CN107760664A - 一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过钙离子和钠离子的协同添加显著改善了直链麦芽低聚糖生成酶的热稳定性，使酶在60～90℃下保温后30min～3h后其相对活力是不添加助剂的2～10倍，相比于单独添加Ca2+或Na+提高至少2倍。对提高酶的工业应用价值具有非常重大的意义，并且，此发明操作简单，所用试剂价格低廉、安全无毒，具有很好的应用前景。

Description

一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
直链麦芽低聚糖生成酶是指可以水解淀粉生成不同类型直链麦芽低聚糖的一类酶，被广泛应用于食品、医药、纺织、造纸等工业。在直链麦芽低聚糖的酶法生产过程中，酶的热稳定性是一个关键因素。酶的热稳定性高不仅有利于延长酶的贮藏时间、减少酶在保存和运输过程中活力的损失，而且可以使酶在较高的温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本。
目前已被报道用来提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法有物理法、化学法、生物法等。其中利用化学修饰改善酶热稳定性的方法存在试剂安全性的问题；生物法主要通过蛋白质工程，如理性化设计和定向进化等改变蛋白质氨基酸序列，进而改变酶结构而提高其热稳定性，存在难度大、技术繁琐、成本高等问题。物理法是通过添加稳定剂形成复合物而达到稳定酶的效果。目前常用的稳定剂有糖和多羟基化合物，如海藻糖、蔗糖、聚乙二醇等，但上述稳定剂的添加有时会影响反应的正常进行。因此，需要开拓一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性且对其工业化应用影响较小的新方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的酶制剂，所述酶制剂含有稳定剂和直链麦芽低聚糖生成酶；所述稳定剂含有钙离子和钠离子。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂中钙离子终浓度为1～20mM，钠离子终浓度为5～80mM。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂中酶的终浓度为20～100U/mL或20～100U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂以酶液形式存在。
在本发明的一种实施方式中，所述稳定剂含有CaCl2。
在本发明的一种实施方式中，所述稳定剂含有NaCl。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶包括直链麦芽五糖-六糖生成酶、直链麦芽六糖生成酶或直链麦芽四糖生成酶。
本发明还提供一种提高直链麦芽低聚糖生成酶的热稳定性的方法，是将钙离子和钠离子添加至含有直链麦芽低聚糖生成酶的体系中。
在本发明的一种实施方式中，钙离子终浓度为1～20mM，钠离子终浓度为5～80mM。
在本发明的一种实施方式中，酶的终浓度为20～100U/mL。
本发明还提供所述方法在食品、医药、纺织、造纸领域以直链麦芽低聚糖生成酶作为催化剂的反应中的应用。
有益效果：本发明通过钙离子和钠离子的协同添加显著改善了直链麦芽低聚糖生成酶的热稳定性，使酶在60～90℃下保温30min～3h后其相对活力是不添加助剂的2～10倍，相比于单独添加Ca2+或Na+提高至少2倍。对提高酶的工业应用价值具有非常重大的意义，并且，此发明操作简单，所用试剂价格低廉、安全无毒，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度钙离子对直链麦芽五糖-六糖生成酶热稳定性的影响，其中，◆：未添加助剂；□：1mM钙离子；▲：2mM钙离子；×：5mM钙离子；■：10mM钙离子；○：20mM钙离子；
图2为不同浓度钠离子对直链麦芽五糖-六糖生成酶热稳定性的影响；其中，◆：未添加助剂；□：5mM钠离子；▲：10mM钠离子；○：20mM钠离子；△：40mM钙离子；■：80mM钠离子；
图3为钙离子和钠离子协同作用对直链麦芽五糖-六糖生成酶热稳定性的影响；其中：◆：未添加助剂；◇：10mM钙离子；■：40mM钠离子；○：10mM钙离子和40mM钠离子。
具体实施方式
直链麦芽五糖-六糖生成酶热稳定性的分析方法：直链麦芽五糖-六糖生成酶在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0℃，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100％。绘制相对酶活-时间曲线。
直链麦芽五糖-六糖生成酶活力的测定方法：采用DNS法。以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH 5.5)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在1.98mL底物中加入20μL稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入2.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
直链麦芽六糖生成酶热稳定性的分析方法：直链麦芽六糖生成酶在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0℃，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100％。绘制相对酶活-时间曲线。
直链麦芽六糖生成酶活力的分析方法：采用DNS法。以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH 5.5)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在1.98mL底物中加入20μL稀释后的酶液，45℃下反应15min，加入2.0mL DNS溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
实施例1
将来源于Bacillus stearothermophilus STB04的直链麦芽五糖-六糖生成酶(Genbank登录号：AIV43245.1)与CaCl2溶液混合均匀，使Ca2+终浓度分别为1，2，5，10，20mM，酶浓度为20U/mL，在80℃下测定该酶溶液的热稳定性，结果如图1所示，该直链麦芽五糖-六糖生成酶在80℃下的半衰期小于5min，与空白对照相比，添加Ca2+后其热稳定性明显提高，终浓度1mM的Ca2+即可将该酶在80℃下的半衰期延长至30min以上，终浓度10mM的Ca2+效果最佳，可将半衰期提高到80min以上。
实施例2
在来源于Bacillus stearothermophilus STB04的直链麦芽五糖-六糖生成酶溶液中加入NaCl溶液，使Na+终浓度为5～80mM，酶的终浓度为100U/mL，在80℃下测定该酶溶液的热稳定性，结果如图2所示，与空白对照相比，添加Na+后其热稳定性明显提高，终浓度5mM的Na+可将该酶在80℃下的半衰期延长至20min，终浓度40mM的Na+可将该酶在80℃下的半衰期延长至69min。
实施例3
在来源于Bacillus stearothermophilus STB04的直链麦芽五糖-六糖生成酶溶液中加入CaCl2溶液使Ca2+终浓度为10mM，并添加NaCl溶液使Na+终浓度为40mM，酶的终浓度为20U/mL。在80℃下测定该酶溶液的热稳定性，结果如图3所示，与不添加助剂的空白对照、只添加10mM Ca2+或40mM Na+的对照相比，直链麦芽六糖生成酶的热稳定性显著提高。在80℃下保温3h后其相对活力仍达71.1％，是单独添加钙离子时的4.7倍，是单独添加钠离子的5.8倍，不添加助剂的空白对照则完全失活。
实施例4
在来源于Bacillus stearothermophilus STB04的直链麦芽五糖-六糖生成酶溶液中加入CaCl2溶液使Ca2+终浓度为5mM，并添加NaCl溶液使Na+终浓度为10mM，酶的终浓度为100U/mL。在90℃下测定该酶溶液的热稳定性，结果显示与不添加助剂的空白对照、只添加5mM Ca2+或10mM Na+的对照相比，直链麦芽五糖-六糖生成酶的热稳定性显著提高。在90℃下保温1h后其相对活力是单独添加钙离子时的2.1倍，是单独添加钠离子的3.1倍，不添加助剂的空白对照则完全失活。
实施例5
在来源于嗜碱芽孢杆菌的直链麦芽六糖生成酶(PDB登录号：1WP6)溶液中加入CaCl2溶液使Ca2+终浓度为10mM，并添加NaCl溶液使Na+终浓度为20mM，酶的终浓度为20U/mL。在90℃下测定该酶溶液的热稳定性，结果显示与不添加助剂的空白对照、只添加10mMCa2+或20mM Na+的对照相比，耐高温α-淀粉酶的热稳定性显著提高。在60℃下保温30min后其相对活力是不添加助剂的空白对照的10倍，是单独添加10mM Ca2+时的2.4倍，是单独添加20mM Na+的3.7倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种热稳定性提高的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂含有稳定剂和直链麦芽低聚糖生成酶；所述稳定剂包括钙离子和钠离子。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述直链麦芽低聚糖生成酶包括直链麦芽五糖-六糖生成酶、直链麦芽六糖生成酶或直链麦芽四糖生成酶。
3.根据权利要求1或2所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂中钙离子终浓度为1～20mM，钠离子终浓度为5～80mM。
4.根据权利要求3所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂中酶的终浓度为20～100U/mL或20～100U/g。
5.根据权利要求3所述的酶制剂，其特征在于，所述钙离子来源于CaCl2，所述钠离子来源于NaCl。
6.根据权利要求4或5所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂以酶液形式存在。
7.一种提高酶的热稳定性的方法，其特征在于，是将钙离子和钠离子添加至含有直链麦芽低聚糖生成酶的体系中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，钙离子终浓度为1～20mM，钠离子终浓度为5～80mM；酶的终浓度为20～100U/mL或20～100U/g。
9.权利要求7或8所述方法在食品、医药、纺织、造纸领域提高直链麦芽低聚糖生成酶稳定性中的应用。
10.权利要求1-2,4-5任一所述的酶制剂在食品、医药、纺织、造纸领域作为催化剂的应用。
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