키핑 유전자에 대하여 결정된다. 이렇게 결정된 Ct 값들은 해당 반응내 총 RNA 농도의 로그10에 대하여 도시되어 표준 곡선이 얻어진다. 이 곡선의 방정식은 정규화 또는 RNA 등가치를 결정하기 위한 입력 RNA의 등가치를 결정하기 위하여 사용된다.

각 반응 튜브내 총 RNA는 역전사효소 활성을 갖는 임의의 천연적 또는 재조합 효소, 예를 들어, AMV 역전사효소, MMLV 역전사효소, Tth DNA 폴리머라제 등을 이용하여 역전사된다. 이어서, 표적 특이적 포워드 및 리버스 프라이머 및 표적 특이적 혼성화 프로브의 존재에서 당업계에 잘 알려진 PCR 열순환기 방법을 이용하여 역 전사물이 증폭된다. 하우스키핑 유전자 역 전사물은 하우스키핑 유전자 특이적 포워드 및 리버스 프라이머, 및 혼성화 프로브의 존재에서 PCR 열순환기 방법을 이용하여 증폭된다.

5'-엑소뉴클라아제 PCR 검사는 DNA 중합 활성 및 5'-엑소뉴클리아제 활성을 갖고 열안정적인 임의의 천연적 또는 재조합 효소를 이용한다. 열안정 DNA 폴리머라제는 상승된 온도에서, 데옥시리보-뉴클레오티드를 주형 DNA 서열에 기하여 올리고뉴클레오티드 프라이머에 첨가시키는 것을 촉매하는 활성을 유지하는 DNA 폴리머라제를 말한다. 이러한 열안정 DNA 폴리머라제로는, Taq DNA 폴리머라제(Thermus aquaticus); Tth DNA 폴리머라제(Thermus thermophilus HB8); 및 Tfl DNA 폴리머라제(Therus flavus) 등이 있다.

더욱 구체적으로, PCR은 DNA 분자내 원하는 서열의 양 말단과 일치하는 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머(일반적으로 10 내지 20 뉴클레오티드의 길이)를 사용한다. 초기 주형은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 만일 RNA가 사용된다면, 이는 먼저 역전사효소에 의해 cDNA로 역전사된다. 이어서, 열과 같은 공지의 기술을 이용하여 이 cDNA의 두가닥을 분리시키고 몰 과량의 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 첨가한다.

프라이머는 상보적 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재에서 프라이머의 연장은 DNA 폴리머라제가 촉매한다. 생성된 산물은, 각 5'-말단에 새로이 합성된 원가닥의 상보물에 공유적으로 결합되어 있는 각각의 프라이머를 함유한다. 복제된 분자는 산물이 충분히 증폭될 때까지 다시 가닥이 분리되고, 프라이머와 혼성화가 계속된다. 이러한 PCR법은 예를 들어, 미국특허 제4,965,188호, 제4,800,159호, 제4,683,202호, 제4,683,195호에 기술되어 있고, 이 전체를 참고로 본문에 삽입한다.

리포터 다이 형광 방출의 증가는 실시간으로 PCR 증폭 도중에 모니터되고 △Rn을 계산하는데 사용된다. "△Rn"는 표적 또는 하우스키핑 유전자 역전사 증폭에 기인한 형광 신호 증가이고, 이는 백그라운드 형광을 차감함으로써 계산된다. 즉, △R =(Rn+)-(Rn-), 여기서 Rn+는 표적 역전사물의 존재에서 증폭 도중 비반응성 기준 다이의 방출 강도에 대한 리포터 다이의 방출 강도의 비율이고, Rn-는 표적 역전사물의 부재에서 증폭 도중 비반응성 기준 다이의 방출 강도에 대한 리포터 다이의 방출 강도의 비이다. △Rn은 총 RNA 희석 표준의 각각 및 하우스키핑 유전자 희석 표준의 각각에 대하여 증폭 사이클수에 대하여 도시한다. Ct는 총 RNA 희석 표준의 각각 및 하우스키핑 유전자 희석 표준에 대하여 결정된다.

표준 곡선은, 전형적으로 선형 표준 곡선을 산출하는, 일련의 희석에 대하여 총 RNA의 농도의 로그10값에 대항하여 Ct 값을 도시함으로써, 관심 유전자의 각각에 대하여 및, 임의로 하우스키핑 유전자에 대하여 마련된다. 이 표준 곡선은 관심 유전자 각각에 대하여 선형 방정식 Y=MX+B에 일치하고, 하우스키핑 유전자에 대하여는 y=mx+b에 적합하다(여기서, Y 및 y는 Ct이고, M 및 m은 직선의 기울기이고, B 및 b는 직선이 좌표축과 교차하는 Ct값이다).

미지의 대조군 및(또는) 처리한 시료에 대한 정규화된 RNA 등가치는 Ct 대 [RNA]의 도시로부터 다음과 같이 계산된다. 미지의 대조군 및(또는) 처리된 시료 RNA 추출물은 포워드 및 리버스 프라이머, 관심 유전자 각각에 특이적인 혼성화 프로브를 이용한 RT-PCR 검사에서 측정된다. 시료 RNA 등가치는 관심 유전자에 대하여 결정된 표준 곡선에서 선형 방정식을 X에 대하여 풀어서, 즉, X=(Y-B)/M을 계산하여 결정한다. 그다음, 하우스키핑 유전자("hg")에 기한 RNA 등가치에서 x에 대해서 풀어서, 즉, x=(y-b)/m을 계산하여 미지 시료내 총 RNA의 양에 대하여 X를 정규화한다. 따라서, 예를 들어, 미지 시험 대조군 시료내 총 RNA가 반응당 0.5 μg이 첨가된 경우의 검사에서, 미지 시료에서 RNA 등가치는 다음과 같이 계산될 수 있다.

미지 1(예를 들어, 대조군 시료)

미지 시험 처리된 시료내 총 RNA가 반응당 0.5 μg이 첨가된 경우의 검사에서, 미지 RNA 등가치는 다음과 같이 계산될 수 있다.

미지 2(예를 들어, 처리된 시료)

처리에 응답하여 관심 유전자로부터 발현된 mRNA의 양을 비교하기 위하여, RNA 등가치2를 RNA 등가치1과 비교한다.

연장 반응을 개시할 수 있는 포워드 및 리버스 프라이머, 및 관심 유전자 또는 유전자들이 암호화하는 mRNA 분자 또는 그의 상보물에 특이적으로 혼성화할 수 있고, 이들의 세그먼트와 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있는 혼성화 프로브, 역전사효소, 및(또는) 열안정 DNA 폴리머라제가 진단 키트에 제공될 수 있다. 이 키트는 또한 기타 적합하게 포함된 시약 및 특정 검사 프로토콜에 필요하거나 소망되는 물질, 예를 들어, 시료로부터 RNA를 추출하는 시약, dNTP 및 검사를 수행하는 안내서를 포함할 수 있다.

상기 키트내에 사용된 시약은 바이알 또는 병과 같은 하나 이상의 용기내에 각 용기가 역전사효소, dNTP 또는 dNTP의 칵테일, 또는 검사에 사용되는 열안정 DNA 폴리머라제와 같은 시약을 개별적으로 함유하도록 제공될 수도 있다고 상정된다. 이러한 시험 키트내에, 당업계의 당업자에게 공지인 완충액, 대조군 등과 같은 기타 성분들이 포함될 수도 있다. 이 키트는 또한 이의 사용을 위한 지시서가 포함될 것이다.

분석적 RT-PCR 검사는 유전자 발현의 정량적 변화를 측정하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 민감하고, 조직 시료를 매우 조금 필요로 하고, 신규 후보 유전자를 신속하게 시험하도록 적응될 수 있다. 기존의 보고된 방법과 비교하여, 본 방법은 검사의 정량적 보정을 위하여, 클로닝된 cDNA 또는 이들의 단편, 또는 cDNA로부터 제조된 인공 전사물을 필요로 하지 않는다. 또한, 기존에 보고된 방법은 상대적으로 순수하고 정제된 RNA 표준을 사용한다. 대조적으로, 본 발명의 검사에서는 총 RNA를 표준으로서 사용하고, 이렇게 더욱 복잡한 표준을 사용하는 것은 미지 시료의 조성을 더욱 근접하게 반영한다. 또한, 이 검사에서는 PCR 프라이머 및 프로브를 설계하기 위하여, 관심 유전자가 암호화하는 mRNA에 상보적인 DNA 서열에 관한 지식만이 요구된다. 또한, 본문에 개시되고 청구된 검사법은 수많은 후보 유전자에 대하여 그 발현의 변화 및 차이를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

마이크로어레이계(microarray-based) 기술 및 발현서열태그 접근법을 이용하여 수많은 수의 유전자상의 유전자 발현 데이터가 현재 수집되고 있다. 발현분석에 관한 이러한 기술의 발생 및 병태생리학의 생체내 및 생체외 모델에의 응용은 각 생물학적 시스템과 특이적으로 관련이 있는 유전자의 세트를 동정할 것이다. 분석적 PCR의 응용은 분자적 표현형의 지문을 나타낼 수 있는 마커를 빨리 찾는 접근가능한 수단을 제공하여야 한다.

소량의 총 RNA로 유전자 발현에서의 변화를 정량적으로 측정할 수 있는 능력은 이 분석적 PCR 검사가 인간 생체절취물 시료를 검사하는데 광범위하게 응용가능할 것이라는 것을 의미한다. 생체절취물에서 일반적으로 얻어지는 재료의 양은 마이크로어레이계 발현 검사를 가능하게 하지 못한다. 그러나, 이러한 시료는 본문에 개시되고 청구된 RT-PCR에 사용되기에는 충분하다. 인간 시료에서 이러한 측정을 가능하게 하는 능력은 질병 진행 및 진단과 관련있는 진단적 분자 마커를 동정하는 수단 및 치료 계획의 효과를 측정하는 수단을 제공할 것이다. 이 데이터는 또한 인간 질병의 동물 모델에 중요한 연관을 제공할 것이다.

예를 들어, 다양한 신경자극제, 기계적 자극 및 세포성 손상을 입을 경우, 성인 심장은 심장근육 세포 비대증으로 응답한다. 세포적 수준에서, 세포 비대적 응답은 세포수의 변화가 없이 개별적 근세포의 크기가 증가하는 것이 특징이다. 비록 초기 보정적이나, 심근경색 및 명백한 심부전에 수반하여 병리적 전이가 발생할 수 있다. 상이한 비대증 모델에서 관찰되는 유전자 발현의 패턴 결정은 적응과 기능장애 사이를 구별할 수 있는 단서를 제공할 것이다. 이러한 결정은 상이한 형태의 심장 비대증을 활성화하는 경로들을 동정할 수 있을 것이고, 이는 궁극적으로 심실 팽창 및 심부전의 병리적 표현형을 가져오는 것이다.

심장 비대증의 가장 보존적인 특징중 하나는 보통 심장 발생의 배발생 윈도우에서만 제한적으로 발현되는 유전자들의 재활성화이다. 예를 들어, 심방성 나트륨배설증가성 펩티드(ANP) 유전자는 배발생 심방 및 심실 모두에서 발현되나, 통상적인 생후 발생 도중 심실에서 하향 조절된다. 그러나, 지금까지 검사된 모든 척추동물종에서 공통적인 응답인 혈류역학적 로딩(loading)에 대한 응답으로서 심실 ANP 유전자 발현은 10배 이상으로 재빨리 유도된다. 이러한 발견은 수많은 다른 유전자에 대한 데이터와 함께, 발생적 유전자 발현의 조절 및 증가된 부하에 응답하는 성인 심장 비대증의 발생에 관여하는 공통적인 경로가 있다는 가정을 이끌어낸다. 이 공통적 경로는 부분적으로는 두 조직 상태 사이에서 공통의 분자 표현형을 가져올 수도 있다. 비록 널리 인식되었지만, 심실 배 발생, 생후 보통의 심장 성장 및 성인 심장의 심장 비대증 도중의 중요한 시점들에서 지금까지 단지 소수의 후보 유전자만이 검사되었기 때문에, 이러한 가정은 아직 결정적으로 시험되지 않고 있다.

생쥐에서 생체내 심장 기능의 측정 방법은 마우스 유전학 및 분자유전학 기술과 결합하여, 심장 생리학상에 미치는 유전자형의 영향을 직접적으로 결정하는 기회를 제공한다. 유전자 녹아웃 및 형질전환 전략에 기초하여 심장 생리학에 있어서 수개의 생쥐 모델이 기술되었다. 그 예로는 α₁B-아드레날린성 수용체의 심근세포-특이적 트란스유전자 발현, 활성화된 H-ras p21 및 gp130 신호 전달의 활성화에 의한 비대증 등이 있다. 팽창된 심근병이 또한 MLP 및 MnSOD 녹아웃 쥐에서 기재되어 있다. 이러한 다양한 생쥐 모델은 인간 심부전과 유사한 기능적 및 병리적 비이상을 갖지만, 이들 유전자 변형이 심장근육 질환의 발병 및 진행에 관여하는 분자적 사건의 재반복 정도는 미지수이다. 이들 연구에서 간과한 점은 생쥐의 유전형에 기초하여, 유전자 발현 프로필 및 분자적 표현형에서의 변화를 모니터하고, 이 데이터가 인간 심장 생리학, 병리학 및 분자적 표현형과 비교하여 어떻게 관련되는지를 연관짓는 것이다.

본문에 개시된 방법을 이용하여, 정상적 성장에서 및 적응성 비대증에서 생쥐 심장근육층에 대한 유전자 발현 프로필이 개발되었다. 3단계의 심장 성장(즉, 후단계 배발생적 심실 발생, 생후 통상적 심장 성장 및 생후 대동맥협착으로부터 압력과부하로 발생하는 비대증)으로부터 유래하는 조직 시료에서 29개 유전자들에 본 RT-PCR 검사를 적용하였다. 이 접근법을 이용하여, 심실 성장의 이들 뚜렷한 단계의 각각에서 다양한 분자적 프로필이 존재한다는 증거가 제공된다. 또한, 이들 발생의 각각에서 선택적으로 조절되는 새로운 군의 분자들이 동정되었는데, 이는 통상적 및 병리적 심장 성장 및 비대증의 정의된 단계의 차등적 특징에 있어서 이들의 잠재적인 특별한 중요성을 암시한다.

B. 실험

본 발명의 실시예는 달리 언급이 없는 한, 당업계의 기술내인 합성 유기 화학, 생화학, 분자 생물학 분야의 통상의 기술들이 사용될 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 삼부르크, 프리트쉬 ＆ 마니아티스 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)]; 서적[Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed., 1984]; 서적[Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames ＆ S. J. Higgins, eds., 1984]; 및 시리즈물[Methods In Exzymology, Academic Press, Inc.];

본 발명이 그의 바람직한 특정 실시예와 관련하여 기술되었으나, 상기 기술 및 하기의 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범주내에서 변형이 가능함이 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게는 명백할 것임을 이해해야 한다.

하기 실시예에서, 사용된 수치(예, 양, 온도 등)에 관하여는 정확성을 담보하기 위하여 노력하였으나, 약간의 실험적 오차 및 편차가 있음은 허용해야 할 것이다. 온도는 섭씨로서 나타내고, 달리 지시가 없는한 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

ROX 표준의 합성.

각 PCR 반응에 포함되는 형광 표준 5'-TTT-TTT-(LAN-ROX)-p3'는 다음과 같이 제조되었다. "ROX", 5-ROX, SE(5-카르복시-X-로다민, 숙시니미딜 에스테르)는 몰리큘라 프로브사(Molecular Probes, Inc.; 오레곤주 유젠소재)로부터 구입하였다. "LAN" 링커암 뉴클레오티드(아미노-개질기 C6dT) 및 3'-포스페이트-CPG(고체상 지지체), 46 μm/g은 글렌 연구소(Glen Research; 버지니아주 스테를링소재)로부터 구입하였다. 합성은 하기의 단계에 따라 10μm 스케일로 ABI 394 DNA 합성기에서 수행하였다. (1) 3'-포스페이트-CPG에 LAN을 커플링시킨다; (2) LAN-3'-포스페이트-CPG에 T6-포스포라미다이트를 커플링시킨다; (3) CPG로부터 올리고뉴클레오티드의 분해는 실온에서 1 내지 2시간 동안 20 ml의 농축 NH₄OH 중에서 수행하였다; (4) 생성된 혼합물을 볼텍스하고, 원심분리 후 상청액을 제거하고 증발시켜 잔류물을 얻었다; (5) 잔류물을 5 ml의 0.25 M NaHCO₃(1N NaOH로 pH 9.0으로 조정)에 용해시킨다. 5-ROX, SE 다이(25 mg/300 ㎕ DMSO)는 다음과 같이 첨가되었다; ROX 50㎕를 첨가하고, 흔들어서 혼합하고, 실온 암소에 45분 동안 두었다. 50㎕의 첨가를 반복하고 45분 동안 암소에 두었다. 마지막 50㎕를 첨가하고, 이 반응물을 실온에서 밤새 인큐베이트하였다. 이어서 반응물을 10개의 알리콧으로 나누고 파마시아(뉴저지주 파스카타웨이 소재) PD-10칼럼을 통과시켜 비반응 다이 잔기를 제거하였다. 원하는 분획을 수집한 후, 증발시키고, 조산물을 HPLC 및 이어서 폴리아크릴아미드겔 전기영동 정제로 정제하였다.

혼성화프로브의 합성

프로브를 피이 어플라이드 바이오시스템사(PE, APPLIED BIOSYSTEMS; 캘리포니아주 포스터시티 소재)로부터 구입하거나 다음과 같이 합성하였다: "TAMRA"는 5-TAMRA이고, SE(5-카르복시테트라메틸로다민-X-로다민, 숙시니미딜 에스테르)는 몰리큘러 프로브사(오레곤주 유젠소재)로부터 구입하였다. "LAN" 링커암 뉴클레오티드(아미노-개질기 C6dT), 3'-포스페이트-CPG(지지체), 46 μm/g 및 "FAM", 5-(5'-플루오레세인 포스포라미다이트)는 글렌 연구소(Glen Research; 버지니아주 스테를링소재)로부터 구입하였다. 합성은 하기의 단계에 따라 0.2μm 스케일로 ABI 394 DNA 합성기에서 수행하였다. (1) 3'-포스페이트-CPG에 LAN을 벌크로(반응당 약 34μm) 커플링시킨다; (2) 0.2μm 스케일을 이용하여, LAN-3'-포스페이트-CPG상에 표준 포스포라미다이트 화학을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다; (3) 완성된 올리고뉴클레오티드에 FAM을 커플링시킨다(커플링 시간 7 내지 10분). CPG로부터 올리고뉴클레오티드의 분해는 40℃에서 18시간 동안 암소에서 1 ml의 농축 NH₄OH 중에서 수행하였다. 상기 혼합물을 볼텍스하고, 원심분리 후 상청액을 제거하고 증발시켜 잔류물을 얻었다. 산물을 침전시키기 위하여, 잔류물을 1 ml의 1 M NaCl에 용해시키고 12 ml의 순수에탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 혼합하고, -20℃에서 밤새 둔다. 그 다음, 현탁액을 6-7분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라버린다. 오렌지색 펫릿을 암소 진공하에서 부드럽게 건조시켜 과량의 에탄올을 제거하고 생성된 잔류물을 0.5 ml의 0.25 M NaHCO₃(1N NaOH로 pH 9.0으로 조정)에 용해시켰다. 5-TAMRA, SE 다이(60 ㎕ DMSO 중 5 mg)는 다음과 같이 첨가된다; TAMRA 5㎕를 반응물에 첨가하고, 볼텍스 후, 실온 암소에 45분 동안 둔다. 5㎕의 첨가를 반복하고 45분 동안 다시 인큐베이트한다. 마지막 5㎕를 첨가하고, 이 반응물을 실온에서 밤새 인큐베이트하였다. 반응용액을 파마시아 PD-10칼럼을 통과시켜 비반응 다이를 제거하였다. 원하는 분획을 수집한 후, 증발시키고, 조산물을 HPLC 및 이어서 폴리아크릴아미드겔 전기영동 정제로 정제하였다.

조직 및 RNA 제조

성 및 노화 연구를 위하여, 어덜트 C57B1/6 생쥐는 국립 노화 연구소 (메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 구입하였다. 생쥐는 CO₂로 안락사시키고 이어서 경부 탈좌시킨다. 조직을 제거하고 5분 이내에 액체 질소중에 순간 냉동시키고, RNA 제조시까지 -80℃에서 보관한다. 신생 심실은 시몬슨 래보로토리즈 인크(Simonsen Laboratories, Inc.; 캘리포니아주 길로이 소재)로부터 구입하였다. 압력 과부하 비대증(POL)은 이미 록만 등(Rockman et al. (1993) Circulation 87 Supplement VII: VII-14-VII-21)에 기재된 바와 같이, 횡행 동맥 수축에 의해 유도되었다.

RNA는 제조자의 지시에 따라 RNA STAT-60 (Tel-Test, Inc. 텍사스주 프렌즈우드 소재)을 이용하여 추출하고, 10-15 μg 알리콧으로 0.5 μg/㎕의 농도로 -80℃에서 저장하였다. 각 유전자에 대하여 정해진 프로브 및 프라이머는 Oligo 5.0 (National Biosciences Inc., 미네소타주 플리마우쓰 소재) 또는 등록상표 Primer Express (PE Applied Biosystems Inc., 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 이용하여 설계되었다. 프로브/프라이머 세트의 설계 규칙은 하기와 같이 요약된다. (1) 바람직한 범위 50-150 bp를 갖는 최대 앰플리콘 크기 500 bp. (2) 프로브는 5' 말단에 G를 갖지 않고, 30-80%의 (G+C) 함량, 연속적 G는 3개 이하를 가지며, G들 보다는 C들을 더 많이 갖는 가닥에 기초하고, 포워드 또는 리버스 프라이머와 혼성화(중첩)되지 않으며, Tm=68-70℃를 갖는다. (3) Tm= 58-60℃를 갖는 프라이머를 설계하고, 프라이머의 3' 말단의 5개 뉴클레오티드는 단지 1 내지 2개의 G+C를 갖는다. 하기 실시예에 사용된 포워드 및 리버스 프라이머 및 프로브를 각각 표1a, 1b 및 1c에 열거하였다.

분석적 PCR

RT-PCR에는 AMV 역전사효소 및 Tfl DNA 폴리머라제 (프로메가사; 위스콘신주 마디손 소재)를 이용하는 Access RT-PCR 시스템을 사용하였다. 50㎕의 RT-PCR 반응물에는 10 ㎕의 AMV/Tfl 5x 반응 완충액, 3 mM MgSO₄, 200 μM dNTPS, 600 nM ROX 표준, AMV 역전사효소 5 유닛, Tfl DNA 폴리머라제 5 유닛, 200 nM 프로브, 100-300 nM 프라이머, 및 100 ng의 총RNA가 포함된다. RT-PCR 조건은 48℃에서 45분, 95℃에서 2분, 및 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 및 72℃에서 15초의 40회 싸이클이다. 표준 곡선은 풀된 어덜트 C57BL/6 심실로부터 제조된 총 RNA를 반응당 400 ng, 100 ng, 25 ng, 6.25 ng으로 사용하여 유전자를 검정하는 매번 얻어졌다. 시험 RNA의 양은 풍부한 유전자에 대하여는 1 ng의 총 RNA로 감소될 수도 있고, 희귀한 전사물의 경우에는 1 μg으로 증가될 수도 있어서 표준 곡선은 이에 따라서 조정된다. 반응액을 모델 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems)상의 96웰 플레이트에 달리게 하고, 결과를 서열검출 소프트웨어 (PE Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다.

상대적 RNA 등가치의 계산

각 시료내 대조군 RNA의 등가양을 각 유전자에 대한 대조군 RNA 희석의 러닝에 기초하여 Ct 대 log₁₀[RNA](ug/반응) 도표로부터 계산한다. 절대적 카피수가 없기 때문에, 이 양은 표준 곡선에 사용된 풀된 심실 RNA에 상대적인 양이고, 상대적 RNA 등가치이다. GAPDH를 입력 시료 RNA내 차등을 정규화하기 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. 각 시료를 일련의 검사의 초기 및 이어서 말기에 GAPDH 검사에서 런닝하였다. 희석된 RNA는 검사 완료를 위하여 4℃에서 3주까지 보관될 수 있다. 이 기간동안에는 GAPDH Ct값에는 변화가 없다. 각 반응에서 입력 RNA의 양은 GAPDH 표준 곡선에 기초하여 100 ng으로 교정되었다.

통계방법

등록상표 Statview 소프트웨어(Abacus Concept, Inc. 캘리포니아주 버클리 소재)를 이용하여 통계적 파라미터를 계산하였다. 동일한 변이를 가정하는 투-테일드 티 테스트(Two-tailed t test)를 이용하여 두 그룹간을 비교하였다. 복수개의 그룹의 경우, 셰페 테스트(Scheffe's test)를 가지고 포스트 hoc 분석으로, 변이의 분석이 이용되었다. 그룹간 불균일 변이의 효과를 최소화하기 위하여 RNA 등가치의 로그10값을 이용하였다. 0.05 미만의 p값은 유의한 것으로 간주되었다.

＜실시예 1＞

생후(postnatal) 심근층에서의 발현 분석

본 실험의 목적은 본원에 개시된 정량적 역 전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 검사를 심장 유전자 발현을 분석하기 위하여 이용하는 것이다.

본원에서 연구된 유전자는 생쥐 및 기타 종에서의 심장 비대 모델로부터 심장 유전자 발현상의 공지된 상이점을 바탕으로 선택하였고, 심장 기능에 영향을 미칠 수 있는 후보 유전자의 수도 시험하였다(표 2). 나트륨배설증가 펩티드, 배아 수축성 단백질, Ca⁺⁺-조절 단백질, 미토콘드리아 효소, 핵 인자, 매트릭스 단백질 및 신호 전달 분자를 포함하는 심장 유전자의 대표적인 카테고리들을 시험하였다.

C57BL/6 생쥐로부터 얻어진 심실 조직에서 심장 유전자 발현에 대한 나이 및 성별에 따른 효과를 시험하였다. 성숙한 젊은(3 개월) 수컷과 암컷 및 나이를 먹은 (18개월) 수컷 및 암컷 군(각 군 당 4 내지 6 개체의 동물)간의 체중(BW) 및 심실의 중량(VW)을 비교하였다. VW 또는 VW/BW 중량은 각 군 사이에 상이하지 않았는데(데이터 기재하지 않음), 이는 체중이 증가함에 따라 심근층도 비례해서 성장한다는 것을 반영한다. 검사된 29개의 유전자 중에서, 단지 α-골격 액틴 만이 성숙한 군사이에서 상이점을 보였다. 어덜트 수컷은 상응하는 암컷에 비하여 α-골격 액틴 mRNA의 수준이 높았는데(3.5 배, p = 0.003), 젊은 동물에서는 이 차이가 통계적 유의성을 가질 만큼 크지는 않았다(2.8배, p = 0.064).

신생아(neonatal) 유전자 발현은 1 일된 심실들로부터 결정하였고, 이를 성숙한 개체에 대한 데이터(성별 및 나이 두가지 모두를 나타내는 개별적인 측정치 모두로부터 모아진 데이터)와 비교하여, 유전자 발현의 배발생 패턴을 반영하는 조직인 생후 심근층과 특이적으로 연관된 상이점을 식별하였다. 7 종의 유전자에 대한 mRNA 발현양은 신생아 심근층 및 성숙한 개체 심근층 사이에서 상이점을 나타내지 않았고, 15 종의 유전자는 생후 심실에서 증가하였고, 3 종의 유전자는 성숙한 개체에 비하여 억제되었다(표 2).

정규화된(normalized) RNA 등가치는 표시된 곳을 제외하고는 1일 신생아 개체들 및 성숙 개체 평균을 위한 16 마리의 동물들로부터의 22 내지 28개의 심실의 세개의 풀로부터 얻었다. 수치는 평균 ±SD이다.

＜실시예2＞

압력 과부하 비대

대동맥 수축에 의한 급성 POL에 응답하는 생쥐 심실의 유전자 발현 분석을 모의 심실과 비교하여 수행하였다. 이러한 심장 비대 생쥐 수술 모델에서, 좌심실이 집중적인 비대를 진행함에 따라, 수축기의 벽의 압박을 정상화하기 위하여 VW/BW이 급격히 증가한다. 대동맥 수축에 기인한 증가된 기계적 부하가 비대 응답을 가져오는 일차적인 자극으로 생각되지만, 병소 괴사에 기인한 벽 압박도 역할을 할 수 있다. 수술후 1주일까지, 12주일 성숙된 암컷 C57BL/6 생쥐의 VW/BW에 30%의 증가가 있었다(표 3). 총 20개의 유전자로부터의 mRNA가 유도되거나 억제된 것으로 확인되었다(표 4)

(값들은 평균±SD이다. NPR-A (0.29), ET-1 (0.67), ETAR (0.54), VEGF (0.64), 심장 액틴 (0.09), VSM 액틴 (0.39), MLP (0.55), TGFβ1 (0.12) 및 GATA-4 (0.51)에서는 통계학적으로 유의한 변화(괄호안은 p값)이 발견되지 않았다.)

신생아 비대와 적응성 비대를 직접 비교하기 위하여, 통계적으로 유의한 유전자 발현의 차이(표 2 및 4)를 거울-상 플롯(도 2A 및 도 2B)에서 함께 그래프로 나타내었다. 유전자들은 왼쪽에 기재되어 있고, 수치들은 표2와 4에서 취해진다. 통계적으로 유의하지 않은 비율은 비교 목적을 위하여 일의 수치가 주어진다. 두 가지 사례중 하나 이상에서 유의한 변화를 보이는 모든 유전자들을 도시하였다.

이들 데이터는 본원에 개시되고 청구된 방법이 유전자 발현을 정량화하고 소량의 총 RNA로 유전자 발현의 변화를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다는 사실을 증명한다. 이러한 정량적 측정을 가능하게 하는 능력은 일련의 표본에서 일단의 유전자들의 발현을 정량화하는데 상기 검사를 신속하게 사용할 수 있게 한다.

따라서, 본원에서 유전자의 발현양을 결정하는 방법이 제공된다. 본 발명의 바람직한 실시태양이 어느정도 상세하게 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위에 의하여 정의되는 바와 같이 명백한 변형이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 가능하다는 것이 이해된다.

Sequence Listing

＜110＞ Genentech, Inc.

＜120＞ QUANTITATIVE ANALYSIS OF GENE EXPRESSION

＜130＞ P1261PCT

＜140＞ PCT/US99/08968

＜141＞ 1999-04-23

＜160＞ 90

＜210＞ 1

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 1

catcaccctg ggcttcttcc t 21

＜210＞ 2

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 2

gcggcatgga tctcctgaag g 21

＜210＞ 3

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 3

tggagatcgg gacactgatt t 21

＜210＞ 4

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 4

cacttcaatt ggacggctcg 20

＜210＞ 5

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 5

gctgttcctg ttcttccttg atgg 24

＜210＞ 6

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 6

gtttaagctc ttggcaggac 20

＜210＞ 7

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 7

agctgcgaag gatcatcgga tcta 24

＜210＞ 8

＜211＞ 23

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 8

gctggcaggc acagttacat att 23

＜210＞ 9

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 9

agcagcatag gcaaggcaga t 21

＜210＞ 10

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 10

aaggagagca gaagtcccat ga 22

＜210＞ 11

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 11

tgtcgtcttc acacctcttc tacct 25

＜210＞ 12

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 12

agacaccatg tgcgacgaag 20

＜210＞ 13

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 13

tatgccaaca atgtcctat 19

＜210＞ 14

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 14

aaacaggaat acgacgaag 19

＜210＞ 15

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 15

agattactgc tctggctcct a 21

＜210＞ 16

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 16

ccaatgagta ccgcgtgaa 19

＜210＞ 17

＜211＞ 18

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 17

atgtgccgga ccttggaa 18

＜210＞ 18

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 18

aggcacaacg tggctcttct 20

＜210＞ 19

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 19

agcaaccctt ccaaattctc t 21

＜210＞ 20

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 20

tggagctggt gaaacggaag c 21

＜210＞ 21

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 21

atgcagccac cttggtcagt c 21

＜210＞ 22

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 22

ggggctggcg ctgtgacaac t 21

＜210＞ 23

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 23

caaagttcca gttgtgaagg a 21

＜210＞ 24

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 24

cgagatggga cgggacact 19

＜210＞ 25

＜211＞ 17

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 25

ccgcgagtgc gtgaact 17

＜210＞ 26

＜211＞ 23

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 26

tccatgagca agatgtttgt gaa 23

＜210＞ 27

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 27

cgatcaccga agccaaggtc tc 22

＜210＞ 28

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 28

ctggaggcta tcaagcgtga cttt 24

＜210＞ 29

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 29

tcggaggcta tggattcaac 20

＜210＞ 30

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 30

atgttccagt atgactccac tcacg 25

＜210＞ 31

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 31

tgggctccaa tcctgtcaat c 21

＜210＞ 32

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 32

cccaggcaga gtcagaaact g 21

＜210＞ 33

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 33

ctggccctcc gtggttagca g 21

＜210＞ 34

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 34

gccgcagata tacacaatgc g 21

＜210＞ 35

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 35

aaattccagc acttcttgtc tttttggtg 29

＜210＞ 36

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 36

agaatccaga tggagacgat 20

＜210＞ 37

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 37

ttggcatagc ttcgtgagga 20

＜210＞ 38

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 38

cggtattcca tagcggtata gacag 25

＜210＞ 39

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 39

cgactggcaa gtttatacag g 21

＜210＞ 40

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 40

cacaggacgg cttgaagatg t 21

＜210＞ 41

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 41

ccacacacga actgaagagc at 22

＜210＞ 42

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 42

ccgtccccag aatccaacac a 21

＜210＞ 43

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 43

cacaatacgg tcatcctgaa 20

＜210＞ 44

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 44

caggaatgat ttggaaagga 20

＜210＞ 45

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 45

caaagaaagg gtgtaaaacg 20

＜210＞ 46

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 46

acagtcatgc cgggatgat 19

＜210＞ 47

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 47

cctcgggtta gctgagagat ca 22

＜210＞ 48

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 48

agctgggaat aggtctcctt ca 22

＜210＞ 49

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 49

agctccccat ccttgtcagt g 21

＜210＞ 50

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 50

gtagagttcc acatgttgct ccaca 25

＜210＞ 51

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 51

aggccagggt caccatttct c 21

＜210＞ 52

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 52

tctaacggca tgaagcactc a 21

＜210＞ 53

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 53

cagcctccat taacttctcc a 21

＜210＞ 54

＜211＞ 19

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 54

ctcaccctcg gcattacga 19

＜210＞ 55

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 55

cgcttctgtg gcttgatgag 20

＜210＞ 56

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 56

tcccgaatga cagacataat cttct 25

＜210＞ 57

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 57

gtggcggcag ctcttcacag a 21

＜210＞ 58

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 58

atgtggccgt gagtgaggtt tc 22

＜210＞ 59

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 59

cttttcaatg tgctcacgag 20

＜210＞ 60

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 60

gaagacacca gtagactcca cgaca 25

＜210＞ 61

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 61

atttcaagaa cctgctagac cacctgga 28

＜210＞ 62

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 62

tccttcggtc tcaaggcagc accctcc 27

＜210＞ 63

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 63

ccacctcctg acatccctaa atgtggct 28

＜210＞ 64

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 64

cagcaacctc agtgtgcagc accagg 26

＜210＞ 65

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 65

aggttcttcc aggtccaagc gttcctt 27

＜210＞ 66

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 66

ccactgctct gtacctgtcc acactg 26

＜210＞ 67

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 67

tgagcagaat ctactccact ggcaaggtct 30

＜210＞ 68

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 68

taaatctcgc cctggctgac ttatgctt 28

＜210＞ 69

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 69

ttgctctccg catggcaacg tggaatca 28

＜210＞ 70

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 70

taccagcgaa gctactgccg tccaatt 27

＜210＞ 71

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 71

tcaccagctc caccacagct ggac 24

＜210＞ 72

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 72

tgtggctatc caggcggtgc tgtccct 27

＜210＞ 73

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 73

atcgtatgca aaaggaaatc actgcactg 29

＜210＞ 74

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 74

acttagaagc atttgcggtg gacga 25

＜210＞ 75

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 75

cggactcatc gtactcctgc ttgctg 26

＜210＞ 76

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 76

tgacccgagg caagctctcc taca 24

＜210＞ 77

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 77

cagcgttctg tcaatgacct caccag 26

＜210＞ 78

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 78

tgatcccatc cctgttctgg tcaatg 26

＜210＞ 79

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 79

aagacctgct tccgctgtgc catctgt 27

＜210＞ 80

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 80

ccgcgtgcta atggtggacc gcaacaa 27

＜210＞ 81

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 81

agccttctac acctgctcct gtgcttc 27

＜210＞ 82

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 82

ctgctgaacc cagtcccgat ggcacca 27

＜210＞ 83

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 83

ccgtccgttt atactcatcg cagac 25

＜210＞ 84

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 84

ctgccagact accaccacca cgctg 25

＜210＞ 85

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 85

ccagacgcca ctgtggagac gagac 25

＜210＞ 86

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 86

catccgagtt ggaagtacca aggtccc 27

＜210＞ 87

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 87

agtgcaatac ctcactcgct cggctatca 29

＜210＞ 88

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 88

agagcaggca gcaatctgta agcgacctt 29

＜210＞ 89

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 89

tggcgtccct catcagcttc tccac 25

＜210＞ 90

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ mus musculus

＜400＞ 90

aagcccatca ccatcttcca ggagcgaga 29

Claims

(a) 하기의 단계를 포함하는 방법에 의한, 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 관심 유전자에 대한 표준 곡선을 제조하는 단계:

(i) 알려진 농도의 총 RNA를 갖는 총 RNA추출물로부터 역전사물(reverse transcript) 표준 연속 희석물의 제조 단계,

(ii) 검사물의 성분으로서 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 혼성화 프로브 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 함유하고, 상기 프라이머 및 프로브는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물의 세그먼트 또는 그의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하여 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있으며, 상기 프라이머는 연장 반응을 개시할 수 있고, 상기 DNA 폴리머라제는 프라아머 연장 반응을 촉매할 수 있으면서 5'-엑소뉴클리아제 활성을 가지는, 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사를 이용한 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원의 증폭 단계,

(iii) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 PCR 각 사이클 동안 실시간으로 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사로부터 형광 강도의 모니터 단계,

(iv) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 역치 사이클(Ct)의 결정 단계,

(v) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원내 총 RNA양의 로그값에 대한 Ct의 도시로부터 RNA 등가치를 결정하는 단계, 및

(vi) 이 RNA 등가치를 정규화하여 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치 표준 곡선을 제공하는 단계;

(b) RT-PCR내 시료를 검사하여 (a) 단계에서 제조한 표준곡선으로부터 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정하는 단계,

를 포함하는, 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정함으로써 생물학적 시료내 관심 유전자의 발현을 정량적으로 측정하여 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정규화 단계 (a)(vi)가 총 RNA 추출물의 알려진 RNA 농도 및 역전사물 연속 희석물의 각 구성원에 있어서 하우스키핑 유전자에 대하여 결정된 Ct의 총 RNA 양의 로그값에 대한 도시에 기초하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 역전사하여 총 RNA 역전사물을 제공하고 이 총 RNA 역전사물을 희석하여 제조되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 희석하여 총 RNA 추출물의 연속적 희석물을 제공하고 이 총 RNA 추출물 연속 희석물을 역전사하여 제조되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 총 RNA 추출물이 생물학적 시료의 총 RNA 추출물인 방법.
(a) 하기의 단계를 포함하는 방법에 의한, 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용한 관심 유전자에 대한 표준 곡선의 제조 단계:

(i) 알려진 농도의 총RNA를 갖는 총RNA추출물로부터 역전사물 표준 연속 희석물의 제조 단계,

(ii) 검사물의 성분으로 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 혼성화 프로브 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 함유하고, 상기 프라이머 및 프로브는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물의 세그먼트 또는 그의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하여 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있으며, 상기 프라이머는 연장 반응을 개시할 수 있고, 상기 DNA 폴리머라제는 프라아머 연장 반응을 촉매할 수 있으면서 5'-엑소뉴클리아제 활성을 가지는, 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사를 이용한 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원의 증폭 단계,

(iii) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 PCR 각 사이클 동안 실시간으로 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사로부터 형광 강도의 모니터 단계,

(iv) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 역치 사이클(Ct)의 결정 단계,

(v) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원내 총 RNA양의 로그값에 대한 Ct의 도시로부터 RNA 등가치를 결정하는 단계, 및

(vi) 이 RNA 등가치를 정규화하여 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치 표준 곡선의 제공 단계;

(b) RT-PCR내 제1 및 제2 미지 시료를 검사하여 (a) 단계에서 제조한 표준곡선으로부터 제1 및 제2 미지 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정하는 단계,

를 포함하는, 제1 비처리 시료 및 제2 처리 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정함으로써, 시료내 관심 유전자 발현의 정량적 측정에 미치는 처리의 효과를 결정하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 정규화 단계 (a)(vi)가 총 RNA 추출물의 알려진 RNA 농도 및 역전사물 연속 희석물의 각 구성원에 있어서 하우스키핑 유전자에 대하여 결정된 Ct의 총 RNA 양의 로그값에 대한 도시에 기초하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 역전사하여 총 RNA 역전사물을 제공하고 이 총 RNA 역전사물을 희석하여 제조되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 희석하여 총 RNA 추출물의 연속 희석물을 제공하고 이 총 RNA 추출물 연속 희석물을 역전사하여 제조되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 총 RNA 추출물이 생물학적 시료의 총 RNA 추출물인 방법.
제6항에 있어서, 상기 처리가 생리학적 처리, 약리학적 처리, 병리상태의 발생, 외과적 처리, 유전적 처리, 이들의 조합 및 이에 대한 적응적 응답으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
(a) 하기의 단계를 포함하는 방법에 의한, 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 각각의 관심 유전자에 대한 표준 곡선의 제조 단계:

(i) 알려진 농도의 총RNA를 갖는 총RNA추출물로부터 역전사물 표준 연속 희석물의 제조 단계,

(ii) 검사물의 성분으로 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 혼성화 프로브 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 함유하고, 상기 프라이머 및 프로브는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물의 세그먼트 또는 그의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하여 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있으며, 상기 프라이머는 연장 반응을 개시할 수 있고, 상기 DNA 폴리머라제는 프라아머 연장 반응을 촉매할 수 있으면서 5'-엑소뉴클리아제 활성을 가지는, 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사를 이용한 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원의 증폭 단계,

(iii) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 PCR 각 사이클 동안 실시간으로 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사로부터 형광 강도의 모니터 단계,

(iv) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 역치 사이클(Ct)의 결정 단계,

(v) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원내 총 RNA양의 로그값에 대한 Ct의 도시로부터 RNA 등가치의 결정 단계, 및

(vi) 이 RNA 등가치를 정규화하여 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치 표준 곡선의 제공 단계;

(b) 각 관심 유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 이용하여 RT-PCR내 시료를 검사하여 (a) 단계에서 제조한 표준곡선으로부터 시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정하는 단계,

를 포함하는, 시료내 각 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정함으로써 시료내 일군의 관심 유전자의 발현을 정량적으로 측정하여 결정하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 정규화 단계 (a)(vi)가 총 RNA 추출물의 알려진 RNA 농도 및 역전사물 연속 희석물의 각 구성원에 있어서 하우스키핑 유전자에 대하여 결정된 Ct의 총 RNA 양의 로그값에 대한 도시에 기초하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 역전사하여 총 RNA 역전사물을 제공하고 이 총 RNA 역전사물을 희석하여 제조되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 희석하여 총 RNA 추출물의 연속적 희석물을 제공하고 이 총 RNA 추출물 연속 희석물을 역전사하여 제조되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 총 RNA 추출물이 생물학적 시료의 총 RNA 추출물인 방법.
(a) 하기의 단계를 포함하는 방법에 의한, 역전사효소-5'-엑소뉴클리아제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 각 관심 유전자에 대한 표준 곡선의 제조 단계:

(i) 알려진 농도의 총RNA를 갖는 총RNA추출물로부터 역전사물 표준 연속 희석물의 제조 단계,

(ii) 검사물의 성분으로 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 혼성화 프로브 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 함유하고, 상기 프라이머 및 프로브는 관심 유전자가 암호화하는 mRNA의 역전사물의 세그먼트 또는 그의 상보가닥과 특이적으로 혼성화하여 안정적 하이브리드 이중가닥을 형성할 수 있으며, 상기 프라이머는 연장 반응을 개시할 수 있고, 상기 DNA 폴리머라제는 프라아머 연장 반응을 촉매할 수 있으면서 5'-엑소뉴클리아제 활성을 가지는, 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사를 이용한 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원의 증폭 단계,

(iii) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 PCR 각 사이클 동안 실시간으로 5'-엑소뉴클리아제 PCR 검사로 인한 형광 강도의 모니터 단계,

(iv) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원에 대하여 역치 사이클(Ct)의 결정 단계,

(v) 역전사물 표준 연속 희석물의 각 구성원내 총 RNA양의 로그값에 대한 Ct의 도시로부터 RNA 등가치의 결정 단계, 및

(vi) 이 RNA 등가치를 정규화하여 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치 표준 곡선의 제공 단계;

(b) RT-PCR내 제1 및 제2 미지시료를 검사하여 (a) 단계에서 제조한 표준곡선으로부터 제1 및 제2 미지시료내 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정하는 단계,

를 포함하는, 제1 비처리 시료 및 제2 처리된 시료내 각각의 관심 유전자에 대한 정규화된 RNA 등가치를 결정함으로써 일군의 관심 유전자들의 발현의 정량적 측정에 미치는 처리의 효과를 결정하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 정규화 단계 (a)(vi)가 총 RNA 추출물의 알려진 RNA 농도 및 역전사물 연속 희석물의 각 구성원에 있어서 하우스키핑 유전자에 대하여 결정된 Ct의 총 RNA 양의 로그값에 대한 도시에 기초하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 역전사하여 총 RNA 역전사물을 제공하고 이 총 RNA 역전사물을 희석하여 제조되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 역전사물 표준 연속 희석물이 총 RNA 추출물을 희석하여 총 RNA 추출물의 연속적 희석물을 제공하고 이 총 RNA 추출물 연속 희석물을 역전사하여 제조되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 총 RNA 추출물이 생물학적 시료의 총 RNA 추출물인 방법.
제17항에 있어서, 상기 처리가 생리학적 처리, 약리학적 처리, 병리상태의 발생, 외과적 처리, 유전적 처리, 이들의 조합 및 이에 대한 적응적 응답으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.