CN101270395A - 柑桔衰退病毒一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化检测试剂盒及利用该检测试剂盒检测柑桔衰退病毒的方法，是专门针对柑桔衰退病毒建立的一种荧光定量检测方法和产品。检测时间仅需4h，特异性强、灵敏度高、稳定可靠。该方法克服了现有对柑桔衰退病毒依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法灵敏度低等缺点，适合于柑桔种苗和传毒媒介昆虫的带毒状况的快速诊断，可以用于柑桔种苗质量检验和衰退病毒病的鉴别。

Description

柑桔衰退病毒一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种农业生物技术，具体的说，涉及一步法扩增柑桔衰退病毒的简单、快速的固相化核酸检测试剂盒，适合于植物保护、植物检疫及农产品质量技术监督等部门使用。

背景技术

我国柑桔栽培面积位居世界第一位，总产量居世界第二位；柑桔产业已成为我国南方三大柑桔生产带最重要的支柱产业。柑桔衰退病毒(英文名称Citrus tristeza virus，简称CTV)引起的柑桔衰退病是世界范围内的一种重要植物病害，主要由嫁接和蚜虫传播，其主要危害在于引起柑桔植株快速死亡或严重衰退，特别是以酸橙作为砧木的柑桔受害最重。受害植株木质部产生茎陷点，进而导致树势减弱、果品变劣；也可引起酸橙、葡萄柚和柠檬实生苗的苗黄症状。从20世纪30年代至今，柑桔衰退病已经毁灭了至少1亿株柑桔，经济损失超过数亿美元，严重威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔产区和对CTV茎陷点株系敏感的葡萄柚、甜橙等品种的安全。目前没有有效的抗病品种，弱株系保护品种尚未问世，化学防治仅对媒介昆虫有效，因此生产上迫切需要特异、灵敏和准确的检验方法来早期快速准确的诊断CTV，为控制病害流行、确保柑桔生产的安全提供技术支撑。

目前针对CTV检测方法有电子显微镜检验法、血清学法、指示植物症状判断法等。由于病毒在柑桔内分布不均利用电子显微镜检验可能造成假阴性，血清学检测法灵敏度偏低对含量较少病毒可能检测不出，指示植物症状判断法费时费力不能快速检测。基于核酸分子检测的反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription polymerase chain reaction，简称RT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、准确性好等优点，RT-PCR已经成为病毒检测的一种常用方法，在病毒的检测上日益显示出强大的优势。

柑桔衰退病毒是正义单链RNA病毒(+ssRNA)，利用核酸分子检测需要首先将病毒RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增(RT-PCR)。已经报道的常规柑桔衰退病毒核酸分子检测技术在制样技术、检测特异性以及检测体系优化等方面还存在一定的局限，还没有荧光定量RT-PCR对柑桔衰退病毒的检测技术报道。目前柑桔衰退病毒分子诊断试剂盒国内尚无生产、而进口的少量血清学试剂盒存在特异性差，影响到柑桔苗木柑桔衰退病毒的准确检出的问题。本发明拟通过特异性引物、探针筛选，内参对照、制样技术，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)反应体系优化等步骤，建立一种快速准确的一步法实时荧光定量RT-PCR分子检测技术平台及快速、简便、准确、高效的检测柑桔衰退病毒检测试剂盒，为柑桔衰退病毒有效检测提供有效工具。

发明内容

本发明旨在克服上述现有检测技术的不足，提供一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒及其检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

1、一种用于田间侵染的柑桔衰退病毒的一步法荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒，由以下各种检测试剂组成：

柑桔样品中病毒RNA提取试剂；

病毒RNA荧光定量RT-PCR固相化试剂；

无害化柑桔衰退病毒阳性对照品；

健康柑桔阴性对照品；

其关键是，所述样品中病毒RNA提取试剂是5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠，在常温下的混合物；

2、所述无害化柑桔衰退病毒阳性对照品由如下步骤制得：

(1)提取含柑桔衰退病毒的总RNA，

(2)设计扩增柑桔衰退病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCATGTATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，

下游引物序列为：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；

(3)进行RT-PCR扩增得柑桔衰退病毒DNA片段；

(4)以柑桔衰退病毒DNA片段为模板经体外转录得柑桔衰退病毒RNA片段用作无害化阳性对照。

所述病毒RNA荧光定量RT-PCR固相化试剂外观呈冻干胶珠；其中，固相化反应试剂含有如下组分：

组分                             终浓度

10×RT-PCR缓冲液                 1×，

25mM MgCl₂                       3mmo l/L，

10mM dNTPs                       0.3mmol/L，

40U/μL RNA酶抑制剂              8Unit/25uL，

200U/μL MMLV反转录酶            50Unit/25uL，

10μM CTV引物对                  0.2μmol/L，

10μM Taq DNA聚合酶Man探针       0.12μmol/L，

5U/μL Taq DNA聚合酶DNA聚合酶    1U/25μL，

生物大分子稳定剂                 加至25μL；

所使用的引物为寡核苷酸引物对：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；5’-CCTCATAACGAAGAAGCCCA-3’；荧光探针5’(FAM)-CGGTTTACTCGCGACAAGCTGCTC(TAMR)-3’。

3、本发明所述柑桔衰退病毒一步法实时荧光定量RT-PCR固相化试剂的混合物冻干胶珠是将所有需要试剂与生物大分子稳定剂混合后经真空冷冻干燥制备而成的可以常温贮运的PCR扩增固相化混合物冻干胶珠。而生物大分子稳定剂由重量体积比为0.05-0.1％明胶、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％牛血清白蛋白，其余为超纯水混合而成。

4、提供一种用于柑桔衰退病毒RNA提取方法，按以下步骤进行：

(1)配制柑桔病毒RNA专用提取液，由5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠与适量无RNA酶的超纯水混合而成；

(2)以下操作一份样本换用一个吸头。用液氮研磨待测样品的柑桔叶片取约50mg的粉末，加入700μL样品提取液，混匀器上振荡混匀1min，在室温下静止30分钟后，以12000r/min的速度离心10min；

(3)取上清液加入300μL的100％乙醇，彻底混匀后全部移入微滤柱中，离心1min，离心速度12000r/min；

(4)加入350μL的75％乙醇洗柱，静置1min后室温离心1min，离心速度为12000r/min；

(5)重复[4]步骤一次；

(6)将微滤柱室温再次离心1min，速度为13000r/min，以彻底去除残存乙醇；

(7)加50μLDEPC水到微滤柱中，静置5min后，在室温下离心1min，速度为12000r/min；将洗脱下来的RNA在冰上保存备用；提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。

5、在具备上述条件的情况下，提供柑桔衰退病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其步骤如下：

[1]根据柑桔衰退病毒的特异序列，设计用于荧光定量RT-PCR检测的特异性引物对、荧光标记杂交探针，引物与探针为第2点中所述引物与探针；

[2]采用简易微滤柱离心法快速提取柑桔衰退病毒RNA(即第4点所述方法)；

[3]取[2]步提取的2μL RNA和23μL DEPC水加入到实时荧光定量RT-PCR固相化试剂中，同时制备阳性对照和阴性对照反应管；

[4]将[3]步配好的RT-PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量RT-PCR扩增；

[5]在荧光定量RT-PCR结果图上依据样品Ct值情况直接判断出样品是否带有柑桔衰退病毒。

采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于：

[1]克服了常规诊断方法误判率高、传统的生物学检测方法费时费力、血清学方法检测灵敏度低等缺陷；

[2]开发了一步法快速检测柑桔衰退病毒的实时荧光RT-PCR固相化试剂盒；

[3]建立了无害化标准阳性对照，可避免直接采用罹病植物样品作为阳性样品的不确定性和不稳定性，保证了检测的准确性和可靠性。

[4]本发明利用RNA简易微滤柱离心技术，只需微量材料即可对柑桔衰退病毒直接进行RT-PCR检测；

[5]具有灵敏、特异的优点，适用于快速鉴定柑桔苗木是否带柑桔衰退病毒和带毒量。

[6]由于样品RNA提取时间短，缩短了检测时间，RT-PCR检测只需要4-6小时，特别适合于大量柑桔苗木的快速检验。

综上所述，采用本发明，能对柑桔苗木和田间调查过程中所获得的各种柑桔材料进行柑桔衰退病毒病分子生物学鉴定或检测，对柑桔苗木质量检验具有重要作用。

具体实施方式：

实施例：

一、柑桔衰退病毒无害化阳性对照品的制备：所述无害化柑桔衰退病毒阳性对照品由如下步骤制得：

(1)提取含柑桔衰退病毒的总RNA；

(2)设计扩增柑桔衰退病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCATGTATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，下游引物序列为：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；

(3)进行RT-PCR扩增得柑桔衰退病毒DNA片段；

(4)以柑桔衰退病毒DNA片段为模板经体外转录得柑桔衰退病毒RNA片段，用作无害化阳性对照。

二、、固相化检测试剂盒的组分：

样品病毒RNA提取试剂，病毒RNA荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂，无害化柑桔衰退病毒阳性对照品，健康柑桔阴性对照品。

三、固相化试剂盒的制备：

试剂盒的制备包括如下步骤：

1)、柑桔样品中病毒提取液配制：

柑桔样品中病毒RNA专用提取液配制：配制病毒RNA提取液，由下列试剂组成(按重量/体积)：5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠。将上述试剂依次加入无RNA酶的超纯水中，磁力搅拌溶解混匀后，定量分装。

2)、实时荧光定量RT-PCR检测试剂配制：

荧光定量RT-PCR反应检测试剂包括：1×RT-PCR缓冲液，3mmo l/LMgCl₂，0.3mmol/L dNTPs，8U RNA酶抑制剂，50U MMLV反转录酶，柑桔衰退病毒引物对0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶Man探针0.12μmol/L，Taq DNA聚合酶1U；生物大分子稳定剂包括(重量/体积)：0.4％明胶、0.2％多糖、0.05％牛血清白蛋白、超纯水。

所使用的引物为寡核苷酸引物对和TaqMan探针：

5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；

5’-CCTCATAACGAAGAAGCCCA-3’；

荧光探针5’(FAM490)-CGGTTTACTCGCGA CAAGCTGCTC(TAMRA)-3’。

3)、柑桔衰退病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒制备：

将上述步骤2中配制的检测试剂和大分子稳定剂依次加入混匀后，定量分装到0.2uL微量PCR管中，放入-20℃低温冰箱预冷1小时，再放入真空冷冻干燥装置中冷冻干燥过夜；冻干后的试剂呈透明胶珠状。密封包装保存备用。同时分别制备阳性对照试剂、阴性反应试剂的固相化反应管。

四、固相化试剂盒的使用方法

利用固相化试剂盒检测柑桔衰退病包括如下步骤：

1)、检测样品病毒RNA制备：

待测柑桔样品经液氮研磨成微粉，取50mg微粉放入1.5mLEPPENDORF离心管，加入700μL柑桔病毒RNA样品提取液；在混匀器上振荡混匀1min；在室温下静止30分钟后，离心10min，速度为12000r/min。吸取上清液至新离心管，加入300μL的无水乙醇，混匀后静置30分钟，再将其全部移入微滤柱中，离心1min，速度为12000r/min；加入350μL75％乙醇清洗微滤柱滤膜，静置1min后，室温离心1min，速度为12000r/min，重复此步一次；加50μL DEPC水，静置5min后室温下离心1min，速度为12000r/min；洗脱的无色液体即为样品总RNA，-20℃保存备用。

2)、实时荧光定量RT-PCR反应体系建立：

吸取25uL无RNA酶的超纯水，加入固相化试剂盒提供的反应试剂管中，将冻干胶珠完全溶解混匀，离心后置于荧光定量PCR扩增仪反应槽中(Icycler^TM iQ，Bio-Rad，USA)进行一步法RT-PCR反应。同时设置无害化柑桔衰退病毒的RNA作阳性对照反应管、健康柑桔植株提取液(阳性对照)作阴性对照反应管和无RNA酶超纯水空白对照反应管。

3)、RT-PCR反应程序如下：

反转录程序：42℃20min；95℃4min；

PCR扩增程序：95℃10s，60℃40s共40个循环；4℃保持。

在荧光定量RT-PCR的扣除基线荧光值Ct值动态图上依据样品Ct情况直接判断出样品是否带有柑桔衰退病毒。

4)、检测结果判定：

若检测到以柑桔衰退毒病毒RNA为模板的阳性对照的Ct值＜28.0，并出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，检测有效；否则，此次检测视为无效。样品的Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在柑桔衰退病毒。有效检测中待测样品Ct＞35的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

(^*Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)。

Claims (2)

1.一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂盒，由以下试剂组成：

柑桔样品中病毒RNA提取试剂，

病毒RNA实时荧光定量RT-PCR固相化试剂，

无害化柑桔衰退病毒阳性对照品，

健康柑桔阴性对照品；

其特征在于：

所述样品病毒RNA提取试剂是用5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠，在常温下的混合物。

所述无害化柑桔衰退病毒阳性对照品由如下步骤制得：

[1]提取含柑桔衰退病毒的总RNA；

[2]设计扩增柑桔衰退病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCATGTATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，下游引物序列为：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’；

[3]进行RT-PCR扩增得到柑桔衰退病毒DNA片段；

[4]以柑桔衰退病毒DNA片段为模板进行体外转录得柑桔衰退病毒RNA片段，用作无害化阳性对照。

所述病毒RNA荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化试剂的外观呈冻干胶珠；并且固相化反应试剂含有如下组分：

组分                         终浓度

10×RT-PCR缓冲液             1×，

25mM MgCl₂                   3mmo l/L，

10mM dNTPs                   0.3mmol/L，

40U/μL RNA酶抑制剂          8Unit/25uL，

200U/μL MMLV反转录酶        50Unit/25uL，

10μM CTV引物对              0.2μmol/L，

10μM Taq DNA聚合酶Man探针   0.12μmol/L，

5U/μL Taq DNA聚合酶         1U/25μL，

生物大分子稳定剂             加至25μL；

所使用的引物为寡核苷酸引物对：5’-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’，5’-CCTCATAACGAAGAAGCCCA-3’；荧光探针5’(FAM)-CGGTTTACTCGCGA CAAGCTGCTC(TAMRA)-3’；

所述生物大分子稳定剂由(重量/体积)0.05-0.1％明胶、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％牛血清白蛋白，其余为超纯水混合而成。

2.一种提供用于柑桔衰退病毒RNA提取的方法，其特征是，按以下步骤进行：

[1]配制柑桔病毒RNA专用提取液，由5mmol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.65％亚硫酸钠与适量无RNA酶的超纯水混合而成；

[2]用液氮研磨待测样品的柑桔叶片，取约50mg的粉末，加入700μL样品提取液，混匀器上振荡混匀1min，在室温下静止20-30分钟后，以12000r/min的速度离心10min，取上清液备用；一份样本换用一个吸头；

[3]上清液加入300μL的100％乙醇，彻底混匀后全部移入微滤柱中，离心1min，离心速度为12000r/min；

[4]加入350μL的75％乙醇洗柱，静置1min后，室温离心1min，离心速度为12000r/min；

[5]重复[4]步骤一次；

[6]将微滤柱室温离心1min，速度为13000r/min以彻底去除残存乙醇；

[7]加50μL DEPC水到微滤柱中，静置5min后，在室温下离心1min，速度为12000r/min；将洗脱下来的RNA冰上保存备用；提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，或在-20℃保存；若需长期保存须放置-70℃冰箱。