CN103088152A - 一种检测褐色橘蚜体内ctv实时荧光定量rt-pcr的引物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法，利用实时定量引物专用设计软件Beacon Designer设计CTV特异性引物，摸索和优化实时荧光定量RT-PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，并对单头橘蚜体内CTV含量进行准确的定量检测。通过融解曲线、标准曲线的扩增效率及相关系数及方法学验证结果表明该体系灵敏、快速、有效，即使橘蚜体内CTV含量低也可准确定量检测。

Description

一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法

技术领域

本发明属于柑橘衰退病毒(CTV)检测领域。具体涉及用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其方法。

背景技术

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)是长线形病毒属(Closterovirus)的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒[1]。褐色橘蚜被普遍认为是其最主要的传播介体。由CTV引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对柑橘产业造成了重大经济损失。监控CTV在田间的流行是控制柑橘衰退病扩大危害的重要策略之一，因此急需建立一种快速、灵敏且可靠的检测橘蚜体内CTV含量的方法，对更好的防治橘蚜传播CTV及深入研究蚜传机制有重大意义。在ELISA技术出现之前，明确蚜虫是否带毒一般通过传毒实验进行评价。血清学ELISA技术的建立推动了植物病毒的诊断，但由于非增殖型传播的病毒在昆虫体内浓度很低及血清学方法检测灵敏度较低，所以检测昆虫体内病毒比较困难。目前，PCR技术已广泛用来检测蚜虫体内带毒情况。对蚜虫体内的CTV成功检出的方法已有报道，主要有常规反转录多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription-nested-polymerase chain reaction，RT-nested-PCR)，这只是定性检测。虽然Maria等及Edson Bertolini等分别用Real-time RT-PCR

对蚜虫内CTV进行了定量检测，但TaqMan探针法成本较高，而应用SYBR Green I染料法检测橘蚜体内CTV尚无好的体系。

发明内容

为解决以上技术问题，为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种柑橘衰退病毒特异性引物，用于荧光定量RT-PCR检测方法。

本发明目的之二在于提供一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法。

本发明目的是这样实现的：

一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物，其关键在于：其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

上述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示。

一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物的制备：根据Genbank中CTV P25基因保守序列，利用BeaconDesigner 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性。在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA；

(2)褐色橘蚜总RNA的提取；

(3)目的基因的扩增与鉴定；

(4)标准品cRNA的制备；

(5)建立荧光定量RT-PCR体系；

(6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测：

当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。

上述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60℃；引物浓度为600nm；

5μl反转录体系为：2×TS ReAction Mix 2.5μl；TrAnsScriptTM/RI Enzyme Mix0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；蚜虫RNA模板或标准品1.5μl；程序为：42℃反转录30min；85℃变性5min.

20μl实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green Supermix)10μl；HD-F/R各1.2μl；ddH₂O 5.6μl；反转录产物cDNA模板2μl；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从65℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照；采用上述建立的体系对在毒源上取食24h的单头蚜虫中CTV进行定量检测，得到单头橘蚜体内CTV含量。

上述荧光定量RT-PCR条件的优化及体系的确定

退火温度的优化

以9.0×10⁵拷贝/μl的cRNA反转录的cDNA作为模板，选取53℃到63℃的10个不同退火温度进行荧光定量RT-PCR，观察温度对荧光信号的影响及是否出现非特异，选取Ct值最小且扩增曲线最好的温度。从附图3、4可以看出退火温度为60℃时，荧光值最高，Ct值比其他组小，说明其扩增效率及检测灵敏度较其他组高，从融解曲线仅有单一峰可以看出无非特异，因此确定该体系退火温度为60℃。

引物浓度的优化

以9.0×10¹拷贝/μl到9.0×10⁸拷贝/μl的cRNA反转录的cDNA作为模板，选取800nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm 6个不同浓度的引物在相同条件下进行定量RT-PCR，观察不同引物浓度下标准曲线的扩增效率。选择最适的退火温度及引物浓度确定最终检测体系。经比较后结果为600nm时扩增效率最高且无非特异扩增，因此600nm为该体系最终引物浓度。扩增曲线及标准曲线如图5、6，可以看出扩增效率达104.7，相关性为0.998，表明该体系可以准确的对橘蚜体内CTV含量进行定量检测。

经退火温度和引物浓度的优化，最终确定该体系为：

5μl反转录体系为：2×TS ReAction Mix 2.5μl；TrAnsScriptTM/RI Enzyme Mix0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；病毒模板1.5μl。程序为：42℃反转录30min；85℃变性5min.

20μl实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green Supermix)10μl；HD-F/R各1.2μl；ddH₂O 5.6μl；cDNA模板2μl；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从65℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照。

标准曲线的建立

将计算好拷贝数的cRNA用TAKARA的EASY Dilution(D9160A)以10倍梯度稀释稀释的9.0×10¹拷贝/μl到9.0×10⁸拷贝/μl为模板进行反转录后，在最优的反应条件下进行定量RT-PCR，每一浓度设定3个重复，同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照，仪器自动生成标准曲线。

反应体系的方法学测试

荧光定量RT-PCR的灵敏性试验

以同一批梯度稀释的9.0×10¹拷贝/μl到9.0×10⁸拷贝/μl的cRNA进行反转录后的cDNA为模板分别进行实时定量PCR和常规PCR，比较这两种方法的灵敏度。结果表明，荧光定量RT-PCR能够检测到9.0×10⁰拷贝/μl个cRNA，而常规RT-PCR只能检测到9.0×10²拷贝/μl个cRNA，表明荧光定量RT-PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍，见附图7，8

荧光定量RT-PCR的重复性试验

用9.0×10³拷贝/μl到9.0×10⁷拷贝/μl的cRNA样品为模板，每个稀释度做3管重复，按照优化的体系进行荧光定量PCR。为考察不同实验组间差异性，将以上不同浓度模板连续3天进行3次试验，根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准差(SD)和变异系数(CV)。根据扩增曲线及统计学分析结果(表1)表明，各梯度的变异系数最大为0.67％，表明该方法具有较好组内重复性。而进行的组间重复性试验结果显示，各梯度的变异系数最大为3.24％(表1)，表明该方法具有较好组间重复性，可同时或分批对样品进行稳定准确的定量检测。

表1重复性试验结果

Tab.1 The result of reproducibility

有益效果：本发明利用实时定量引物专用设计软件Beacon Designer设计CTV特异性引物，摸索和优化实时荧光定量RT-PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，并对单头橘蚜体内CTV含量进行准确的定量检测。通过融解曲线、标准曲线的扩增效率及相关系数及方法学验证结果表明该体系灵敏、快速、有效，即使橘蚜体内CTV含量低也可准确定量检测。

说明书附图

图1为橘蚜总RNA电泳图谱。M：100bp DNA分子量标准；1-4：RNA；

图2为用特异引物扩增的目的基因电泳图谱。M：100bpDNA分子量标准；1-5：

目的基因片段，6：阴性对照；7：水对照；

图3为不同退火温度扩增曲线：53℃-63℃；

图4为退火温度为60℃的融解曲线；

图5为引物浓度600nm时标准品cRNA10倍系列稀释的扩增曲线；

图6为引物终浓度600nm的标准曲线；

图7为不同浓度cRNA的扩增曲线1-9：9.0×10⁸-9.0×10⁰拷贝/μL 10：负对照和水对照；

图8为不同浓度cRNA的扩增后的电泳图1-9：9.0×10⁸-9.0×10⁰拷贝/μL；

图9为不同浓度cRNA重复性扩增曲线1-5：9×10⁷-9×10³拷贝/μL。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

1材料的准备

供试毒源

毒源CT16-2株系由中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔苗木脱毒中心温室提供。

褐色橘蚜

褐色橘蚜由中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔苗木脱毒中心养虫室提供，在25℃±2℃的条件下用无毒锦橙实生苗饲养。

主要试剂

Tranzol up(TransGen Biotech)；TransScript^TM One-Step gDNA Rrmoval andcDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)；2×SYBR Greensupermix(TAKARA公司产品)；1oobpDNA分子量标准(100bpDNALaddermarker，北京鼎国产品)。

主要仪器

实时荧光定量PCR仪(icycler iQ，Bio-Rad)；分光光度计(SmartSpec^TMplus(Bio-Rad))等上述设备均由国家柑桔苗木脱毒中心提供。

2引物的设计与合成

根据Genbank中CTV P25基因保守序列，利用Beacon Designer 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性。在LD-F的5′端加T7启动子序列和保护碱基得到引物LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA，引物由大连宝生物公司和华大基因公司合成，引物详细信息见表2。

表2 SYBR Green I Real-time RT-PCR检测CTV所用引物序列

3褐色橘蚜总RNA的提取

褐色橘蚜(直接从毒源上收集或保存在-80℃冰箱)用TransZol Up试剂盒(ET111，TransGen Biotech)根据操作说明书提取，具体方法如下：

(1)将1头放入1.5ml Eppendoff管(进口管)中在液氮中充分研磨，并迅速在管中加入100μL TranzolUp；

(2)室温(15-30℃)静置5min使核酸蛋白复合物完全分离；

(3)加20μL氯仿(1/5V)剧烈振荡30秒，室温(15-30℃)孵育3min，10000rpm，4℃离心15min；

(4)取上清至新管(50μL)，加入50μL异丙醇(等体积)颠倒或涡旋混匀，室温(15-30℃)孵育10min；

(5)10000rpm，4℃离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀弃上清，短暂离心15s，用10μL枪头吸弃上清；

(6)加100μL，-20℃DEPC水配75％乙醇洗涤沉淀(多次颠倒EP管并短暂涡旋)，4℃7500×g离心5min，弃上清；短暂离心15s；

(7)用10μL枪头吸弃上清通风厨中干燥RNA沉淀5-10min(不要干燥至半透明，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低)；

(8)20μL RNA溶解液水用枪头吸打几次，55-60℃孵育10min使RNA溶解；-20℃保存或-80℃长久保存；所提取的总RNA经凝胶电泳鉴定，从附图1可见，28S、18S条带清晰可见，无明显降解，经分光光度计检测，比值大于1.90，说明RNA纯度较好，适用于real time RT-PCR。

4目的基因的扩增与鉴定

5μl反转录(RT)体系为：2×TS Reaction Mix 2.5μl；TransScript^TMRT/RIEnzyme Mix 0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；褐色橘蚜总RNA模板1.5μl。程序为：42℃反转录30min；85℃加热5min.失活TransScript^TMRT与gDNA Remover

25μl PCR反应体系：Premix Ex Taq 12.5μl；HD-F 0.75μl；HD-R 0.5μl；cDNA模板5μl。程序为：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共35个循环，最后72℃延伸30s

取100μl PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经电泳、切胶回收纯化后与PMD19-T载体连接，转化Trans 1-T，接种于含有AMP的LB平板，37℃过夜，挑取单菌落白斑接种于含AMP的LA培养基，37℃震荡过夜。采用菌液PCR的方法来鉴定是否有插入片段。将阳性菌液送大连宝生物公司进行测序。从附图2中可以看出阳性对照都有特异的条带，且无引物二聚体和其他非特异扩增，片段长度为136bp，而阴性对照和水对照均无扩增。序列测序后，在NCBI经Blast分析，与CTV序列同源性最高达100％，由此确定扩增片段的正确性。

5标准品cRNA的制备

采用修饰引物对(LD-T7-F/LD-R)进行PCR扩增的产物cDNA经电泳切胶回收纯化后为模板，用T7体外转录试剂盒(TOYOBO)根据说明进行体外转录，并用RNase-Free Dnase I(Promega)对cRNA进行纯化。纯化后的cRNA用分光光度计(SmartSpec^TMplus(Bio-Rad)进行测定cRNA浓度：所得cRNA浓度一般大于900ng/μl，A260/A280一般在1.95-2.00之间，可作为标准品，并用下

列公式计算：

其中：MW=RNA碱基数(bp)×330dalton/bp经计算得cRNA拷贝数为9.0×10¹²拷贝/μl

制备9.0×10⁹拷贝/μl溶液作为标准品与原液，贮存于-80℃。

标准曲线的建立

将计算好拷贝数的cRNA用TAKARA的EASY Dilution(D9160A)以10倍梯度稀释的9.0×10¹拷贝/μl到9.0×10⁸拷贝/μl为模板进行反转录后，在最优的反应条件下进行定量RT-PCR，每一浓度设定3个重复，同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照，仪器自动生成标准曲线。

6单头褐色橘蚜体内CTV含量检测

当毒源CT16-2开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测。按照该方法做3次平行试验。

具体操作如下：

在冰上配制混合液M1：2×TS Reaction Mix 2.5μL；TransScript^TM/RI EnzymeMix 0.25μL；gDNA Remover 0.25μL；HD-R 0.25μL；ddH₂O 0.25μL；涡旋混匀，每个PCR管分装3.5μL，再将标准品及蚜虫RNA模板1.5μL加入各管共5μL。42℃反转录30min；85℃变性5min.得cDNA.

(3)以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR：

在冰上配制混合液M2：2×SYBR Green Supermix)10μL；HD-F/R各1.2μL；ddH₂O 5.6μL；每管分装18μL,并将待检cDNA模板2μL加入各管，共20μL，瞬时离心。同时做正对照、负对照、水对照，每个模板做3个重复放入实时PCR仪进行定量检测。扩增前将实时PCR仪提前30min预热使仪器稳定，再进行校正程序以消除孔与孔之间的差异，最后扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从65℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成。

7单头橘蚜带毒量

采用上述建立的体系对在毒源上取食24h的单头蚜虫中CTV进行定量检测，3次平行实验共检测60头蚜虫，结果(表3)表明，橘蚜在毒源上取食24h后带毒率为100％，得到CTV最低含量为2500拷贝，最高含量为1,243,333拷贝，差异较大，但是总体来看每头橘蚜CTV含量主要集中于104-105数量级之间，约占检测蚜虫总量的91.67％。

表3实时RT-PCR定量检测单头橘蚜CTV含量

Tab.2 Dctection and quantitation of CTV in singleT.citricida by real time RT-PCR

序列表

<110> 单位名称

<120>一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其方法

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

CGAGTCTGGG  GTAGAAGTAA  CGA

<210> 2

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

GGTCAAGAAT  CTGCACACAG  G

<210> 3

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 3

TCATTGCAAA  GTGACGACGA  C

<210> 4

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 4

TGCCTGACAT  TGGTAACTAC  G

 

 

 

 

Claims (4)

1.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于：其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

2.根据权利要求1所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于，所述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3和4所示。

3.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物的设计：根据Genbank中CTVP25基因保守序列，利用BeaconDesigner 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性，在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得引物LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA；

(2)褐色橘蚜总RNA的提取；

(3)目的基因的扩增与鉴定；

(4)标准品cRNA的制备；

(5)建立荧光定量RT-PCR体系，所述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60℃；引物浓度为600nm，体系如下：

5μl反转录体系为：2×TS ReAction Mix 2.5μl；TrAnsScriptTM/RI Enzyme Mix0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；蚜虫RNA模板或标准品1.5μl；程序为：42℃反转录30min；85℃变性5min；

20μl实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green Supermix)10μl；HD-F/R各1.2μl；ddH₂O 5.6μl；反转录产物cDNA模板2μl；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从65℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照；

(6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测。

4.根据权利要求3所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于：采用上述建立的体系对在毒源植物上获毒的单头蚜虫中CTV进行定量检测，得到单头橘蚜体内CTV含量，具体检测为：当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。

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