CN105755178A - 一种柑橘衰退病的q-PCR引物 - Google Patents

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戴素明
李芳�
邓子牛
李大志
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

一种柑橘衰退病的q?PCR引物，所述引物序列为：p23?F:5’?CGTGGATTGYGGTAGAAA?3’,p23?R:5’?CTGAGAYTGYGT ATTGTT?3’，上、下游引物序列均为18bp。本发明引物根据NCBI已经公布的柑橘衰退病毒<i>p23</i>基因序列，与自主分离的多个<i>p23</i>基因序列同源比对分析后设计，通用型强，不受柑橘衰退病基因型的限制；检测灵敏度高（最低可以检测的浓度是8.2×10?6 ng/μL的cDNA），可用于低含量病毒的检测，避免因病毒浓度低而检测失败；能够适合多种柑橘组织检测，结果稳定，提高柑橘衰退病检测效率。

Description

一种柑橘衰退病的q-PCR引物
技术领域
本发明涉及一种柑橘衰退病毒检测引物，具体涉及一种用于q-PCR检测柑橘衰退病毒的p23基因引物序列，属于生物技术领域。
背景技术
柑橘衰退病是一种世界性的柑橘病害，对柑橘产业危害严重。果树感染柑橘衰退病后，出现树势衰退、矮化、生长缓慢、果实品质和产量低或者无果等症状。目前，生产中该病害防控主要依赖无病毒苗木种植。为保证苗木的无毒化，在生产过程中需要对柑橘衰退病进行检测。
在病毒病的检测中，q-PCR是一种常用的方法，具有灵敏度高、快速、准确的优势。然而，这些优势往往受到引物扩增效率的限制。虽然已有报道，利用ORF1，p25，p20和3’UTR基因设计的引物序列可对病毒进行检测，但是这些引物很难检测到低含量的病毒。因此，必须筛选一种高效率的柑橘衰退病毒检测引物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种灵敏度较高的柑橘衰退病的q-PCR引物，通过q-PCR可以检测不同基因型的柑橘衰退病毒。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种柑橘衰退病的q-PCR引物，序列如下：上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。
本发明克服现有引物检测效率低的不足，提供一种柑橘衰退病p23基因的扩增引物，通过q-PCR可以检测不同基因型的柑橘衰退病毒。
本发明将已公布的柑橘衰退病毒p23基因序列与多个自主分离病毒株系的p23基因序列进行同源分析，在保守区域处进行引物设计，序列为p23-F:5’-CGTGGATTGYGGTAGAAA-3’,R:p23-R:5’-CTGAGAYTGYGTATTGTT-3’，上、下游引物序列均为18bp。
与已报道的引物进行灵敏度比较，本发明之引物，病毒检测灵敏度，较ORF1和3’UTR基因的扩增引物提高625倍，较p25和p20基因的扩增引物提高5倍。
本发明引物根据NCBI已经公布的柑橘衰退病毒p23基因序列，与自主分离的多个p23基因序列同源比对分析后设计，通用型强，不受柑橘衰退病基因型的限制；检测灵敏度高(最低可以检测的浓度是8.2×10-6ng/μL的cDNA)，可用于低含量病毒的检测，避免因病毒浓度低而检测失败；能够适合多种柑橘组织检测，结果稳定，提高柑橘衰退病检测效率。
附图说明
图1为p23引物对不同基因型柑橘衰退病毒的q-PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
本实施例是利用感染柑橘衰退病的柑橘叶片总RNA，将总RNA反转录后的cDNA稀释成不同浓度，再进行q-PCR扩增，分析引物的扩增效率。
1)RNA的提取：按照公知的方法提取感染柑橘衰退病的柑橘叶片总RNA；
2)反转录：反应体系为：RNA 0.5μg，随机六聚体引物0.5μg，1mM dNTP 5μL，M-MLV200U，5×M-MLV buffer 5μL，RNase 20U，用RNA-free水补足至25μL。反应程序为：37℃45min，65℃10min。
3)cDNA的稀释浓度为80ng/μL的cDNA用RNA-free水进行5倍稀释。
4)Real Time PCR反应反应体系为SYBR MIX(BiO-rad 170-8882AP)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 7.2μL。反应程序为95℃5min,95℃5sec,55℃15sec,40个循环，在72℃采集荧光信号。
步骤4)中，所述上下游引物采用本发明之上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。
对比例，步骤4)中，所述上下游引物分别采用ORF1，p25，p20和3’UTR基因的引物序列。
ORF1，p25，p20,3’UTR引物序列如下：
ORF1 5‘-AACGGGGTGACCAAGAC-3’
5‘-AACCGACACAGTTTAGTATAGC-3’
p25 5‘-AGCRGTTAAGAGTTCATCATTRC-3’
5‘-CRGTCCAAAGTTTGTCAGA-3’
p20 5‘-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’
5‘-CCTCATAACGAAGAAGCCCA-3’
3'UTR 5‘-CGTATCCTCTCGTTGGTCTAAGC-3’
5‘-ACAACACACACTCTAAGGAGAACTTCTT-3’
扩增结果如表1所示，公知的引物ORF1和3’UTR能够扩增的最低cDNA浓度为5.1×10-3ng/μL，p25和p20能够检测的最低cDNA浓度是4.1×10-5ng/μL，本发明设计的p23引物最低的检测浓度为8.2×10-6ng/μL。p23引物的检测效率比其他已报道引物的检测效率要高5-625倍，可以用于低病毒含量检测。
表1不同引物检测柑橘衰退病的效率分析
注：√表示在此浓度下该引物的q-PCR扩增结果为阳性，括号内的数值为对应的Ct值，-表示在此浓度下该引物的q-PCR扩增无结果。
实施例2
本实施例是首先将感染衰退病的柑橘样品通过植物组织印迹法保存，以此为模板，分别用p23,ORF1,p25,p20和3’UTR基因的扩增引物进行q-PCR检测，分析各对引物对低含量病毒的检测能力。
1)病毒样品的保存：对10株感染衰退病的柑橘树，采集幼嫩枝条，通过植物组织印迹法保存在硝酸纤维素膜上。
2)洗脱：每个病毒样品的印迹单独放入PCR管中，加入洗脱液50μL，密封后置于PCR以上，95℃反应5min，立即置于冰上保持4min。
3)反转录取洗脱后的样品5μL用于反转录，具体的实施方式同实施例1的步骤2)。
4)q-PCR扩增，实施方式同实施例1的步骤4)。
扩增结果如表2所示，公知的引物ORF1只能检测出2个样品，公知的引物p25能够检测出3个样品，公知的引物p20能够检测出5个样品，公知的引物3’UTR能够检测出4个样品，p23引物能够全部检测出10个样品，检测效率为100％。由此说明，本发明的p23引物能够用于低含量病毒样品检测。
表2不同引物对低含量病毒的检测能力
注：√表示该引物对此样品的q-PCR扩增结果为阳性，括号内的数值为引物扩增结果对应的Ct值，-表示该引物对此样品的q-PCR扩增无结果。
实施例3
本实施例利用感染不同柑橘衰退病基因型的柑橘叶片，提取总RNA反转录后的cDNA为模板，用本发明的p23引物进行q-PCR扩增，分析引物对不同基因型的检测能力。
1)样品的准备5株柑橘树编号及感染的基因型分别为
1：VT；
2：T36；
3：T3；
4：T36,T3,VT和B165复合感染；
5：T36,T3,VT和T30复合感染；
2)RNA的提取、反转录和p23基因的q-PCR检测实施方式同实施例1的步骤1)，2)和4)。
扩增结果如图1所示(图中数字表示样品编号)，p23引物能够全部检测出3个感染不同基因型的样品和2个感染多种基因型的样品，检测效率为100％。由此说明，本发明的p23引物能够用于多种基因型病毒样品的检测。
序列表
<110>湖南农业大学
<120>一种柑橘衰退病的q-PCR引物
<160> 2
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213>上游引物
<400> 1
CGTGGATTGY　GGTAGAAA　18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>下游引物
<400> 2
CTGAGAYTGY　GTATTGTT　18

Claims (1)

1.一种柑橘衰退病的q-PCR引物，其特征在于，其引物序列如下：上游引物 p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物 p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。
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