JP6445426B2 - ヌクレオチド配列を決定する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2012年5月10日に提出された米国特許仮出願第61/645,364号および2012年8月3日に提出された第61/679,302号の恩典を主張する。

配列表
本出願は、EFS-Webを通してASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2013年3月8日に作製された該ASCIIのコピーの名称は、030258-074962-PCT_SL.txtであり、サイズは、41,722バイトである。

政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号5R21CA161590の下で連邦政府の資金援助によって行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

技術分野
本明細書において記述される技術は、オリゴヌクレオチド配列を決定する方法に関する。

背景
次世代シークエンシングの前にターゲットエンリッチメントを行うことは、全ゲノム、全エクソーム、および全トランスクリプトームシークエンシングより費用効果が高く、それゆえ、研究開発および臨床適用の両方の幅広い実践にとってより現実的である。たとえば、ターゲットエンリッチメントアプローチによって与えられる高いカバレッジ深度によって、がんにおける体細胞変異の評価にとって重要な特色である、対立遺伝子計数（遺伝子発現およびコピー数評価において）および低頻度変異の検出に関してより広いダイナミックレンジが可能となる。次世代シークエンシングのための現在のエンリッチメントプロトコールの例には、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉アッセイ（TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent）、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくアッセイ（HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina；エマルジョン／デジタルPCR, Raindance）が挙げられる。ハイブリダイゼーションに基づくアプローチは、捕捉プローブによってカバーされるターゲット配列のみならず、シークエンシング能を消費する付近のオフターゲット塩基も捕捉する。加えて、これらの方法は、比較的時間がかかり、労力がかかり、比較的低レベルの特異性を有する。PCR増幅に基づくアプローチは単純かつ迅速であるが、通常の設計では、ターゲット座に隣接するフォワードおよびリバースプライマーの両方を用いる必要がある。特に、未知の融合パートナーによるゲノム再構成を検出するためには、PCRは適用できない。

概要
本明細書において記述される技術は、オリゴヌクレオチド配列を決定する方法に向けられる。いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、配列をシークエンシングする前にターゲット配列を濃縮することに関する。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する方法であっ（a）既知のターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸を、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターにライゲートする段階；（b）ターゲット核酸の一部分およびユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖を第一のアダプタープライマーおよび第一のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；（c）段階（b）から得られたアンプリコンの一部分を、第二のアダプタープライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；（d）第一および第二のシークエンシングプライマーを用いて段階（c）の増幅された一部分をシークエンシングする段階を含み；ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターが、第一のライゲート可能な二本鎖および第二の不対合末端を含み；ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターが、ブロック鎖および増幅鎖を含み；ブロック鎖が、5'二本鎖部分を含み；増幅鎖が、5'不対合部分、3'二本鎖部分、および3' Tオーバーハングを含み；増幅鎖が、第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含み；ブロック鎖および増幅鎖の二本鎖部分が、実質的に相補的であり、3' Tオーバーハングを含む第一のライゲート可能な二本鎖末端を形成し；二本鎖部分が、ライゲーション温度で二本鎖型を保つのに十分な長さであり；第一のターゲット特異的プライマーが、アニーリング温度でターゲット核酸の既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールすることができる核酸配列を含み；第二のターゲット特異的プライマーが、段階（b）から得られたアンプリコンに含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列の一部分に特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分と、第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む5'部分とを含み、第二のターゲット特異的プライマーが、第一のターゲット特異的プライマーに関してネスト化しており；第一のアダプタープライマーが第一のシークエンシングプライマーの5'部分と同一である核酸配列を含み；ならびに第二のアダプタープライマーが、第一のシークエンシングプライマーの一部分と同一である核酸配列を含み、第一のアダプタープライマーに関してネスト化している、方法に関する。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖はさらに、増幅鎖の5'不対合部分と実質的に相補的でない3'不対合部分を含みうる；およびブロック鎖の3'不対合部分は、いずれのプライマーとも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない。いくつかの態様において、第二のアダプタープライマーは、第一のアダプタープライマーに関して少なくとも3ヌクレオチド、ネスト化し得る。いくつかの態様において、第一および第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む増幅鎖の一部分は、少なくとも部分的に、増幅鎖の5'不対合部分に含まれうる。

いくつかの態様において、第一のターゲット特異的プライマーはさらに、プライマーのいずれのいかなる他の一部分とも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分を含みうる。いくつかの態様において、第一のターゲット特異的プライマーはさらに、アニーリング温度でプライマーまたはその相補物のいずれのいかなる他の部分にも特異的にアニールしない高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分を含みうる。いくつかの態様において、第二のアダプタープライマーは、完全長の第一のシークエンシングプライマーと同一でありうる。いくつかの態様において、既知のターゲットに特異的にアニールするターゲット特異的プライマーの一部分は、PCR緩衝液中で約65℃の温度で特異的にアニールすることができる。

いくつかの態様において、方法はさらに、段階（a）の前に、核酸を機械的に剪断する段階；核酸を末端修復に供する段階；核酸をリン酸化に供する段階；および核酸をアデニル化に供する段階を含みうる。いくつかの態様において、試料は、ゲノムDNAを含みうる。いくつかの態様において、試料は、RNAを含みえて、方法はさらに、試料を逆転写酵素レジメンに供する第一の段階を含みうる。いくつかの態様において、逆転写酵素レジメンは、ランダムヘキサマーの使用を含みうる。

いくつかの態様において、既知のターゲット配列は、遺伝子再構成に含まれうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成は、ゲノムDNA、RNA、およびcDNAからなる群より選択される核酸中に存在しうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成はがん遺伝子を含みうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成は、融合がん遺伝子を含みうる。

いくつかの態様において、核酸産物は、次世代シークエンシング法によってシークエンシングされうる。いくつかの態様において、次世代シークエンシング法は、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454; Massively Parallel Signature Sequencing、固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング；およびDNAナノボールシークエンシングからなる群より選択される方法を含みうる。いくつかの態様において、第一および第二のシークエンシングプライマーは、選択された次世代シークエンシング法と適合性である。

いくつかの態様において、方法は、試料または試料の個別の部分に、複数セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーを接触させる段階を含みうる。いくつかの態様において、方法は、複数セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーを、試料を含む1つの反応混合物に接触させる段階を含みうる。いくつかの態様において、複数セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、個別の遺伝子に含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、既知のターゲットヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、既知のターゲットヌクレオチド配列を含む1つの遺伝子の異なる部分に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、既知のヌクレオチドターゲット配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、複数の第一のターゲット特異的プライマーは、同一の5'タグ配列部分を含みうる。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターはさらに、バーコード部分を含みうる。いくつかの態様において、多数の試料をそれぞれ、ユニークバーコード部分を有するユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターに接触させることができ、試料は段階（a）の後にプールされる。

いくつかの態様において、各増幅段階は、長さが5サイクルから20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含みうる。いくつかの態様において、ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーは、それらが約61から72℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計されうる。いくつかの態様において、ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーは約65℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計されうる。

いくつかの態様において、試料は、対象から得られた生物試料を含みうる。いくつかの態様において、試料は、遺伝子変化に関連する疾患の処置を必要とする対象から得られうる。いくつかの態様において、疾患はがんでありうる。いくつかの態様において、試料は、腫瘍細胞集団を含みうる。いくつかの態様において、試料は腫瘍生検を含みうる。いくつかの態様において、がんは肺がんでありうる。

いくつかの態様において、既知のターゲット配列は、疾患関連遺伝子に含まれうる。いくつかの態様において、既知のターゲット配列は、試料中の遺伝子再構成産物に含まれうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成産物は、がん遺伝子でありうる。

いくつかの態様において、既知のターゲット配列は、ALK；ROS1;およびRETからなる群より選択される遺伝子からの配列を含みうる。いくつかの態様において、第一のターゲット特異的プライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも1つのセットは、SEQ ID NO: 5と6；SEQ ID NO: 7と8；SEQ ID NO: 9と10；SEQ ID NO: 11と12；SEQ ID NO: 13と14；SEQ ID NO: 15と16；SEQ ID NO: 17と18；SEQ ID NO: 19と20；SEQ ID NO: 21と22；SEQ ID NO: 23と24；SEQ ID NO: 25と26；SEQ ID NO: 27と28；SEQ ID NO: 29と30；SEQ ID NO: 31と32；SEQ ID NO: 33と34；SEQ ID NO: 35と36;およびSEQ ID NO: 37と38からなる群より選択されうる。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にALKの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示されうる。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にROS1の遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ROS阻害剤；ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示されうる。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にRETの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示されうる。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、がんの処置を必要とする対象から得られた腫瘍試料において、本明細書において記述される方法に従う1つまたは複数のがん遺伝子再構成の存在を検出する段階；検出された任意のがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効であるがんの処置を投与する段階を含む、がんを処置する方法に関する。いくつかの態様において、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置は、ALKがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効でありうる。いくつかの態様において、ROS1阻害剤；ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置は、ROS1がん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効でありうる。いくつかの態様において、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置は、RETがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効でありうる。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、対象から得られた腫瘍試料において、本明細書において記述される方法に従うがん遺伝子再構成の存在を検出する段階を含む、がんの処置を必要とする対象が所定の処置に応答するか否かを決定する方法であって、がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象が、がん遺伝子再構成産物を標的とする処置に応答性であると決定される方法に関する。

いくつかの態様において、ALKがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象は、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性でありうる。いくつかの態様において、ROS1がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象は、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性でありうる。

いくつかの態様において、RETがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象は、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置に対して応答性であろう。

いくつかの態様において、がんは肺がんでありうる。

標的化RNAおよびDNAシークエンシングのためのライブラリ構築の例の概略図を示す。1）二本鎖cDNA合成の標準的な技法を、開始材料としてFFPE標本からの総核酸を用いて適用する。または、開始材料は、剪断されたgDNAでもありうる。2）クリーンアップ後、二本鎖cDNAまたはgDNAを、末端修復およびdAテーリングに供した後、そのあいだにクリーンアップを行わずに直ちに半切断Y字アダプターのライゲーションを行う。3）SPRIクリーンアップの後、ライゲートした試料を、多重遺伝子特異的プライマー（GSP1）およびIon Torrent短鎖フォワードプライマーA 5' 20-mer（A20）を用いて、65℃のアニーリング温度で14サイクルのPCR増幅に供する。4）第二のSPRIクリーンアップの後、試料を、IonTorrentリバースプライマー（P1_GSP2s）およびフォワードプライマーA（完全長30-mer）によってタグをつけた多重ネステッド遺伝子特異的プライマー（GSP1の3'下流で同じ方向）を用いて、65℃のアニーリング温度でさらに14サイクルのPCR増幅に供する。5）最終の第三のSPRIクリーンアップの後、産物は、下流のエマルジョンPCRおよびシークエンシングの準備ができたIon Torrentライブラリである。段階2の後に試料をプールする段階を行ってもよい。 ゲノムDNA（イントロン-エキソン境界に及ぶ）、cDNA（エキソンに及ぶ）、および融合cDNA（エキソン34において、ここに示されていない融合パートナーSLC34A2上にマッピング）に対応するリードを含むROS1配列の1回のシークエンシング実行における異なるプライマー（ドット）伸長産物を証明するマッピングの結果を示す。91.8％の特異性（127,446/138,787）が得られた。 図3Aは、例としてROS1を用いるネステッドプライマーターゲティング戦略の概略図を示す。アッセイターゲットパネルは、ROS1、ALKおよびRETに関して全体で17対のGSP1およびGSP2を含む。図3Bは、gDNAおよびcDNA鋳型を用いて起こりうるタイプの伸長産物の表示を示す。 図4Aは、Integrative Genomics Viewerを用いたリードマッピングの可視化を示す。 図4Bは2つの選択的スプライスされた融合配列の配列を示す。 図4Cは、エキソン、フレーム、および融合型のリードのカバレッジ詳細のアノテーション付与を行った関係遺伝子における融合転写物を報告する要約表を示す。 例としてのシークエンシング実行の結果を示す。 それぞれ、ALKおよびRET配列のシークエンシング実行結果の例を示す。 それぞれ、ALKおよびRET配列のシークエンシング実行結果の例を示す。 本明細書において記述される標的化シークエンシングアプローチの概略図を示す。 例示的なユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの概略図を示す。

詳細な説明
本明細書において記述される技術の態様は、オリゴヌクレオチド配列を決定する（すなわち、シークエンシングする）方法に関する。いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、シークエンシング段階の前にターゲット配列を濃縮する方法に関する。いくつかの態様において、濃縮されるターゲット配列の1つの末端の配列は、シークエンシング段階の前まで既知ではない。

便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語およびフレーズの意味を以下に提供する。それ以外であると示している場合を除き、または本文から明白である場合を除き、以下の用語およびフレーズは、以下に提供される意味を含む。本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって制限されることから、定義は、特定の態様の説明を助けるために提供されるのであり、特許請求される本発明を制限することを意図していない。それ以外であると定義されている場合を除き、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書において提供されるその定義のあいだに明白な相違がある場合、本明細書において提供される定義が優先するであろう。

便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語を以下にまとめて示す。

「減少する（decrease）」、「減少した（reduced）」、「減少（reduction）」、または「阻害する（inhibit）」という用語は全て、本明細書において、一般的に統計学的に有意な量の減少を意味するために用いられる。しかし、誤解を防ぐために、「減少した」、「減少」、「減少する」、または「阻害する」は、参照レベルと比較して少なくとも10％の減少、たとえば参照レベルと比較して少なくとも約20％の減少、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％、または100％までのおよび100％を含む減少（たとえば、参照レベルと比較して存在しないレベルまたは検出不能なレベル）、または10〜100％のあいだの任意の減少を意味する。マーカーまたは症状の文脈では、そのようなレベルの統計学的に有意な減少を意味する。減少はたとえば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％またはそれより多くの減少でありえて、好ましくはそのような障害を有しない個体に関する正常範囲内であると容認されるレベルへの減少である。

「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、「増強する（enhance）」、または「活性化する（activate）」という用語は全て、本明細書において一般的に統計学的に有意な量の増加を意味するために用いられる。誤解を防ぐために、「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、たとえば参照レベルと比較して少なくとも約20％の増加、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％、または100％までのおよび100％を含む増加、または10〜100％のあいだの任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍、または2倍から10倍のあいだの任意の増加、またはそれより多くの増加を意味する。

本明細書において用いられる「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、たとえばアカゲザルを含む。齧歯類は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、たとえばネコ、イヌ種、たとえばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、たとえばニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、たとえばマス、ナマズ、およびサケを含む。いくつかの態様において、対象は哺乳動物、たとえば霊長類、たとえばヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。

好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物は、たとえば肺がんの動物モデルを表す対象として都合よく用いられうる。対象は雄性または雌性でありうる。

対象は、処置を必要とする状態（たとえば、がん）、またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症に罹っているまたは有すると既に診断されているか、または同定されている、および任意で状態または状態に関連する1つもしくは複数の合併症に関する処置を既に受けている対象でありうる。または、対象は、状態（たとえば、がん）または状態に関連する1つもしくは複数の合併症を有するとこれまで診断されていない対象でもありうる。たとえば、対象は、状態に関するまたは状態に関連する1つもしくは複数の合併症に関する1つもしくは複数の危険因子を示す対象、または危険因子を示さない対象でありうる。

特定の状態に関する処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断されている、またはその状態を発症するリスクを有する対象でありうる。

本明細書において用いられる、「遺伝子の変化に関連する疾患」は、健康な野生型対象と比較して、少なくとも部分的に対象の遺伝子材料の変化、たとえば欠失、挿入、SNP、遺伝子再構成によって引き起こされる任意の疾患を意味する。疾患は、その変化が、対象が疾患を発症するリスクを増加させる場合、疾患（感染疾患、または感染成分を有する疾患を含む）に対する対象の感受性を増加させる場合、疾患関連分子の産生を引き起こす場合、または細胞を疾患にするもしくは異常にする場合（たとえば、がん細胞における細胞周期調節の喪失）、少なくとも部分的に、対象の遺伝子材料の変化によって引き起こされうる。疾患は、多数の遺伝子変化に関連しうる、たとえばがんでありうる。

本明細書において用いられる、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそのアナログの単位を組み入れる任意の分子、好ましくはポリマー分子を意味する。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかでありうる。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAの1つの鎖の核酸でありうる。または、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸でありうる。1つの局面において、鋳型核酸はDNAである。もう1つの局面において、鋳型はRNAである。適した核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適した核酸分子は、mRNAを含むRNAである。

本明細書において用いられる「単離された」または「一部分精製された」という用語は、核酸の場合、その天然起源において見いだされる核酸と共に存在するおよび／または細胞によって発現される場合には核酸と共に存在する少なくとも1つの他の成分（たとえば、核酸またはポリペプチド）から分離されている核酸を意味する。化学合成された核酸またはインビトロ転写／翻訳を用いて合成された核酸は「単離された」と見なされる。

「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に機能的に連結している場合に、インビトロまたはインビボでRNAに転写される（DNA）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後に調節領域、たとえば5'非翻訳（5' UTR）または「リーダー」配列、および3' UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）のあいだに介在配列（イントロン）を含みうる。

本明細書において用いられる、「相補的」という用語は、2つの所定のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が互いにアニールする場合に、DNAにおいてAがTと対を形成してGがCと対を形成し、およびRNAにおいてGがCと対を形成してAがUと対を形成するように、ヌクレオチド塩基G、A、T、C、およびUのあいだの水素結合による塩基対形成選択性の階層を意味する。本明細書において用いられる、「実質的に相補的」とは、第二のヌクレオチド配列に対して、分子の全長またはその一部分にわたって少なくとも90％の相補性を有する、たとえば90％相補的、95％相補的、98％相補的、99％相補的、または100％相補的である核酸分子またはその一部分（たとえば、プライマー）を意味する。本明細書において用いられる「実質的に同一」とは、第二のヌクレオチド配列に対して、分子の完全長またはその一部分にわたって少なくとも90％のアイデンティティ、たとえば90％のアイデンティティ、95％のアイデンティティ、98％のアイデンティティ、99％のアイデンティティ、または100％のアイデンティティを有する核酸分子またはその一部分を意味する。

本明細書において用いられる、標的核酸に対して特異的なプライマーの文脈において用いる場合の「特異的」は、プライマーがターゲット核酸にアニールして、その増幅を媒介するが、試料中に存在する非ターゲット配列にはアニールせず、その増幅を媒介しないアニーリング温度が存在するような、プライマーとターゲットのあいだの相補性のレベルを意味する。

本明細書において用いられる「増幅された産物」、「増幅産物」または「アンプリコン」は、ヌクレオチド配列において鋳型オリゴヌクレオチド配列および／またはその相補的配列に対応する特定のターゲット核酸鋳型鎖および／またはその相補的配列の一部分のコピーであるPCR反応から得られたオリゴヌクレオチドを意味する。増幅産物はさらに、プライマーに対して特異的で、ターゲット核酸および／またはその相補体の一部分である配列に隣接する配列を含みうる。本明細書において記述される増幅産物は、その個々の鎖について言及することができるものの、一般的に二本鎖DNAであろう。

本明細書において用いられる核酸分子の「一部分」は、その分子に含まれるヌクレオチドの近接するセットを意味する。一部分は、分子に含まれるヌクレオチドの全てまたはサブセットのみを含みうる。一部分は、二本鎖または一本鎖でありうる。

本明細書において用いられる、「処置する（treat）」、「処置（treatment）」、「処置する（treating）」、または「改善(amelioration)」という用語は、その目的が疾患または障害、たとえば肺がんに関連する状態の進行または重症度を逆転させる、軽減する、改善する、阻害する、遅らせる、または停止させることである治療的処置を意味する。「処置する」という用語は、状態、状態に関連する疾患または障害の少なくとも1つの有害な効果または症状を減少または軽減する段階を含む。処置は一般的に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少すれば「有効」である。または処置は、疾患の進行が減少または停止すれば、「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善のみならず、処置の非存在下で予想される場合と比較した症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅れを含む。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不能であるかによらず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または遅れ、疾患状態の改善または緩和、寛解（部分的または完全であるかによらず）、および／または死亡率の減少を含むがこれらに限定されるわけではない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用の除去を提供する段階（緩和的処置を含む）も含む。

「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を意味し、一般的に正常値より2標準偏差（2SD）下の、またはそれより低いマーカー濃度を意味する。

実施例以外において、またはそれ以外であると示している場合を除き、本明細書において用いられる成分または反応条件に関する量を表す全ての数値は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。百分率に関連して用いる場合の「約」という用語は、±1％を意味しうる。

本明細書において用いられる「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、方法または組成物にとって本質的である組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に関連して用いられ、本質的であるか否かによらず、明記されていない要素を含めることに対して制限がない。

「からなる（consisting of）」という用語は、態様のその記述において引用されていないいかなる要素も除外する、本明細書において記述される組成物、方法、および各々の成分を意味する。

本明細書において用いられる「本質的にからなる」という用語は、所定の態様にとって必要な要素を意味する。この用語は、その態様の基本的および新規または機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。

単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、本文が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き複数形を含む。同様に、「または」という用語は、本文が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き「および」を含むと意図される。本明細書において記述の方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本開示の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。省略語の「たとえば（e.g.）」は、ラテン語のたとえば（exempli gratia）に由来し、本明細書において非制限的な例を示すために用いられる。このため、省略語の「たとえば（e.g.）」は、「たとえば（for example）」という用語と同意語である。

細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)において見いだされうる。分子生物学における一般的な用語の定義はまた、Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.においても見いだされうる。

それ以外であると示している場合を除き、本発明は、たとえばその全ての全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); and Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995)において記述される標準的な技法を用いて行われた。

他の用語は、本明細書において本発明の様々な局面の説明の中で定義される。

本明細書において、既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する方法が記述される。従来のシークエンシング法は、無作為に（たとえば、「ショットガン」シークエンシング）またはプライマーを設計するために用いられる2つの既知の配列のあいだの配列情報を生成する。これに対し、本明細書において記述される方法により、いくつかの態様において、既知の配列の1つの領域の上流または下流のヌクレオチド配列を高レベルの特異性および感度で決定する（たとえば、シークエンシングする）ことが可能である。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、次世代シークエンシング技術を用いてヌクレオチド配列を決定する前に特異的ヌクレオチド配列を濃縮する方法に関する。いくつかの態様において、特異的ヌクレオチド配列を濃縮する方法は、ハイブリダイゼーションエンリッチメントを含まない。

いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、（a）既知のターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸にユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターをライゲートする段階；（b）ターゲット核酸の一部分およびユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖を、第一のアダプタープライマーおよび第一のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；（c）段階（b）から得られたアンプリコンの一部分を、第二のアダプタープライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；ならびに（d）第一および第二のシークエンシングプライマーを用いて段階（c）からの増幅部分をシークエンシングする段階を含む、既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する方法に関しうる。本明細書において用いられる、「ターゲット核酸」という用語は、決定される核酸配列および既知のターゲットヌクレオチド配列の両方を含む核酸分子を意味する。ターゲット核酸は、任意の長さの核酸でありえて、二本鎖または一本鎖でありうる。本明細書において用いられる「既知のターゲットヌクレオチド配列」という用語は、配列（たとえば、核酸を含むヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび順序）が既知であるターゲット核酸の一部分を意味する。既知のターゲットヌクレオチド配列は、10ヌクレオチドまたはそれより長い、好ましくは30ヌクレオチドまたはそれより長い（たとえば、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチドまたはそれより長い）任意の長さの配列でありうる。本明細書において用いられる「に近接するヌクレオチド配列」という用語は、既知のターゲットヌクレオチド配列と同じ核酸分子（すなわち、ターゲット核酸）上で、既知のターゲットヌクレオチド配列の上流または下流のいずれかに位置するヌクレオチド配列を意味する。に近接するヌクレオチド配列は、任意の長さのヌクレオチド配列を含みうる。いくつかの態様において、既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列は、1 kbまたはそれ未満のヌクレオチド配列、たとえば1 kbまたはそれ未満のヌクレオチド配列、750 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列、500 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列、400 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列、300 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列、200 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列、100 bpまたはそれ未満のヌクレオチド配列を含む。試料が、既知のターゲットヌクレオチド配列を含む異なるターゲット核酸を含む場合（たとえば、既知のターゲットヌクレオチド配列がゲノムまたは個別の非同一の染色体に何回も出現する細胞）、既知のターゲットヌクレオチド配列に「近接するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在しうる。本明細書において用いられる「ヌクレオチド配列を決定する」という用語は、核酸を含むヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび相対的位置を決定する段階を意味する。

本明細書において記述される方法の段階（a）において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターを、ターゲット核酸にライゲートすることができる。いくつかの態様において、ターゲット核酸は、そのいくつかがターゲット核酸を含まない複数の核酸を含む試料に含まれうる。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、試料中の実質的に全ての核酸にライゲートすることができる。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、ターゲット核酸配列を含む核酸およびターゲット核酸配列を含まない核酸の両方にライゲートすることができる。

本明細書において用いられる「ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプター」という用語は、2つの鎖（ブロック鎖と増幅鎖）で構成され、第一のライゲート可能な二本鎖末端と第二の非対合末端とを含む核酸分子を意味する。ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖は、5'二本鎖部分を含む。増幅鎖は、5'不対合部分、3'二本鎖部分、および3' Tオーバーハング、ならびに第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含む。ブロック鎖および増幅鎖の二本鎖部分は、実質的に相補的であり、3' Tオーバーハングを含む第一のライゲート可能な二本鎖末端を形成して、二本鎖部分はライゲーション温度で二本鎖型を保つのに十分な長さの部分である。

いくつかの態様において、第一および第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む増幅鎖の一部分は、少なくとも部分的に、増幅鎖の5'不対合部分に含まれうる。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、二本鎖部分および不対合部分を含みえて、不対合部分は、増幅鎖の5'部分のみを含み、すなわちブロック鎖は全体が二本鎖部分である。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、「Y字」型を有しえて、すなわち不対合部分は、不対合であるブロック鎖と増幅鎖の両方の部分を含みうる。ブロック鎖の不対合部分は、増幅鎖の不対合部分より短い、長い、または同じ長さでありうる。いくつかの態様において、ブロック鎖の不対合部分は、増幅鎖の不対合部分より短くなりうる。Y字型ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、ブロック鎖の不対合部分がPCRレジメンの際に3'伸長に供されないという利点を有する。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖はさらに、増幅鎖の5'不対合部分と実質的に相補的でない3'不対合部分を含みえて、およびブロック鎖の3'不対合部分は、プライマーのいずれとも実質的に相補的でなくまたは実質的に同一ではない。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖はさらに、アニーリング温度で増幅鎖の5'不対合部分に特異的にアニールしない3'不対合部分を含みえて、およびブロック鎖の3'不対合部分は、アニーリング温度でプライマーまたはその相補鎖のいずれにも特異的にアニールしない。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの二本鎖部分（たとえば、鎖のいずれかまたは両方の二本鎖部分）は、長さが少なくとも7塩基対であり、たとえば長さが7 bpもしくはそれより長い、8 bpもしくはそれより長い、9 bpもしくはそれより長い、10 bpもしくはそれより長い、11 bpもしくはそれより長い、12 bpもしくはそれより長い、13 bpもしくはそれより長い、または14 bpもしくはそれより長い。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの二本鎖部分は、少なくとも30 bpまたはそれより長い、たとえば30 bpもしくはそれより長い、31 bpもしくはそれより長い、32 bpもしくはそれより長い、33 bpもしくはそれより長い、34 bpもしくはそれより長い、35 bpもしくはそれより長い、40 bpもしくはそれより長い、または50 bpもしくはそれより長い長さでありうる。ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの二本鎖部分は、用いられるPCR増幅レジメンにおける所望のアンプリコンのPCR増幅を抑制するほど長くてはならない。いくつかの次世代シークエンシング法は、Y字型アダプター分子を用いる。これらのY字型アダプター分子は、いくつかのPCR段階（たとえば、ライブラリエンリッチメントPCR、ブリッジPCR、またはエマルジョンPCR）の際に分子内ヘアピンが形成されないように、二本鎖部分が限られた長さ（たとえば、17 bpまたはそれ未満）である必要がある。本明細書において記述される方法のY字型ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、2として二本鎖末端のこの制限を受けない。本発明では、2つのターゲットプライマーがターゲット断片に内部でアクセスできることから、二本鎖末端に起因するこのPCR抑制効果は本発明において適用されない。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの二本鎖部分は、少なくとも18 bpまたはそれより長い、たとえば18 bpもしくはそれより長い、19 bpもしくはそれより長い、20 bpもしくはそれより長い、21 bpもしくはそれより長い、22 bpもしくはそれより長い、23 bpもしくはそれより長い、24 bpもしくはそれより長い、または25 bpもしくはそれより長い長さでありうる。

ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの図解による例を図9に示す。

ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのライゲーションは、当技術分野において既知の任意の方法、たとえば平滑末端ライゲーションまたはTAライゲーションによって行うことができる。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのライゲーションの前に、核酸の末端を平滑にするために、試料中の核酸を核酸末端修復に供することができる。末端修復は当技術分野において周知であり、関連キットおよび／または酵素は市販されている（たとえば、NEBNEXT（商標）末端修復モジュール（カタログ番号E6050L; New England Biolabs; Ipswich, MA）。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのライゲーションの前に、試料中の核酸は、リン酸化および／またはアデニル化されうる。アデニル化は、核酸の3'末端上でアデノシンオーバーハングを提供しうる。次に、チオニン3'オーバーハングを有する第二の核酸を、TAライゲーションによって第一の核酸にライゲートすることができる。ライゲーションの方法は当技術分野において周知であり、関連キットおよび／または酵素が市販されており、たとえばNEBNEXT（商標）da-Tailingモジュール（カタログ番号E6053L: New England Biolabs; Ipswich, MA）を用いて、核酸の平滑末端をアデニル化することができる。いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターは、チオニン3'オーバーハングを提供されうる。

本明細書において記述される方法の段階（b）および（c）は、各々がPCR増幅レジメン、すなわちポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅サイクルセットを含みうる。本明細書において用いられる、「増幅レジメン」という用語は、関心対象の核酸配列を特異的に増幅する、すなわちその量を増加させるプロセス、およびより詳しくはその前のポリメラーゼ伸長産物が連続的伸長ラウンドの鋳型として役立つ場合に起こる指数的増幅のプロセスを意味する。本発明に従うPCR増幅レジメンは、少なくとも1サイクル、好ましくは少なくとも5サイクルまたはそれより多くの反復サイクルを含み、各サイクルは、1）鎖の分離（たとえば、熱変性）；2）鋳型分子に対するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および3）アニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長の段階を含む。これらの段階の各々にとって必要な条件および時間は、当業者によって考案されうる。本明細書において記述される方法に従う増幅レジメンは、好ましくはサーマルサイクラーにおいて行われ、その多くは市販されている。

PCRは、核酸ポリメラーゼを用いることを必要とする。本明細書において用いられる「核酸ポリメラーゼ」というフレーズは、ヌクレオシド三リン酸の鋳型依存的重合化を触媒して、鋳型核酸配列と相補的であるプライマー伸長産物を形成する酵素を意味する。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニールしたプライマーの3'末端で合成を開始して、鋳型の5'末端に向かう方向に進行する。多数の核酸ポリメラーゼが当技術分野において既知であり、市販されている。好ましい核酸ポリメラーゼの1つの群は、熱安定であり、すなわち、それらは相補的核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度、たとえば94℃または時にそれより高い温度に供した後でも、その機能を保持する。

当技術分野において理解されるように、PCRは、反応混合物の加熱を一般的に伴う鎖分離段階を含むサイクルを必要とする。本明細書において用いられる「鎖分離」または「鎖を分離する」という用語は、相補的二本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用することができる2つの一本鎖へと分離する核酸試料の処置を意味する。より詳しくは、本明細書において記述される方法に従う鎖分離は、核酸試料をそのT_mより上まで加熱することによって行われる。一般的に、核酸ポリメラーゼにとって適した緩衝液中で核酸分子を含む試料に関して、鎖分離を行うためには、94℃への加熱で十分である。例示的な緩衝液は、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（25℃でpH 8.8）、0.5から3 mM MgCl₂、および0.1％BSAを含む。

同様に当技術分野において理解されるように、PCRは、鋳型核酸にプライマーをアニールする段階を必要とする。鋳型核酸は、所定のプライマーが特異的にアニールする一本鎖核酸であると定義されることから、ターゲット核酸のいかなる鎖も鋳型核酸でありうる。本明細書において用いられる「アニールする」とは、2つの相補的または実質的に相補的な核酸鎖をハイブリダイズさせる段階、およびより詳しくは、PCRの文脈において用いられる場合に、鋳型依存的ポリメラーゼ酵素のためのプライマー伸長基質が形成されるようにハイブリダイズさせる段階を意味する。プライマー-ターゲット核酸のアニーリングのための条件は、プライマーの長さおよび配列と共に変化して、プライマーに関して計算されるT_mに基づく。一般的に、増幅レジメンにおけるアニーリング段階は、そのようなアニーリングを可能にするために十分な期間、プライマー配列に関して計算されたT_mに基づく温度まで鎖分離段階後の温度を低下させる段階を伴う。T_mは、多数の任意の広く利用可能なアルゴリズム（たとえば、OLIGO（商標）（Molecular Biology Insights Inc. Colorado）プライマー設計ソフトウェアおよびVENTRO NTI（商標）（Invitrogen, Inc. California）プライマー設計ソフトウェア、ならびにPrimer3、Oligo Calculator、およびNetPrimer（Premier Biosoft; Palo Alto, CA；およびワールドワイドウェブhttp://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上で無料で入手可能）を含むインターネット上で入手可能なプログラムを用いて当業者によって容易に決定されうる。たとえば、プライマーのT_mは、以下の式を用いて計算することができるが、これはNetPrimerソフトウェアによって用いられ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Frieir et al. PNAS 1986 83:9373-9377においてより詳細に記述される。
T_m＝△H/(△S＋R * ln(C/4))＋16.6 log([K⁺]/(1＋0.7 [K⁺]))−273.15
式中、△Hは、ヘリックス形成のためのエンタルピーであり、△Sは、ヘリックス形成のためのエントロピーであり、Rはモル気体定数（1.987 cal/℃*mol）であり、Cは核酸濃度であり、および[K⁺]は塩濃度である。ほとんどの増幅レジメンにとって、アニーリング温度は、予想T_mより約5℃低い温度であるように選択されるが、T_mにより近いおよびT_mより上の温度（たとえば、予想T_mより1℃から5℃下、または予想T_mより1℃から5℃上）を用いることができ、同様にたとえば予想T_mより5℃超低い（たとえば6℃下、8℃下、10℃下、またはそれより低い）温度でありうる。一般的に、アニーリング温度がT_mに近ければ、アニーリングはより特異的となる。PCR増幅レジメンの際にプライマーアニーリングを行うことができる時間は、反応の体積に大きく依存し、体積がより大きければより長い時間を必要とするが、プライマーおよび鋳型の濃度にも依存して、鋳型に対するプライマーの相対的濃度がより高ければ、相対濃度が低い場合より必要な時間は短くなる。体積および相対的プライマー／鋳型濃度に応じて、増幅レジメンにおけるプライマーアニーリング段階は、1秒から5分の次数でありうるが、一般的に10秒から2分のあいだ、好ましくは30秒から2分のあいだの次数であろう。本明細書において用いられる「実質的にアニールする」とは、特異的に増幅された産物の検出可能なレベルを産生するために十分であるPCR増幅レジメンの際のアニーリングの程度を意味する。

PCRはまた、各サイクルでアニールしたプライマーのポリメラーゼ伸長にも依存する。本明細書において用いられるように、「ポリメラーゼ伸長」という用語は、核酸ポリメラーゼによる、アニールしたプライマーの3'末端への少なくとも1つの相補的ヌクレオチドの鋳型依存的組み込みを意味する。ポリメラーゼ伸長は好ましくは、1つより多くのヌクレオチド、好ましくは鋳型の完全長に対応するヌクレオチドまでおよび完全長を含むヌクレオチドを付加する。ポリメラーゼ伸長のための条件は、ポリメラーゼの独自性により変化する。ポリメラーゼ伸長のために用いられる温度は、一般的に、酵素の公知の活性特性に基づく。アニーリング温度がたとえば酵素の至適温度より下である必要がある場合、より低い伸長温度を用いることがしばしば容認可能である。一般的に、酵素は、その至適伸長温度より下でも少なくとも部分的に活性を保持するが、最も一般的に用いられる熱安定性ポリメラーゼ（たとえば、Taqポリメラーゼおよびその変種）によるポリメラーゼ伸長は、65℃から75℃、好ましくは約68〜72℃で行われる。

プライマーの伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件で行われる。本明細書において用いられる、「伸長産物が生成されるようにアニールしたオリゴヌクレオチドの伸長を許容する条件」という用語は、たとえば核酸ポリメラーゼがプライマーの伸長を触媒する、温度、塩、および補因子濃度、pH、および酵素濃度を含む条件セットを意味する。そのような条件は、用いられる核酸ポリメラーゼの独自性により変化するが、多数の有用なポリメラーゼ酵素に関する条件が当業者に周知である。1つの例示的な条件セットは、72℃で50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（25℃でpH 8.8）、0.5から3 mM MgCl₂、200μM各dNTP、および0.1％BSAであり、この条件下でTaqポリメラーゼはプライマー伸長を触媒する。開始および伸長のための条件は通常、適した緩衝液（この文脈において、「緩衝液」は、溶媒（一般的に水性）に加えて、必要な補因子、およびpH、イオン強度等に影響を及ぼす試薬を含む）および適した温度で、少なくとも1つの、しかしより好ましくは異なる4つ全てのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在、およびDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合化誘導物質を含む。

いくつかの態様において、各増幅段階は、長さが5サイクルから20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含みうる。いくつかの態様において、各増幅段階は、長さが10サイクルから20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含みうる。いくつかの態様において、各増幅段階は、長さが12サイクルから16サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含みうる。いくつかの態様において、アニーリング温度は、70℃未満でありうる。いくつかの態様において、アニーリング温度は72℃未満でありうる。

様々な態様において、本明細書において記述される方法および組成物は、本明細書において記述される1つまたは複数のタイプのプライマーによってPCR増幅レジメンを行うことに関する。本明細書において用いられる「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型に特異的にアニールすることができ、ポリヌクレオチド鋳型と相補的である伸長産物を産生するために鋳型依存的ポリメラーゼの基質として役立つ3'末端を提供するDNAまたはRNAポリヌクレオチド分子またはそのアナログを意味する。本明細書において記述される方法において有用なプライマーは、一般的に一本鎖であり、プライマーおよびその相補体は、アニールして、二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。本明細書において記述される方法および組成物に従うプライマーは、長さが300ヌクレオチド未満またはそれに等しい、たとえば長さが300、もしくは250、もしくは200、もしくは150、もしくは100、もしくは90、もしくは80、もしくは70、もしくは60、もしくは50、または40ヌクレオチド未満もしくはそれに等しい、または30ヌクレオチドもしくはそれ未満、または20ヌクレオチドもしくはそれ未満、または15ヌクレオチドもしくはそれ未満でありうるが、少なくとも10ヌクレオチドでありうる。プライマーを作製する方法は、当技術分野において周知であり、多数の企業が、本明細書において記述される方法および組成物に従うプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス、たとえばINVITROGEN（商標）カスタムDNAオリゴ；Life Technologies、Grand Island, NY、またはIDT社のカスタムDNAオリゴ；Coralville, IAを提供する。

いくつかの態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターを試料中の核酸（たとえば、ターゲット核酸）にライゲートした後、ターゲット核酸を第一の増幅段階（すなわち、段階（b））において増幅することができる。第一の増幅段階は、第一のターゲット特異的プライマーおよび第一のテールアダプタープライマーを用いるPCR増幅サイクルセットでありうる。

本明細書において用いられる、「第一のターゲット特異的プライマー」という用語は、アニーリング温度でターゲット核酸に特異的にアニールすることができる核酸配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

いくつかの態様において、第一のターゲット特異的プライマーは、5'タグ配列部分を含みうる。いくつかの態様において、反応に存在する第一のターゲット特異的プライマーは全て、同一の5'タグ配列部分を含みうる。多重PCR反応では、異なるプライマー種が、望ましくないオフターゲット手法で互いに相互作用して、それによってDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長およびその後の増幅が起こりうる。これらのプライマー二量体は短い傾向があり、その効率的な増幅が反応を圧倒して優勢となり、それによって所望のターゲット配列の増幅不良が起こりうる。第一のターゲット特異的プライマーに5'タグ配列を含めることにより、起こりうる可能性があるいかなるプライマー二量体も、両方の末端で同じ相補的テールを含む。その後のPCRサイクルにおいて、プライマー二量体は変性して、各々がその2つの末端で5'タグによって導入された相補的配列を含む一本鎖DNAプライマー二量体となる。これらの一本鎖DNAプライマー二量体にプライマーがアニールする代わりに、異なる分子上の新規プライマーとの分子内相互作用より、同じプライマー二量体分子上の相補性タグが近位でアクセス可能であることから、分子内ヘアピン（フライパンの柄のような構造）の形成が優先的に起こるであろう。その結果、これらのプライマー二量体は、非常に非効率的に増幅され、そのためプライマーが、増幅にとって望ましくない二量体によって指数的に消費されることはない。代わりに、タグ付きプライマーは、ターゲット配列の所望の特異的増幅のために十分な高濃度で残りうる。プライマー二量体の蓄積はまた、それらが反応における他の試薬と競合して消費することから、多重PCRにとって有害でありうる。いくつかの態様において、5'タグ配列は、GCに富む配列でありえて、すなわち、タグ配列は、少なくとも50％のGC含有量、少なくとも55％のGC含有量、少なくとも 60％のGC含有量、少なくとも 65％のGC含有量、少なくとも 70％のGC含有量、少なくとも 75％のGC含有量、少なくとも 80％のGC含有量、またはそれより高いGC含有量を含みうる。いくつかの態様において、タグ配列は、少なくとも60％のGC含有量を含みうる。いくつかの態様において、タグ配列は少なくとも65％のGC含有量を含みうる。

本明細書において用いられる、「第二のターゲット特異的プライマー」という用語は、段階（b）から得られたアンプリコンに含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列の一部分に特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分と、第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む5'部分とを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。第二のターゲット特異的プライマーは、第一のターゲット特異的プライマーに関してネスト化している。いくつかの態様において、第二のターゲット特異的プライマーは、第一のターゲット特異的プライマーに関して、少なくとも3ヌクレオチド、たとえば3ヌクレオチドもしくはそれより多く、4ヌクレオチドもしくはそれより多く、5ヌクレオチドもしくはそれより多く、6ヌクレオチドもしくはそれより多く、7ヌクレオチドもしくはそれより多く、8ヌクレオチドもしくはそれより多く、9ヌクレオチドもしくはそれより多く、10ヌクレオチドもしくはそれより多く、または15ヌクレオチドもしくはそれより多くネスト化している。

いくつかの態様において、反応に存在する第二のターゲット特異的プライマーは全て、同じ5'部分を含む。いくつかの態様において、5'部分は、本明細書において先に記述した第一のターゲット特異的プライマーの5'タグに関して記述されたようにプライマー二量体を抑制するように作用しうる。

いくつかの態様において、第一および第二のターゲット特異的プライマーは、ターゲット核酸の同じ鎖に対して実質的に相補的である。いくつかの態様において、既知のターゲット配列に特異的にアニールする第一および第二のターゲット特異的プライマーの一部分は、全体で、既知のターゲットヌクレオチド配列の少なくとも20個のユニーク塩基、たとえば20個もしくはそれより多くのユニーク塩基、25個もしくはそれより多くのユニーク塩基、30個もしくはそれより多くのユニーク塩基、35個もしくはそれより多くのユニーク塩基、40個もしくはそれより多くのユニーク塩基、または50個もしくはそれより多くのユニーク塩基を含みうる。いくつかの態様において、既知のターゲット配列に特異的にアニールする第一および第二のターゲット特異的プライマーの一部分は、全体で既知のターゲットヌクレオチド配列の少なくとも30個のユニーク塩基を含みうる。

本明細書において用いられる、「第一のアプタマープライマー」という用語は、第一のシークエンシングプライマーの5'部分と同一である核酸配列を含む核酸分子を意味する。そのため、第一のテールアダプタープライマーは、増幅鎖の配列の少なくとも一部分と同一である（相補鎖ではない）ことから、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターそのもののいかなる部分にも特異的にアニールすることができないであろう。

本明細書において用いられる、「第二のアダプタープライマー」という用語は、第一のシークエンシングプライマーの一部分と同一である核酸配列を含み、第一のアプタマープライマーに関してネスト化している核酸分子を意味する。それゆえ、第二のテールアダプタープライマーは、増幅鎖の配列の少なくとも一部分と同一（相補的ではなくて）であることから、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターそのもののいかなる部分にも特異的にアニールすることができないであろう。いくつかの態様において、第二のアダプタープライマーは、第一のシークエンシングプライマーと同一である。

第二のアダプタープライマーは、第一のアダプタープライマーに関してネスト化するべきであり、すなわち第一のアダプタープライマーは、第二のアダプタープライマーに含まれず、第二のアダプタープライマーに含まれる増幅鎖と同一の配列のいずれよりも増幅プライマーの5'末端に近い位置に存在する増幅鎖と同一の核酸配列を含む。いくつかの態様において、第二のアダプタープライマーは、少なくとも3ヌクレオチド、たとえば3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、またはそれより多くネスト化する。

いくつかの態様において、第一のアダプタープライマーは、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖の最も5'側の約20個の塩基と同一である核酸配列を含み、第二のアダプタープライマーは、5'塩基が増幅鎖の5'末端の3'の少なくとも3ヌクレオチドである、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖の約30塩基と同一である核酸配列を含みうる。

ネステッドアダプタープライマーを用いることにより、半ネスト法の際に生じうる状況である、増幅可能であるが（たとえば、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRの際に）シークエンシングすることができない最終アンプリコンが生成される可能性がなくなる。他の状況において、シークエンシングプライマーと同一のプライマーを用いる半ネストアプローチでは、第一のPCR段階から第二のPCR段階への望ましくない増幅産物のキャリーオーバーが起こりえて、最終的に人為的なシークエンシングリードを生じるであろう。本明細書において記述されるように2つのアダプタープライマーを用いることにより、これらの問題を減少させることができ、いくつかの態様において消去することができる。

第一の増幅段階の第一のPCR増幅サイクルにおいて、第一のターゲット特異的プライマーは、既知のターゲットヌクレオチド配列を含む任意の核酸の鋳型鎖に特異的にアニールすることができる。第一のターゲット特異的プライマーが設計される方向に応じて、既知のターゲットヌクレオチド配列の上流または下流で、鋳型鎖と相補的である配列が合成される。PCRの伸長相の際に、鋳型鎖の5'末端が、ライゲートされたユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの途中で終了する場合、新たに合成された産物鎖の3'末端は、第一のテールアダプタープライマーと相補的である配列を含むであろう。その後のPCR増幅サイクルにおいて、第一のターゲット特異的プライマーおよび第一のテールアダプタープライマーはいずれも、ターゲット核酸配列の適切な鎖に特異的にアニールすることができ、既知のヌクレオチドターゲット配列とユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのあいだの配列を増幅する（すなわちコピーする）ことができる。

本明細書において記述される方法の次の段階（すなわち段階（c））において、段階（b）から得られた増幅部分の一部分は、第二の増幅段階において増幅される。第二の増幅段階は、第二のターゲット特異的プライマーおよび第一のシークエンシングプライマーを用いるPCR増幅サイクルセットでありうる。第二のPCR増幅サイクルセットは、第一のPCR増幅サイクルセットと同一である、または異なるPCRパラメータを有しうる。たとえば、段階（b）および（c）のPCR増幅レジメンは、同じもしくは異なるアニーリング温度、または同じもしくは異なる伸長段階の持続時間を有しうる。

本明細書において記述される方法によって、既知のターゲットヌクレオチド配列の片側または両側に隣接する既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定することができる。ターゲット核酸が通常、一本鎖または二本鎖核酸として存在するか否かによらず、配列情報は典型的に一本鎖フォーマット（鎖A）で5'から3'で表示される。鎖Aの既知のターゲットヌクレオチド配列の5'の配列が決定されれば、遺伝子特異的プライマーは鎖Aと相補鎖でありうる（すなわちアニールすることができる）。鎖Aの既知のターゲットヌクレオチド配列の3'の配列が決定されれば、遺伝子特異的プライマーは鎖Aと同一でありえて、それらは、二本鎖ターゲット核酸の相補鎖にアニールするであろう。プライマー設計のそのような検討は、当業者に周知である。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法によって、第一および第二の遺伝子特異的プライマーの使用に関して、優れたオンターゲット率、たとえば70〜90％のアッセイを得ることができる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるアッセイおよび方法は、少なくとも85％のターゲット特異性率を有しうる。

いくつかの態様において、それらが、約61から72℃、たとえば約61から69℃、約63から69℃、約63から67℃、約64から66℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように、4つのタイプのプライマーを設計する。いくつかの態様において、72℃未満のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように、4つのタイプのプライマーを設計する。いくつかの態様において、70℃未満のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように、4つのタイプのプライマーを設計する。いくつかの態様において、68℃未満のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように、4つのタイプのプライマーを設計する。いくつかの態様において、約65℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように、4つのタイプのプライマーを設計する。

いくつかの態様において、既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールするターゲット特異的プライマーの一部分は、約61から72℃、たとえば約61から69℃、約63から69℃、約63から67℃、約64から66℃のアニーリング温度で特異的にアニールする。いくつかの態様において、既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールするターゲット特異的プライマーの一部分は、PCR緩衝液中で約65℃の温度で特異的にアニールするであろう。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるプライマーおよび／またはアダプターは、修飾塩基を含むことができない（たとえば、プライマーおよび／またはアダプターは、ブロック3'アミンを含むことができない）。

本明細書において記述される方法の次の段階（すなわち、段階（d））において、段階（c）から得られた増幅された部分をシークエンシングすることができる。いくつかの態様において、シークエンシングは、次世代シークエンシング法によって行われうる。本明細書において用いられる「次世代シークエンシング」は、何千から何百万ものシークエンシング反応を同時に行って読み取ることにより、通常のシークエンシング法（たとえば、サンガーシークエンシング）で可能であった速度を超える速度でオリゴヌクレオチドをシークエンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシークエンシング技術を意味する。次世代シークエンシング法／プラットフォームの非制限的な例には、Massively Parallel Signature Sequencing（Lynx Therapeutics）；454ピロシークエンシング（454 Life Sciences/ Roche Diagnostics）；固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング（Solexa/illumina）: SOLiD技術（Applied Biosystems）；イオン半導体シークエンシング（ION Torrent.）；DNAナノボールシークエンシング（Complete Genomics）；ならびにPacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、Oxford Nanopore Technologies、およびHelicos Biosciencesから入手可能な技術が挙げられる。いくつかの態様において、シークエンシングプライマーは、選択された次世代シークエンシング法と適合性の部分を含みうる。次世代シークエンシング技術ならびに関連するシークエンシングプライマーの制約および設計パラメータは、当技術分野において周知である（たとえば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Shendure, et al., "Next-generation DNA sequencing," Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145; Mardis, "The impact of next-generation sequencing technology on genetics," Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141; Su, et al., "Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics" Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333-43; Zhang et al., "The impact of next-generation sequencing on genomics", J Genet Genomics, 2011, 38(3): 95-109; (Nyren, P. et al. Anal Biochem 208: 17175 (1993): Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545-52 (2006); Strausberg, R. L., et al. Drug Disc Today 13:569-77 (2008);米国特許第7,282,337号；米国特許第7,279,563号；米国特許第7,226,720号；米国特許第7,220,549号；米国特許第7,169,560号；米国特許第6,818,395号；米国特許第6,911,345号；米国特許出願公開第2006/0252077号；第2007/0070349号；および第20070070349号を参照されたい）。

いくつかの態様において、シークエンシング段階は、第一および第二のシークエンシングプライマーを用いることに依存する。いくつかの態様において、第一および第二のシークエンシングプライマーは、本明細書において記述される次世代シークエンシング法と適合性であるように選択される。

ゲノムおよび／またはcDNA配列の公知の配列データベースにシークエンシングリードを整列させる方法は、当技術分野において周知であり、このプロセスのためのソフトウェアが市販されている。いくつかの態様において、野生型配列データベースにその全体がマップされないリード（シークエンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列を除く）は、ゲノム再構成または大きいindel変異でありうる。いくつかの態様において、ゲノムにおいて多数の位置にマップされる配列を含むリード（シークエンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列を除く）は、ゲノム再構成でありうる。

いくつかの態様において、ターゲット核酸および／またはその増幅産物は、段階aからdのいずれかの前および／または後に酵素、プライマー、または緩衝液成分から単離されうる。核酸を単離する方法は当技術分野において周知である。いくつかの態様において、単離は、固相可逆的固定（SPRI）クリーンアップを含みうる。SPRIクリーンアップの方法は当技術分野において周知であり、キット、たとえばAgencourt AMPure XP - PCR Purification（カタログ番号A63880, Beckman Coulter; Brea, CA）が市販されている。いくつかの態様において、酵素は熱処理によって不活化されうる。

いくつかの態様において、ターゲット核酸は、ゲノムDNAに含まれうる。いくつかの態様において、ターゲット核酸は、リボ核酸（RNA）、たとえばmRNAに含まれうる。いくつかの態様において、ターゲット核酸は、cDNAに含まれうる。本明細書において記述される方法において用いるために適したシークエンシング法の多くが、何十個から何百個ものヌクレオチド塩基の最適なリード長でのシークエンシング実行を提供する（たとえば、Ion Torrent技術は、200〜400 bpのリード長を生じうる）。たとえばゲノムDNAまたはmRNAに含まれるターゲット核酸は、この最適なリード長より実質的に長い核酸分子に含まれうる。段階（c）から得られた増幅された核酸部分が特定のシークエンシング技術において用いるために適した長さとなるために、既知のターゲットヌクレオチド配列と、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターをライゲートすることができるターゲット核酸の末端との平均距離は、選択された技術の最適なリード長に可能な限り近づかなければならない。たとえば、所定のシークエンシング技術の最適なリード長が200 bpである場合、本明細書において記述される方法に従って増幅される核酸分子は、約400 bpまたはそれ未満の平均長を有しなければならない。たとえばゲノムDNAまたはmRNAに含まれるターゲット核酸は、段階（a）の前に任意の所望のサイズの断片を生成するように剪断、たとえば機械的または酵素的に剪断されうる。機械的剪断プロセスの非制限的な例には、超音波処理、噴霧化、およびCovaris（Woburn, MA）から入手できるAFA（商標）剪断技術が挙げられる。いくつかの態様において、ゲノムDNAに含まれるターゲット核酸は、超音波処理によって機械的に剪断されうる。いくつかの態様において、ターゲット核酸がRNAに含まれる場合、試料を逆転写酵素レジメンに供して、DNA鋳型を生成することができ、その後DNA鋳型を剪断することができる。いくつかの態様において、ターゲットRNAは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断されうる。いくつかの態様において、ターゲットRNAを含む試料は、cDNAシークエンシングのためにゲノムDNAを除去する必要がなく、cDNAシークエンシングのためにリボソームRNAを枯渇させる必要がなく、いずれの段階においても機械的または酵素的剪断を必要とすることなく、ランダムヘキサマーを用いて二本鎖cDNA合成のためのRNAを供することによって、および1本のチューブの中で核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供することによって、新しいまたは分解した標本のいずれかから抽出した総核酸を用いて本明細書において記述される方法において用いられうる。

いくつかの態様において、既知のターゲットヌクレオチド配列は、遺伝子再構成に含まれうる。本明細書において記述される方法は、予め既知でなければならないのが遺伝子再構成のアイデンティティの半分のみでよいことから（すなわち、遺伝子特異的プライマーによって標的とされる遺伝子再構成の半分）、遺伝子再構成の存在および／またはアイデンティティを決定するために適している。いくつかの態様において、遺伝子再構成は、がん遺伝子を含みうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成は融合がん遺伝子を含みうる。

いくつかの態様において、ターゲット核酸は、試料に含まれうる。いくつかの態様において、ターゲット核酸は、対象から得られた試料に含まれうる。いくつかの態様において、試料は、対象から得られた診断試料でありうる。いくつかの態様において、試料はさらにタンパク質、細胞、液体、生体液、保存剤、および／または他の物質を含みうる。非制限的な例として、試料は、口腔内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離液、胸水、心膜液、嚢液、腫瘍組織、組織、生検、唾液、吸引液、またはその組み合わせでありうる。いくつかの態様において、試料は、切除または生検によって得られうる。

いくつかの態様において、試料は、がんの処置を必要とする対象から得られうる。いくつかの態様において、試料は、腫瘍細胞集団、たとえば少なくとも1つの腫瘍細胞を含みうる。いくつかの態様において、試料は、無処理生検組織または処理後の生検組織（たとえば、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋生検組織）を含むがこれらに限定されるわけではない腫瘍生検を含みうる。

いくつかの態様において、試料は新たに採取されうる。いくつかの態様において、試料は、保存された後、本明細書において記述される方法および組成物において用いられうる。いくつかの態様において、試料は無処理試料である。本明細書において用いられるように、「無処理試料」は、溶液中での希釈および／または懸濁を除く、試料のいかなる前処理も予め行っていない生物試料を意味する。いくつかの態様において、試料は、対象から得て、保存または加工された後、本明細書において記述される方法および組成物において利用されうる。非制限的な例として、試料はパラフィンロウに包埋、冷蔵、または凍結されうる。凍結試料は、融解した後、本明細書において記述される方法および組成物に従って核酸の存在に関して決定されうる。いくつかの態様において、試料は加工されたまたは処理された試料でありうる。試料を処理または加工する例示的な方法には、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結融解、保存剤（たとえば、抗凝固剤またはヌクレアーゼ阻害剤）との接触、およびその任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、試料は、化学試薬および／または生物試薬によって処理されうる。化学および／または生物試薬は、加工および／または保存の際に試料または試料に含まれる核酸の安定性を保護および／または維持するために用いられうる。加えてまたは代わりに、化学および／または生物試薬は、試料の他の成分から核酸を放出させるために用いられうる。非制限的な例として、血液試料は、抗凝固剤によって処理された後に、本明細書において記述される方法および組成物において用いられうる。当業者は、核酸分析のための試料を加工、保存、または処理するための方法およびプロセスを十分に承知している。いくつかの態様において、試料は、たとえば遠心分離によって透明にされた液体試料でありうる。いくつかの態様において、試料を、低速遠心分離（たとえば、3,000×gまたはそれ未満）によって透明にして、透明な液体試料を含む上清を回収することができる。

いくつかの態様において、試料中に存在する核酸は、単離、濃縮、または精製された後に本明細書において記述される方法および組成物において利用されうる。試料から核酸を単離、濃縮、または精製する方法は、当業者に周知である。非制限的な例として、様々な試料タイプからゲノムDNAを単離するためのキットが市販されている（たとえば、カタログ番号51104、51304、56504、および56404；Qiagen; Germantown, MD）。

本明細書において記述される方法は、多重化技術において用いられうる。本明細書において記述される方法の態様において、多重適用は、1つまたは複数の既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する段階を含みうる。本明細書において用いられる「多重PCR」は、1つの反応容器において、第一および第二の遺伝子特異的プライマーの1つより多くのセットを用いることによって、1つより多くのターゲット核酸の同時増幅ならびにその後に増幅産物の配列の決定を行うPCRの変化形を意味する。多重化とは、1つの反応において約2個から1,000個の異なるターゲット配列を検出することを意味しうる。本明細書において用いられる、多重化は、1回の反応で2〜1,000個、たとえば5〜500、25〜1000、または10〜100個等の任意の範囲の異なるターゲット配列の検出を意味する。PCRに適用される場合の「多重」という用語は、同じPCR反応において少なくとも2つの異なるターゲット配列に対して特異的なプライマーが存在することを意味する。

いくつかの態様において、試料中、または試料の異なる部分に存在するターゲット核酸は、複数の第一および第二のターゲット特異的プライマーによって増幅されうる。いくつかの態様において、複数の第一および第二のターゲット特異的プライマーが、1つの反応混合物に存在しえて、たとえば多数の増幅産物が、同じ反応混合物において産生されうる。いくつかの態様において、第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットは、別個の遺伝子に含まれる既知のターゲット配列に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、既知のターゲット配列の異なる部分に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、1つの遺伝子に含まれる既知のターゲット配列の異なる部分に特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、少なくとも2セットの第一および第二のターゲット特異的プライマーは、既知のターゲット配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールすることができる。いくつかの態様において、複数の第一のターゲット特異的プライマーは、同一の5'タグ配列部分を含みうる。

本明細書において記述される方法の態様において、多重適用は、1回のシークエンシング反応またはシークエンシング実行で、多数の試料中の1つまたは複数の既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する段階を含みうる。多数の試料は、異なる起源から、たとえば異なる組織および／または異なる対象からの試料でありうる。そのような態様において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターはさらに、バーコード部分を含みうる。いくつかの態様において、ユニークバーコード部分を有するユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターを、各試料に添加して、その中の核酸にライゲートさせることができ、次に試料を段階（a）の後にプールすることができる。それゆえ、増幅産物の各々の得られたシークエンシングリードは、増幅産物が由来する当初の鋳型核酸をどの試料が含むかを同定するバーコードを含むであろう。次世代シークエンシング適用においてバーコード部分を用いることは、当技術分野において周知であり、たとえば、その全てが参照により本明細書に組み入れられる、Margulies, M. et al. "Genome Sequencing in Microfabricated High -Density Picolitre Reactors", Nature, 437, 376-80 (2005); Mikkelsen, T. et al. "Genome-Wide Maps of Chromatin State in Pluripotent and Lineage- Committed Cells", Nature, 448, 553-60 (2007); McLaughlin, S. et al. "Whole-Genome Resequenicing With Short Reads: Accurate Mutation Discovery With Mate Pairs and Quality Values", ASHG Annual Meeting (2007); Shendure I et al. "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome", Science, 309, 1728-32 (2005): Harris, T. et al. "Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome", Science, 320, 106-9 (2008); Simen, B. et al. "Prevalence of LoW Abundance Drug Resistant Variants by Ultra Deep Sequencing in Chronically HIV-infected Antiretroviral (ARV) Naive Patients and the Impact on Virologic Outcomes", 16th International HIV Drug Resistance Workshop, Barbados (2007); Thomas, R. et al. "Sensitive Mutation Detection in Heterogeneous Cancer Specimens by Massively Parallel Picoliter Reactor Sequencing", Nature Med., 12, 852-855 (2006); Mitsuya, Y et al. "Minority Human Immunodeficiency Virus Type 1 Variants in Antiretroviral-Naive Persons With Reverse Transcriptase Codon 215 Revertant Mutations", I. Vir., 82, 10747-10755 (2008); Binladen, J. et al. "The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing", PLoS ONE, 2, e197 (2007); and Hoffmann, C. et al. "DNA Bar Coding and PyROS1equencing to Identify Rare HIV Drug Resistance Mutations", Nuc. Acids Res., 35, e91 (2007)において記述される。

本明細書において記述される技術のいくつかの態様において、既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列に近接する配列を決定する段階は、疾患の処置に関連する情報を提供することができ、および／または疾患を処置する方法に含まれうる。いくつかの態様において、試料は、遺伝子変化に関連する疾患の処置を必要とする対象からの試料でありうる。いくつかの態様において、既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列は、疾患関連遺伝子、たとえばがん遺伝子に含まれうる。いくつかの態様において、既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列に近接する配列および／または既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列は、疾患関連である変異または遺伝子異常、たとえばSNP、挿入、欠失、および／または遺伝子再構成を含みうる。いくつかの態様において、試料中に存在する既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列に近接する配列および／または既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列は、遺伝子再構成産物に含まれうる。いくつかの態様において、遺伝子再構成は、がん遺伝子、たとえば融合がん遺伝子でありうる。

がんに対するある処置は、あるがん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効であり、たとえば所定の融合がん遺伝子の作用または発現を標的とする処置物質は、その融合がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効でありうるが、融合がん遺伝子を欠如する腫瘍に対しては有効ではない。本明細書において記述される方法によって、がん遺伝子の状態（たとえば、変異、SNP、および／または再構成）を明らかにする特異的配列を決定することができる。本明細書において用いられるように、本明細書において記述される方法によってさらに、片側の隣接配列のみが既知である特異的配列を決定することができ、たとえば本明細書において記述される方法は、正確な位置および／または再構成パートナーが、本明細書において記述される方法を行う前にわかっていない、既知のがん遺伝子を伴う遺伝子再構成の存在およびアイデンティティを決定することができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、がんの処置を必要とする対象から得られた腫瘍試料において、本明細書において記述される方法に従って1つまたは複数のがん遺伝子再構成の存在を検出する段階；検出されたがん遺伝子再構成のいずれかを有する腫瘍に対して有効であるがんの処置を投与する段階を含む、がんを処置する方法に関する。いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、対象から得られた腫瘍試料において、本明細書において記述される方法に従ってがん遺伝子再構成の存在を検出する段階を含む、がんの処置を必要とする対象が所定の処置に対して応答するか否かを決定する方法であって、がん遺伝子の再構成の存在が検出されれば、対象が、がん遺伝子再構成産物を標的とする処置に対して応答性であることが決定される方法に関する。

いくつかの態様において、たとえば、試料が肺がんの処置を必要とする対象から得られる場合、既知のオリゴヌクレオチドターゲット配列は、ALK、ROS1、およびRETの群から選択される遺伝子からの配列を含みうる。ALK、ROS1、およびRET遺伝子を伴う、およびその結果、融合がん遺伝子が得られる遺伝子再構成は、当技術分野において周知である（たとえば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Soda et al. Nature 2007 448561-6: Rikova et al. Cell 2007 131: 1190-1203; Kohno et al. Nature Medicine 2012 18:375-7; Takouchi et al. Nature Medicine 2012 18:378-81を参照されたい）。しかし、遺伝子再構成の正確な位置（たとえばALK、ROS1、および／またはRET遺伝子において再構成が起こった場合）、および再構成に関係する第二の遺伝子のアイデンティティは変化しうる。本明細書において記述される方法において、そのような再構成の存在およびアイデンティティは、再構成の位置または遺伝子再構成に関係する第二の遺伝子のアイデンティティを知る必要なく、検出されうる。

いくつかの態様において、既知のターゲット配列は、ALK、ROS1、およびRETの群から選択される遺伝子からの配列を含みうる。いくつかの態様において、第一のターゲット特異的プライマーと第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも1つのセットは、SEQ ID NO: 5と6；SEQ ID NO: 7と8；SEQ ID NO: 9と10；SEQ ID NO: 11と12；SEQ ID NO: 13と14；SEQ ID NO: 15と16；SEQ ID NO: 17と18；SEQ ID NO: 19と20；SEQ ID NO: 21と22；SEQ ID NO: 23と24；SEQ ID NO: 25と26；SEQ ID NO: 27と28；SEQ ID NO: 29と30；SEQ ID NO: 31と32；SEQ ID NO: 33と34；SEQ ID NO: 35と36;およびSEQ ID NO: 37と38からなる群より選択されうる。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にALKの遺伝子再構成が存在すれば、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；ならびにNVP-TAE684およびPF-02341066などのALKキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジン阻害剤（たとえば、Galkin et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104:270-275: Zou et al. Cancer Res, 2007, 67:4408-4417; Hallberg and Palmer F1000 Med Reports 2011 3:21; and Sakamoto et al. Cancer Cell 2011 19:679-690を参照されたい）ならびにWO 04/079326に開示される分子からなる群より選択される処置による処置に対して腫瘍が感受性を有することが示されうる。前述の参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ALK阻害剤は、たとえばALKまたはその一部分の発現および／または活性を減少させるオリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む、ALKまたはその一部分の発現および／またはキナーゼ活性を減少させる任意の物質を含みうる。本明細書において用いられる、「退形成性リンパ腫キナーゼ」または「ALK」は、野生型で神経調節に典型的に関係する膜貫通型チロシンキナーゼを意味する。ALK遺伝子およびmRNAのヌクレオチド配列は、ヒト（たとえば、SEQ ID NO:2（mRNA）、NCBI Gene ID：238）を含む多数の種に関して公知である。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にROS1の遺伝子再構成が存在すれば、ROS1阻害剤および本明細書において先に記述したALK阻害剤（たとえば、クリゾチニブ）からなる群より選択される処置による処置に対して腫瘍が感受性を有することが示されうる。ROS1阻害剤は、たとえばROS1またはその一部分の発現および／または活性を減少させるオリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む、ROS1またはその一部分の発現および／またはキナーゼ活性を減少させる任意の物質を含みうる。本明細書において用いられる「c-ROS1がん遺伝子1」または「ROS1」（当技術分野においてROS1-1とも呼ばれる）は、PTPN6と相互作用するセブンレスサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼを意味する。ROS1遺伝子およびmRNAのヌクレオチド配列は、ヒト（たとえば、SEQ ID NO:1（mRNA）、NCBI Gene ID：238）を含む多数の種に関して公知である。

いくつかの態様において、対象の腫瘍から得られた試料中にRETの遺伝子再構成が存在すれば、RET阻害剤；DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506（レゴラフェニブ）、ZD6474、NVP-AST487、ソラフェニブ、RPI-1、XL184、バンデタニブ、スニチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ゲフィチニブ、およびウィザフェリンA（たとえば、Samadi et al. Surgery 2010 148: 1228-36; Cuccuru et al. JNCI 2004 13: 1006-1014; Akeno- Stuart et al. Cancer Research 2007 67:6956; Grazma et al. J Clin Oncol 2010 28: 15s 5559; Mologni et al. J Mol Endocrinol 2006 37: 199-212; Calmomagno et al. Journal NCI 2006 98:326-334; Mologni. Curr Med Chem 2011 18: 162-175）ならびにWO 06/034833；米国特許出願公開第2011/0201598号、および米国特許第8,067,434号に開示される化合物からなる群より選択される処置による処置に対して、腫瘍が感受性を有することが示されうる。前述の参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。RET阻害剤は、たとえばRETまたはその一部分の発現および／または活性を減少させるオリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む、RETまたはその一部分の発現および／またはキナーゼ活性を減少させる任意の物質を含みうる。本明細書において用いられる「トランスフェクション時の再構成」または「RET」は、神経堤の発達に関係して、グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリーのシグナル伝達分子を認識するカドヘリンスーパーファミリーの受容体チロシンキナーゼを意味する。ROS1遺伝子およびmRNAのヌクレオチド配列は、ヒト（たとえば、SEQ ID NO:3〜4（mRNA）、NCBI Gene ID：5979）を含む多数の種に関して公知である。

本明細書において記述される方法の適用のさらに非制限的な例には、血液悪性疾患マーカーおよびそのパネルの検出（たとえば、リンパ腫および白血病におけるゲノム再構成を検出するためのマーカーを含む）、肉腫関連ゲノム再構成およびそのパネルの検出、ならびにリンパ腫の試験のためのIGH/TCR遺伝子再構成およびそのパネルの検出が挙げられる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、たとえばがんを有するまたは有すると診断された対象をがんの処置によって処置することに関する。がんを有する対象は、がんを診断する現行の方法を用いて医師によって同定されうる。たとえば、これらの状態を特徴付けして診断に役立つ肺がんの症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、弱い呼吸、鎖骨上のリンパ節の腫脹、肺の異常音、胸部打診時の濁音、および胸痛を含むがこれらに限定されるわけではない。たとえば肺がんの診断において役立ちうる試験は、x-線、ある物質（たとえばカルシウム）の高レベルに関する血液検査、CTスキャン、および腫瘍生検を含むがこれらに限定されるわけではない。肺がんの家族の既往または肺がんの危険因子に対する曝露（たとえば、喫煙または煙および／または空気汚染に対する曝露）もまた、対象が肺がんを有する可能性があるか否かを決定するために、または肺がんの診断を行うために役立ちうる。

がんは、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、神経膠芽腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、神経膠芽腫および髄芽細胞腫を含む脳がんを含む癌；乳がん、子宮頚がん、絨毛癌；結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、子宮内膜がん；食道がん、胃がん；様々なタイプの頭頚部がん、ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；急性リンパ球性白血病および骨髄性白血病を含む血液の新生物；カポジ肉腫、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、AIDS関連白血病および成人T細胞白血病リンパ腫；腎細胞癌などの腎臓がん、急性T細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；肝臓癌および肝がんを含む肝臓がん、メルケル細胞癌、黒色腫、多発性骨髄腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔がん；上皮細胞から生じるがんを含む卵巣がん、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；膵臓がん；黒色腫、間質細胞、胚細胞および間葉細胞を含む皮膚がん；前立腺がん、直腸がん；外陰部がん、腺癌を含む腎臓がん；セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍などの胚腫瘍を含む精巣がん；甲状腺の腺癌および髄様癌を含む甲状腺がん；食道がん、唾液腺癌、およびウィルムス腫瘍を含むがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、がんは肺がんでありうる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、がんの症状を軽減するために、本明細書において記述される組成物、たとえばがんの処置の有効量を対象に投与する段階を含む。本明細書において用いられる「がんの症状を軽減する」とは、がんに関連する任意の状態または症状を軽減することである。同等の無処置対照と比較すると、そのような減少は、任意の標準的な技術によって測定した場合に、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれより多い減少である。本明細書において記述される組成物を対象に投与するための多様な手段が、当業者に公知である。そのような方法は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、表面、注射、または腫瘍内投与を含みうるがこれらに限定されるわけではない。投与は局所または全身でありうる。本明細書において用いられる「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要な処置の量を意味し、所望の効果を提供するための薬理学的組成物の十分量に関する。それゆえ、「治療的有効量」は、典型的な対象に投与した場合に、特定の抗がん効果を行うために十分である量を意味する。本明細書において用いられる有効量はまた、様々な文脈において、疾患の症状の発生を遅らせるため、疾患の症状の経過を変化させるために（たとえば、疾患の症状の進行を遅らせるため、しかしこれに限定されない）、または疾患の症状を逆転させるために十分な量を含むであろう。このため、正確な「有効量」を明記することは一般的に実用的ではない。しかし、いずれの所定の場合に関しても、適切な「有効量」は、単なるルーチンの実験を用いて当業者によって決定されうる。任意の特定の用量の効果は、適したバイオアッセイによってモニターされうる。用量は、医師によって決定され、観察される処置の効果に適合するように必要に応じて調節されうる。

がんの処置の非制限的な例には、放射線療法、手術、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（たとえば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマII、およびカリケアミシンオメガII（たとえば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照されたい）などの抗生物質；ジネミシンAを含むジネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート;エスペラマイシン;ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連クロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアニン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、たとえばTAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（登録商標）クレモフォアフリー、パクリタキセルのアルブミンナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）、およびTAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル（chloranbucil）；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE.RTM；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イダバンドロネート；イリノテカン（Camptosar、CPT-11）（イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン処置レジメン（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb.RTM）；細胞増殖を減少させる、PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR（たとえば、エルロチニブ（Tarceva（登録商標）））およびVEGF-Aの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。加えて、処置の方法はさらに、放射線または放射線治療を用いることを含みうる。さらに、処置の方法は、外科的処置を用いることを含みうる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、たとえば大量の核酸の非方向性のシークエンシングによって得られた、特に関連する、品質の低い、および／または複雑な配列を確認するためのリシークエンシングのために適用可能でありうる。非制限的な例として、本明細書において記述される方法によって、標的化疾患遺伝子パネル（たとえば、遺伝子10〜100個）の方向性のおよび／または標的化リシークエンシング、大規模シークエンシングプロジェクトにおいて得られた変種を確認するためのリシークエンシング、全エキソームリシークエンシング、および／または1ヌクレオチド変種、多ヌクレオチド変種、挿入、欠失、コピー数の変化、およびメチル化状態を検出するための標的化リシークエンシングを行うことができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法によって、微生物相シークエンシング、古い試料のシークエンシング、および／または新しい変種ウイルス遺伝子タイピングを行うことができる。

本出願を通して引用された文献、参考文献、公開された特許、公表された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む全ての特許および他の刊行物は、たとえば本明細書において記述される技術に関連して用いられうるそのような刊行物に記述される方法論を記述および開示する目的のために、明白に参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の提出日以前に単にその開示がなされたために提供される。この点においていかなるものも、先行発明に基づいて、または他のいかなる理由により、本発明者らがそのような開示の日付を早める権利がないと自認したと解釈すべきではない。これらの文書の日付に関する声明または内容に関する表現は全て、本出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関していかなる承認も与えない。

本開示の態様の説明は、網羅的ではなく、開示される厳密な型にその開示を制限しないと意図される。開示の特異的態様および例は、説明目的のために本明細書において記述され、当業者が認識するように、様々な同等の修飾が可能であり、それらも本開示の範囲内である。たとえば、方法の段階または機能は所定の順序で提示されるが、代わりの態様は、異なる順序で機能を行ってもよく、または機能は実質的に同時に行われうる。本明細書において提供される開示の教示は、必要に応じて他の技法または方法に適用することができる。本明細書において記述される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。必要であれば、開示の局面を改変して、開示のなおさらなる態様を提供するために上記の参考文献および出願の組成、機能、および概念を用いることができる。これらおよび他の変更は、詳細な説明に照らして開示に行うことができる。そのような修飾は全て、添付の特許請求の範囲に含まれると意図される。

前述の態様のいずれかの特異的要素を、組み合わせるか、または他の態様における要素と置換することができる。さらに、開示のある態様に関連する利点は、これらの態様の文脈において記述されているが、他の態様もまたそのような利点を示す可能性があり、必ずしも全ての態様が、開示の範囲内に入るためにそのような利点を示す必要はない。

本明細書において記述される技術は、さらに制限すると決して解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。

本明細書において記述される技術のいくつかの態様は、以下の番号をつけた項目のいずれかに従って定義されうる：
１． 既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（a）既知のターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸にユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターをライゲートする段階；
（b）第一のアダプタープライマーおよび第一のターゲット特異的プライマーによって、ターゲット核酸の一部分およびユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖を増幅する段階；
（c）段階（b）から得られたアンプリコンの一部分を、第二のアダプタープライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；
（d）第一および第二のシークエンシングプライマーを用いて段階（c）の増幅部分をシークエンシングする段階
を含み、
ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターが第一のライゲート可能な二本鎖末端および第二の不対合末端を含み；
ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターがブロック鎖および増幅鎖を含み、；
ブロック鎖が5'二本鎖部分を含み；
増幅鎖が5'不対合部分、3'二本鎖部分、および3' Tオーバーハングを含み；
増幅鎖が第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含み；
ブロック鎖および増幅鎖の二本鎖部分が、実質的に相補的であり、かつ3' Tオーバーハングを含む第一のライゲート可能な二本鎖末端を形成し；
二本鎖部分が、ライゲーション温度で二本鎖型を保つのに十分な長さであり；
第一のターゲット特異的プライマーが、アニーリング温度でターゲット核酸の既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールすることができる核酸配列を含み；
第二のターゲット特異的プライマーが、段階（b）から得られたアンプリコンに含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列の一部分に特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分と、第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む5'部分とを含み、かつ第二のターゲット特異的プライマーが第一のターゲット特異的プライマーに関してネスト化しており；
第一のアダプタープライマーが第一のシークエンシングプライマーの5'部分と同一である核酸配列を含み；ならびに
第二のアダプタープライマーが第一のシークエンシングプライマーの一部分と同一である核酸配列を含み、かつ第一のアダプタープライマーに関してネスト化している、方法。
２． ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖が、増幅鎖の5'不対合部分と実質的に相補的でない3'不対合部分をさらに含み、かつ
ブロック鎖の3'不対合部分がプライマーのいずれとも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない、項目1記載の方法。
３． 第二のアダプタープライマーが第一のアダプタープライマーに関して少なくとも3ヌクレオチド、ネスト化している、項目1〜2のいずれかに記載の方法。
４． 第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含む増幅鎖の一部分が少なくとも部分的に、増幅鎖の5'不対合部分に含まれる、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
５． 第一のターゲット特異的プライマーが、プライマーのいずれの任意の他の部分とも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分をさらに含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
６． 第二のアダプタープライマーが完全長の第一のシークエンシングプライマーと同一である、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
７． 既知のターゲットに特異的にアニールするターゲット特異的プライマーの一部分が、PCR緩衝液において約65℃の温度で特異的にアニールする、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
８． 段階（a）の前に、以下の段階をさらに含む、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法：
核酸を機械的に剪断する段階；
核酸を末端修復に供する段階；
核酸をリン酸化に供する段階；および
核酸をアデニル化に供する段階。
９． 試料がゲノムDNAを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
１０． 試料がRNAを含み、かつ方法が試料を逆転写酵素レジメンに供する第一の段階をさらに含む、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
１１． 逆転写酵素レジメンがランダムヘキサマーの使用を含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
１２． 既知のターゲット配列が遺伝子再構成に含まれる、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
１３． 遺伝子再構成が、ゲノムDNA、RNA、およびcDNAからなる群より選択される核酸に存在する、項目12記載の方法。
１４． 遺伝子再構成ががん遺伝子を含む、項目12〜13のいずれかに記載の方法。
１５． 遺伝子再構成が融合がん遺伝子を含む、項目14記載の方法。
１６． 核酸産物が次世代シークエンシング法によってシークエンシングされる、項目1〜15のいずれか一項に記載の方法。
１７． 次世代シークエンシング法が、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454；Massively Parallele Signature Sequensing、固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング；およびDNAナノボールシークエンシングからなる群より選択される方法を含む、項目16記載の方法。
１８． 第一および第二のシークエンシングプライマーが、選択された次世代シークエンシング法と適合性である、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
１９． 試料または試料の個別の部分に、第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットを接触させる段階を含む、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
２０． 試料を含む1つの反応混合物に、第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットを接触させる段階を含む、項目１〜19のいずれか一項に記載の方法。
２１． 第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットが、別個の遺伝子に含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールする、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
２２． 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のターゲットヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールする、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
２３． 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のターゲットヌクレオチド配列を含む1つの遺伝子の異なる部分に特異的にアニールする、項目1〜22のいずれか一項に記載の方法。
２４． 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のヌクレオチドターゲット配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールする、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
２５． 複数の第一のターゲット特異的プライマーが、同一の5'タグ配列部分を含む、項目19〜24のいずれか一項に記載の方法。
２６． ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターがバーコード部分をさらに含む、項目1〜25のいずれか一項に記載の方法。
２７． 多数の試料に各々、ユニークバーコード部分を有するユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターを接触させ、かつ試料が段階（a）の後にプールされる、項目26記載の方法。
２８． 各増幅段階が、長さが5サイクルから20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含む、項目1〜27のいずれか一項に記載の方法。
２９． ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーが、約61から72℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計される、項目1〜28のいずれか一項に記載の方法。
３０． ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーが、約65℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計される、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
３１． 試料が、対象から得られた生物試料を含む、項目1〜30のいずれか一項に記載の方法。
３２． 試料が遺伝子変化に関連する疾患の処置を必要とする対象から得られる、項目1〜31のいずれか一項に記載の方法。
３３． 疾患ががんである、項目32記載の方法。
３４． 試料が腫瘍細胞集団を含む、項目1〜33のいずれか一項に記載の方法。
３５． 試料が腫瘍生検を含む、項目1〜34のいずれか一項に記載の方法。
３６． がんが肺がんである、項目1〜35のいずれか一項に記載の方法。
３７． 既知のターゲット配列が疾患関連遺伝子に含まれる、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
３８． 既知のターゲット配列が試料中の遺伝子再構成産物に含まれる、項目1〜37のいずれか一項に記載の方法。
３９． 遺伝子再構成産物が、がん遺伝子である、項目1〜38のいずれか一項に記載の方法。
４０． 既知のターゲット配列がALK、ROS1、およびRETからなる群より選択される遺伝子からの配列を含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の方法。
４１． 第一のターゲット特異的プライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも1セットが、SEQ ID NO: 5と6；SEQ ID NO: 7と8；SEQ ID NO: 9と10；SEQ ID NO: 11と12；SEQ ID NO: 13と14；SEQ ID NO: 15と16；SEQ ID NO: 17と18；SEQ ID NO: 19と20；SEQ ID NO: 21と22；SEQ ID NO: 23と24；SEQ ID NO: 25と26；SEQ ID NO: 27と28；SEQ ID NO: 29と30；SEQ ID NO: 31と32；SEQ ID NO: 33と34；SEQ ID NO: 35と36;およびSEQ ID NO: 37と38からなる群より選択される、項目40記載の方法。
４２． 対象の腫瘍から得られた試料中にALKの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、項目40〜41のいずれかに記載の方法。
４３． 対象の腫瘍から得られた試料中にROS1の遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ROS阻害剤；ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、項目40〜41のいずれかに記載の方法。
４４． 対象の腫瘍から得られた試料中にRETの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、項目40〜41のいずれかに記載の方法。
４５． がんの処置を必要とする対象から得られた腫瘍試料において、項目1〜44のいずれか一項に記載の方法に従う1つまたは複数のがん遺伝子再構成の存在を検出する段階、
検出された任意のがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効であるがんの処置を投与する段階
を含む、がんを処置する方法。
４６． ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置が、ALKがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効である、項目45記載の方法。
４７． ROS1阻害剤；ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置が、ROS1がん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効である、項目45記載の方法。
４８． RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置が、RETがん遺伝子再構成を有する腫瘍に対して有効である、項目45記載の方法。
４９． 対象から得られた腫瘍試料において、項目1〜44のいずれか一項に記載の方法に従うがん遺伝子再構成の存在を検出する段階であって、がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象ががん遺伝子再構成産物を標的とする処置に対して応答性であることが決定される、段階を含む、がんの処置を必要とする対象が所定の処置に応答するか否かを決定する方法。
５０． ALKがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象がALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性である、項目49記載の方法。
５１． ROS1がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象がALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性である、項目49記載の方法。
５２． RETがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象が、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置に対して応答性である、項目49記載の方法。
５３． がんが肺がんである、項目44〜52のいずれか一項に記載の方法。

実施例1
1つの態様において、本明細書において、新たなまたはホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）標本から鋳型としてRNAまたはゲノムDNAを用いて迅速かつ効率的なターゲットエンリッチメントを行うことができる、次世代シークエンシングライブラリ構築のために新規半切断型「Y」字アダプターを用い、その後に2回のシングルエンドネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うアッセイが記述される。このエンリッチメント法により、遺伝子変化（一ヌクレオチド変種、挿入／欠失、およびコピー数）、後成的変化（メチル化）、遺伝子発現、およびゲノム再構成の検出の可能性に関するcDNAまたはgDNAのターゲットリシークエンシングが可能となる。

次世代シークエンシングの前のターゲットエンリッチメントは、全ゲノム、全エキソーム、および全トランスクリプトームシークエンシングより費用効果が高く、それゆえ研究開発および臨床適用の両方の幅広い実践にとってより現実的である。ターゲットエンリッチメントアプローチによって得られる高いカバレッジ深度により、がんにおける体細胞変異の評価にとって重要な特色である、対立遺伝子計数（遺伝子発現およびコピー数評価において）および低頻度変異の検出にとってより広いダイナミックレンジが可能となる。全ゲノムまたは全エキソームシークエンシングを広く実践することができるようになる前では、臨床での次世代シークエンシングの主流は、個々の数の遺伝子ターゲットを有する疾患パネルを選択する段階を伴うであろう。同様に、定義された遺伝子ターゲットに基づいて大きい試料サイズの分析を行う調査研究もまた、遺伝子タイピングを行うための安価な手段を必要とする。本明細書において記述されるアッセイは、これらの状況の両方に適用可能であろう。

染色体間および染色体内再構成を検出する場合、全ゲノムまたはトランスクリプトームシークエンシングは、ゲノム再構成を新たに発見するために有用であり、関係する遺伝子／染色体パートナーが既知である必要はない。しかし、これらの全ゲノムおよびトランスクリプトームアプローチは、高コスト、低いシークエンシング深度による不良な感度、および非常に労力がかかるバイオインフォマティクス分析により、臨床の状況では現在のところ現実的ではない。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）は、検査室においてゲノム再構成を検出するための基準となる標準アッセイである；しかし、アッセイは処理能力が低く、その実施は、特殊な機器および専門的な知識／経験を必要とする。RT-PCRもまた、そのような再構成を検出するために有効であるが、5'および3'パートナーの両方が既知である必要があり、多数のターゲット／試料に規模拡大できない。

次世代シークエンシングのために一般的に用いられる予備的エンリッチメントアッセイの例には、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉アッセイ（TruSeq Capture, Illumina; SureSelect Hybrid Capture, Agilent）、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくアッセイ（HaloPlex, Agilent; AmpliSeq, Ion Torrent; TruSeq Amplicon, Illumina；エマルジョン／デジタルPCR, Raindance）が挙げられる。ハイブリダイゼーションに基づくアプローチは、捕捉プローブによってカバーされる標的となる配列のみならず、シークエンシング能をさらに消費する付近のオフターゲット塩基も捕捉する。加えて、これらの方法は比較的時間がかかり、労力がかかり、特異性が低い。PCR増幅に基づくアプローチは、より単純かつ迅速であるが、通常の設計ではターゲット座に隣接するフォワードおよびリバースプライマーの両方を必要とする。特に未知の融合パートナーによってゲノム再構成を検出する場合、PCRは適用できない。

本明細書において、次世代シークエンシングライブラリ構築のために新規半切断「Y」字型アダプターを用いるターゲットエンリッチメントアッセイが記述され、これによって新しいまたはFFPE標本からのcDNAまたはgDNAの迅速なシークエンシングが可能となる。図1は、一例としてIon Torrentシークエンシングのために半切断Y字アダプターを用いるターゲットエンリッチメントのためのライブラリ構築を概要する。重要なことに、この方法は、Illumina、SOLiD、および454を含むがこれらに限定されるわけではない任意の他の次世代シークエンシングプラットフォームに適合可能である。簡単に説明すると、無作為に剪断した二本鎖cDNAまたはgDNA鋳型を、末端修復して、アデニル化した後、片側または両側の末端をユニバーサルY字アダプターにライゲートして、PCRを開始するためおよびその後にシークエンシングを行うためのユニバーサル配列を作製することができる。PCRの初回ラウンドは、スタッファーテール（スタッファーテールは多数のターゲットを多重化するために役立つ）によってタグをつけたターゲット特異的プライマーおよび5' Y字アダプターオーバーハングでの20塩基と同じプライマーを用いる。PCRの第二ラウンドは、5' Y字アダプターオーバーハングでの30塩基と同じプライマー、および第一のターゲット特異的プライマーの3'下流でアニールする第二のタンデムネストターゲット特異的プライマーによって行われる。第二のタンデムネストプライマーは、シークエンシング技術に応じて下流のエマルジョンPCRまたはクラスタリングにとって必要な第二のプライマー配列によって5'でタグ付けされる。このシステムにおける高い特異性は、単一方向性のタンデムネストプライマーによって得られ、これは36〜40塩基またはそれより多く（プライマー間の間隔に依存して）のターゲット配列を有効にカバーする。極めて重要な点は、PCRのサイクル数は、用いられる開始核酸材料の量、プールした試料の数、およびターゲットの数に応じて最適化されうる点である。

要約すると、方法は、特異性のために2つの単一方向性のネステッドターゲット特異的プライマーを用いる2ラウンドのPCRのために利用される、共通の3'末端を有する全てのdsDNA断片に例外なくタグを付けるために半切断Y字アダプターを利用する。タグ付きネステッドプライマーを適用することによってまた、ゲノムまたはトランスクリプトームにおける多くの異なる部位を標的とする場合に、プライマーのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成の効果も回避される。ターゲットを多重化することに加えて、本明細書において記述される方法によってまた、個々の試料にユニークバーコード化アダプターがライゲートされるY字アダプターのライゲーション（段階2）後に多数の試料をプールすることができる。Y字アダプターのライゲーションを通してバーコード化した後、下流のターゲットエンリッチメントのために、多数の試料を1つの反応チューブにプールしてもよい。

ホモポリマーの結果としてのIon Torrentおよび454シークエンシングにおいて見いだされるエラーなどの、挿入および欠失シークエンシングエラーに対してより寛容であるゲノム再構成の検出とは対照的に、一塩基および多塩基変異（挿入および欠失を含む）の検出は、Illuminaシークエンシングプラットフォームによって行われうるより高い精度のシークエンシングを必要とする。この目的に関して、たとえばIlluminaフォワードアダプター配列（バーコード化または非バーコード化）によってタグをつけたプライマー、およびタグ付き遺伝子特異的ネステッドプライマー（IlluminaリバースプライマーによってタグをつけたGSP2）を用いて、Y字アダプターの突出している切断された3'アームを増幅することによって、半切断Y字アダプターライブラリをIlluminaライブラリに変換することができる。同様に、第一のPCRの段階3の際のタグ付きプライマーを用いて、突出している切断された3' Y字アダプターアームを介してシークエンシングプライマーを導入することによって、両方向のシークエンシングも同様に行うことができる。

本明細書において記述されるアッセイおよび方法は、ROS1キナーゼドメインを含む7個のエキソンを標的とする7個の遺伝子特異的プライマーを用いてROS1遺伝子融合型を検出するために、FFPE標本に由来するcDNAに適用されている。ROS1ゲノム再構成は、「SLC34A2エキソン12−ROS1エキソン34」および「EZRエキソン9−ROS1エキソン34」融合型などの、既知の融合パートナーとこれまで未知の融合パートナーによって検出された。アッセイは、高いオンターゲット特異性（ヒトゲノムhgl9リファレンスを用いてマッピングした場合に〜85から95％）を示し、これによってIon Torrent PGM314チップなどの最小規模のシークエンシングプラットフォーム（およびこのように最も少ない費用で）であっても高いカバレッジ結果で（ターゲット座7個、試料5個、試料あたり各ターゲットに関して＞1000×カバレッジ）、多数の試料のシークエンシングを行うことができる。図2は、遺伝子ROS1キナーゼドメインにおけるターゲット座に対するシークエンシングリードのマッピングを示す。

本明細書において記述される方法の利点には、以下が挙げられる：
1．本明細書において記述される方法は、新しいまたはFFPE試料からの二本鎖cDNAまたはgDNAのターゲットエンリッチメントのために利用することができ、次世代シークエンシングを用いてターゲットcDNAまたはgDNA断片の5'および3'末端両方のマッピングが可能となる。現行のハイブリダイゼーションに基づくアプローチは、準備およびハイブリダイゼーションのために日数を要し、付近のオフターゲット配列の捕捉により、より低い特異性を示す。現行の増幅に基づくアプローチは、設計上、既知のフォワードおよびリバースプライマーが必要であり、ターゲットの大規模多重化には利用できない。
2．単純なバイオインフォマティクス分析。選択した標的の数に応じて、このアッセイから得られたデータの分析は、単純かつ迅速である。加えて、既存のバイオインフォマティクスツールとも適合するように設定されうる。このように、小規模臨床検査室であっても、次世代シークエンシングを広く臨床で実施する際の制限となるバイオインフォマティクスにおける有意な投資の必要なく、データ分析を行うことができる。
3．高い特異性（約85〜95％）。ルーチンのライブラリ構築のためにフォワードおよびリバースプライマー（5'および3'オーバーハング）の両方の成分を有する通常のY字アダプター構築物は、「シークエンシング可能な」ゲノムまたはトランスクリプトームライブラリ開始材料のキャリーオーバーにより、バックグラウンドのオフターゲットシークエンシングを高レベルで導入するであろう。例として、ターゲットのサイズが100 bpで、1つのゲノムに2コピー存在する場合、ターゲット対ゲノム比は、約1：3×10⁷である。ハイブリダイゼーションに基づくアプローチは通常、ハイブリダイズしたターゲット断片をストレプトアビジンコーティング磁気ビーズによって引っ張り出すために、ビオチニル化オリゴヌクレオチドの餌を用いる。可能性がある3×10⁷の可能性の中からのわずか1つの非特異的結合事象によって、劇的に50％のオフターゲット率が起こりうる。半切断Y字アダプターを用いることにより、その後のシークエンシングのための調製段階において開始ライブラリ材料を増幅することができないことから、このバックグラウンドのキャリーオーバー問題が有効に回避される。追加の特異性は、2つの単一方向性のプライマー、すなわちGSP1の3'下流のGSP2を用いることによって得られる。実際に、2つのタンデムプライマーを用いることにより、1つのみのプライマーを用いる場合より、40個のターゲットプライミング部位（長さ20塩基対のプライマー2個を仮定する）および高い特異性が得られる。第一のPCRにおいて5'の20-merプライマーおよび第二のPCRにおいて完全な30-merプライマー（ユニバーサルプライミング部位に関してネステッドプライマーとして作用する）を用いることにより、特異性はさらに増加する。最後に、両方のPCR段階に関してタグ付きプライマーを用いることによって、追加の特異性が得られる。タグ付きプライマーは、分子内ヘアピンの形成を通して、PCR反応を圧倒して非特異的で望ましくない人為的産物を産生しうるプライマーのホモ二量体およびヘテロ二量体の増加を防止する。それゆえ、タグ付きプライマーによって、プライマー二量体を回避しながら多くのターゲットを多重化することができる。
4．経済的コスト。本明細書において記述される方法の重要な成分は、通常の修飾されていないタグ付きプライマー、標準的なPCR試薬、およびルーチンのサーモサイクリングである。ハイブリダイゼーションに基づく捕捉法またはマイクロフルイディックデジタルPCRセットアップとは異なり、記述のターゲットエンリッチメントプロトコールは、比較的高価なビオチニル化オリゴヌクレオチド、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ、および特殊な機器を用いる必要がない。一度製造されると、プールされたGSP1およびGSP2プライマーミクスは、何千もの反応のために用いられうる。
5．自動化。本明細書において記述される方法は、標準的なPCR技術およびSPRIクリーンアップに依存することから、ハイスループット適用において容易に自動化される可能性がある。体積は、ウルトラハイスループット実行のために384ウェルプレートに合うように調節される。

本明細書において記述される方法およびアッセイの適用は、以下を含むがこれらに限定されるわけではない：1．遺伝子ALK、ROS1、およびRETを含む既知の治療ターゲットからなる肺がん転座パネル；2．リンパ腫および白血病におけるゲノム再構成を検出するためのパネルを含む血液悪性疾患パネル；3．肉腫ゲノム再構成パネル；4．リンパ腫の試験のためのIGH/TCR遺伝子再構成パネル；5．リシークエンシングのための標的化疾患遺伝子パネル（10〜100個の遺伝子）；6．大規模シークエンシングプロジェクトからの変種を確認するための標的化リシークエンシング；7．全エキソーム標的化リシークエンシングの可能性；8．一ヌクレオチド変種、多ヌクレオチド変種、挿入、欠失、コピー数の変化、およびメチル化状態を検出するための標的化リシークエンシング；9．微生物相シークエンシング；10．古い試料のシークエンシング；11．新規変種ウイルスの遺伝子タイピング。

実施例2：ALK、ROS1、およびRET遺伝子再構成を同時に検出するための標的化次世代シークエンシングアッセイ
がんにおける染色体再構成状態が既知であることは、個別化標的化治療にとって重要である。最近、肺がんにおける再構成に関係する3つの主要な受容体チロシンキナーゼが記述されている。ALK遺伝子を伴う遺伝子再構成は、治療標的として確立されている。初期の臨床試験データもまた、ROS1阻害剤が、ROS1再構成に関して試験陽性である患者を処置するために有効であることを示唆している。インビトロの証拠から、RET再構成を有する腫瘍細胞がRET阻害剤に対して応答性であることが示されている。このため、ALK、ROS1およびRETは現在のところ、肺がんにおける3つの重要な治療ターゲットを表す。

遺伝子再構成を検出するための現在の臨床アッセイは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）、免疫組織化学（IHC）、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を含む。FISHおよびIHCは、その低い処理能力、高いコスト、および複雑な解釈により、大きい体積の試験／スクリーニングに関する増えつつある需要に適応することができない。RT-PCRアッセイは、両方の融合パートナーが完全に既知である必要があり、このため、時に利用できず、臨床での感度に有効に影響を及ぼす。多重RT-PCRは、2つの既知の融合パートナー間に異なるエキソンを含む変種融合型を検出するために用いられている。一般的に、これらのアッセイは、多数の反応セットアップおよび分析を必要とする時間アプローチで1つの遺伝子ターゲットに限定される。

トランスクリプトームまたはターゲット捕捉シークエンシングのための最新の次世代シークエンシングに基づくアッセイは、大規模シークエンシング施設において主に研究開発の目的のために適用されている。研究の状況のこれらのアッセイでは、ターゲットが多数であるためにシークエンシング深度が低く、このため分析感度は低くなり、および臨床感度も不良となる。大規模のシークエンシング施設では余裕があるものの、これらのアッセイは、多くの臨床検査室ではなおも手が届かない。

本明細書において上記で、新しいまたはホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）標本から鋳型としてRNAまたはゲノムDNAを用いる迅速かつ効率的なターゲットエンリッチメントを行うことができる、次世代シークエンシングライブラリ構築のために新規半切断「Y」字型アダプターを適用し、その後に2回のシングルエンドネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行う標的化シークエンシング法に関連する方法およびアッセイを記述する。

この方法に基づいて、本実施例において、ALK、ROS1、およびRET遺伝子再構成を検出するための特異的アッセイが記述される（図3A〜3B）。遺伝子特異的プライマー（GSP1）は、キナーゼドメイン付近またはキナーゼドメインにおけるエキソンをプライミングするように設計される。ネステッドプライマー（GSP2）は、GSP1の下流であるが、同じエキソン内でその対を形成したGSP1の近位をプライミングするように設計される。パネルは現在、ROS1エキソン31から37を標的とするプライマー7対；ALKエキソン19から22を標的とするプライマー4対；およびRETエキソン8から13を標的とするプライマー6対を含む。

このアッセイは、半機能的「Y」字アダプター構成に従うプラットフォーム特異的アダプター配列およびGSP2プライマーを用いることによって、異なるNGSシークエンシングプラットフォームに適合させることができる。シークエンシング後、リードをヒトゲノムリファレンスにマップして、融合パートナー遺伝子、選択的スプライシングの同定を行うと共に、本発明者らによって開発されたバイオインフォマティクスアルゴリズムを用いて融合型のフレーム状態を同定することができる（たとえば、図4Aおよび4B）。得られた産物は、迅速に報告するための単純なアノテーションを付与した表である（図4C）。多数の試料のバーコード化を伴うこの3つの遺伝子ターゲットパネルアッセイを用いて、ROS1、ALK、およびRET再構成陽性試料は、1つのIon Torrentシークエンシング実行を用いて検出されている。

このアッセイは、分子診断試験に関する最も広く入手可能な臨床材料であるホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）標本から抽出されたRNAなどの分解したRNAに適用可能である。このアッセイは、ベンチトップNGSプラットフォーム、単純なインフォマティクス分析パイプラインを利用し、それゆえ臨床検査室で比較的容易に行われる。極めて重要なことに、このアッセイは、融合パートナーが既知である必要がなく、主なターゲット遺伝子に関連する様々な遺伝子パートナー（および対応する多数のエキソン）の検出において高い臨床感度が得られるであろう。加えて、アッセイは、パートナーの1つが既知である限り、未知の5'上流または3'下流の融合パートナーの両方に関して機能的であろう。多重化および深部シークエンシングにより、低い腫瘍細胞充実度、まれな融合型、およびまれな選択的スプライシング事象を有する試料を試験することが可能となる。このアッセイによって与えられる詳細な患者特異的再構成情報は、遺伝子タイプ特異的治療応答を評価するために、およびおそらく最少残留疾患モニタリングのための患者特異的腫瘍マーカーを評価するために有用であろう。通常のオリゴ合成試薬、すぐに入手可能な酵素、および多くの試料を1回の実行で多重化できることに基づいて、このアッセイは、遺伝子再構成を検出するための費用効果の高い臨床アッセイであろう。

（表1）Ion Torrentプラットフォームv1に適合させたプライマー。プライマーの名称は、ターゲット遺伝子、および既知のターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子エキソンを示す。R1は第一のターゲット特異的プライマーを指し、R2は第二のターゲット特異的プライマーを指す。この表において、第一のターゲット特異的プライマーおよび各遺伝子の記載される各エキソンに対して特異的な1つの第二のターゲットの1セットが詳述される。

Claims (49)

1. 既知のターゲットヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列を決定する方法であって、
   （a）既知のターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸にユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターをライゲートする段階；
   （b）第一のアダプタープライマーおよび第一のターゲット特異的プライマーによって、ターゲット核酸の一部分およびユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターの増幅鎖を増幅する段階；
   （c）段階（b）から得られたアンプリコンの一部分を、第二のアダプタープライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーによって増幅する段階；
   （d）第一および第二のシークエンシングプライマーを用いて段階（c）の増幅部分をシークエンシングする段階
   を含み、
   ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターが第一のライゲート可能な二本鎖末端および第二の不対合末端を含み；
   ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターがブロック鎖および増幅鎖を含み、；
   ブロック鎖が5'二本鎖部分を含み；
   増幅鎖が5'不対合部分、3'二本鎖部分、および3' Tオーバーハングを含み；
   増幅鎖が第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含み；
   ブロック鎖および増幅鎖の二本鎖部分が、実質的に相補的であり、かつ3' Tオーバーハングを含む第一のライゲート可能な二本鎖末端を形成し；
   二本鎖部分が、ライゲーション温度で二本鎖型を保つのに十分な長さであり；
   第一のターゲット特異的プライマーが、アニーリング温度でターゲット核酸の既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールすることができる核酸配列を含み；
   第二のターゲット特異的プライマーが、段階（b）から得られたアンプリコンに含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列の一部分に特異的にアニールすることができる核酸配列を含む3'部分と、第二のシークエンシングプライマーと同一である核酸配列を含む5'部分とを含み、かつ第二のターゲット特異的プライマーが第一のターゲット特異的プライマーに関してネスト化しており；
   第一のアダプタープライマーが第一のシークエンシングプライマーの5'部分と同一である核酸配列を含み；ならびに
   第二のアダプタープライマーが第一のシークエンシングプライマーの一部分と同一である核酸配列を含み、かつ第一のアダプタープライマーに関してネスト化している、方法。
2. ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターのブロック鎖が、増幅鎖の5'不対合部分と実質的に相補的でない3'不対合部分をさらに含み、かつ
   ブロック鎖の3'不対合部分がプライマーのいずれとも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない、請求項1記載の方法。
3. 第二のアダプタープライマーが第一のアダプタープライマーに関して少なくとも3ヌクレオチド、ネスト化している、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
4. 第一および第二のシークエンシングプライマーと同一の核酸配列を含む増幅鎖の一部分が少なくとも部分的に、増幅鎖の5'不対合部分に含まれる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
5. 第一のターゲット特異的プライマーが、プライマーのいずれの任意の他の部分とも実質的に相補的でなくかつ実質的に同一でない高GC含有量の核酸配列を含む5'タグ配列部分をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6. 第二のアダプタープライマーが完全長の第一のシークエンシングプライマーと同一である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
7. 既知のターゲットに特異的にアニールするターゲット特異的プライマーの一部分が、PCR緩衝液において約65℃の温度で特異的にアニールする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
8. 段階（a）の前に、以下の段階をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法：
   核酸を機械的に剪断する段階；
   核酸を末端修復に供する段階；
   核酸をリン酸化に供する段階；および
   核酸をアデニル化に供する段階。
9. 試料がゲノムDNAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
10. 試料がRNAを含み、かつ方法が試料を逆転写酵素レジメンに供する第一の段階をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
11. 逆転写酵素レジメンがランダムヘキサマーの使用を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
12. 既知のターゲット配列が遺伝子再構成に含まれる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
13. 遺伝子再構成が、ゲノムDNA、RNA、およびcDNAからなる群より選択される核酸に存在する、請求項12記載の方法。
14. 遺伝子再構成ががん遺伝子を含む、請求項12〜13のいずれかに記載の方法。
15. 遺伝子再構成が融合がん遺伝子を含む、請求項14記載の方法。
16. 核酸産物が次世代シークエンシング法によってシークエンシングされる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
17. 次世代シークエンシング法が、Ion Torrent（商標）、Illumina（登録商標）、SOLiD（登録商標）、454（商標）；Massively Parallele Signature Sequensing、固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング；およびDNAナノボールシークエンシングからなる群より選択される方法を含む、請求項16記載の方法。
18. 第一および第二のシークエンシングプライマーが、選択された次世代シークエンシング法と適合性である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
19. 試料または試料の個別の部分に、第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットを接触させる段階を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
20. 試料を含む1つの反応混合物に、第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットを接触させる段階を含む、請求項１〜19のいずれか一項に記載の方法。
21. 第一および第二のターゲット特異的プライマーの複数のセットが、別個の遺伝子に含まれる既知のターゲットヌクレオチド配列に特異的にアニールする、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
22. 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のターゲットヌクレオチド配列の異なる部分に特異的にアニールする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
23. 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のターゲットヌクレオチド配列を含む1つの遺伝子の異なる部分に特異的にアニールする、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
24. 第一および第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも2セットが、既知のヌクレオチドターゲット配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
25. 複数の第一のターゲット特異的プライマーが、同一の5'タグ配列部分を含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の方法。
26. ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターがバーコード部分をさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
27. 多数の試料に各々、ユニークバーコード部分を有するユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプターを接触させ、かつ試料が段階（a）の後にプールされる、請求項26記載の方法。
28. 各増幅段階が、長さが5サイクルから20サイクルのPCR増幅レジメンのサイクルセットを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
29. ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーが、約61から72℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
30. ターゲット特異的プライマーおよびアダプタープライマーが、約65℃のアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールするように設計される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
31. 試料が、対象から得られた生物試料を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
32. 試料が遺伝子変化に関連する疾患の処置を必要とする対象から得られたものである、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
33. 疾患ががんである、請求項32記載の方法。
34. 試料が腫瘍細胞集団を含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
35. 試料が腫瘍生検を含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
36. がんが肺がんである、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
37. 既知のターゲット配列が疾患関連遺伝子に含まれる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
38. 既知のターゲット配列が試料中の遺伝子再構成産物に含まれる、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
39. 遺伝子再構成産物が、がん遺伝子である、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
40. 既知のターゲット配列がALK、ROS1、およびRETからなる群より選択される遺伝子からの配列を含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
41. 第一のターゲット特異的プライマーおよび第二のターゲット特異的プライマーの少なくとも1セットが、SEQ ID NO: 5と6；SEQ ID NO: 7と8；SEQ ID NO: 9と10；SEQ ID NO: 11と12；SEQ ID NO: 13と14；SEQ ID NO: 15と16；SEQ ID NO: 17と18；SEQ ID NO: 19と20；SEQ ID NO: 21と22；SEQ ID NO: 23と24；SEQ ID NO: 25と26；SEQ ID NO: 27と28；SEQ ID NO: 29と30；SEQ ID NO: 31と32；SEQ ID NO: 33と34；SEQ ID NO: 35と36;およびSEQ ID NO: 37と38からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
42. 対象の腫瘍から得られた試料中にALKの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、請求項40〜41のいずれかに記載の方法。
43. 対象の腫瘍から得られた試料中にROS1の遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、ROS阻害剤；ALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、請求項40〜41のいずれかに記載の方法。
44. 対象の腫瘍から得られた試料中にRETの遺伝子再構成が存在すれば、腫瘍が、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置による処置に対して感受性を有することが示される、請求項40〜41のいずれかに記載の方法。
45. 対象から得られた腫瘍試料において、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法に従うがん遺伝子再構成の存在を検出する段階であって、がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象ががん遺伝子再構成産物を標的とする処置に対して応答性であることが決定される、段階を含む、がんの処置を必要とする対象が所定の処置に応答するか否かを決定する方法。
46. ALKがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象がALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性である、請求項45記載の方法。
47. ROS1がん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象がALK阻害剤；クリゾチニブ（PF-02341066）；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；およびNVP-TAE684からなる群より選択される処置に対して応答性である、請求項45記載の方法。
48. RETがん遺伝子再構成の存在が検出されれば、対象が、RET阻害剤；DP-2490；DP-3636；SU5416；BAY 43-9006；BAY 73-4506（レゴラフェニブ）；ZD6474；NVP-AST487；ソラフェニブ；RPI-1；XL184；バンデタニブ；スニチニブ；イマチニブ；パゾパニブ；アキシチニブ；モテサニブ；ゲフィチニブ；およびウィザフェリンAからなる群より選択される処置に対して応答性である、請求項45記載の方法。
49. がんが肺がんである、請求項44〜48のいずれか一項に記載の方法。

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