CN104603287A - 用于测定核苷酸序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本文所述的技术针对例如通过在对序列进行测序前富集靶序列来测定寡核苷酸序列的方法。

Description

用于测定核苷酸序列的方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年5月10日提交的U.S.临时申请号61/645,364和2012年8月3日提交的U.S.临时申请号61/679,302的优先权，以引用的方式将其内容全部并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已通过EFS-Web以ASCII形式提交，并以引用的方式将其全部并入本文。所述ASCII副本于2013年3月8日创建，命名为030258-074962-PCT_SL.txt，大小为41,722字节。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号5R21CA161590的联邦资助下完成的。美国政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本文所述的技术涉及测定寡核苷酸序列的方法。
背景技术
相比全基因组、全外显子组以及全转录组测序，下一代测序(next-generation sequencing)前的靶富集更具成本效益，因此更适于在研究发现和临床应用中广泛实施。例如，由靶富集方法提供的高覆盖深度(highcoverage depth)能够实现较宽动态范围的等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)以及对低频突变的检测(用于评价癌症中的体细胞突变的关键特征)。目前用于下一代测序的富集方案的实例包括：基于杂交的捕获分析(TruSeq Capture，Illumina；SureSelect Hybrid Capture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的分析(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，Ion Torrent；TruSeq Amplicon，Illumina；乳液/数字PCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获到被捕获探针覆盖的靶向序列，还捕获到了消耗测序能力的附近的脱靶碱基(near off-target bases)。此外，这些方法都比较费时、劳动密集、并且特异性水平较低。基于PCR扩增的方法较简单且较快速，但根据常规设计需要使用位于靶基因座两翼的正向引物和反向引物。特别地，对于检测具有未知融合伴侣(fusion partner)的基因组重排(genomic rearrangements)来说，PCR是不适用的。
发明内容
本文所述的技术针对测定寡核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，本文所述的方法涉及在对序列进行测序前对靶序列进行富集。
在一个方面，本文所述的技术涉及测定与已知靶核苷酸序列邻接(contiguous to)的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部接头(adaptor)连接；(b)用第一接头引物和第一靶特异性引物扩增所述靶核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接头的扩增链；(c)用第二接头引物和第二靶特异性引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分；(d)使用第一测序引物和第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序；其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含第一可连接双链末端和第二未配对末端；其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含封闭链(blocking strand)和扩增链(amplification strand)；其中，所述封闭链包含5’双链部分；其中，所述扩增链包含未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出(overhang)；其中，所述扩增链包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列；其中，所述封闭链和所述扩增链的双链部分基本上(substantially)互补，并形成包含3’T突出的第一可连接双链末端；其中，所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式；其中，所述第一靶特异性引物包含能在退火温度下特异性退火至所述靶核酸的已知靶核苷酸序列的核酸序列；其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分含有能够特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分含有与第二测序引物相同的核酸序列，并且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套(nested)；其中，所述第一接头引物包含与所述第一测序引物的5’部分相同的核酸序列；以及其中，所述第二接头引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于所述第一接头引物嵌套。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的封闭链可进一步包含3’未配对部分，所述3’未配对部分基本上不与扩增链的5’未配对部分互补；以及其中，封闭链的3’未配对部分基本上不与任何引物互补，或基本上不同于任何引物。在一些实施方式中，第二接头引物可通过至少3个核苷酸相对于第一接头引物嵌套。在一些实施方式中，含有与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列的扩增链的部分可至少部分包含于扩增链的5’未配对部分中。
在一些实施方式中，第一靶特异性引物可进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不同于任何引物的任何其它部分的高GC含量的核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物可进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含在退火温度下不会特异性退火至任何引物或其互补物的任何其它部分的高GC含量的核酸序列。在一些实施方式中，第二接头引物可与全长第一测序引物相同。在一些实施方式中，特异性退火至已知靶的靶特异性引物的部分可在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
在一些实施方式中，所述方法可进一步在步骤(a)之前包括如下步骤：对核酸进行机械剪切；使所述核酸经历末端修复；使所述核酸经历磷酸化；以及使所述核酸经历腺苷酸化。在一些实施方式中，样品可包括基因组DNA。在一些实施方式中，样品可包括RNA，并且所述方法可进一步包括使所述样品经历逆转录酶方案(reverse transcriptase regimen)的第一步骤。在一些实施方式中，所述逆转录酶方案可包括使用随机六聚体(random hexamers)。
在一些实施方式中，已知靶序列可包含于基因重排(generearrangement)中。在一些实施方式中，基因重排可存在于选自于由如下核酸所组成的组中的核酸中：基因组DNA、RNA和cDNA。在一些实施方式中，基因重排可包含癌基因(oncogene)。在一些实施方式中，基因重排可包含融合癌基因。
在一些实施方式中，可通过下一代测序法对核酸产物进行测序。在一些实施方式中，下一代测序法可包括选自于由以下方法所组成的组中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing)、固相可逆染料终止物测序(reversible dye-terminator sequencing)以及DNA纳米球测序(DNAnanoball sequencing)。在一些实施方式中，第一测序引物和第二测序引物兼容所选的下一代测序法。
在一些实施方式中，所述方法可包括将样品或样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。在一些实施方式中，所述方法可包括将包含样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。在一些实施方式中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至由不同基因所包含的已知靶核苷酸序列。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至已知靶核苷酸序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的基因的不同外显子。在一些实施方式中，多个第一靶特异性引物可包含相同的5’标签序列部分。在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头可进一步包含条形码部分(barcode portion)。在一些实施方式中，可将多种样品各自与具有独特(unique)条形码部分的通用寡核苷酸尾部接头接触，其中，在步骤(a)后将所述样品合并(pooled)。
在一些实施方式中，各个扩增步骤可包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，可将靶特异性引物和接头引物设计成在约61-72℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，可将靶特异性引物和接头引物设计成在约65℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。
在一些实施方式中，样品可包括获得自受试者的生物样品。在一些实施方式中，样品可获得自需要治疗与遗传改变(genetic alteration)相关的疾病的受试者。在一些实施方式中，疾病可为癌症。在一些实施方式中，样品可包括肿瘤细胞群。在一些实施方式中，样品可包括肿瘤活组织切片(biopsy)。在一些实施方式中，癌症可为肺癌。
在一些实施方式中，已知靶序列可包含于疾病相关基因中。在一些实施方式中，已知靶序列可包含于样品中的基因重排产物中。在一些实施方式中，基因重排产物可为癌基因。
在一些实施方式中，已知靶序列可包含来自选自以下基因的组中的基因的序列：ALK、ROS1和RET。在一些实施方式中，至少一组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可选自于由以下引物所组成的组：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQID NO：25和SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；SEQID NO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
在一些实施方式中，在从受试者的肿瘤获得的样品中，ALK的基因重排的存在可说明肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ALK抑制剂、克唑替尼(crizotinib)(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
在一些实施方式中，在从受试者的肿瘤获得的样品中，ROS1的基因重排的存在可说明肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ROS抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
在一些实施方式中，在从受试者的肿瘤获得的样品中，RET的基因重排的存在可说明肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼，regorafenib)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼(sorafenib)、RPI-1、XL184、凡德他尼(vandetanib)、舒尼替尼(sunitinib)、伊马替尼(imatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、莫特塞尼(motesanib)、吉非替尼(gefitinib)以及醉茄素A(withaferin A)。
在一个方面，本文所述的技术涉及治疗癌症的方法，所述方法包括：根据本文所述的方法，对获得自需要治疗癌症的受试者的肿瘤样品中一种以上癌基因重排的存在进行检测；给予对于具有任何检测到的癌基因重排的肿瘤有效的癌症治疗。在一些实施方式中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂可对于具有ALK癌基因重排的肿瘤有效：ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。在一些实施方式中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂可对于具有ROS1癌基因重排的肿瘤有效：ROS1抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。在一些实施方式中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂可对于具有RET癌基因重排的肿瘤有效：RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
在一个方面，本文所述的技术涉及测定需要治疗癌症的受试者是否会对给定治疗作出响应的方法，所述方法包括：根据本文所述的方法，对获得自受试者的肿瘤样品中癌基因重排的存在进行检测；其中，如果检测到存在癌基因重排，确定所述受试者对靶向癌基因重排产物的治疗作出响应。
在一些实施方式中，当检测到存在ALK癌基因重排时，受试者可对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。在一些实施方式中，当检测到存在ROS1癌基因重排时，受试者可对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
在一些实施方式中，当检测到存在RET癌基因重排时，受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
在一些实施方式中，癌症可为肺癌。
附图说明
图1描绘了用于靶向RNA和DNA测序的文库构建实例的图示说明。1)使用来自FFPE样本的总核酸作为起始材料，应用双链cDNA合成的标准程序。或者，起始材料也可为剪切的gDNA。2)纯化(cleanup)后，使双链cDNA或gDNA经历末端修复和dA加尾，然后直接连接半截短(half-truncated)Y接头，其间不需要纯化。3)SPRI纯化后，使用多重基因特异性引物(GSP1)和Ion Torrent短长度正向引物A 5’20-mer(A20)，以65℃的退火温度使连接的样品经历14个循环的PCR扩增。4)第二SPRI纯化后，使用标记有Ion Torrent反向引物(P1_GSP2)的多重嵌套基因特异性引物(GSP1的3’下游并在同一方向)和正向引物A(全长30-mer)，以65℃的退火温度使样品经历另外的14个循环的PCR扩增。5)最后的第三SPRI纯化后，产物为准备好进行下游乳液PCR和测序的Ion Torrent文库。可在步骤2后进行样品合并。
图2描绘了映射(mapping)结果，证明在ROS1序列的一个测序运行中的不同引物(点)延伸产物，所述结果包括对应于基因组DNA(跨内含子-外显子边界)、cDNA(跨外显子)和融合cDNA(在外显子34上，融合伴侣SLC34A2上的映射在此处未示出)的读段(reads)。达到了91.8％的特异性(127,446/138,787)。
图3A以ROS1为例描绘了嵌套引物靶向策略的图解展示。关于ROS1、ALK和RET，分析靶组(assay target panel)包括总共17对GSP1和GSP2。图3B描绘了使用gDNA和cDNA模板的代表性延伸产物的可能类型。
图4A描绘了使用Integrative Genomics Viewer的可视化读段映射。图4B描绘了两个可变剪接融合序列的序列。图4C描绘了报告所涉及的基因(注释有外显子、读码框和融合读段覆盖度详情)中的融合转录本的总结表。
图5描绘了示例性测序运行的结果。
图6和图7分别描绘了ALK序列和RET序列的测序运行结果的实例。
图8描绘了本文所述的靶向测序方法的图解展示。
图9描绘了说明性的通用寡核苷酸尾部接头的示意图。
具体实施方式
本文所述技术的实施方式涉及对寡核苷酸序列进行测定(即，测序)的方法。在一些实施方式中，本文所述的方法涉及在测序步骤前富集靶序列的方法。在一些实施方式中，在测序步骤之前，待富集的靶序列的一个末端的序列是未知的。
为方便起见，下文提供了在说明书、实施例以及所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。提供所述定义以辅助描述具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果在本领域中术语的使用和本文所提供的术语定义之间存在明显不一致，应以本说明书中所提供的定义为准。
为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
本文使用的术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”通常都意味着统计学显著量的降低。然而，为避免疑义，“减少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”表示相比参比水平降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括降低100％(如，相比参比样品的缺失水平或不可检测水平)、或相比参比水平降低在10％到100％之间的任意量。在标志物(marker)或症状(symptom)的情况下，意味着这种水平的统计学显著降低。例如，所述降低可为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并优选降至被认为是未患此种病症的个体的正常范围内的水平。
本文使用的术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”通常都意味着统计学显著量的增加；为避免疑义，术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”表示相比参比水平增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。
本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛(cows)、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼(trout)、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物，例如，灵长类动物、如人类。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者为哺乳动物。所述哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利于用作代表例如肺癌动物模型的受试者。受试者可以为雄性或雌性。
受试者可为先前已被诊断患有或鉴定为遭受或患有需要治疗的病症(例如，癌症)、或与此种病症相关的一种以上并发症的受试者，并且所述受试者任选已接受对所述病症或与所述病症相关的一种以上并发症的治疗。或者，受试者还可为先前未曾被诊断为患有所述病症(例如，癌症)或与所述病症相关的一种以上并发症的受试者。例如，受试者可为表现出针对所述病症或与所述病症相关的一种以上并发症的一种以上风险因素的受试者，或者可为并未表现出风险因素的受试者。
对于特定病症的治疗“有需要的受试者”可为患有该病症、被诊断为患有该病症、或处于发展为该病症的风险中的受试者。
本文所使用的“与遗传改变相关的疾病”指的是至少部分由相对于健康野生型受试者而言受试者的遗传物质的改变(例如，删除、插入、SNP、基因重排)引起的任何疾病。如果改变增加受试者发展成疾病的风险、增加受试者对疾病(包括传染性疾病或具有传染性组分的疾病)的易感性、引起疾病相关分子的产生、或使细胞变为患病的或不正常的(例如，癌细胞中细胞周期调控的缺失)，疾病可至少部分由受试者遗传物质中的所述改变引起。疾病可与多种遗传改变相关，例如，癌症。
本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，模板核酸为DNA。在另一方面，模板为RNA。合适的核酸分子为DNA，包括基因组DNA或cDNA。其它合适的核酸分子为RNA，包括mRNA。
在核酸的情况下，本文所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”涉及从在其天然来源中与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸；和/或从当由细胞表达时会与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。
术语“基因”是指当可操作地连接至合适调控序列时在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。所述基因可包括编码基因之前和之后的调控区域，例如，5’非翻译(5’UTR)序列或“前导(leader)”序列；以及3’UTR或“尾随(trailer)”序列；以及各编码片段(外显子)之间的间插序列(intervening sequences)(内含子)。
本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对形成偏好的等级制度(hierarchy)，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。本文所使用的“基本上互补”指核酸分子或其部分(例如，引物)在所述分子或其部分的全长内与第二核苷酸序列具有至少90％的互补性，例如，90％互补、95％互补、98％互补、99％互补或100％互补。本文所使用的“基本上相同”指核酸分子或其部分在所述分子或其部分的全长内与第二核苷酸序列具有至少90％的一致性，例如，90％一致、95％一致、98％一致、99％一致或100％一致。
在特异性针对靶核酸的引物的情况下，本文所使用的“特异的”指引物与靶标之间的互补性水平，这样的互补性水平使得存在这样的退火温度：在该退火温度时，引物将退火至所述靶核酸并介导所述靶核酸的扩增、而并不退火至样品中的非靶序列或介导样品中的非靶序列的扩增。
本文所使用的“扩增产物(amplified product/amplification product)”或“扩增子(amplicon)”是指由PCR反应产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸是特定靶核酸模板链和/或其互补序列的一部分的拷贝，其在核苷酸序列上对应于所述模板寡核苷酸序列和/或其互补序列。扩增产物可进一步包含对引物具有特异性的序列和位于序列(其为所述靶核酸和/或其互补物的一部分)两侧的序列。虽然可以参考其单个链，本文所述的扩增产物通常将为双链DNA。
本文所使用的核酸分子的“部分(portion)”是指由该分子包含的连续核苷酸集(contiguous set of nucleotides)。部分可包含由该分子包含的核苷酸的全部或仅子集。部分可为双链的或单链的。
本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗处理，其中，目的是扭转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如，肺癌)相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症、与病症有关的疾病或紊乱的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物得到减少，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病进展得到减少或停止，则治疗是“有效”的。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，也包括与未得到治疗时所预期的情况相比而言症状进展或恶化的中止或至少延缓。有益的或期望的临床结果包括但不限于：减轻一种或多种症状、降低疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或延缓疾病进展、改善或缓和(palliation)疾病状态、缓解(部分或全部)、和/或降低死亡率，无论上述结果是可检测的还是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或不良影响的舒缓(包括姑息治疗(palliative treatment))。
术语“统计学显著的(statistically significant)”或“显著地(significantly)”指统计显著性，并且通常意味着低于正常标志物浓度两个标准差(2SD)或更低。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。
本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”用于表示对方法或组合物必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响该实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的元素。
除非上下文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(forexample)”同义。
细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可以在如下著作中找到：“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，MerckResearch Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(著)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)。分子生物学中常用术语的定义还可在如下著作中找到：Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等(著)，Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Current Protocols in ProteinSciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等著。
除非另有说明，使用例如如下著作中所述的标准程序来进行本发明：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)；以及Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier SciencePublishing,Inc.，New York，USA(1995)，以引用的方式将其整体全部并入本文。
其它术语在本发明各个方面的描述中进行定义。
本文所述的是测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法。传统测序方法随机地生成序列信息(例如，“鸟枪”测序)，或用于设计引物的两个已知序列间的序列信息。相反，在一些实施方式中，本文所述的方法允许以高特异性水平和高灵敏度水平对已知序列的单个区域的上游或下游的核苷酸序列进行测定(例如，测序)。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及在使用下一代测序技术测定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，所述富集特定核苷酸序列的方法并不包括杂交富集。
在一些实施方式中，本文所述的技术可涉及测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部接头连接；(b)用第一接头引物和第一靶特异性引物扩增所述靶核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接头的扩增链；(c)用第二接头引物和第二靶特异性引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分；以及(d)使用第一测序引物和第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序。本文所使用的术语“靶核酸”涉及含有待测定的核酸序列和已知靶核苷酸序列这二者的核酸分子。所述靶核酸可为任何长度，并可为双链的或单链的。本文所使用的术语“已知靶核苷酸序列”是指其序列(例如，所述核酸所包含的核苷酸碱基的种类(identity)和顺序)已知的靶核酸的一部分。已知靶核苷酸序列可为10个以上核苷酸、优选30个以上核苷酸的任意长度(例如，30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸或更多核苷酸)。本文所使用的术语“与…邻接的核苷酸序列”是指与已知靶核苷酸序列位于相同核酸分子(即，靶核酸)上、且为所述已知靶核苷酸序列的上游或下游的核苷酸序列。所述与…邻接的核苷酸序列可包含任意长度的核苷酸序列。在一些实施方式中，与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列包含1kb以下的核苷酸序列，例如，1kb以下的核苷酸序列、750bp以下的核苷酸序列、500bp以下的核苷酸序列、400bp以下的核苷酸序列、300bp以下的核苷酸序列、200bp以下的核苷酸序列、100bp以下的核苷酸序列。在样品包含含有已知靶核苷酸序列的不同靶核酸(例如，已知靶核苷酸序列在基因组中、或在单独的不同染色体上出现多次的细胞)的情况下，可存在含有“与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列”的多个序列。本文所使用的术语“测定核苷酸序列”涉及测定核酸所含的核苷酸碱基的种类和相对位置。
在本文所述方法的步骤(a)中，可将通用寡核苷酸尾部接头连接至靶核酸。在一些实施方式中，靶核酸可包含于含有多种核酸的样品中，所述多种核酸中的一些并不含有所述靶核酸。在一些实施方式中，可将通用寡核苷酸尾部接头连接至样品中的基本上全部的核酸。在一些实施方式中，可将通用寡核苷酸尾部接头连接至含有靶核酸序列的核酸和不含靶核酸序列的核酸这两种核酸。
本文所使用的术语“通用寡核苷酸尾部接头”是指由两条链(封闭链和扩增链)构成的核酸分子，所述核酸分子包含第一可连接双链末端和第二未配对末端。通用寡核苷酸尾部接头的封闭链含有5’双链部分。扩增链含有未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出、以及与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列。封闭链和扩增链的双链部分基本上互补，并形成含有3’T突出的第一可连接双链末端，并且所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式。
在一些实施方式中，包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列的扩增链的部分可至少部分包含于扩增链的5’未配对部分。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头可包含双链部分和未配对部分，其中，所述未配对部分仅包含扩增链的5’部分，即，整个封闭链是双链部分。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头可为“Y”形，即，未配对部分可包含封闭链和扩增链二者的未配对部分。封闭链的未配对部分的长度可短于、长于或等于扩增链的未配对部分。在一些实施方式中，封闭链的未配对部分可短于扩增链的未配对部分。Y形通用寡核苷酸尾部接头具有在PCR方案中封闭链的未配对部分将不经历3’延伸的优点。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的封闭链可进一步包含3’未配对部分，所述3’未配对部分基本上不与扩增链的5’未配对部分互补；以及其中，所述封闭链的3’未配对部分基本上不与任何引物互补，或基本上不同于任何引物。在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的封闭链可进一步包含在退火温度下不会特异性退火至扩增链的5’未配对部分的3’未配对部分；以及其中，所述封闭链的3’未配对部分在退火温度下不会特异性退火至任何引物或其互补物。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的双链部分(例如，两条链之一或二者的双链部分)的长度为至少7个碱基对，例如，长度为7bp以上、8bp以上、9bp以上、10bp以上、11bp以上、12bp以上、13bp以上、或14bp以上。在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的双链部分的长度可为至少30bp以上，例如，30bp以上、31bp以上、32bp以上、33bp以上、34bp以上、35bp以上、40bp以上、或50bp以上。通用寡核苷酸尾部接头的双链部分不应该太长，而在使用的PCR扩增方案中阻遏(suppress)所需扩增子的PCR扩增。一些下一代测序法使用Y形接头分子。这些Y形接头分子需要有限长度(例如，17bp以下)的双链部分，以避免在若干PCR步骤(例如，文库富集PCR(library enrichmentPCR)、桥式PCR(bridge PCR)或乳液PCR(emulsion PCR))期间形成分子内发卡。本文所述方法中的Y形通用寡核苷酸尾部接头并不受双链两末端的这一限制。由双链末端导致的这种PCR阻遏作用并不适用于本发明，因为两个靶引物可从内部接近靶片段。在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头的双链部分的长度可为至少18bp以上，例如，18bp以上、19bp以上、20bp以上、21bp以上、22bp以上、23bp以上、24bp以上、或25bp以上。
通用寡核苷酸尾部接头的说明性实例显示于图9中。
通用寡核苷酸尾部接头的连接可通过本领域中已知的任何方法完成，例如，平末端连接或TA连接。在一些实施方式中，在通用寡核苷酸尾部接头的连接之前，可使样品中的核酸经历核酸末端修复，以使所述核酸的末端变成平末端。末端修复在本领域中是公知的，相关试剂盒和/或酶是可商购的(例如，NEBNEXTTM End Repair Module(目录号E6050L；New England Biolabs；Ipswich,MA))。
在一些实施方式中，在通用寡核苷酸尾部接头的连接之前，可使样品中的核酸磷酸化和/或腺苷酸化。腺苷酸化可在核酸的3’末端提供腺苷突出(adenosine overhang)。然后，可通过TA连接将具有硫堇(thionine)3’突出的第二核酸连接至第一核酸。连接方法在本领域中是公知的，相关试剂盒和/或酶是可商购的，例如，可将NEBNEXTTM da-Tailing module(目录号E6053L:New England Biolabs；Ipswich,MA)用于使核酸平末端腺苷酸化。在一些实施方式中，可提供具有硫堇3’突出的通用寡核苷酸尾部接头。
本文所述方法的步骤(b)和步骤(c)可以各自包括PCR扩增方案，即，聚合酶链式反应(PCR)扩增循环组。本文所使用的术语“扩增方案”是指特异性扩增感兴趣的核酸序列(即，增加感兴趣的核酸序列的丰度)的程序，更具体地，当先前的聚合酶延伸产物作为相继的多轮延伸的模板时，指数扩增出现。根据本发明的PCR扩增方案包括至少1个、优选至少5个以上的重复循环，其中，每个循环包括以下步骤：1)链分离(例如，热变性)；2)寡核苷酸引物退火至模板分子；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。这些步骤各自所需的条件和时间可以由本领域普通技术人员制定。根据本文所述方法的扩增方案优选在热循环仪中进行，许多热循环仪是可商购的。
PCR需要使用核酸聚合酶。本文所使用的短语“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合，以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3’末端起始合成，并朝向模板5’末端的方向进行。许多核酸聚合酶在本领域中是已知并可商购的。一组优选的核酸聚合酶是热稳定的，即，它们在经历了足以使互补核酸的退火链变性的温度(例如，94℃)或有时更高的温度之后，仍保留功能。
如本领域所理解的，PCR需要包括链分离步骤的循环，所述链分离步骤通常涉及加热反应混合物。本文所使用的术语“链分离”或“将链分离”是指处理核酸样品，以使得互补双链分子分离成可退火至寡核苷酸引物的两条单链。更具体而言，根据本文所述方法的链分离通过将核酸样品加热至高于其Tm而实现。通常，对于在适于核酸聚合酶的缓冲液中的含有核酸分子的样品而言，加热至94℃足以实现链分离。示例性缓冲液含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.825℃)、0.5-3mM MgCl2和0.1％BSA。
还如本领域所理解的，PCR需要将引物退火至模板核酸。靶核酸的任何链都可为模板核酸，因为模板核酸被定义为给定引物会特异性退火至其上的单链核酸。本文所使用的“退火”是指允许两条互补核酸链或基本上互补的核酸链杂交，更具体而言，当在PCR的情况下使用时，是指允许两条互补核酸链或基本上互补的核酸链杂交，以使得形成模板依赖性聚合酶的引物延伸底物。引物-靶核酸退火的条件随引物长度和序列而变化，并基于所计算的引物Tm。通常，扩增方案中的退火步骤包括在链分离步骤后将温度降低至基于所计算的引物序列Tm的温度足够长的时间，以允许由此退火。Tm可由本领域技术人员使用大量广泛施用的算法中的任一种容易地预测(例如，互联网上可获得的OLIGOTM(MolecularBiology Insights Inc.Colorado)引物设计软件和VENTRO NTITM(Invitrogen,Inc.California)引物设计软件和程序，包括Primer3、OligoCalculator和NetPrimer(Premier Biosoft；Palo Alto，CA；以及在万维网http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上免费提供的))。例如，引物的Tm可利用以下公式进行计算，该公式为NetPrimer软件所使用并在Frieir等的PNAS 1986 83:9373-9377中存在更详细的描述，以引用的方式将其整体并入本文。
Tm＝ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
其中，ΔH为螺旋形成的焓；ΔS为螺旋形成的熵；R为摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C为核酸浓度；以及[K+]为盐浓度。对大多数扩增方案而言，将退火温度选择为低于预测Tm约5℃，尽管可使用更接近Tm和高于Tm的温度(例如，低于预测Tm 1℃和5℃之间的温度或高于预测Tm 1℃和5℃之间的温度)，例如，低于预测Tm超过5℃的温度(如，低6℃、低8℃、低10℃或更低)同样可以。通常，退火温度越接近Tm，退火越特异。在PCR扩增方案期间允许引物退火的时间在很大程度上取决于反应的体积(较大的体积需要更长的时间)，同时还取决于引物和模板的浓度(相比较低的引物与模板的相对浓度，较高的相对浓度需要较少的时间)。根据体积和相对引物/模板浓度，扩增方案中的引物退火步骤可为大约1秒-5分钟，但通常会在10秒和2分钟之间、优选为大约30秒-2分钟。本文所使用的“基本上退火”是指PCR扩增方案中足以产生可检测水平的特异性扩增产物的退火程度。
PCR还依赖于在每个循环中退火引物的聚合酶延伸。本文所使用的术语“聚合酶延伸”是指由核酸聚合酶将至少一个互补核苷酸以模板依赖性的方式加至退火引物的3’末端上。聚合酶延伸优选添加多于1个核苷酸、优选添加多至并包括对应于模板全长的核苷酸。聚合酶延伸的条件随聚合酶种类而改变。用于聚合酶延伸的温度通常基于酶的已知活性性质。虽然在退火温度需要为例如低于酶的最理想温度的情况下，使用较低的延伸温度往往也是可接受的。通常，虽然酶在低于其最理想延伸温度时保留有至少部分活性，由最常用的热稳定聚合酶(例如，Taq聚合酶和其变体)进行的聚合酶延伸在65℃-75℃、优选约68℃-72℃进行。
引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文所使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸以使得延伸产物生成的条件”指的是包括例如温度、盐浓度和辅因子浓度、pH和酶浓度等核酸聚合酶在此类条件下催化引物延伸的条件的集合。这些条件将随所用核酸聚合酶的种类而改变，但很多有用聚合酶的条件是本领域技术人员所熟知的。条件的一个示例性集合是50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.825℃)、0.5-3mM MgCl2、dNTP各200μM和0.1％BSA，72℃，Taq聚合酶在上述条件下催化引物延伸。起始和延伸的条件通常包括在适合的缓冲液(在此情况下“缓冲液”包括溶剂(通常为水性的)，加上必要的辅因子以及影响pH、离子强度等的试剂)中并在合适的温度下，存在至少一种、但更优选存在所有四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂(例如DNA聚合酶或逆转录酶)。
在一些实施方式中，各扩增步骤可包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，各扩增步骤可包括长度为10个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，各扩增步骤可包括长度为12个循环-16个循环的PCR扩增方案循环组。在一些实施方式中，退火温度可以低于70℃。在一些实施方式中，退火温度可以低于72℃。
在不同的实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及用一种或多种类型的本文所述引物进行PCR扩增方案。本文所使用的“引物”是指能够特异性退火至多核苷酸模板、并提供作为模板依赖性聚合酶的底物的3’末端，以产生与所述多核苷酸模板互补的延伸产物的DNA或RNA多核苷酸分子或其类似物。本文所述方法中有用的引物通常是单链的，并且引物及其互补物可以退火形成双链多核苷酸。根据本文所述方法和组合物的引物的长度可小于或等于300个核苷酸，例如，长度小于或等于300、或250、或200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或40、或30个或更少、或20个或更少、或15个或更少的核苷酸、但至少有10个核苷酸。制备引物的方法是本领域公知的，并且许多商业来源提供适于提供根据本文所述方法和组合物的引物的寡核苷酸合成服务，例如，INVITROGENTM Custom DNA Oligos；Life Technologies；GrandIsland，NY或来自IDT的custom DNA Oligos；Coralville，IA。
在一些实施方式中，在将通用寡核苷酸尾部接头连接至样品中的核酸(例如，靶核酸)后，可在第一扩增步骤(即步骤(b))中对所述靶核酸进行扩增。第一扩增步骤可为使用第一靶特异性引物和第一尾部接头引物进行的PCR扩增循环组。
本文所使用的术语“第一靶特异性引物”是指含有可在退火温度下特异性退火至靶核酸的核酸序列的单链寡核苷酸。
在一些实施方式中，第一靶标特异性引物可包含5’标签序列部分。在一些实施方式中，反应中存在的所有第一靶特异性引物可包含相同的5’标签序列部分。在多重PCR反应中，不同引物种类可通过不希望的脱靶方式彼此相互作用，从而引起由DNA聚合酶进行的引物延伸和随后的扩增。这些引物二聚体一般是短的，它们的高效扩增可主导反应并占据优势，从而导致所需靶序列的扩增不佳。在第一靶特异性引物中包含有5’标签序列引起任何潜在的引物二聚体(其可导致在两个末端含有相同的互补尾部)。在随后的PCR循环中，引物二聚体将变性成单链DNA引物二聚体，每个单链DNA引物二聚体在其两个末端上含有由5’标签引入的互补序列。并非是引物退火至这些单链DNA引物二聚体，而是优先发生分子内发卡(锅柄状结构)的形成，这是由于相同引物二聚体分子上互补标签的接近的可及性(proximate accessibility)，而不是不同分子上与新引物的分子间相互作用。结果是这些引物二聚体非常难以扩增，从而使得引物不会呈指数地被不希望的二聚体扩增所消耗。相反，对于期望的靶序列的特异性扩增而言，带标签的引物可保持高且足够的浓度。引物二聚体的累积还会有损多重PCR，因为引物二聚体竞争并消耗反应中的其它试剂。在一些实施方式中，5’标签序列可为富含GC的序列，即，标签序列可含有至少50％的GC含量、至少55％的GC含量、至少60％的GC含量、至少65％的GC含量、至少70％的GC含量、至少75％的GC含量、至少80％的GC含量、或更高的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可含有至少60％的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可含有至少65％的GC含量。
本文所使用的术语“第二靶特异性引物”是指含有3’部分和5’部分的单链寡核苷酸，所述3’部分含有能够特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子包含的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分含有与第二测序引物相同的核酸序列。第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第二靶特异性引物通过至少3个核苷酸(例如，通过3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、或者15个以上核苷酸)相对于第一靶特异性引物嵌套。
在一些实施方式中，存在于反应中的所有第二靶特异性引物含有相同的5’部分。在一些实施方式中，5’部分可用来阻遏上文所述的关于第一靶特异性引物的5’标签所描述的引物二聚体。
在一些实施方式中，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物基本上与靶核酸的同一条链互补。在一些实施方式中，特异性退火至已知靶序列的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可包含总共至少20个所述已知靶核苷酸序列的独有(unique)碱基，例如，20个以上独有碱基、25个以上独有碱基、30个以上独有碱基、35个以上独有碱基、40个以上独有碱基、或50个以上独有碱基。在一些实施方式中，特异性退火至已知靶序列的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可含有总共至少30个所述已知靶核苷酸序列的独有碱基。
本文所使用的术语“第一接头引物”是指含有与第一测序引物的5’部分相同的核酸序列的核酸分子。因为第一尾部接头引物由此与扩增链序列的至少一部分相同(与互补相对)，所述第一尾部接头引物将不能够特异性退火至通用寡核苷酸尾部接头本身的任何部分。
本文所使用的术语“第二接头引物”是指含有与第一测序引物的一部分相同的核酸序列、并相对于第一接头引物嵌套的核酸分子。因为第二尾部接头引物由此与扩增链序列的至少一部分相同(与互补相对)，所述第二尾部接头引物将不能够特异性退火至通用寡核苷酸尾部接头本身的任何部分。在一些实施方式中，第二接头引物与第一测序引物相同。
所述第二接头引物应该相对于第一接头引物嵌套，即，所述第一接头引物包含与扩增链相同的核酸序列，该序列并不包含于所述第二接头引物中、且与包含于第二接头引物中的与扩增链相同的任何序列相比而言位于较接近扩增引物的5’末端的位置。在一些实施方式中，第二接头引物通过至少3个核苷酸(例如，通过3个核苷酸、通过4个核苷酸、通过5个核苷酸、通过6个核苷酸、通过7个核苷酸、通过8个核苷酸、通过9个核苷酸、通过10个核苷酸或更多核苷酸)来嵌套。
在一些实施方式中，第一接头引物可含有与通用寡核苷酸尾部接头的扩增链的最5’端的约20个碱基相同的核酸序列，且第二接头引物可包含与通用寡核苷酸尾部接头的扩增链的约30个碱基相同的核酸序列，所述第二接头引物的5’碱基在3’方向上距所述扩增链的5’末端至少3个核苷酸(at least 3nucleotides 3’of the 5’terminus of the amplification strand)。
嵌套接头引物的使用消除了生成可扩增(例如，桥式PCR或乳液PCR中)但不能测序的最终扩增子的可能性，这是可能在半巢式(hemi-nested)方法中出现的情况。在其它情况下，使用与测序引物相同的引物进行的半巢式方法可导致不希望的扩增产物从第一PCR步骤遗留至第二PCR步骤，并将最终产生人为测序读段。如本文所述，两个接头引物的使用可以减少这些问题，并且在一些实施方式中可消除这些问题。
在第一扩增步骤的第一PCR扩增循环中，第一靶特异性引物可特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的任何核酸的模板链。根据设计第一靶特异性引物的方向，将合成已知靶核苷酸序列上游或下游且与模板链互补的序列。如果在PCR的延伸阶段期间，模板链的5’末端终止于连接的通用寡核苷酸尾部接头，新合成的产物链的3’末端将会含有与第一尾部接头引物互补的序列。在随后的PCR扩增循环中，第一靶特异性引物和第一尾部接头引物两者将能够特异性退火至靶核酸序列的适当链，已知靶核苷酸序列和通用寡核苷酸尾部接头之间的序列可被扩增(即，复制)。
在本文所述方法的下一步骤(即，步骤(c))中，在第二扩增步骤中扩增由步骤(b)产生的扩增部分的一部分。第二扩增步骤可为使用第二靶特异性引物和第一测序引物进行的PCR扩增循环组。第二PCR扩增循环组可具有与第一PCR扩增循环组中的PCR参数相同或不同的PCR参数。例如，步骤(b)和步骤(c)的PCR扩增方案可具有相同或不同的退火温度、或者相同或不同的延伸步骤时长。
本文所述的方法允许测定在已知靶核苷酸序列的两侧之一或两侧的与所述已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。无论靶核酸是正常地以单链核酸的形式还是双链核酸的形式存在，序列信息通常以单链格式(链A)从5’至3’表示。如果将要测定链A的已知靶核苷酸序列的5’端的序列，基因特异性引物可与链A互补(即，退火至链A)。如果将要测定链A的已知靶核苷酸序列的3’端的序列，基因特异性引物可与链A相同，以使得所述引物将退火至双链靶核酸的互补链。这样的引物设计考虑为本领域普通技术人员所熟知。
在一些实施方式中，本文所述的涉及使用第一基因特异性引物和第二基因特异性引物的方法可使得分析具有优秀的靶命中(on-target)率，例如70-90％。在一些实施方式中，本文所述的分析和方法可具有至少85％的靶特异率。
在一些实施方式中，将四类引物设计为引物在约61-72℃的退火温度下(例如，约61-69℃、约63-69℃、约63-67℃、约64-66℃)将特异性退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，将四类引物设计为引物在低于72℃的退火温度下将特异性退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，将四类引物设计为引物在低于70℃的退火温度下将特异性退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，将四类引物设计为引物在低于68℃的退火温度下将特异性退火至它们的互补序列。在一些实施方式中，将四类引物设计为引物在约65℃的退火温度下将特异性退火至它们的互补序列。
在一些实施方式中，特异性退火至已知靶核苷酸序列的靶特异性引物的部分将在约61-72℃的温度下(例如，约61-69℃、约63-69℃、约63-67℃、约64-66℃)特异性退火。在一些实施方式中，特异性退火至已知靶核苷酸序列的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
在一些实施方式中，本文所述的引物和/或接头不可含有修饰的碱基(例如，引物和/或接头不可含有封闭3’胺(blocking 3’amine))。
在本文所述方法的下一步骤(即，步骤(d))中，可对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，测序可通过下一代测序法进行。本文所使用的“下一代测序”是指此类寡核苷酸测序技术：所述寡核苷酸测序技术具有以高于传统测序方法(例如，Sanger测序)的可能速度的速度对寡核苷酸进行测序的能力，因为所述下一代测序平行执行和读取数千甚至数百万个测序反应。下一代测序法/平台的非限制性实例包括：大规模平行签名测序(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸测序(454Life Sciences/Roche Diagnostics)；固相可逆染料终止物测序(Solexa/Illumina)：SOLiD技术(Applied Biosystems)；Ion半导体测序(IONTorrent)；DNA纳米球测序(Complete Genomics)；以及可从PacificBiosciences、Intelligen Bio-systems、Oxford Nanopore Technologies和Helicos Biosciences获得的技术。在一些实施方式中，测序引物可包含可与选定的下一代测序法兼容的部分。下一代测序技术及相关引物的限制和设计参数在本领域中是公知的(参见例如Shendure等，“Next-generationDNA sequencing”，Nature，2008，第26卷，第10期，1135-1145；Mardis，“The impact of next-generation sequencing technology on genetics”，Trendsin Genetics，2007，第24卷，第3期，第133-141页；Su等，“Next-generationsequencing and its applications in molecular diagnostics”，Expert Rev MolDiagn，2011，11(3):333-43；Zhang等，“The impact of next-generationsequencing on genomics”，J Genet Genomics，2011，38(3):95-109；Nyren,P.等，Anal Biochem 208:17175(1993)；Bentley,D.R.，Curr Opin Genet Dev16:545-52(2006)；Strausberg,R.L.等，Drug Disc Today 13:569-77(2008)；美国专利号7,282,337；美国专利号7,279,563；美国专利号7,226,720；美国专利号7,220,549；美国专利号7,169,560；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国公开号2006/0252077、2007/0070349和20070070349，以引用的方式将其整体并入本文)。
在一些实施方式中，测序步骤取决于第一测序引物和第二测序引物的使用。在一些实施方式中，将第一测序引物和第二测序引物选择为兼容本文所述的下一代测序法。
将测序读段与基因组和/或cDNA序列的已知序列数据库进行比对的方法是本领域中公知的，并且用于此过程的软件是可商购的。在一些实施方式中，并未完全映射(map)至野生型序列数据库的读段(去掉测序引物和/或接头核苷酸序列)可为基因组重排或大型插入缺失(indel)突变。在一些实施方式中，含有映射至基因组中多个位置的序列的读段(去掉测序引物和/或接头核苷酸序列)可为基因组重排。
在一些实施方式中，可在步骤a-步骤d的任意步骤之前和/或之后，将靶核酸和/或其扩增产物从酶、引物、或缓冲液组分中分离。用于分离核酸的方法在本领域是公知的。在一些实施方式中，分离可包括固相可逆固定(Solid Phase Reversible Immobilization，SPRI)纯化。SPRI纯化方法是本领域所熟知的，且试剂盒是可商购的，例如，Agencourt AMPureXP-PCR纯化(目录号A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些实施方式中，酶可通过加热处理失活。
在一些实施方式中，靶核酸可包含于基因组DNA中。在一些实施方式中，靶核酸可包含于核糖核酸(RNA)中，例如，mRNA。在一些实施方式中，靶核酸可包含于cDNA中。许多适于用于本文所述方法的测序方法提供最佳读段长度为数十至数百核苷酸碱基的测序运行(例如，Ion Torrent技术可产生200-400bp的读段长度)。例如，由基因组DNA或mRNA所包含的靶核酸可包含于大大长于这一最佳读段长度的核酸分子中。为了使由步骤(c)产生的扩增核酸部分成为可适于在特定测序技术中使用的长度，已知靶核苷酸序列和靶核酸末端(可将通用寡核苷酸尾部接头连接至该末端)之间的平均距离应尽可能接近所选定技术的最佳读段长度。例如，如果给定测序技术的最佳读段长度为200bp，则根据本文所述方法扩增的核酸分子应具有约400bp以下的平均长度。在步骤(a)之前，可对由例如基因组DNA或mRNA所包含的靶核酸进行剪切(例如，机械剪切或酶促剪切)，以产生任何所需大小的片段。机械剪切方法的非限制性实例包括：超声、雾化、以及可从Covaris(Woburn,MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方式中，可通过超声对基因组DNA所包含的靶核酸进行机械剪切。在一些实施方式中，当靶核酸由RNA所包含时，可使样品经历逆转录酶方案以生成DNA模板，然后可对所述DNA模板进行剪切。在一些实施方式中，可在进行逆转录酶方案前对靶RNA进行剪切。在一些实施方式中，含有靶RNA的样品可用于本文所述的如下方法：使用从新鲜样本或降解样本提取的总核酸；无需为cDNA测序去除基因组DNA；无需为cDNA测序而使核糖体RNA耗竭；在任何步骤中均不需要机械剪切或酶促剪切；通过使用随机六聚体使RNA经历双链cDNA合成；以及通过在单个管中使核酸经历末端修复、磷酸化以及腺苷酸化。
在一些实施方式中，已知靶核苷酸序列可包含于基因重排中。本文所述的方法适合于测定基因重排的存在和/或种类，因为仅一半的基因重排的种类必须是先前已知的(即，待由基因特异性引物所靶向的一半基因重排)。在一些实施方式中，基因重排可包含癌基因。在一些实施方式中，基因重排可包含融合癌基因。
在一些实施方式中，靶核酸可包含于样品中。在一些实施方式中，靶核酸可包含于获得自受试者的样品中。在一些实施方式中，样品可为获得自受试者的诊断样品。在一些实施方式中，样品可进一步包含蛋白质、细胞、流体、生物流体、保护剂、和/或其它物质。以非限制性实例的方式，样品可为面颊拭子(cheek swab)、血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物(alveolar isolates)、胸膜液、心包液、囊液(cyst fluid)、肿瘤组织、组织、活组织切片、唾液、抽出物(aspirate)，或上述物质的组合。在一些实施方式中，样品可通过切除术或活组织切片获得。
在一些实施方式中，样品可获得自需要治疗癌症的受试者。在一些实施方式中，样品可包含肿瘤细胞群，例如，至少一种肿瘤细胞的群。在一些实施方式中，样品可包含肿瘤活组织检片，包括但不限于未处理的活检组织或经过处理的活检组织(例如，福尔马林固定的活检组织和/或石蜡包埋的活检组织)。
在一些实施方式中，样品可新鲜收集。在一些实施方式中，可在将样品用于本文所述的方法和组合物中之前，将所述样品储存。在一些实施方式中，样品是未经处理的样品。本文所使用的“未经处理的样品”是指除了稀释于溶液中和/或悬浮于溶液中外，未曾进行任何事先的样品预处理的生物样品。在一些实施方式中，样品可获得自受试者，并可在用于本文所述的方法和组合物之前对其进行保存或加工。以非限制性实例的方式，可将样品包埋于石蜡中、冷藏或冷冻。可在根据本文所述的方法和组合物测定核酸的存在之前，将冷冻的样品解冻。在一些实施方式中，样品可为加工过的或处理过的样品。用于处理或加工样品的示例性方法包括但不限于：离心、过滤、超声、均质化、加热、冷冻和解冻、与保护剂(例如，抗凝血剂或核酸酶抑制剂)接触，以及上述方法的任意组合。在一些实施方式中，可用化学试剂和/或生物试剂对样品进行处理。可采用化学试剂和/或生物试剂在加工和/或存储期间保护和/或保持样品或样品中所含核酸的稳定性。可替代地或额外地，可采用化学试剂和/或生物试剂使核酸从样品的其它组分中释放出。以非限制性实例的方式，在用于本文所述的方法和组合物之前，可用抗凝血剂处理血液样品。本领域技术人员熟知用于核酸分析的样品加工、保存或处理方法和过程。在一些实施方式中，样品可以是例如通过离心得到的澄清流体样品。在一些实施方式中，可通过低速离心(例如，3000×g以下)并收集含有澄清流体样品的上清液来使样品澄清。
在一些实施方式中，可在用于本文所述的方法和组合物之前，对样品中存在的核酸进行分离、富集或纯化。从样品中分离、富集或纯化核酸的方法是本领域普通技术人员所公知的。以非限制性实例的方式，用于从各种样品类型中分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。
本文所述的方法可用于多重(multiplex)技术。在本文所述方法的实施方式中，多重应用可以包括测定与一种或多种已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。本文所使用的“多重PCR”是指在一个反应容器中进行多于一种靶核酸的同时扩增的PCR变型、并随后通过使用多于一组第一基因特异性引物和第二基因特异性引物对扩增产物的序列进行测定。多重可涉及在单个反应中检测约2-1,000种不同的靶序列。本文所使用的多重是指在单个反应中检测2-1,000种之间的任何范围(例如，5-500、25-1000、或10-100种之间)的不同靶序列等。适用于PCR的术语“多重”意味着在同一PCR反应中存在对于至少两种不同靶序列具有特异性的引物。
在一些实施方式中，可用多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物对样品或样品的单独部分中的靶核酸进行扩增。在一些实施方式中，所述多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可存在于单个反应混合物中，例如，可在同一反应混合物中产生多种扩增产物。在一些实施方式中，多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至不同基因中所包含的已知靶序列。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至已知靶序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至单个基因所包含的已知靶序列的不同部分。在一些实施方式中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可特异性退火至含有已知靶序列的基因的不同外显子。在一些实施方式中，多个第一靶特异性引物可含有相同的5’标签序列部分。
在本文所述方法的实施方式中，多重应用可包括在一个测序反应或测序运行中测定多个样品中与一个或多个已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。多个样品可为不同来源，例如，来自不同组织和/或不同受试者。在此类实施方式中，通用寡核苷酸尾部接头可进一步包含条形码部分。在一些实施方式中，可将具有独特条形码部分的通用寡核苷酸尾部接头添加至各样品中，并与其中的核酸连接；然后可在步骤(a)之后将所述样品合并。扩增产物所得到的各测序读段由此都将包含识别含有原始模板核酸的样品类型的条形码，所述扩增产物源自所述原始模板核酸。下一代测序应用中条形码部分的使用在本领域中是公知的，并在以下著作中有所描述：例如，Margulies,M.等，“Genome Sequencing inMicrofabricated High-Density Picolitre Reactors”，Nature，437，376-80(2005)；Mikkelsen,T.等，“Genome-Wide Maps of Chromatin State inPluripotent and Lineage-Committed Cells”，Nature，448，553-60(2007)；McLaughlin,S.等，“Whole-Genome Resequencing With Short Reads:Accurate Mutation Discovery With Mate Pairs and Quality Values”，ASHGAnnual Meeting(2007)；Shendure I.等，“Accurate Multiplex PolonySequencing of an Evolved Bacterial Genome”，Science，309，1728-32(2005)；Harris,T.等，“Single-Molecule DNA Sequencing of a ViralGenome”，Science，320，106-9(2008)；Simen,B.等，“Prevalence of LoWAbundance Drug Resistant Variants by Ultra Deep Sequencing inChronically HIV-infected Antiretroviral(ARV)Naive Patients and theImpact on Virologic Outcomes”，16th International HIV Drug ResistanceWorkshop，Barbados(2007)；Thomas,R.等，“Sensitive Mutation Detectionin Heterogeneous Cancer Specimens by Massively Parallel Picoliter ReactorSequencing”，Nature Med.，12,852-855(2006)；Mitsuya,Y等，“MinorityHuman Immunodeficiency Virus Type 1Variants in Antiretroviral-NaivePersons With Reverse Transcriptase Codon 215Revertant Mutations”，I.Vir.，82,10747-10755(2008)；Binladen,J.等，“The Use of Coded PCRPrimers Enables High-Throughput Sequencing of MultipleHomologAmplification Products by 454Parallel Sequencing”，PLoS ONE，2,e197(2007)；以及Hoffmann,C.等，“DNA Bar Coding andPyROS1equencing to Identify Rare HIV Drug Resistance Mutations”，Nuc.Acids Res.，35,e91(2007)，以引用的方式将其全部并入本文。
在本文所述技术的一些实施方式中，测定与已知寡核苷酸靶序列邻接的序列可提供与治疗疾病相关的信息，和/或可包含于治疗疾病的方法中。在一些实施方式中，样品可来自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。在一些实施方式中，已知寡核苷酸靶序列可包含于疾病相关基因(例如，癌基因)中。在一些实施方式中，与已知寡核苷酸靶序列邻接的序列和/或所述已知寡核苷酸靶序列可含有疾病相关的突变或遗传异常，例如，SNP、插入、删除和/或基因重排。在一些实施方式中，存在于样品中的与已知寡核苷酸靶序列邻接的序列和/或所述已知寡核苷酸靶序列可包含于基因重排产物中。在一些实施方式中，基因重排可为癌基因，例如，融合癌基因。
癌症的某些治疗对于含有特定癌基因的肿瘤特别有效，例如，靶向给定融合癌基因的作用或表达的治疗剂可对于含有该融合癌基因的肿瘤有效，但对于缺乏该融合癌基因的肿瘤无效。本文所述的方法可以允许对揭示癌基因状态(例如，突变、SNP和/或重排)的特定序列进行测定。如本文所述，当只有一侧的序列已知时，本文所述的方法可以进一步允许测定特定序列，例如，当在进行本文所述方法之前精确位置和/或重排伴侣未知的情况下，本文所述的方法可测定涉及已知癌基因的基因重排的存在和种类。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及治疗癌症的方法，所述方法包括：根据本文所述的方法，检测获得自需要治疗癌症的受试者的肿瘤样品中一种或多种癌基因重排的存在；给予对于具有任何检测到的癌基因重排的肿瘤有效的癌症治疗。在一些实施方式中，本文所述的技术涉及测定需要治疗癌症的受试者是否会对给定治疗作出响应的方法，所述方法包括：根据本文所述的方法，检测获得自受试者的肿瘤样品中癌基因重排的存在；其中，如果检测到存在癌基因重排，则所述受试者被确定为对靶向癌基因重排产物的治疗作出响应。
在一些实施方式中，例如，当样品获得自需要治疗肺癌的受试者时，已知寡核苷酸靶序列可包含来自选自下组中的基因的序列：ALK、ROS1和RET。涉及ALK、ROS1和RET基因并导致融合癌基因的基因重排在本领域中是公知的(参见，例如，Soda等，Nature 2007448561-6；Rikova等，Cell 2007131:1190-1203；Kohno等，Nature Medicine 201218:375-7；Takouchi等，Nature Medicine 201218:378-81；以引用的方式将其整体并入本文)。然而，基因重排的精确位置(例如，在ALK、ROS1和/或RET基因中重排发生的位置)和涉及重排的第二基因的种类可以变化。在本文所述的方法中，可以在不必知道重排的位置或涉及基因重排的第二基因的种类的情况下，对此类重排的存在和种类进行检测。
在一些实施方式中，已知靶序列可包含来自选自下组中的基因的序列：ALK、ROS1和RET。在一些实施方式中，至少一组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物可选自于由以下引物所组成的组：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38。
在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中ALK的基因重排的存在可说明，所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802、ALK激酶活性的二氨基抑制剂和氨基嘧啶抑制剂(例如，NVP-TAE684和PF-02341066)(参见，例如，Galkin等，Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:270-275；Zou等，Cancer Res，2007，67:4408-4417；Hallberg and Palmer F1000Med Reports 20113:21；以及Sakamoto等，Cancer Cell 201119:679-690)；以及WO 04/079326中公开的分子。以引用的方式将上述所有参考文献整体并入本文。ALK抑制剂可包括降低ALK或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低ALK或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“间变性淋巴瘤激酶”或“ALK”是指在野生型形式中通常涉及神经元调节的跨膜酪氨酸激酶。许多物种的ALK基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如SEQ ID NO：2(mRNA)，NCBI GeneID：238)。
在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中ROS1的基因重排的存在可说明，所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：ROS1抑制剂和如上所述的ALK抑制剂(例如，克唑替尼)。ROS1抑制剂可包括降低ROS1或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低ROS1或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“c-ROS1癌基因1”或“ROS1”(在本领域中也称为ROS1-1)是指与PTPN6相互作用的sevenless亚家族的跨膜酪氨酸激酶。许多物种的ROS1基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如SEQ ID NO：1(mRNA)，NCBI Gene ID：238)。
在一些实施方式中，获得自受试者的肿瘤的样品中RET的基因重排的存在可说明，所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A(参见，例如，Samadi等，Surgery 2010148:1228-36；Cuccuru等，JNCI 200413:1006-1014；Akeno-Stuart等，Cancer Research 200767:6956；Grazma等，J Clin Oncol 201028:15s 5559；Mologni等，J Mol Endocrinol 200637:199-212；Calmomagno等，JournalNCI 200698:326-334；Mologni.Curr Med Chem 201118:162-175；以及WO 06/034833、美国专利公开2011/0201598和美国专利8,067,434中公开的化合物)。以引用的方式将上述所有参考文献整体并入本文。RET抑制剂可包括降低RET或其部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如，降低RET或其部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“转染重排(rearranged during transfection)”或“RET”是指钙粘着蛋白超家族的受体酪氨酸激酶，其参与神经嵴发育并识别神经胶质细胞系来源的神经营养因子家族信号分子。许多物种的RET基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4(mRNA)，NCBI Gene ID：5979)。
本文所述方法的应用的进一步非限制性实例包括检测血液恶性肿瘤标志物(hematological malignancy)及其组(panels)(例如，包括在淋巴瘤和白血病中检测基因组重排的标志物组)、检测肉瘤相关的基因组重排及其组、以及检测针对淋巴瘤测试的IGH/TCR基因重排及其组。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用癌症治疗来治疗患有或被诊断为具有例如癌症的受试者。患有癌症的受试者可由医师使用目前诊断癌症的方法来鉴定。例如，表征这些病症和有助于诊断的肺癌症状和/或并发症是本领域公知的，包括但不限于：呼吸微弱、锁骨以上淋巴结肿大、肺部异常声音、轻叩(tapped)胸部时有浊音(dullness)、以及胸部疼痛。可有助于诊断例如肺癌的测试包括但不限于X射线、对高水平特定物质(例如，钙)的血液测试、CT扫描、和肿瘤活检。肺癌家族病史或暴露于肺癌风险因素(例如，吸烟或暴露于烟雾和/或空气污染)也可有助于测定受试者是否可能患有肺癌或正在进行肺癌诊断。
癌症可包括但不限于：癌(carcinoma)，包括腺癌，淋巴瘤，母细胞瘤，黑色素瘤，肉瘤，白血病，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胃肠癌，霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，胰腺癌，胶质母细胞瘤，基底细胞癌，胆道癌，膀胱癌，脑癌(包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤)；乳腺癌，子宫颈癌，绒毛膜癌；结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜上皮癌(endometrial carcinoma)，子宫内膜癌(endometrial cancer)；食道癌，胃癌；各种头颈部癌，上皮内肿瘤(包括Bowen病和佩吉特氏病)；血液肿瘤(包括急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病)；卡波济氏肉瘤，毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病(myelogenousleukemia)，AIDS相关的白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；肾癌(如肾细胞癌)，T细胞急性淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤，淋巴瘤(包括霍奇金病和淋巴细胞性淋巴瘤)；肝癌(如肝癌和肝细胞瘤)，Merkel细胞癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(包括鳞状细胞癌)；卵巢癌(包括由上皮细胞产生的卵巢癌)，肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)；胰腺癌；皮肤癌(包括黑色素瘤、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞)；前列腺癌，直肠癌；外阴癌，肾癌(包括腺癌)；睾丸癌(包括胚肿瘤(例如精原细胞瘤)、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤)；甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和甲状腺髓癌)；食道癌，唾液腺癌和Wilm氏肿瘤。在一些实施方式中，癌症可为肺癌。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的组合物(例如，癌症治疗)，以减轻癌症症状。本文所使用的“减轻癌症症状”为改善与癌症相关的任何病症或症状。相比等同的未治疗对照，由任何标准技术所测量的此类减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。向受试者给予本文所述组合物的各种手段对本领域技术人员而言是已知的。此类方法可包括但不限于口服给药、肠胃外给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、经皮给药、气道(气雾剂)给药、肺部给药、皮肤给药、局部给药、注射给药或肿瘤内给药。给药可以是局部的或全身的。本文所使用的术语“有效量”是指减轻疾病或病症的至少一种以上症状所需的治疗剂的量，并涉及足以提供所需效果的药物组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予典型受试者时足以产生特定抗癌效果的量。本文使用的有效量在不同的上下文中还可涵盖足以延缓疾病症状发展的量、足以改变疾病症状进程(例如但不限于，减缓疾病症状进展)的量、或逆转疾病症状的量。因此，指定精确的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。任何特定剂量的效果可通过合适的生物测定进行监测。剂量可由医师确定，并可在必要时进行调整以适应所观测到的治疗效果。
癌症治疗的非限制性实例可包括放射治疗、外科手术、吉西他滨、顺铂(cisplastin)、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他(vorinostat)、利妥昔单抗(rituximab)、替莫唑胺(temozolomide)、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和嗪消安(piposulfan)；氮丙啶(aziridines)，例如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、硫代三乙烯磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；软海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和ranimnustine；抗生素，例如烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡其霉素γ1I和卡奇霉素ΩI1(参见例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicinA；二膦酸盐(bisphosphonates)，例如氯磷酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)，aclacinomysins，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博莱霉素，cactinomycin，carabicin，caminomycin，嗜癌菌素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素，柔红霉素，detorubicin，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代阿霉素、菁基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)，表阿霉素，依索比星(esorubicin)，伊达比星，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(例如丝裂霉素C)，麦考酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二叶甲酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、thiamiprine、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；地美可辛(demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；podophyllinic acid；2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；丙亚胺(razoxane)；根瘤菌素；sizofuran；螺环锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-trichlorotriethylamine；单端孢霉烯类(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、漆斑菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free、紫杉醇白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE.RTM.长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb.RTM)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼)和VEGF-A的抑制剂(减少细胞增殖)，以及以上任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法可进一步包括使用辐射疗法或放射疗法。此外，治疗方法可进一步包括使用外科手术治疗。
在一些实施方式中，本文所述的方法可适用于重测序(resequencing)，例如，以用于确定由大量核酸的非定向测序获得的特别相关的、低质量和/或复杂的序列。以非限制性实例的方式，本文所述的方法可允许对靶向疾病基因组(例如，10-100个基因)的定向和/或靶向重测序、重测序以确定在大规模测序项目中获得的变体、全外显子组(whole exome)重测序、和/或用于检测单核甘酸变异、多核苷酸变异、插入、删除、拷贝数变化以及甲基化状态的靶向重测序。
在一些实施方式中，本文所述的方法可允许微生物群(microbiota)测序、古代样品(ancient sample)测序、和/或新变种病毒基因分型。
出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将本申请通篇所引用的所有专利与其它出版物(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及共同的未决(co-pending)专利申请)明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本文所述技术的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
对本公开的实施方式的描述不意味着穷举或将本公开限制在所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的对本公开的具体实施方式和实施例进行了描述，本领域技术人员将会认识到，可在本公开范围内作出多种等同修改。例如，虽然将方法步骤或功能以给定顺序给出，其它实施方式可以不同顺序来实施功能、或可以基本上同时实施这些功能。本文所提供的本公开的教导可以适当的方式应用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。如有需要的话，可对本公开的方面进行修改，以利用上述参考和应用中的组合物、功能和构思，来提供本公开更进一步的实施方式。可根据详细描述来对本公开进行上述改变和其它改变。所有此类修改都落入所附权利要求书所限定的本发明的范围之内。
任何前述实施方式中的具体要素均可进行组合或替代其它实施方式中的要素。此外，尽管与本公开的特定实施方式相关的优势已经在这些实施方式的上下文中描述，其它实施方式也可表现出此类优势，但不是所有实施方式都必须展现出此类优势，才能落入本公开的范围。
本文所述的技术进一步由以下实施例予以说明，但决不应当理解为本文所述的技术被进一步限定。
可根据任何以下编号段落对本文所述技术的一些实施方式进行定义：
1.一种测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
(a)将包含所述已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部接头连接；
(b)用第一接头引物和第一靶特异性引物扩增所述靶核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接头的扩增链；
(c)用第二接头引物和第二靶特异性引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分；
(d)使用第一测序引物和第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序；
其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含第一可连接双链末端和第二未配对末端；
其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含封闭链和扩增链；
其中，所述封闭链包含5’双链部分；
其中，所述扩增链包含未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出；
其中，所述扩增链包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列；
其中，所述封闭链和所述扩增链的双链部分基本上互补，并形成包含3’T突出的所述第一可连接双链末端；
其中，所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式；
其中，所述第一靶特异性引物包含能在退火温度下特异性退火至所述靶核酸的所述已知靶核苷酸序列的核酸序列；
其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分含有能特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子所包含的所述已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分含有与第二测序引物相同的核酸序列，并且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；
其中，所述第一接头引物包含与所述第一测序引物的5’部分相同的核酸序列；以及
其中，所述第二接头引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于所述第一接头引物嵌套。
2.如段1所述的方法，其中，所述通用寡核苷酸尾部接头的所述封闭链进一步包含3’未配对部分，所述3’未配对部分基本上不与所述扩增链的所述5’未配对部分互补；以及
其中，所述封闭链的所述3’未配对部分基本上不与任何引物互补，或基本上不同于任何引物。
3.如段1-2中任一项所述的方法，其中，所述第二接头引物通过至少3个核苷酸相对于所述第一接头引物嵌套。
4.如段1-3中任一项所述的方法，其中，含有与所述第一测序引物和所述第二测序引物相同的核酸序列的所述扩增链的部分至少部分包含于所述扩增链的所述5’未配对部分。
5.如段1-4中任一项所述的方法，其中，所述第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不同于任何引物的任何其它部分的高GC含量的核酸序列。
6.如段1-5中任一项所述的方法，其中，所述第二接头引物与全长第一测序引物相同。
7.如段1-6中任一项所述的方法，其中，特异性退火至已知靶的所述靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
8.如段1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步在步骤(a)之前包括如下步骤：
对所述核酸进行机械剪切；
使所述核酸经历末端修复；
使所述核酸经历磷酸化；
以及使所述核酸经历腺苷酸化。
9.如段1-8中任一项所述的方法，其中，所述样品包括基因组DNA。
10.如段1-9中任一项所述的方法，其中，所述样品包括RNA，并且所述方法进一步包括使所述样品经历逆转录酶方案的第一步骤。
11.如段1-10中任一项所述的方法，其中，所述逆转录酶方案包括使用随机六聚体。
12.如段1-11中任一项所述的方法，其中，已知靶序列包含于基因重排中。
13.如段12所述的方法，其中，所述基因重排存在于选自于由如下物质所组成的组中的核酸：
基因组DNA、RNA和cDNA。
14.如段12-13中任一项所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。
15.如段14所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。
16.如段1-15中任一项所述的方法，其中，通过下一代测序法对核酸产物进行测序。
17.如段16所述的方法，其中，所述下一代测序法包括选自于由以下方法所组成的组中的方法：
Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序、以及DNA纳米球测序。
18.如段1-17中任一项所述的方法，其中，所述第一测序引物和所述第二测序引物兼容所选的下一代测序法。
19.如段1-18中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。
20.如段1-19中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。
21.如段1-20中任一项所述的方法，其中，所述多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至由不同基因所包含的已知靶核苷酸序列。
22.如段1-21中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至已知靶核苷酸序列的不同部分。
23.如段1-22中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。
24.如段1-23中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的基因的不同外显子。
25.如段19-24中任一项所述的方法，其中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。
26.如段1-25中任一项所述的方法，其中，所述通用寡核苷酸尾部接头进一步包含条形码部分。
27.如段26所述的方法，其中，将多种样品各自与具有独特条形码部分的通用寡核苷酸尾部接头接触；以及其中，在步骤(a)后将所述样品合并。
28.如段1-27中任一项所述的方法，其中，各个扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。
29.如段1-28中任一项所述的方法，其中，将所述靶特异性引物和所述接头引物设计成在约61-72℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。
30.如段1-29中任一项所述的方法，其中，将所述靶特异性引物和所述接头引物设计成在约65℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。
31.如段1-30中任一项所述的方法，其中，所述样品包括获得自受试者的生物样品。
32.如段1-31中任一项所述的方法，其中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。
33.如段32所述的方法，其中，所述疾病为癌症。
34.如段1-33中任一项所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤细胞群。
35.如段1-34中任一项所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤活组织切片。
36.如段1-35中任一项所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。
37.如段1-36中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含于疾病相关基因中。
38.如段1-37中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含于样品中的基因重排产物中。
39.如段1-38中任一项所述的方法，其中，所述基因重排产物为癌基因。
40.如段1-39中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含来自选自以下基因的组中的基因的序列：
ALK、ROS1和RET。
41.如段40所述的方法，其中，至少一组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物选自于由以下引物所组成的组：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
42.如段40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中ALK的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
43.如段40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中ROS1的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
ROS抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
44.如段40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中RET的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
45.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
根据段1-44中任一项所述的方法，对获得自需要治疗癌症的受试者的肿瘤样品中一种以上癌基因重排的存在进行检测；
给予对于具有任何检测到的癌基因重排的肿瘤有效的癌症治疗。
46.如段45的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有ALK癌基因重排的肿瘤有效：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
47.如段45所述的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有ROS1癌基因重排的肿瘤有效：
ROS1抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
48.如段45所述的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有RET癌基因重排的肿瘤有效：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
49.一种测定需要治疗癌症的受试者是否会对给定治疗作出响应的方法，所述方法包括：
根据段1-44中任一项所述的方法，对获得自所述受试者的肿瘤样品中癌基因重排的存在进行检测；
其中，如果检测到存在所述癌基因重排，确定所述受试者对靶向癌基因重排产物的治疗作出响应。
50.如段49所述的方法，其中，如果检测到存在ALK癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
51.如段49所述的方法，其中，如果检测到存在ROS1癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
52.如段49所述的方法，其中，如果检测到存在RET癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
53.如段44-52中任一项所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。
实施例
实施例1
在一个实施方式中，本文描述的是使用来自新鲜样本或福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)样本的RNA或基因组DNA作为模板进行的分析，该分析使用用于下一代测序文库构建的新型半截短“Y”形接头，继以进行两个单末端巢式聚合酶链式反应(single-end nested polymerase chainreactions)，能够实现快速且有效的靶富集。该富集方法能够实现用于检测潜在的如下情况的cDNA或gDNA的靶向重测序：遗传改变(单核苷酸变异、插入/删除、以及拷贝数)、表观遗传改变(甲基化)、基因表达和基因组重排。
相比全基因组、全外显子组以及全转录组测序，下一代测序前的靶富集更具成本效益，因此更适于在研究发现和临床应用中广泛实施。由靶富集方法提供的高覆盖深度能够实现较宽动态范围的等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)以及对低频突变的检测(用于评价癌症中的体细胞突变的关键特征)。在全基因组测序或全外显子组测序的广泛实施成为可能之前，临床下一代测序的主流将涉及选择具有离散数量的基因靶标的疾病组。同样，基于确定的基因靶标分析大样本量的调查研究也需要经济的基因分型手段。本文所述的分析将适用于这两种情况。
对于染色体间重排和染色体内重排的检测，全基因组测序或全转录组测序对新基因组重排的发现有用，并且不需要预先知道所涉及的基因/染色体伴侣。然而，这些全基因组方法和全转录组方法由于成本高、测序深度低导致灵敏度差、并且对生物信息学分析的要求高，目前在临床环境中并不实用。荧光原位杂交(FISH)一直是临床上检测基因组重排的金标准分析；然而，该分析是低通量的，并且它的实施需要专门的设备和专业知识/经验。RT-PCR也在检测此类重排中有效，但RT-PCR需要知道5’伴侣和3’伴侣，并且不可扩展至大量靶标/样品。
下一代测序常用的预备富集分析的实例包括：基于杂交的捕获分析(TruSeq Capture，Illumina；SureSelect Hybrid Capture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的分析(HaloPlex,Agilent；AmpliSeq，Ion Torrent；TruSeq Amplicon，Illumina；乳液/数字PCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获到被捕获探针覆盖的靶向序列，还捕获到了消耗额外测序能力的附近的脱靶碱基。此外，这些方法都比较费时、劳动密集、并且特异较低。基于PCR扩增的方法较简单且较快速，但根据常规设计需要位于靶基因座两翼的正向引物和反向引物。特别地，对于检测具有未知融合伴侣的基因组重排来说，PCR是不适用的。
本文所述的是使用用于下一代测序文库构建的新型半截短“Y”形接头的靶富集分析，所述分析能够对来自新鲜样本或FFPE样本的cDNA或gDNA进行快速测序。图1以用于Ion Torrent测序的半截短Y接头为例概括了用于靶富集的文库构建。重要的是，该方法可适用于任何其它下一代测序平台，包括但不限于Illumina、SOLiD和454。简言之，可对随机剪切的双链cDNA或gDNA模板进行末端修复、腺苷酸化，然后在末端之一或两个末端上连接通用Y接头，从而制成用于起始PCR和后续测序的通用序列。第一轮PCR使用标记有填充尾部(stuffer tail)(所述填充尾部有助于复用(multiplexing)大量靶标)的靶特异性引物和与5’Y接头突出的20个碱基相同的引物。第二轮PCR用如下引物进行：与5’Y接头突出的30个碱基相同的引物；和退火至第一靶特异性引物的3’下游的第二串联(tandem)嵌套靶特异性引物。取决于测序技术，所述第二串联嵌套引物在5’标记有下游乳液PCR或聚类(clustering)所需的第二引物序列。通过将有效覆盖36-40个碱基以上的靶序列(这取决于引物之间的间隔)的单向串联嵌套引物(unidirectional tandem,nested primers)，使该系统获得高特异性。值得注意的是，PCR循环数可根据使用的起始核酸材料的多少、合并的样品的数量、以及靶标的数量来进行优化。
总而言之，该方法利用半截短Y接头以共同的3’末端统一标记所有dsDNA片段，该共同的3’末端被用于使用两个单向嵌套靶特异性引物进行的两轮PCR中以获得特异性。带标签的嵌套引物的应用还避免了在靶向基因组或转录组中的许多不同位点时的引物同二聚化和异二聚化的影响。除了复用靶标外，本文所述的方法还允许在Y接头连接(步骤2)后合并多重样品，在此期间，将单个样品与独特的条形码接头连接。一旦通过Y接头连接加上条形码，可将多个样品合并至一个反应管中用于下游靶富集。
与对基因组重排的检测(对插入和删除测序错误(例如，在根据均聚物结果的Torrent和454测序中发现的测序错误)具有较高容忍度)相反，对单碱基和多碱基突变(包括插入和删除)的检测需要可用Illumina测序平台实现的具有较高精确度的测序。为了这一目的，例如可通过使用标记有Illumina正向接头序列(条形码化或不条形码化)的引物和带标签的基因特异性嵌套引物(标记有Illumina反向引物的GSP2)对Y接头的突出的截短3’臂进行扩增，来将半截短Y接头文库转化成Illumina文库。类似地，也可通过在第一PCR(步骤3)中使用带标签的引物经由突出的截短3’Y接头臂引入测序引物来实现双向测序。
已将本文所述的分析和方法应用至来源自FFPE样本的cDNA，通过使用靶向七个外显子(包含ROS1激酶结构域)的七个基因特异性引物对ROS1基因融合进行检测。已用已知的融合伴侣和以前未知的融合伴侣检测到了ROS1基因组重排，例如“SLC34A2外显子12-ROS1外显子34”融合和“EZR外显子9-ROS1外显子34”融合。该分析实现了高的靶命中特异性(当使用人基因组hg19参比进行映射时，为～85-95％)，这使得能够利用甚至最小规模的测序平台(因此最便宜)(例如Ion TorrentPGM 314芯片)以高覆盖度结果(7个靶向基因座，5个样品，每个样品的各个靶>1000×覆盖度)对多个样品进行测序。图2示出了将测序读段映射至基因ROS1激酶结构域中的靶基因座。
本文所述方法的优势包括：
1.本文所述的方法可用于来自新鲜样本或FFPE样本的双链cDNA或gDNA的靶富集，允许使用下一代测序对靶cDNA或gDNA片段的5’和3’两个末端进行映射。目前基于杂交的方法需要数天来进行制备和杂交，并由于捕获附近的脱靶序列显示出较低特异性。目前基于扩增的方法需要设计已知的正向和反向引物，并且不适合于靶标的高规模复用。
2.简单的生物信息学分析。根据选定靶标的数量，对由该分析产生的数据进行的分析是简单且快捷的。此外，可将该方法设定为与目前现有的生物信息学工具兼容。因此，小型临床实验室无需在生物信息学上大量投资(这将限制下一代测序的广泛临床实施)，便能够进行数据分析。
3.高特异性(～85-95％)。由于遗留了“可被测序”的起始基因组或转录组文库物质，用于常规文库构建的具有正向和反向引物(5’和3’突出)两种组件的传统Y接头构建体将引入高水平的背景脱靶测序。例如，如果靶标大小为100bp并存在于一个基因组的两个拷贝中，靶标与基因组的比为约1:3×10^7。基于杂交的方法通常采用生物素化的寡核苷酸饵(baits)，以通过包被有链霉亲和素的磁珠将杂交的靶片段拉出。可能的3×10^7的可能性中的仅一个非特异性结合事件将显著导致50％的脱靶率。半截短Y接头的使用有效地避免了这一背景遗留问题，因为在后续用于测序的制备步骤中起始文库材料不能被扩增。通过使用两个单向引物(GSP2在GSP1的3’下游)而获得额外的特异性。实际上，两个串联引物的使用产生40(假设两个20个碱基对长的引物)的靶引发(priming)位点和相比只用一个引物而言的较高特异性。第一PCR中5’20-mer引物的使用和第二PCR中全长30-mer引物(用作通用引发位点的嵌套引物)的使用进一步提高了特异性。最后，通过使用带标签的引物进行两个PCR步骤而获得额外的特异性。带标签的引物通过分子内发卡的形成防止引物同二聚体和异二聚体的增加，所述引物同二聚体和异二聚体的增加可能主导PCR反应，并导致非特异性和不需要的人为产物，因此，带标签的引物允许在避免引物二聚体的同时复用多个靶标。
4.成本经济。本文所述方法中的关键组成是传统的未经修饰的带标签的引物、标准PCR试剂和常规热循环仪。不像基于杂交的捕获方法或微流体数字PCR设置，所述靶富集方案避免使用相对昂贵的生物素化寡核苷酸、包被有链霉亲和素的磁珠以及专用设备。一旦制造出，合并的GSP1和GSP2引物混合物可以被用于成千上万个反应。
5.自动化。因为本文所述的方法依赖于标准PCR技术和SPRI纯化，因此存在在高通量应用中易于自动化的可能性。可针对384孔板对体积进行调整以用于超高通量实施。
本文所述方法和分析的应用包括但不限于：1.由已知治疗靶标(包括基因ALK、ROS1和RET)组成的肺癌易位(translocation)组；2.血液恶性肿瘤组，包括检测淋巴瘤和白血病中的基因组重排的组；3.肉瘤基因组重排组；4.针对淋巴瘤测试的IGH/TCR基因重排组；5.用于重测序的靶向疾病基因组(10-100个基因)；6.用于确认在大规模测序项目中获得的变体的靶向重测序；7.全外显子组靶向重测序的潜力；8.用于检测单核苷酸变异、多核苷酸变异、插入、删除、拷贝数变化和甲基化状态的靶向重测序；9.微生物群测序；10.古代样品测序；11.新变种病毒基因分型。
实施例2：用于同时检测ALK、ROS1和RET基因重排的靶向下一代测序分析
对癌症中染色体重排状态的认识对个体化的靶向治疗而言非常重要。目前，已描述了在肺癌中涉及重排的三个主要受体酪氨酸激酶。已将涉及ALK基因的基因重排建立为治疗靶标。早期的临床试验数据还表明，ROS1抑制剂在治疗经测试呈ROS1重排阳性的患者中有效。体外证据表明，携有RET重排的肿瘤细胞对RET抑制剂作出响应。因此，ALK、ROS1和RET目前代表了肺癌中三个重要的治疗靶标。
目前用于检测基因重排的临床分析包括：荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。FISH和IHC由于其低通量、高成本以及复杂的判读可能无法适应对高体积测试/筛选需求的增长。RT-PCR分析需要充分知晓两个融合伴侣，而这有时是不可得的，显著影响了临床灵敏度。已将多重RT-PCR用于检测涉及两个已知融合伴侣间不同外显子的不同融合。通常，这些分析限于一次针对一个基因靶标，其方法需要多个反应设置和分析。
已将用于转录组测序或靶捕获测序的基于最新的下一代测序的分析大量应用于大型测序设施中的研究和探索目的。在研究环境下的这些分析由于靶标数量巨大，通常获得低测序深度，从而产生低分析灵敏度以及随后的不良临床灵敏度。虽然负担得起大型测序设施，但这些分析对于很多临床实验室尚且是不可得的。
以上描述的是涉及靶向测序方法的方法和分析，该方法和分析使用来自新鲜样本或福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的样本的RNA或基因组DNA作为模板，应用用于下一代测序文库构建的新型半截短“Y”形接头，继以进行两个单末端巢式聚合酶链式反应，能够实现快速且有效的靶富集。
根据本方法，在本实施例中描述的是对ALK、ROS1和RET基因重排进行检测的具体分析(图3A-图3B)。将基因特异性引物(GSP1)设计成引发激酶结构域附近或激酶结构域上的外显子。将嵌套引物(GSP2)设计成在同一外显子内并邻近与它们配对的GSP1引发GSP1的下游。组目前包括用于靶向ROS1外显子31-37的七对引物；用于靶向ALK外显子19-22的4对引物；以及用于靶向RET外显子8-13的6对引物。
该分析通过使用半官能化“Y”接头结构和GSP2引物后的平台特异性接头序列，可适于不同的NGS测序平台。测序后，将读段映射至人基因组参比，使得能够使用由本发明人开发的生物信息学算法来鉴定融合伴侣基因、可变剪接、以及融合体的读码框状态(例如，图4A和图4B)。所得输出为用于快速报告的简单注释表(图4C)。使用具有多样品条形码化的这三种基因靶组分析，已使用一个Ion Torrent测序运行检测出了ROS1、ALK和RET重排阳性样品。
该分析可适用于降解的RNA，例如，从福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的样本中提取的RNA，该样本是分子诊断测试中最广泛易得的临床材料。该分析运用台式(bench-top)NGS平台(一种简单的信息学分析管道)，因此相对容易在临床实验室中实施。值得注意的是，该分析无需预先知道融合伴侣，并且能在检测与主要(principle)靶基因相关的各种基因伴侣(和相应的多个外显子)中得到高临床灵敏度。此外，只要伴侣之一是已知的，该分析对于未知的5’上游融合伴侣或未知的3’下游融合伴侣也是有效的。复用和深度测序允许对具有低肿瘤细胞构成、罕见融合、以及罕见可变剪接事件的样品进行测试。由本分析提供的详细的、患者特异的重排信息将对评价基因分型特异性治疗响应有用，或许对评价用于微小残留病监测的患者特异性肿瘤标志物有用。基于常规寡核苷酸合成试剂、成品酶、以及在一次运行中复用多个样品的能力，本分析将是具有成本效益的检测基因重排的临床分析。
表1：适合IonTorrent平台的引物(v1)。引物名称指出包含已知靶核苷酸序列的靶基因和靶基因外显子。R1表示第一靶特异性引物，R2表示第二靶特异性引物。该表中的详细信息为针对每个基因所列出的各个外显子的一组第一靶标特异性引物和第二靶特异性引物。

Claims (53)

1.一种测定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
(a)将包含所述已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部接头连接；
(b)用第一接头引物和第一靶特异性引物扩增所述靶核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接头的扩增链；
(c)用第二接头引物和第二靶特异性引物扩增由步骤(b)产生的扩增子的一部分；
(d)使用第一测序引物和第二测序引物对由步骤(c)产生的扩增部分进行测序；
其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含第一可连接双链末端和第二未配对末端；
其中，所述通用寡核苷酸尾部接头包含封闭链和扩增链；
其中，所述封闭链包含5’双链部分；
其中，所述扩增链包含未配对5’部分、3’双链部分和3’T突出；
其中，所述扩增链包含与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列；
其中，所述封闭链和所述扩增链的双链部分基本上互补，并形成包含3’T突出的所述第一可连接双链末端；
其中，所述双链部分足够长，以在连接温度下维持双链形式；
其中，所述第一靶特异性引物包含能在退火温度下特异性退火至所述靶核酸的所述已知靶核苷酸序列的核酸序列；
其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分含有能特异性退火至由步骤(b)产生的扩增子所包含的所述已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分含有与第二测序引物相同的核酸序列，并且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；
其中，所述第一接头引物包含与所述第一测序引物的5’部分相同的核酸序列；以及
其中，所述第二接头引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于所述第一接头引物嵌套。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述通用寡核苷酸尾部接头的所述封闭链进一步包含3’未配对部分，所述3’未配对部分基本上不与所述扩增链的所述5’未配对部分互补；以及
其中，所述封闭链的所述3’未配对部分基本上不与任何引物互补，或基本上不同于任何引物。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述第二接头引物通过至少3个核苷酸相对于所述第一接头引物嵌套。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，含有与所述第一测序引物和所述第二测序引物相同的核酸序列的所述扩增链的部分至少部分包含于所述扩增链的所述5’未配对部分。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述第一靶特异性引物进一步包含5’标签序列部分，所述5’标签序列部分包含基本上不与任何引物的任何其它部分互补或基本上不同于任何引物的任何其它部分的高GC含量的核酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述第二接头引物与全长第一测序引物相同。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，特异性退火至已知靶的所述靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步在步骤(a)之前包括如下步骤：
对所述核酸进行机械剪切；
使所述核酸经历末端修复；
使所述核酸经历磷酸化；
以及使所述核酸经历腺苷酸化。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述样品包括基因组DNA。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述样品包括RNA，并且所述方法进一步包括使所述样品经历逆转录酶方案的第一步骤。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述逆转录酶方案包括使用随机六聚体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，已知靶序列包含于基因重排中。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述基因重排存在于选自于由如下物质所组成的组中的核酸：
基因组DNA、RNA和cDNA。
14.如权利要求12-13中任一项所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，通过下一代测序法对核酸产物进行测序。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述下一代测序法包括选自于由以下方法所组成的组中的方法：
Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大规模平行签名测序、固相可逆染料终止物测序、以及DNA纳米球测序。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述第一测序引物和所述第二测序引物兼容所选的下一代测序法。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述样品或所述样品的单独部分与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将包含所述样品的单一反应混合物与多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物接触。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述多组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至由不同基因所包含的已知靶核苷酸序列。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至已知靶核苷酸序列的不同部分。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的单个基因的不同部分。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，至少两组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物特异性退火至含有已知靶核苷酸序列的基因的不同外显子。
25.如权利要求19-24中任一项所述的方法，其中，多个第一靶特异性引物包含相同的5’标签序列部分。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述通用寡核苷酸尾部接头进一步包含条形码部分。
27.如权利要求26所述的方法，其中，将多种样品各自与具有独特条形码部分的通用寡核苷酸尾部接头接触；以及其中，在步骤(a)后将所述样品合并。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，各个扩增步骤包括长度为5个循环-20个循环的PCR扩增方案循环组。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，将所述靶特异性引物和所述接头引物设计成在约61-72℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，将所述靶特异性引物和所述接头引物设计成在约65℃的退火温度下会特异性退火至它们的互补序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述样品包括获得自受试者的生物样品。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述样品获得自需要治疗与遗传改变相关的疾病的受试者。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述疾病为癌症。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤细胞群。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述样品包括肿瘤活组织切片。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含于疾病相关基因中。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含于样品中的基因重排产物中。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中，所述基因重排产物为癌基因。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，所述已知靶序列包含来自选自以下基因的组中的基因的序列：
ALK、ROS1和RET。
41.如权利要求40所述的方法，其中，至少一组第一靶特异性引物和第二靶特异性引物选自于由以下引物所组成的组：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；以及SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
42.如权利要求40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中ALK的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
43.如权利要求40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中ROS1的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
ROS抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
44.如权利要求40-41中任一项所述的方法，其中，在从受试者的肿瘤获得的样品中RET的基因重排的存在说明所述肿瘤易受以选自于由如下物质组成的组中的治疗剂进行的治疗的影响：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
45.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
根据权利要求1-44中任一项所述的方法，对获得自需要治疗癌症的受试者的肿瘤样品中一种以上癌基因重排的存在进行检测；
给予对于具有任何检测到的癌基因重排的肿瘤有效的癌症治疗。
46.如权利要求45的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有ALK癌基因重排的肿瘤有效：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
47.如权利要求45所述的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有ROS1癌基因重排的肿瘤有效：
ROS1抑制剂、ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
48.如权利要求45所述的方法，其中，选自于由以下物质组成的组中的治疗剂对于具有RET癌基因重排的肿瘤有效：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
49.一种测定需要治疗癌症的受试者是否会对给定治疗作出响应的方法，所述方法包括：
根据权利要求1-44中任一项所述的方法，对获得自所述受试者的肿瘤样品中癌基因重排的存在进行检测；
其中，如果检测到存在所述癌基因重排，确定所述受试者对靶向癌基因重排产物的治疗作出响应。
50.如权利要求49所述的方法，其中，如果检测到存在ALK癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
51.如权利要求49所述的方法，其中，如果检测到存在ROS1癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
ALK抑制剂、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。
52.如权利要求49所述的方法，其中，如果检测到存在RET癌基因重排，所述受试者会对选自于由如下物质所组成的组中的治疗剂作出响应：
RET抑制剂、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A。
53.如权利要求44-52中任一项所述的方法，其中，所述癌症为肺癌。
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