CN102634503A - β-葡聚糖酶稳定剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固态或液态β-葡聚糖酶稳定剂及其制备方法。该β-葡聚糖酶稳定剂至少包含β-葡聚糖酶与保护剂，原料酶液的酶活力为：15,000-25,000IU/ml。保护剂选自：至少包含以下一种或多种：(1)白蛋白，(2)明胶，(3)CaCl₂。本发明在室温下保存6个月酶活损失不高于20％(未加保护剂的酶活损失高于65％)，在4℃下保存12个月酶活损失不高于10％(未加保护剂的酶活损失高于35％)，可以满足长期稳定保存的要求。

Description

β-葡聚糖酶稳定剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及稳定生物活性制品制剂方法的技术领域，特别涉及一种固态或液态β-葡聚糖酶复合制剂及其制备方法。

背景技术

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶，它可以水解大麦β-葡聚糖成较小聚合物，从而消除β-葡聚糖在啤酒行业所造成的麦汁粘度增大，过滤困难，得率降低，啤酒的雾状浑浊和凝胶沉淀等问题。如将β-葡聚糖酶添加到饲料中，可以减少大麦β-葡聚糖的抗营养作用，增加单胃动物对养分的吸收，提高以大麦为饲料的饲料利用率。广义的β-葡聚糖酶主要包括内切1，3-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，3-1，4-葡聚糖酶、内切β-1，3-葡聚糖酶、内切β-1，4-葡聚糖酶和外切β-1，3-葡聚糖酶外切β-1，4-葡聚糖酶等.狭义的β-葡聚糖酶指的即是内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶。已经证明，内切酶可以明显降低β-葡聚糖的粘度，而外切酶对β-葡聚糖的粘度影响较小。

生物活性制品特别是酶通常在贮藏和使用过程中比较容易失活，而不能充分发挥其自身的生物功能，从而限制了这些活性物质的应用。应用于饲料、啤酒等领域的固态生物活性制品，通常还需要经历干燥、造粒、挤压、膨胀等高温(80-120℃)高温处理操作，极易导致这些生物制品失去活性。动物胃中的酸性环境和胃、胰蛋白酶的存在，都会影响酶的使用效果。啤酒酿造糖化工艺的高温为70-80℃，绝大多数β-葡聚糖酶不能耐此高温。

商品化的酶制剂有粉末和液体两种，液体酶制剂的工艺比较简单，设备投资少，能耗低，但液体酶制剂存在着保存期短的缺点。为了提高液体酶的稳定性，常采用添加保护剂的方法。

酶在具体应用的过程中会出现保存期短，或者酶活性降低，这是因为酶活力很大程度上依赖于酶分子构象的稳定性，酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响到酶的催化活力，周围温度和pH会导致酶的空间结构破坏从而丧失其原有的生物活性。酶在纯的溶液中更易变性。β-葡聚糖酶的结构与其稳定性有直接相关性，周围环境会影响实际应用过程中作用效率。因此酶的稳定性问题使得其应用受限。

发明内容

本发明的目的是提出一种固态或液态β-葡聚糖酶稳定剂及其制备方法。稳定β-葡聚糖酶的液态制剂是直接向β-葡聚糖酶溶液加稳定剂；固态制剂是向酶液中添加稳定剂后再加入载体淀粉进行干燥、制粒。这两种方法具有制剂简单、易于操作、成本低廉、制剂稳定效果显著等优点。本发明的β-葡聚糖酶制剂产品在室温下存放6个月，酶活损失不高于20％(未加保护剂的酶活损失高于65％)；在4℃下冷藏存放12个月，酶活损失不高于10％(未加保护剂的酶活损失高于35％)，满足长期保存的要求。

本发明提供一种提高固态或液态β-葡聚糖酶稳定性的保护剂，其特征在于：至少包含以下一种或多种：

(1)白蛋白；

(2)明胶；

(3)CaCl₂。

所述原料酶液的酶活力为15,000-25,000IU/ml。

所述的保护剂的质量比为：

(1)白蛋白       0.5-1.2％；

(2)明胶         1-4％；

(3)CaCl₂        0.01-0.03％。

所述的β-葡聚糖酶稳定剂，其特征在于所述的β-葡聚糖酶为微生物来源的β-葡聚糖酶，微生物是芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌中的一种或多种，优选芽孢杆菌β-葡聚糖酶和由芽孢杆菌经理化因素诱变育种及基因工程构建的工程菌表达的β-葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明使用的β-葡聚糖酶溶液是微生物分批补料发酵制得β-葡聚糖酶的粗酶液，经离心处理后制得，其中产酶微生物包括芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌各类菌种，优选芽孢杆菌及其经经理化因素诱变育种和基因改造后构建的基因工程菌，但不仅限于此类微生物；(2)饲料用酶：β-葡聚糖酶的发酵粗酶液，再经过絮凝、离心的酶液；(3)啤酒酿造用酶：β-葡聚糖酶的发酵粗酶液，再经过絮凝、离心和超滤纯化后操作所获得的酶液。酶活定义为在pH5.5，37℃下，每分钟释放出1μmol相当于β-葡聚糖的还原糖所需要的酶量为1个活力单位(IU)。所用的保护剂均为市售的食品级商品。

实施例1：收集由芽孢杆菌分批补料发酵生产的β-葡聚糖酶粗酶液，基于酶的特定用途选择纯化操作：将11L上述β-葡聚糖酶粗酶液，用三足离心机以2000rpm转速进行离心操作去除大部分的菌体等固体形物，制得大约10L澄清的β-葡聚糖酶溶液；(1)饲料用酶：将10L上述β-葡聚糖酶的粗酶液，加入絮凝助剂(氯化钙、聚铝、阳离子和阴离子聚丙烯酰胺等)进行絮凝操作，并用三足离心机以2000rpm转速离心分离去除大部分絮凝助剂、菌体和杂蛋白等固形物，制得大约8L的β-葡聚糖酶溶液；(2)啤酒酿造用酶：将10L上述β-葡聚糖酶的粗酶液，经过壳聚糖为絮凝助剂絮凝操作、三足离心机离心分离以及两个截留分子量分别为10kDa与50kDa中空纤维超滤膜分离，获得了纯度更高的β-葡聚糖酶溶液。纯化后β-葡聚糖酶溶液再通过真空蒸发浓缩的方法将酶液的酶活控制在20,000IU/ml。

实施例2：以啤酒酿造用酶为例，将发酵获得的β-葡聚糖酶液进行絮凝、离心和10kDa、50kDa和超滤纯化处理操作，并经适当浓缩后获得β-葡聚糖酶溶液(酶活为20,120IU/mL)。取5L上述β-葡聚糖酶溶液，向其中加入50g白蛋白、100g明胶和1g CaCl₂作为液态酶制剂复合保护剂，并通过搅拌混合均匀，制得β-葡聚糖酶的液态制剂产品，4℃下冷藏保存或室温保存备用，其储存稳定性如表1。

表1β-葡聚糖酶液态酶制剂储存稳定性

保存时间(天)	0	7	21	75	180
						4℃保存酶活保留率(％)	100	99.1	96.3	94.2	91.0
室温保存酶活保留率(％)	100	95.6	93.2	88.1	81.3

实施例3：以饲料添加酶制剂为例，将发酵获得的β-葡聚糖酶的粗酶液(酶活为7,500IU/mL)进行絮凝和离心纯化处理操作，并经适当浓缩后获得了β-葡聚糖酶溶液(酶活为22,000IU/ml)。取5L上述β-葡聚糖酶溶液，向其中加入40g白蛋白、80g明胶和0.8g CaCl₂，搅拌混合均匀后，再加入5000g淀粉将β-葡聚糖酶溶液变成浆态，利用105℃的热空气对该浆料进行干燥，干燥程度以最终产品的含水量要求为控制指标，大约干燥需要4小时。将制得的含复合稳定剂的β-葡聚糖酶固态粒状制剂过40-80目标准筛处理，最终获得β-葡聚糖酶固态酶制剂(酶活为21,000IU/g)，4℃下冷藏保存或室温保存备用，其储存稳定性见表2。

表2β-葡聚糖酶固态酶制剂储存稳定性

保存时间(天)	0	7	21	75	180
						4℃保存酶活保留率(％)	100	99.8	98.8	98.5	93.3
室温保存酶活保留率(％)	100	98.3	96.1	91.9	87.6

Claims (3)

1.一种提高固态或液态β-葡聚糖酶稳定剂，其特征在于：至少包含以下一种或多种：

(1)白蛋白；

(2)明胶；

(3)CaCl₂。

所述原料酶液的酶活力为15,000-25,000IU/ml。

2.根据权利要求1所述的一种β-葡聚糖酶稳定剂，其特征在于：所述的保护剂的质量比为：

(1)白蛋白      0.5-1.2％；

(2)明胶        1-4％；

(3)CaCl₂       0.01-0.03％。

3.根据权利要求1所述的β-葡聚糖酶稳定剂，其特征在于所述的β-葡聚糖酶为微生物来源的β-葡聚糖酶，微生物是芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌中的一种或多种，优选芽孢杆菌β-葡聚糖酶和由芽孢杆菌经理化因素诱变育种及基因工程构建的工程菌表达的β-葡聚糖酶。